TEMA 3.

ALGUNAS APLICACIONES DEL ANÁLISIS DEL DNA EN

DIFERENTES CAMPOS DE ACTUACIÓN DEL VETERINARIO
I. PRODUCCIÓN ANIMAL
II. SANIDAD ANIMAL
III. INSPECCIÓN Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
IV. VETERINARIA FORENSE
IV.I.Veterinaria forense
I.1.Control libros
genealógicos III.4.Detección de transgénicos

III.3.Detección de patógenos
I.2. Test de paternidad
en alimentos
I.3. Detección de III.2.Trazabilidad
genes de interés
III.1.Autentificación de productos:
II.1.Diagnóstico de patologías identificación de raza y especie
hereditarias
II.2.Diagnóstico de patologías
infecciosas y parasitarias
 PRIMER PASO: conocimiento de la secuencia

MAPAS DEL GENOMA: conocer la secuencia completa

de las bases nitrogenadas (A,C,G,T ) de una célula (3.000.000.000)

26 de junio de 2000
Primer borrador secuencia genoma humano

PROYECTO GENOMA HUMANO

1988 – Inicio Proyecto
2003 - Secuencia completa
 2009
Se completa secuencia genoma de la vaca

BOVMAP
 I. GENÉTICA Y PRODUCCIÓN ANIMAL
OBJETIVO: CONSEGUIR MÁS Y MEJORES PRODUCTOS DE
ORIGEN ANIMAL DESTINADOS AL CONSUMO HUMANO

Desde la domesticación, el hombre ha estado llevando a cabo “mejora

genética” , sin tener conocimiento de la existencia de los genes
2,13 m
SELECCIONANDO LOS MEJORES ANIMALES PARA REPRODUCTORES
(SELECCIÓN POR FENOTIPO- estimación del valor genético)
1,69 m
GENÉTICA CUANTITATIVA
1950 2000

Producción de huevos 150 > 300

X = 5000l. X= 8000l. X = 12000l.
Producción de leche 3.200 l. > 9.000 l.
PLANES DE MEJORA

Selección tradicional Selección por fenotipos

Elección de los mejores genotipos en función del fenotipo

GENÉTICA CUANTITATIVA

GENOTIPO
AMBIENTE

FENOTIPO

EBV SELECCIÓN
FENOTIPO FAMILIARES (estimated breeding value)
(valor genético)
I.1. CONTROL DE LIBROS GENEALÓGICOS
Datos genealógicos importantes estimación del valor genético

IMPRESCINDIBLES: En caracteres limitados a las hembras la

valoración de los machos ha de hacerse a partir de los valores
fenotípicos de sus hijas
Estimación : 10-20% de errores de paternidad. En algunos casos también se detectan
errores de maternidad.
- Superior en algunas especies como el ovino por su forma extensiva de explotación

Test de paternidad mediante marcadores genéticos (microsatélites)

LIBRO GENEALÓGICO RAZA PARDA DE MONTAÑA

LIBRO GENEALÓGICO RAZA LIMOUSIN

I.2 TESTS DE PATERNIDAD
SE REALIZA EN LA ESPECIE HUMANA Y EN NUMEROSAS ESPECIES DE ANIMALES DOMÉSTICOS

-Vacas -Caballos - Perros…

 Test de paternidad /maternidad
…POR QUE AUNQUE EL PARECIDO ES MUCHO, NO ES SUFICIENTE

Identificación dudosa de
pajuelas de inseminación

Cubrición con más

de un macho
Inseminación con
mas de un macho

Fraudes en registros de
certificados de pedigris
Pérdidas o defectos
de marcas
VERRACO/LECHON MICROSATELITES
REF. S0155 S0005 SW24 SW936 S0228 SW857 SW72 SW240 S0090
LECHON M9495- 152 166 231 245 104 112 96 110 222 226 148 150 103 103 102 122 246 250
VERRACO M7971- 166 166 231 251 104 106 110 114 222 226 142 150 103 103 116 122 246 250
VERRACO M7982- 160 166 213 251 98 104 108 108 222 226 146 152 103 103 102 102 246 246
VERRACO M7983- 162 166 213 231 104 106 108 116 222 226 152 152 103 103 100 102 246 250

¿Cuál de los tres verracos es compatible con el lechón?

¿Cuáles son incompatibles y por lo tanto se pueden excluir como padres del
lechón?

VERRACO MICROSATELITES
/LECHON REF. S0155 S0005 SW24 SW936 S0228 SW857 SW72 SW240 S0090
LECHON M9495- 152 166 231 245 104 112 96 110 222 226 148 150 103 103 102 122 246 250
VERRACO M7971- 166 166 231 251 104 106 110 114 222 226 142 150 103 103 116 122 246 250
VERRACO M7982- 160 166 213 251 98 104 108 108 222 226 146 152 103 103 102 102 246 246
VERRACO M7983- 162 166 213 231 104 106 108 116 222 226 152 152 103 103 100 102 246 250
PRUEBA DE PATERNIDAD/MATERNIDAD

"Principio de Exclusión"

De los dos alelos que presenta un individuo para un

determinado marcador genético

Uno proviene del padre y otro de la madre

Incompatibilidad
100% Fiabilidad

Compatibilidad
Fiabilidad depende del número de marcadores
analizado - generalmente >99,99 %
 I.3.-DETECCIÓN DE GENES CON INFLUENCIA EN LA CANTIDAD
O CALIDAD DE LOS PRODUCTOS

DESDE QUE CONOCEMOS Y PODEMOS ESTUDIAR EL DNA …

… ADEMÁS DE LA SELECCIÓN DE LOS MEJORES FENOTIPOS PODEMOS BUSCAR LOS
MEJORES GENOTIPOS PARA DISTINTOS GENES DE INTERÉS EN PRODUCCIÓN ANIMAL
(que nos permitan producir más y mejor)

ATCGGCATACGTTAGCCGG PROTEINAS
IGF2 – Desarrollo
ATCGGCATmuscular y depósitos grasos
GCGTTAGCCGG DIFERENTES

K-Caseína - Mayor rendimiento en la producción de queso

IGF2 – Desarrollo muscular y depósitos grasos

PRKAG 3 – Aumenta la cantidad de glucógeno del músculo en un 70% y el desarrollo muscular

DAGT 1 - Tiene una gran influencia en la cantidad de grasa en la leche

MIOSTATINA – Hipertrofia muscular o doble musculatura

RYR 1 – Síndrome de estrés porcino (SSP). Carne no comestible

 GEN DE LA MIOSTATINA
PERDIDA DE FUNCIÓN DEL GEN GENERA UN FENOTIPO SIMILAR EN LAS
TRES ESPECIES DE MAMÍFEROS

Hipertrofia muscular
“ CULONES “

- mayor rendimiento a la canal

- mayor proporción de músculo
- menor proporción de hueso
- mucha menor proporción de grasa

Fotografías obtenidas de Genome

research (Womack, 2005)
 Myostatin mutations in Piedmontese (Right) cattle compared with wild-type Holstein cattle.

McPherron A C , and Lee S PNAS 1997;94:12457-12461

©1997 by National Academy of Sciences

 Si analizamos el DNA y elegimos los animales en función de las
variantes de diferentes genes…

¿PODREMOS DISEÑAR “ANIMALES A LA CARTA”?

-Menos grasa
-Menos colesterol
-Más músculo
-Carne más blanca o más dura o blanda
-Leche sin lactosa
-Leche con más omega 3….
 II. GENÉTICA Y SANIDAD ANIMAL
II.1. DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS HEREDITARIAS

OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) :

Base de datos de genes y enfermedades hereditarias en
137 especies animales

PERRO VACA GATO CERDO CABALLO OVEJA POLLO CABRA CONEJO OTROS TOTAL

Total 567 408 298 223 205 202 188 72 59 593 2815
Caracteres

Caracteres 204 119 66 37 88 79 81 11 21 117 773

mendelianos
Caracteres 150 70 37 15 24 25 28 8 7 52 416
Mendelianos
(mutación
conocida)
Potenciales 268 137 151 75 104 75 40 29 38 255 1172
modelos
caracteres
humanos
 OMIA 000595-9913 : Leukocyte
BLAD adhesion deficiency in Bos taurus

In other species: dog , water buffalo

Possible human homologue (MIM number): 116920

Single locus: yes

Mode of inheritance: Autosomal Recessive

Considered a defect: yes

Causative mutation known: yes

Cross-species summary: Affected animals die because of extreme susceptibility to infections, caused by an inability
of white blood cells (leukocytes) to pass from the blood stream into infected tissue. This inability is due to the lack
of a membrane glycoprotein called the leukocyte integrin beta-2 subunit or CD18.

Species-specific name: Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD)

Species-specific description: In 1992, Shuster et al. showed that this disorder is due to a mis-sense mutation in the
CD18 gene.

Symbol Description
ITGB2 integrin, beta 2
2 Meydan, H., Yildiz, MA., Agerholm, JS. : Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency,
0 deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine
1 citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey. Acta Vet Scand 52:56,
2010. Pubmed reference: 20929557
0
OMIM: ON LINE MENDELIAN INHERITANCE IN MAN
OTRO EJEMPLO DE PATOLOGÍA HEREDITARIA
 SSP – Síndrome de estres porcino
Repercusión sobre la calidad de la carne: Carnes pálidas, blandas y exudativas
Malignant hyperthermia (Phene ID 1193, Group 000621) in Sus scrofa
Possible human homologue (MIM number) 145600 180901
Symbol PSS
Cross Species Summary
Malignant hyperthermia. A progressive increase in body temperature, muscle rigidity and metabolic acidosis,
leading to rapid death.
Summary
In pigs, malignant hyperthermia (MH) leads to rapid post-mortem changes in muscle, resulting in pale soft
exudative (PSE) meat. MH can be triggered by a minor stress, such as loading, transport, sexual
intercourse, high ambient temperature, or exposure to the anaesthetic halothane. Susceptibility to
halothane-induced MH is an autosomal recessive trait in pigs. Together, sudden death syndrome and PSE
constitute porcine stress syndrome (PSS), which became a major economic problem in many countries in
the 1970s. In part, this was due to strong selection for increased leanness, which is associated with
susceptibility to PSS. In 1991, a major breakthrough occurred when a Canadian research team led by David
MacLennan (Fujii et al., 1991) showed that MH is due to a base substitution (C-T) in the 1843rd
nucleotide of the gene for the calcium release channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal
muscle. The base substitution causes an amino-acid substitution (arginine - cysteine) in the 615th position
of the calcium release channel, resulting in altered calcium flow. A PCR genotyping test based on the
causative mutation has been used extensively in many countries, leading to the elimination of the mutation
from many herds.
Species Specific Name Porcine Stress Syndrome
Genetic Test
Various PCR genotyping tests have been devised, all based on detection of an RFLP resulting from the
causative base substitution.
Single Locus yes
Characterised at a molecular level Yes
 DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

Mutación en el gen de RYR-l: Receptor de la ryanodina- Gen

para la liberación del calcio en el músculo esquelético -

Sustitución C-T en el nucleótido 1843

Sustitución arginina–cisteina en al posición 615

C/C: Individuos sanos y no portadores

C/T: Individuos sanos y portadores
T/T: Individuos enfermos
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO
PCR/RFLPs
199bp
PCR
Alelo C 199bp

165bp 34bp
Alelo T
BsiHKA I
II.2. DIAGNÓSTICO DE PATOLOGÍAS INFECCIOSAS Y PARASITARIAS
III. INSPECCIÓN Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
III.1. DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES

Aprovechando las diferencias que existen en el DNA de individuos de distintas

especies

Autentificación de los componentes de los alimentos

DETECCIÓN DE FRAUDES
Diferenciación de distintas especies
•Patés
•Quesos
•Hamburguesas (cerdo, vaca, caballo..)
 IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

Autentificación

Razones filosóficas
> Demanda y religiosas
de productos de calidad

Cuestiones legales

Fraudes
económicos
 En patés RAPDs

C/Pt Pt O Pv Pll C Pt

En hamburguesas
Identificación de especies mediante RAPDs

Aplicable a carne o a quesos

750 pb

340 pb
310 pb
290 pb

Caprino Ovino Bovino

III.2. TRAZABILIDAD GENÉTICA

Seguridad alimentaria
PREOCUPACIÓN CRECIENTE ENTRE LOS CONSUMIDORES

Crisis de las vacas locas, listeriosis,

dioxinas, etc

OBLIGATORIEDAD DE ESTABLECIMIENTO
DE UN SISTEMA DE TRAZABILIDAD
 Sistema de trazabilidad genética
Sistema basado en el análisis del ADN

FUNDAMENTO: Los animales presentan

diferencias en su ADN, a excepción
Marcadores
de los utilizados
gemelos monocigóticos :
o los
clones.
MICROSATÉLITES
SISTEMA
Como FIABLE
media, 1 de cada 1000Ybases
REPETIBLE
del ADN (de
los 3.000.000.000) es diferente entre animales
La información genética
SNPs contenida en las
células es igual en todas las partes del cuerpo
del animal y no varía con el tiempo
GENOTIPADO SNPs A GRAN ESCALA EN ANIMALES DE GRANJA

OvineSNP50 Genotyping BeadChip

- 50,000 SNPs,

PorcineSNP60 Genotyping BeadChip

- 60,000 SNPs

BovineSNP50 beadchip

- 54,000 SNP
Tomar muestras de canales , que es cuando se pierde la identificación del animal…

Principles of meat traceability Obtenido de Cunnhigam 2000

(e) identification of animal of origin by comparison of meat profile with database batch of animal profiles
 III.3. DETECCIÓN DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas

• Deterioran los alimentos

• Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación

VENTAJAS

1. Sensibilidad
2. Especificidad
3. Capacidad de procesamiento de gran número de muestras
Microrganismos Trastorno Posible producto Método
que ocasiona portador

Acrobacter spp Diarrea Carne de aves RAPD-PCR

Bacillus cereus Arroz, prod. Lacteos

Diarrea, vómitos Y cárnicos PCR

Campilobacter spp Diarrea Aves, cerdo , res y PCR múltiple

Leche cruda

Clostridium botulinum Botulismo, vómitos Pescado, miel, latas PCR anidado

Clostridium perfringens Diarrea, dolor abd. Carne de res y aves, PCR duplex
Salsas
E.Coli Diarrea, colitis Carne y productos PCR múltiple
Lácteos RT- PCR
Listeria spp Listeriosis Pate, leche, queso, carne PCR-múltiple
Mariscos, ensalada de col
RT- PCR
Salmonella spp Gastroenteritis Leche, huevo crudo, carne RT- PCR
de res y ave
Shigella spp Fiebre , calambres Mayonesa, vegetales crudos PCR simple
Leche y aves
Vibrio cholera Cólera Ostras crudas, pescado RT- PCR
Yersinia enterocolitica Yersiniosis Leche, tofu, canales de cerdo
RT- PCR
 EXISTEN KITS COMERCIALES

BAX (Qualicom, USA) Salmonella PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella

Listeria Listeria

E.Coli O157:H7

- + + +
TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella

Listeria

E.Coli O 157
III.4. DETECCIÓN DE TRANSGÉNICOS

Creación de plantas Detección de transgénicos en una

transgénicas mezcla con una sensibilidad 0,1%

Mediante técnica PCR

Aplicación a la verificación de etiquetas,

seguimiento y detección de fraudes
DETECCIÓN POR PCR DE MAÍZ TRANSGÉNICO
IV.I. VETERINARIA FORENSE
ANALIZANDO EL DNA PODEMOS IDENTIFICAR LOS INDIVIDUOS BASÁNDONOS
EN LAS DIFERENCIAS EXISTENTES EN SU SECUENCIA.

Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos

monocigóticos o los clones.
La muestra problema
se corresponde con
el ANIMAL 3.
CSI VETERINARIO
Si dos muestras
coinciden en todas las
bandas, se trata de
muestras del mismo
1 2 3 4 5 6 7 animal.
 VETERINARIA FORENSE

ASESINATO de Shirley Duguay

y un GATO BLANCO
- Shirley Duguay desaparece y aparece muerta

- Douglas Beamish, fue acusado de asesinato… jamás pensó que el gato de sus padres fuera a
denunciarle.