TÉC

CNIC
CAS D
DE DIAGNÓSTIICO
MOL
LECUULAR
MÓD DICA
DULO 2: INTRODU CCIÓN A LA GENÉTICA MÉD

CERTIFICADO DE G
GENÉTICA M
MÉDICA 2014 ‐ 2015
Material didááctico: Mód
dulo 2‐Clase
e 6

 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
Material didáctico: Módulo 2‐Clase 6 
 

ÍNDICE

MODULO 2: INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA MÉDICA

ASIGNATURA 2.6‐ TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR. Profesor: Dr. Carlos ruiz
Lafora

1.‐PLANIFICACIÓN DEL ESTUDIO GENÉTICO…………………………………………………….1

2.‐ REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)……………………………………….1

2.1.‐ Fundamentos y componentes de la PCR…………………………………………..1

2.2.‐ Aplicaciones de la PCR convencional……………………………………………….4

2.3.‐ Modificaciones de la PCR: TP‐PCR……………………………………………….…..5

3.‐PCR A TIEMPO REAL……………………………………………………………………………………..6

3.1.‐ Fundamentos de la PCR a tiempo real……………………………………………...6

3.2.‐ Sistemas de detección de fluorescencia……………………………………………7

3.3.‐Ventajas de la PCR a tiempo real……………………………………………………….8

3.4.‐ Aplicaciones de la PCR a tiempo real………………………………………………...8

3.5.‐ Modificación de PCR a tiempo real: PCR digital……………………………….10

4.‐SECUENCIACIÓN DE ADN…………………………………………………………………………..…11

4.1.‐ Aplicaciones de la Secuenciación: análisis de enfermedades……………12

4.2.‐ Limitaciones………………………………………………………………………………….13

5.‐ TECNOLOGÍAS DE NUEVA GENERACIÓN. ULTRASECUENCIACIÓN……………….13

5.1.‐ Fundamentos………………………………………………………………………………...12

ANEXO 1. Secuenciación masiva. Ampliación……………………………………………….……14

NOTA: Las diapositivas asociadas al siguiente texto didáctico se encuentran

disponibles en el Aula Virtual, Recursos/Módulo 2/Carpeta 2.7/PDF.

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1.‐PL
LANIFICACIIÓN DEL EST
TUDIO GEN
NÉTICO
El d
diagnóstico genético
g es un procesoo en el que hay que pa
asar por differentes fasses: la
histo oria genéticaa (determin
nación de ssi se trata de un casoo familiar, ppor medio de la
obserrvación de llos antecede entes), un esstudio genéttico en el qu ue se obtienne información de
tipo m molecular ddel paciente y su familiaa, y para el que hay que determinaar la metodo ología
más adecuada a cada caso, y por últim
mo, el consejjo genético en el que s e interpreta
an los
datoss obtenidos y se informa al pacientee.

Para el estudio ggenético, es importantee identificar qué técnicaa es la más aadecuada para el
análiisis que se quiere llev
var a cabo, porque dep
pende del gen
g que see analiza o de la
inforrmación quee se quiere o obtener.

CONS
SULTAR DIA
APOSITIVA
A 2 a 7:

2.‐ R
REACCIÓN EN CADENA DE LA POL IMERASA (PCR)

Práctticamente todas
t las muestras quee entran en
n un labora
atorio de esstudios gené
éticos
tieneen que pasaar en algún momento por la técn R (reacción en cadena de la
nica de PCR
polim
merasa).

n 1986 por Kary Mulliss, quien recibió el prem

Se deescubrió en mio Nobel een 1993 porr esta
aporttación. Desdde entoncess la técnica se utiliza en todos los campos dee la biología
a y ha
sido consideradaa como la más revolucioonaria en loss últimos añ ños.

El annálisis de ADDN es una he erramienta esencial en la investigaación y diagnnóstico, perro con

la maayoría de métodos
m la cantidad
c de ADN obten nida para un
n determinaado parámettro es
muy baja. El propósito de la PCR es pro ducir un graan número d de copias dee un determinado
fragmmento del geenoma, es decir, obteneer una gran cantidad de e ADN a parttir de unas pocas
copiaas. La PCR posibilita la amplificacción de cad
denas de ADN de un aamplio rang go de
tamaaño (hasta 20 kilobases)) hasta 1 milllón de vecees y es extremadamentee sensible.

2.1.‐ Fundamen
ntos y comp
ponentes dee la PCR

La P
PCR es unaa técnica de amplificaación enzim
mática in viitro. Permitte amplifica
ar un
fragm
mento especcífico de AD DN situado eentre dos reegiones de ssecuencia coonocida, y cconsta
de tres pasos:

 Desnaturralización del ADN (a 95 5ºC): las doss hebras se a abren a estaa temperatuura.
 Hibridacción de dos cebadores (a 50ºC‐65ººC): en este
e rango de ttemperatura
as los
cebadorees se unen aa la hebra dee ADN complementaria.

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 Extensión o elongacción de la P
PCR (72ºC):  la Taq polimerasa se uune al ceba
ador y
empieza a replicar laa cadena qu e se desea aamplificar.

EEstos tres paasos o fasess conforman n un ciclo qu

ue se repite e unas 30 o 40 veces. P
Puesto
qque cada caddena que se e sintetiza en
n el ciclo an
nterior sirvee de molde ppara el sigu
uiente,
een cada ciclo
o se duplicann las copias de ADN. Assí, la cantida
ad de ADN oobtenido cre ece de
foorma que ess exponencial y pueden n conseguirsse al final deel proceso m
millones de ccopias
dde un único ffragmento dde ADN.

C
CONSULTAR
R DIAPOSIT
TIVAS 9, 10,, 11 y 12

C
Componenttes de la PCR
R

 ADN mollde:

EEl primer paaso antes de

e iniciar un DN que se qquiere amplificar,
na PCR es exxtraer el AD
nnormalmentte a partir de e muestras d de sangre o de parafina a. El protocoolo de extra
acción
yy de PCR cambia en funnción del orrigen de la muestra ya a que el ADN
N puede ha
aberse
vvisto afectad
do de forma a diferente por los difeerentes meccanismos dee preparació ón de
mmuestras.

MMediante téccnicas de PC
CR se puede llegar a dettectar una única molécuula en una m mezcla
ccompleja de ADN. La sensibilidad dde la PCR vaaría dependiiendo de la cantidad de e ADN
mmolde (tamaaño medio d de los fragmmentos y purreza). Ademmás, determiinadas susta ancias
qque pueden estar presenntes en el A DN extraídoo pueden dissminuir la eeficacia de la
a PCR.
LLa cantidad ó
óptima de AADN molde d de partida para la reacciión de PCR ees de 10‐200ng.

 Cebadorees:

LLos cebadorres son crítiicos para laa PCR ya qu

ue proporciionan la esppecificidad de la
reacción. Asíí, en funciónn del diseño de estos ceb badores se a
amplificará uuna región u u otra
ddentro del A
ADN utilizad do como mo lde (normallmente, en lla materia qque nos ocupa, se
aamplificará u
una región e exónica de u un gen relaciionado con lla enfermeddad).

L
La longitud y
y secuencia de los cebad dores son caaracterísticaas esencialess para la reaacción
d
de PCR ya qu ue determinnan la eficie ncia de la m
misma. Cuan ndo se diseññan los cebadores
(existen pro
ogramas infoormáticos eespecíficos para ello), hay que coonsiderar biien la
teemperaturaa a la que de
ebe realizarsse la hibridaación y evitaar los motivvos repetido os que
p
puedan hibridar de form ma incorreccta con el AD DN. También debe evita tarse la pressencia
d
de secuenciias invertid
das que puuedan dar lugar a la formaciónn de estruccturas

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secundarias en el cebad
dor, o las seccuencias complementarrias entre loos cebadore
es que
d
darían lugar a dímeros e
entre ellos.

 Enzima T
Taq polimerrasa:

E ma termoesttable capaz de incorporar progressivamente nnucleótidos d

Es una enzim desde
eel extremo 3
3’ de un cebaador. La Taqq polimerassa fue iniciallmente aislaada de la bacteria
TThermus aquuaticus y es ccapaz ampliificar el DNA mperaturas ((y por tanto no se
A a altas tem
ddesnaturaliza cuando en el ciclo see superan los 75ºC y 95ºC).
9 Actuaalmente, se usan
ppolimerasas comerciale es y con aactividad “h hot‐start”, cuya
c activacción se iniicia a
eelevadas tem
mperaturas, lo que impi de la síntesiis a partir de dímeros dde cebadores, que
se pueden foormar a bajaas temperatu uras.

 Otros com
mponentes:

TTampones: cada ADN polimerasa

p requiere dee su tampón
n específicoo para realizzar su
aactividad enzzimática en condicioness óptimas.

MMgCl2: la con
ncentración n de MgCl in fluye en la pproductividad y especifficidad de la
a PCR.
UUna concenttración baja de estos ionnes producee un bajo ren ndimiento. SSin embargoo, una
cconcentracióón elevada produce la formacción de prroductos innespecíficoss. La
cconcentracióón final en la
a mezcla de reacción deebe estar enttre 1.5 y 5 n M

NNucleótidoss: componentes básicoos del ADN,, constituye en las unidaades que la

a Taq
ppolimerasa va a utiliza
ar para for mar la nueeva cadena de ADN. LLa concentrración
eestándar de los nucleótiidos en la reeacción es dde 200 microoM. Los cuattro deben estar a
laa misma con
ncentración para evitar errores en lla polimerizzación.

T
Termociclad dor: es un equipo
e que marca las temperatura
t as en los tieempos indiccados,
de forma que permite realizar de foorma autom
d mática las distintas fasees que confo orman
laa reacción d
de PCR.

En una PCR se pasan

p de un
nas pocas coopias de AD
DN a millonees de copiass, que se pu
ueden
visuaalizar mediiante diferrentes méttodos. Norm malmente la visualizzación del ADN
ampllificado durrante la PC CR se realizza mediantte electroforesis en geel de agaro osa o
electroforesis caapilares en a acrilamida. EEn ambos caasos, se utiliza la aplicacción de una carga
eléctrica para haacer migrar al ADN, carggado negativ vamente, haacia el polo ppositivo. En el gel
de aggarosa, el ADN,
A transpaarente se haace visible mediante
m un
n componennte que se une u al
ADN,, el Bromuro o de Etidio y
y en electrofforesis capilar se utilizan fluoróforoos.

CONS
SULTAR DIA
APOSITIVA
AS 13, 14 , 1
15 y 16:

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2.2.‐A
Aplicacione
es de la PCR
R convencio
onal

 A
Amplificación de microssatélites (ST
TRs):

Los m
microsatélittes son regiones del geenoma con repeticione es en tándeem de secueencias
cortaas (motivos)) de nucleótidos (cac, ggt,). Su pressencia no es indicativoo de enferm
medad,
sino que su caarácter poliimórfico see puede uttilizar para considerarrlos marcadores
moleeculares asoociados a un
u gen. Es decir, no es e que las repeticionees en sí mismas
impliiquen una ppatología, pe ero sí que pu ueden ir ligaadas o asociiadas a un aalelo que pro oduce
una eenfermedad d y por tanto o su herenciia es similarr. Mediante marcadoress polimórficcos se
puedden etiquetaar genes y ver cómo se están hered dando dentrro de una faamilia. Se pu ueden
hacerr haplotiposs, árboles fammiliares, etcc.

Ejemplo 1: Distro ofia muscular de cinturras (enfermeedad autosó ómica dominnante)  se e sabe
que eel gen respoonsable estáá ligado a un
na región co oncreta del ccromosoma 7q32. Se hiizo un
estud
dio de haplootipos con 7
7 microsatéélites, tanto en el probando, el paddre, como en
e los
herm
manos de éstte para ver q qué cromosooma había h heredado el feto del paddre, si el san no o el
asociiado a la enffermedad.

Ejemplo 2: síndrome de Prrader‐willi (15q11‐13) está aso ociado a unna deleción en el

crom
mosoma de origen pate a disomia uniparental materna o a defectos en el
erno, a una
impriinting del cromosoma
c 15 paternoo. En el casso especifica
ado se deteerminó meddiante
microosatélites que el pacien nte había heeredado los dos cromossomas mateernos y por tanto
ba afectado de la enferrmedad por un efecto de
estab d disomía uniparentall del cromo osoma
mateerno.

CONS
SULTAR DIA
APOSITIVA
AS 17, 18 Y 1
19:





 M
Mutaciones d
dinámicas:

Son ssecuencias ccortas repettidas, similaares a las anteriores perro para las qque, en este
e caso,
su reepetición y/o expansión n sí afecta a la expresió
ón o función de algún geen. Son por tanto
repetticiones de nucleótidoss en tándemm que puedden adquirir un tamañño patológicco. Se
denoominan din námicas po orque este carácter patológico depende ddel númerro de
repetticiones. Haay muchas m mutaciones dinámicas descritas tanto en zonaas exónicas como
intró unos ejempllos pueden verse en la
ónicas. Algu l enfermed dad de Hunntington, attaxias
cerebbroespinaless, distrofia m
miotónica, eetc, todas ellas debidas a
a expansionees de triplettes.

Caraccterísticas d
de la inestab
bilidad de re peticiones d
de tripletes e
en tándem:

 Número de repeticio
ones polimóórfico en la p
población.
 Adquiereen un tamañ
ño patológic o.

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 Inestabillidad interge
eneracional..
 Fenómen no de anticippación.
 Enfermedades neuro ológicas.

Ejemplo 1: Enfeermedad de Huntington n alelos normales de d 6‐26 reppeticiones/ alelos

a
interrmedios de 2 27‐35 repetiiciones/ ale los asociado o a la enferm medad de Huuntington m más de
36 reepeticiones// forma juv venil 60 rep E este tipo de casos s e suelen realizar
peticiones. En
electroforesis caapilar, que p permite deteectar variaciiones de rep peticiones dde tripletes, al ser
más sensible que la electrofforesis en aggarosa. Las repeticiones patológicaas se localizzan en
el exxón 1 del geen que codiffica para la huntingtinaa y lo que se
e hace es unna PCR con unos
cebad dores que fllanqueen esa región rep petida y desp pués analiza arlo por elecctroforesis.

Ejemplo 2: Distro ofia miotóniica  aleloss normales d de 5‐24 repe eticiones/ allelos premu utados
de 35‐49 repeticiones/ alelos asociad os a DM1 mínima
m de 50‐150 reppeticiones/ alelos
a
asociiados a DM1 1 Clásica de 100‐1000 rrepeticioness/ alelos aso ociados a D M1 Congénita de
más de 2000 rep peticiones. E
En el caso p planteado, een algunos d de los pacienntes no se ppuede
estabblecer de forma absoluuta uno de llos alelos po nicamente ccon la PCR no se
or lo que ún
puedde caracterizzar genéticaamente al p
probando. En E estos casos se puedee hacer una a PCR
flanq
queante a la repetición q que se está aanalizando y y ver por ele ectroforesis capilar los a
alelos
que eestán presen ntes: una se
egunda PCR,, que está esspecíficamen nte diseñadaa para ampllificar
zonas repetidas. Es la TP‐PC CR, como se indica a con ntinuación.

2.3.‐ Modificaciiones de la P
PCR: TP‐PC
CR (triplet rrepeat prim
med PCR)

La TP P‐PCR es un na modificacción de la PCCR, específicca para el estudio de zonnas repetida as. En

ella sse utiliza un
n cebador adyacente a la zona rep
petida y otro o cebador ddiseñado sob
bre la
repettición (es decir, que suu secuencia es homólog ga a los trip
pletes de la
a expansión)), que
tienee añadida un na cola que nno hibrida ccon el ADN m molde. Esta cola es com mplementaria a a un
terceer cebador.

Dado o que el cebaador homólo ogo a la repeetición tienee muchos poosibles sitioss donde hibbridar,
se vaa a ir uniend
do en todas llas posibles posiciones dentro de laa expansiónn, y para cad da una
ones, con el tercer ceb
de estas posicio bador vamo os a obtene
er amplificaados de lon
ngitud
variaable.

Así ppues, en la TP‐PCR no se e obtiene un

n solo pico, ssino que se o obtiene un ppico por cadda una
de laas repeticion
nes de la ex
xpansión y en los paciientes que tengan
t aleloos expandid
dos se
obserrvará un efeecto sierra, d de muchos ppicos, en la eelectroforesis capilar.

SULTAR DIA
CONS APOSITIVA
AS 20, 21, 22
2 Y 23:

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3.‐ PC
CR A TIEMP
PO REAL

La PC
CR a tiempo real es también una moodificación d de la PCR co
onvencional,, que permitte
tanto
o la detecció
ón como la cu
uantificacióón de mRNA,, RNA y DNA A, la identificcación de
mutaaciones punttuales (SNPss), el estudioo de la expresión génica
a y la diferennciación alélica.

3.1.‐ Fundamen
ntos de la PC o real
CR a tiempo

La PCCR a tiempo o real simpliifica la técniica de PCR p puesto que no es necessario realiza ar una
osterior ya que es en eel propio terrmocicladorr donde se ddetecta a tiempo
electroforesis po
real lla cantidad de amplifica
ado existentte. Por tanto o se minimizan los riesggos de la técnica,
como o por ejemplo las contam minaciones..

F
Fases de la P
PCR a tiempo
o real:

 Exponen ncial: en cada ciclo se du uplica la canntidad inicia

al del ADN ddiana (asumiendo
un 100%% de eficienccia)
 os componentes de la r eacción emp
Lineal: lo piezan a connsumirse, laa reacción es más
lenta y algunos de lo os reactivoss o enzimas empiezan a degradarsee. La eficiencia ya
no es dell 100% por llo que en caada ciclo ya n no se duplica la cantidaad de ADN.
 Plateau: la amplifica
ación está p
parada, no se
s producen n nuevos prooductos. Alg
gunos
producto os de la PCR R se pueden n degradar. E Esta fase ess la que se ddetecta en la
a PCR
tradicionnal.

AA diferenciaa de la PCR
R que se vissualiza en un u gel de agarosa
a y enn la que só ólo se
aanalizaría el resultado d de “sí” o “noo” respecto a la amplificación, en lla PCR en tiempo
real se pued den analizarr todas las fases. No obstante, la fase que normalmen nte se
al y el valorr con el quee se suele trrabajar es ell Ct, o ciclo en el
aanaliza es laa exponencia
ccual se deteccta la fluoresscencia.

LLos producto os de amplificación en tiempo real se detectan a medida a que transcurren

lo n este caso, el termocicclador no só
os ciclos dee la PCR. En ólo aumentaa y disminuuye la
teemperaturaa sino que esstá diseñadoo para detecctarla en cad da ciclo. Estee mecanismo o está
bbasado en la l detección n y cuantifficación de un reporte er fluoresceente, cuya señal
aaumenta en proporción n directa a la cantidadd de producto de PCR R generado en la
reacción. El ttermociclador tiene acooplado un sistema de de etección, cappaz de cuanttificar
laa señal emittida por el re eporter, al fiinal de cadaa ciclo.

EEn una missma reacción de PCR R se puedeen detectarr diferentees mutacion

nes o
aamplificadoss, en función
n del fluorofo
foro que se u
utiliza.

CONS
SULTAR DIA
APOSITIVA
AS 24 a 32:

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3.2.‐ Sistemas de detección de fluorescencia

Los sistemas principales de detección de la fluorescencia son:

1) SYBRGreen ( similar al bromuro de etidio, BrEt):

Se une preferentemente a DNA de doble cadena incrementando fuertemente su

fluorescencia. La fluorescencia emitida es proporcional a la concentración de DNA, de
esta forma, el producto que se está formando en cada ronda de amplificación puede
ser visualizado de forma continua. La señal aparece a partir de un número
determinado de ciclos, dependiendo de la concentración de partida. La concentración
de DNA se determina usando estándares de concentración conocida y comparando las
curvas de fluorescencia de dichos estándares con la fluorescencia de la muestra.

2) Sondas FRET (Fluoresence Resonance Transfer):

Las sondas FRET están compuestas por dos sondas: un fluoróforo donador, que
excitado por una fuente de luz externa, emite luz, absorbida por un segundo fluoróforo
próximo a él, denominado aceptor. Este aceptor emite luz a una longitud de onda
distinta del donador. Esta luz puede medirse. Para que este fenómeno ocurra, ambas
sondas deben estar muy próximas entre sí. Por lo que deben diseñarse de manera
específica para que hibriden con el DNA objetivo en regiones muy cercanas, que
permitan, que tras la excitación del fluoróforo donador, éste sea capaz de excitar al
fluoróforo aceptor, en la zona interna del amplificado por PCR con cebadores
normales. A medida que se incrementa la cantidad de DNA debida al número de ciclos,
se incrementa igualmente la cantidad de sondas que hibridarán y darán una señal. Así,
la señal FRET será directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR
específico. Si el DNA no es específico, no se producirá hibridación de las sondas y por
tanto no habrá reacción.

3) Sondas Taqman:

Es una única sonda formada por un reporter, fluoróforo que emite a una determinada
longitud de onda; y un quencher, que absorbe la luz emitida por el reporter haciendo
que dicha emisión no sea detectada. El quencher puede ser un fluoróforo o una
molécula que no emite fluorescencia. Tras la fase de elongación de la PCR, se libera el
reporter por un fenómeno de hidrolización y se produce la detección. Es decir, durante
la elongación la sonda se une al DNA y cuando la polimerasa se encuentra con la sonda,
gracias a su actividad exonucleasa (actividad que degrada el DNA que encuentra por
delante) degrada la sonda liberando el reporter (CONSULTAR DIAPOSITIVAS 38 A 52).
A medida que se incrementa la cantidad de DNA debida al número de ciclos, se
incrementa igualmente la cantidad de las sondas hidrolizadas. Así la señal será
directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR específico. Si el DNA no es
específico no se producirá la hibridación de la sonda y por tanto no habrá reacción.

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C
CONSULTAR
R DIAPOSIT
TIVA 35 a 52
2:

3.3.‐V
Ventajas de
e la PCR a tiiempo reall

Las vventajas de lla PCR en Tiempo Real sson:

 En la PCCR convenciional se ob serva el resultado fina al de la ammplificación (Fase

plateau).. En la PCR a tiempo reeal se analizan los datoos de la fas e de crecim
miento
exponencial.
 l fluoresceencia es dirrectamente proporcionaal al número de
El increemento de la
amplicon nes generados.
 La precissión, la resollución y la ssensibilidad son mayore es con la PCR R a tiempo rreal.
 La PCR convenciona al solo discriimina por el tamaño dell amplificadoo.
 No se requiere ning gún proceso post‐PCR p por lo que se ahorra tieempo. Adem más se
minimizaan los problemas de contaminaación por amplicones a y se redu uce la
variabilid dad en el resultado.
 El rango o dinámico, es decir laa sensibilidaad de la téccnica para ddiferenciar entre
diferentees cantidade es, es muchoo mayor emp pleando PCR R a tiempo rreal.
 Si se emplean sonda as en la dettección de laa fluorescen
ncia, se evitaa la detección de
los artefaactos de la rreacción com mo los dímerros de cebad dores.

3.4.‐ Aplicacion
nes de la PCR a tiempo
o real

1) Geenotipado

 Curvas M
Melting o Currvas de Fusiión:
‐ Cada ADN se carracteriza poor su Tm o temperaturra de Fusióón, que se define
d
como la temperattura en la qu ue el 50% deel ADN está en cadena ssimple (mita ad del
DNA eestá desnatu uralizado).
‐ La Teemperatura de fusión n de un prroducto de PCR puedde monitoriizarse
midiendo la dism minución de ffluorescenciia por increm mento de la
a Temperatu ura. Se
obtien
nen así las curvas de fussión.
‐ Variacciones de la
a Tm del prooducto de PCR:
P la Tm depende
d dee la secuencia del
fragm
mento que esstemos amp plificando. U
Un fragmento bajo en G C tendrá un na Tm
más baja,
b mientrras que un ffragmento rico
r en GC, tendrá una
a Tm más allta. El
tamañño o longittud del fraggmento tam mbién modiifican la Tm m, así com
mo las
conceentraciones d de Sal y otroos componentes de la re eacción.

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 HRM (High Resolution Melting):
‐ Es una técnica reciente, de tan sólo unos pocos años, que permite analizar la Tm
del producto amplificado con alta resolución. Está basada en un agente
intercalante similar al SYBRGreen, pero con mayor capacidad de intercalarse en
el ADN de doble cadena. El análisis es mucho más sensible y proporciona
información incluso de un único cambio en la cadena nucleotídica.
‐ Tras obtener un amplificado, si empezamos a subir la temperatura, el nivel de
fluorescencia caerá según vayamos aumentando la temperatura de la reacción.
Podemos normalizarlo y diferenciar distintas secuencias que tengamos en la
muestra. El HRM necesita muchas muestras a la vez, porque lo que hace es
comparar muchas curvas de Melting de unas muestras con respecto a las otras.
‐ Se está utilizando para genotipado de mutaciones conocidas, mutaciones
recurrentes, y para el screening de BRCA 1 y 2. El problema es que el saber si va a
detectar un cambio puntual o no, por lo que se debe validar. Esto lleva a que las
mutaciones ya descritas sí pueden validarse, pero las mutaciones de novo no se
puede estar seguro de detectar todos los cambios.

 Análisis de mutaciones mediante sondas FRET:
‐ Las curvas de Melting se hacen después de la PCR. Si tenemos una pareja de
sondas FRET y tenemos una mutación conocida, podemos diseñar una sonda que
se una en la región donde está esa mutación conocida. Según aumentemos la
temperatura, si el alelo posee esa región que hemos detectado con la sonda, la
unión va a ser más fuerte que si el DNA tiene una secuencia diferente (su unión
será más débil, por lo que se despegará a una temperatura interior).

Ejemplo 1: Genotipado de factores de coagulación: el factor 5 Leiden tiene una
mutación recurrente que se analiza con sondas FRET. Se parte de una
fluorescencia inicial provocada por la unión de las sondas y según se
incrementa la temperatura se van desnaturalizando (deshibridando) las
sondas FRET del DNA de la muestra. Entonces, un resultado de 2 picos nos
indica que es DNA heterocigoto, mientras que si sólo aparece un pico se
pueden dar dos opciones: si es el pico que tiene la temperatura más alta, es el
alelo frente al cual se ha diseñado la sonda (puede ser el alelo mutante o el
normal); y si es el pico de la temperatura más baja, es el alelo frente al cual no
se ha diseñado sonda. (CONSULTAR DIAPOSITIVA 58)

Ejemplo 2: Síndromes mieloproiferativos crónicos: detección semicuantitativa
de la mutación p.Val617Phe del gen JAK2 mediante el empleo de sondas FRET.
(CONSULTAR DIAPOSITIVA 59.)

 El genotipado también puede realizarse usando Sondas TaqMan: en este caso, en
lugar de utilizar curvas melting, se diseñan dos sondas, cada una de las cuales se
une de forma específica al alelo mutado o al alelo normal.

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Ejem
mplo: Síndrome de Gilbeert, genotipaado del alelo
o A(TA)7TAA
AA en el prom
motor
del ggen UGT1A1 mediante ssondas TaqM Man. (CONSU ULTAR DIAPPOSITIVA 600).

2) Cu
uantificación
n

La cu
uantificaciónn puede ser absoluta o relativa. La absoluta prresenta erroores más gra
andes
por lo
o que se sueele usar la cu
uantificación
n relativa.

La cuuantificación
n mediante la PCR a ttiempo reall permite determinar eel porcentajje del
analiito (del ampplicón de intterés) preseente en una muestra. La a PCR cuanttitativa se d diseña
de m
manera que el incremen nto de la caantidad de producto
p prroduce un iincremento en la
fluorrescencia em
mitida por sondas
s espeecíficas. Parra cuantificar la muesttra se obtie
ene el
númeero de ciclo a partir del cual se emp pieza a deteectar la fluorrescencia, deenominado “Ct” y
se co
ompara con los diferenttes Ct obten nidos con un n estándar en cantidadees conocidass. Con
una sserie de patrones se pu uede realizarr una recta de regresión n, entre el nnúmero de ccopias
y el número dee ciclos neccesarios paara llegar al
a umbral de d fluoresceencia establlecido
(realización de curvas patrrón). Depen ndiendo de la concentrración inici al del analiito se
detecctará antes oo después laa fluorescen cia.

Ejemplo: Cuantificación de reordenaamientos (ttranslocacio

ones) en ooncohemato
ología.
CONSSULTAR DIAAPOSITIVA 6 65.

Ejem
mplo: Cuantifficación de p polimorfism mos en quim meras hemattopoyéticas mediante so ondas
TaqMMan. Median nte este anállisis se pued de conocer si la sangre d de un paciennte sometido o a un
trasp
plante de médula
m ósea, se está voolviendo a producir o si por el ccontrario ha
a sido
totalmmente sustiituida por la a sangre dell donante. A Así se evalúa a la evolucióón del trasp plante.
En esste caso no se utilizan
n estándaress sino que se
s utiliza el ADN del reeceptor, antees del
trasp
plante, como calibrado or. Lo que se analizan son polim morfismos informativo os de
inserrciones o deleciones, asíí como aleloos nulos. CO ONSULTAR D DIAPOSITIVA AS 66 Y 67.

CONS
SULTAR DIA
APOSITIVA
AS 53 A 67:

3.5.‐ Modificaciión de la PC
CR a tiempo
o real: PCR d
digital

La PC CR digital lleeva ya desa

arrollada dessde hace un nos años, pero ha sido ddurante el ú último
año ccuando se h ha iniciado ssu incorporaación en differentes labo oratorios paara su utilizzación
de foorma rutinarria. La base de la PCR d digital es divvidir una úniica reacciónn de PCR en miles
de reeacciones. Esta
E modificcación de la PCR a tiem
mpo real perrmite hacerr cuantificacciones
absollutas. Funciiona con sonndas TaqMaan por lo qu ue se puede
e diseñar unna sonda pa
ara un
alelo mutante y
y una sond da para el alelo norm a proporcióón de cada uno.
mal y ver la
Norm malmente, laa reacción es fragmentaada en alred dedor de 12000‐15000 PCRs. La té écnica

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permmite la cuan
ntificación de
d cantidadees iniciales muy peque eñas ya quee al subdividir la
muesstra la proporción de un alelo d de baja freecuencia en la muestrra general se ve
increementada en n algunas de las micro muestras. Dependiend
D o del númeero de reaccciones
uántas reacciones se tieene con 1, 2
vacíaas, se sabe cu 2..5 copias, y
ya que se siggue un mode elo de
distribución de Poisson. See puede obttener ratioss entre alelo
os raros y aalelos comú
ún. Se
puedde cuantificaar hasta un rratio del 0.011%.

La PCCR digital prresenta com mo ventajas p principales, la posibilid

dad de hacerr cuantificacciones
absollutas y el heecho de que muchos fac tores que in nfluyen en la
a PCR de tiem
mpo real no ormal,
nfluyen en laa PCR digital. Por ejemp
no in plo, si hay prresencia de inhibidoress en una mu uestra,
todass las submu uestras experimentarán el mismo p problema, sin influir en el ratio enttre los
productos que se detectan. Sus princip pales utilidad des es el genotipado enn sangre ma aterna
deDNNA fetal y ell genotipado
o de mutaciiones en tum
mores (CONNSULTAR DIIAPOSITIVA AS 68‐
72).

ECUENCIACIÓN DE ADN
4.‐SE N

La seecuenciación n del ADN ess una técnic a que surgió ó en el año 1

1977 y una dde las princiipales
herraamientas en n el diagnóstico genétiico. La may agnósticos sse llevan a cabo
yoría de dia
mediiante PCR y posterior se ecuenciación n del producto, bien por secuencia ción Sangerr, bien
utilizzando las últtimas tecnollogías de seccuenciaciónn.

La seecuenciación n enzimáticca diseñada por Sangerr es un procceso enzimáático similar a la

PCR, en el que únicamente
ú se utiliza u
un primer y
y en el que,, además dee los nucleó
ótidos
normmales, se inccluyen otross nucleótidoos modificad dos, denominados term minadores, que no
permmiten el avaance de la reacción de la polimeraasa. La reaccción de sínntesis de AD DN va
progrresando hassta que la po olimerasa uttiliza uno dee los nucleóttidos modifiicados. Al fin nal de
la reaacción lo qu
ue se obtiene e es una coleección de fraagmentos de todos los ttamaños posibles
en lo
os que el últiimo nucleóttido es un nu ucleótido teerminador. E Estos nucleóótidos termiinales
estánn marcado os de mane era que pu ueda detecttarse toda la variedadd de fragm mentos
obten nidos. Originnalmente se e marcaban por radioacctividad y se e separaban en electrofo oresis
por ggeles de accrilamida. En
E el métod do actual, cada
c nucleó ótido está mmarcado co on un
fluorróforo difereente y la separación dee fragmento os por tamaño se lleva a cabo med diante
electroforesis caapilar con un lector q que reconocce qué fluo oróforo es ccada uno de d los
nucleeótidos y quue va indican ndo la secueencia.

CONS
SULTAR DIA
APOSITIVA
AS 70, 71, 72
2, 73 y 74

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4.1.‐ Aplicacion
nes de la Seccuenciación
n: análisis d
de enferme
edades.

La seecuenciaciónn, junto con

n la PCR son
n las dos téécnicas máss usadas parra el diagnó
óstico
genéttico de enfermedade
e es, ademá s, normalm mente amb bas técnicaas son usadas
conju untamente: con la PCR a aumentamoos la cantidad del ADN m muestra paraa posteriorm mente
ser aanalizado mediante
m su secuenciacción y comp paración con n secuenciaas de refereencias
públiicas.

En eel diagnóstiico genético

o molecularr de enfermedades, la secuenciaación Sange er de
electroforesis caapilar se con mo la técnicaa de referenccia, dada su alta sensibilidad
nsidera com
pecificidad.
y esp

ADN es exttraído y se amplifica ppor PCR la zona

Para el análisis,, en primerr lugar, el A
genómica objeto o de estudiio. Normalm mente son amplificada as zonas exxónicas de genes
“sosppechosos” y/o
y zonas ad dyacentes aa los mismo os. Tras la secuenciacióón automátiica de
estass zonas, el aanálisis de la
as secuenciaas obtenidass se realiza comparanddo con secue encias
de reeferencia parra dichos ge enes publicaadas en basees de datos.

Se pueden obteener diferen ntes resultaados: secuencias con posiciones

p ssin cambios con
respeecto a la seecuencia de referencia o secuenciias donde son detectaddos cambios que
puedden ser en ho omocigosis (por ejempllo cambio de una G por una A en am mbos alelos) o en
heterrocigosis (po or ejemplo ccambio de CC por una T een sólo uno de los aleloss). Estos cam mbios
puedden dar lugaar a un polimorfismo del gen qu ue no afecta
a a la enferrmedad o a
a una
mutaación que prrovoque la a alteración e n la expresiión del gen ó en las zonnas de proce esado
del A
ARN mensajeero del gen, provocandoo transcritoss diferentes del gen.

Ejem
mplos:

‐ Polliquistosis Renal Autoosómica Do minante: enfermedad hereditariaa prevalente (su

incid
dencia es de 1/1000‐1/5 500) asociad da a mutaciones en el g gen PKD1 enn un 85%‐90 0% de
los caasos y en el gen PKD2 en un 10%‐1 15% de los ccasos. El genn PKD1 es unn gen grande, con
46 exxones y adeemás presen nta hasta 6 pseudogenees que no so on procesaddos pero con n una
simillitud a PKDD1 de hastta el 90%.. Por tanto
o, el análissis directo resulta costoso.
Normmalmente see hace una llong‐PCR ussando cebad dores únicam mente preseentes en el gen y
no enn los pseudo ogenes, y se
e utiliza esa misma PCRR como mold de para possteriores PCRs de
los exxones.

SULTAR DIA
CONS APOSITIVA
AS 79 a 86:

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4.2.‐ Limitacion
nes de la seccuenciación
n Sanger

‐ En eel caso de análisis de ge

enes grandees supone un
nos altos costes económ
micos, debid
do a la
gran cantidad dee exones (co on una reaccción de PCR para cada uno).

‐ Enfermedadess con heterrogeneidad genética: las enfermedades conn muchos genes g

asociiados preseentan una dificultad añadida porque p req
quieren de un diagnó óstico
diferencial, resu
ultando difíccil diferenciiar a qué geen está asocciada la enffermedad de una
famillia concreta..

‐Enfeermedades ccomplejas y multifactorriales: Muy ffrecuentes, diagnóstico genético to

odavía
no reesuelto.

‐Iden
ntificación d
de nuevos ge
enes (investtigación): En
nfermedades monogéniicas, multigé
énicas
y com
mplejas.

CONSULTAR DIAPO
OSITIVA 87::

5.‐ TECNOLOGÍA
AS DE NUEV
VA GENERA
ACIÓN. ULTRASECUENCIACIÓN

de hace unos pocos año

Desd os se han id
do desarrolllando nueva
as tecnologíías que perm
miten
hacerr una secueenciación masiva.
m Son las denomiinadas NGS,, del inglés New Generration
Sequeencing.

Existten multitudd de equipos, la mayoríía son usado os con finess de investiggación, otro
os aún
en deesarrollo y o
otros ya adaptables al laaboratorio d
de diagnósticco moleculaar.

Para la secuenciaación masiv

va hay tres p
procesos principales:

 La capturra del ADN

 La preparración de lass librerías
 La secuennciación

os resultado
En lo os de la secu
uenciación mmasiva ya noo se ven picos como en n la secuenciiación
Sanger, que simb media de las secuencias totales, sino
bolizan la m o que se obttiene inform
mación
de caada una de laas secuencia
as.

CONSULTAR

DIAPOSIITIVAS 89 A
A 90:

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ANEXO 1. Secuenciación masiva. Ampliación

Para la secuenciación masiva hay tres procesos principales:

 La captura del ADN

 La preparación de las librerías
 La secuenciación

La captura del ADN de interés ó selección de regiones de interés, puede ser mediante:

Método de captura mediante Sondas: sondas marcadas con biotina o cualquier otro
compuesto y diseñadas de forma específica hacia distintas regiones de interés del genoma
o que capturen todo el exoma. Se diseñan las sondas, se fragmenta el DNA, se hace una
reacción en la cual las sondas reaccionan con el DNA y se capturan estas sondas que han
reaccionado con el DNA. Muchas casas comerciales comercializan este tipo de sondas con
un sistema propio.

Captura mediante PCR: existen diferentes métodos, algunos parecidos a la PCR digital
donde se realizan multitud de PCRs diferentes en microgotas que posteriormente se
juntan y pasan a secuenciacion. Otros métodos están basados en microarrays con
diferentes muestras, donde se obtienen diferentes amplicones que posteriormente se
juntan para su secuenciación. También se realizan PCR multiplex que generan miles de
amplicones en un solo tubo de reacción.

La preparación de librerías depende del posterior equipo de ultrasecuenciación que se

vaya a utilizar, pero normalmente consta de dos pasos principales partiendo del DNA de
partida que puede o no estar fragmentado en función del método de captura. Lo primero
es por tanto reparar ese DNA porque presenta unos extremos cohesivos o colas (según
método de captura) de partida y añadirle unos adaptadores que son los que utilizará el
equipo para iniciar la secuenciación y por tanto dichos adaptadores son específicos del
posterior equipo de ultrasecuenciación. El otro aspecto principal en la preparación de
librerías, es que se pueden mezclar muchas muestras diferentes de DNA, marcadas de
forma diferencial mediante secuencias de referencias comerciales (BAR CODES, INDEXs), y
secuenciarlas a la vez, haciendo por tanto que la secuenciación sea más eficiente.

Tipos de tecnologías NGS

Existen 4 métodos principales copados en tres casas comerciales:

A) Pirosecuenciación: equipos de Roche (454 GS FLX/ Junior GS):

En la pirosecuenciación la ultrasecuenciación se basa en una PCR en emulsión donde el

DNA se une a unas partículas (bolas) y en una microgota se hace la reacción de PCR a
partir de una única hebra del DNA. Cada una de las bolas en cada microreactor debe haber
una única cadena de DNA que vamos a amplificar para obtener las copias suficientes para
después poder secuenciar. Hay una reacción química en la cual se produce luz mediante la
luciferasa cada vez que se incorpora un nucleótido. La luz la detecta el equipo y va
almacenando todas las señales que va recibiendo. El equipo introduce un nucleótido,
detecta si se incorpora, lava si no se ha incorporado y así sucesivamente. Es un proceso
lento, tarda alrededor de una semana, pero se obtienen millones de secuencias.

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B) Secuenciación por ligación (SOLID):

También se basa en una emulsión: en cada microreactor debe haber una única cadena de
DNA que vamos a amplificar para obtener las copias suficientes para después poder
secuenciar. Hay unos pequeños primers marcados con un fluoróforo que se van liberando
a las secuencias y se va mirando si hibridan o no con el DNA. si hibridan hay una sonda que
mediante una ligasa los une y continúa con el siguiente proceso. Cada una de las bases se
analiza dos veces. las secuencias empiezan por A y dependiendo de la base y del color
sabemos qué nucleótido se ha incorporado. El problema es que no se obtiene una
secuencia real sino que la secuencia se obtiene por comparación de varias reacciones, por
ello esta tecnología se está descatalogando. La ventaja es que cada base se analiza dos
veces con dos primers distintos.

C) Terminadores reversibles (HiSeq 2000 / MiSEq):

Hay librería pero no hay PCR en emulsión. Existe una superficie llena de adaptadores que
se unen a las hebras de ADN. Hay un PCR en un puente entre los distintos adaptadores del
array. Se van incorporando 4 nucleótidos marcados con fluoróforos distintos. Cada vez que
se incorpora un nucleótido a esa superficie o cluster se detecta su señal de fluorescencia.
Luego se hace el análisis bioinformático.

D) Detección de iones ( Ion Torrent):

No tiene un sistema de captación de imagen. Se detecta la liberación de iones. Cada vez

que se incorpora un nucleótido se libera un ion de forma que lo que se detecta es una
variación de potencial cada vez que se libera un ion. Si no se incorpora el nucleótido no
hay señal, si se incorpora un nucleótido hay señal y si se incorpora más de uno hay más
señal. Es un sistema parecido a la pirosecuenciación pero más automático.

Retos de la ultrasecuenciación

La ultrasecuenciación es una metodología muy joven y en evolución y aunque presenta un

gran potencial en investigación, todavía tiene grandes limitaciones en el análisis de datos
ya que se obtienen millones de datos que resultan costosos de procesar.

En cuanto a las aplicaciones en Salud Humana, la indicación clínica debe justificar el uso de
esta tecnología. Otro punto crítico es la información al paciente sobre resultados que
pueden encontrarse sin ser solicitados por el paciente.

También la Validación clínica todavía requiere de una calidad alta, una sensibilidad y
especificidad similares a la secuenciación Sanger y unos costes justificables.

Todavía hoy por hoy los resultados deben validarse con la secuenciación Sanger que es la
técnica por referencia.

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