1

S i l v i a L e t i c i a S a n c h e z Prado.
T e l é f o n o : 5-32-26-38.
M a t r í c u l a : 82233601.

CLAVE: 23. 3. 128. 8 7

JCarrera: I n g e n i e r í a Bioquímica I n d u s t r i a l .
Trimestre l e c t i v o : 88-0
Horas semana: 20 - 2 5 h o r a s .
.
L u g a r : L a b o r a t o r i o de M i c r o b i o l o g í a , e d i f i c i o S - 1 5 7 .
U n i v e r s i d a d Autdnoma Metropolitana-Iztapalapa.
F e c h a de i n i c i o : D i c i e m b r e 1' de 1 9 8 7 .
J F e c h a de t e r m i n a c i b n : J u n i o 1' de 19%
/T u t o r i n t e r n o : M. en C. J a v i e r B a r r i o s G o n z á l e z .
Profesor asociado
Depto. B i o t e c n o l o g l a .
C .
4itulo: P r o d u c c i ó n de P e n i c i l i n a en F e r m e n t a c i ó n L í q u i d a .

S i l v i a L e t i c i a S a n c h e z Prado.

- . . ~ > ,
u
. ~ ~.
-. ..
./*<,l.
E_ . -kv..
8. e n ' C . J a v i e r B a r r i o s Gonzalez.
I,
*. INDICE
...
1.- TITULO DEL INFORME FINAL

.. 2.- INTRODUCCION
-. . 2.1. INTRODUCCION GENERAL
..~ 2.2. ESTRUCTURA
F .

._ 2.3.

2.4.
BIOSINTESIS

MECANISMO DE REGULACION
.,. .
A ) REGULACION POR LA FUENTE DE CARBONO
? "
B ) REGULACION POR NITROGEN0

-. 2.5. FERMENTACION LIQUIDA. FERMENTACION BATCH

.,. "
3.- OBJETIVOS

4.- MATERIAL, METOOOS Y TECNICA DE FERMENTACION

I..

4.1. METODO DE ESPORULAC ION

L.

... 4.2. METODO DE SUSPENSION DE ESPORAS

c. 4.3. METODO DE BIOENSAYO PARA PRODUCCION DE PENICILINA

-- 4.3.1. PREPARACION DE CURVA ESTANDAR
._ 4.3.2. MEDIO DE CRECIMIENTO DE LA CEPA SARCINA LUTEA (NRRLB - 1018)
.,. 4.3.3. INOCULACION DE LA CEPA
-- 4.3.4. CRECIMIENTO DE SARCINA DEL BIOENSAYO
.~
. 4.3.5. METODO DE LA CURVA ESTANDAR DEL BIOENSAYO I

. ,.
4.3.6.
4.3.7.
METODO DE PREPARACION DE BUFFER DE FOSFATOS
OETERMINACION DE LA CURVA ESTANDAR BIOENSAYO
" <

4.4. METODO DE DETERMINACION DE BIOMASA

c-

4.5. METODO DE CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES

.. ..
5.- RESULTADOS OBTENIDOS O ACTIVIDADES DESARROLLADAS
I

- 6.- DISCUSION Y CONCLUSIONES

L
7.- LITERATURA CITADA
_ .
b.

i...

c
 :
I

PRODUCCION DE PENICILINA

EN F€RRMENTACION LIQUIDA.

L.

-.
C.

* .

r-

L.

r-

r-

L.

..-
111. INTRODUCCION.

111.1. Desde el siglo pasado es conocida la existencia de compuestos de origen

microbiano, capaces de inhibir el crecimiento de otros microorganismos.
No fue sino hasta el aRo de 1929 en que Alexander Fleming descubrió l a actividad
terapeútica de l a penicilina producida por el hongo Penicillium notatum, cuando se --
marcó el inicio de una nueva era en la medicina clínica para el control de enfermeda-
des infecciosas, y para l a industria de las fermentaciones por su producción en gran
escala.
Al igual que otros metabolitos secundarios, la penicilina no presenta ninguna --
función aparente en los microorganismos que l a producen. Posee propiedades bacterici
-
das sobre gérmenes GRAM positivo, aunque en cierto grado también actúa sobre GRAM ne-
-
gativos. Dicha acción sobre estos microorganismos se deriva de su capacidad para blo
quear la unión entre los aminoácidos D-alanina y L-alanina del péptido glucano de l a
pared celular, l o que provoca una estructura sensible a los cambios osmóticos.
Diversos microorganismos presentan una resistencia natural a la acción de l a pe-
nicilina; dicha resistencia resulta de la síntesis de beta-lactamasas, enzima que hi-
droliza el anillo beta-lactámico. ( 3 ).
111.2. Hasta 1945 se determinó l a estructura química de l a penicilina, demos--
trando por estudios cristalográficos, que esta compuesto de dos anillos, uno tiazoli-
dínico y otro beta-lactámico, que constituyen un núcleo central denominado ácido o --
amino-penicilánico (6-APA). Posteriormente, en el mismo aiio Abraham en Inglaterra y
Adriaens en Bélgica, esclarecieron l a secuencia de síntesis de penicilina en Penici--
Ilium chrysogenum y demostraron que l a condensación de L-cisteína y D-valina da lugar
a los anillos mencionados. ( 11 ):

ac. fenilacético I L-ci

steína I L-valina

-.
I o
Estructura de l a Penicilina (penicilina G )
 Ac. 6 amino-penicilánico (6-APA)

111.3. Biosíntesis. La penicilina es sintetizada por hongos por medio del áci-
do alfa-amino-adípico, como intermediario en l a biosíntesis de lisina, cisteina y vali
-
na son condensados a el tripéptido gama- al fa-aminoadipil) cisteinilvalina.
Subsecuentemente, l a lactama y el anillo tiazolidina se cierran produciendo Isope
-
nicilina N.

ac. alfa-amino-adípico cisteína valina

/ 5~ ,'U3
d-AAh- h\t\-C - crl, CN-C%
I /
- dU-C -
al fa-aminoadipil-cisteinil-valina
C-oN
50

Isopenicilina N MRRb ATP

.
111.4. Mecanismos de Regulación.

111.4.1. Regulación pro la fuente de Carbono. La formación de penicilina en -

el hongo Penicillium crysogenum es reprimida por l a glucosa. El porcentaje de re
-
presión depende de l a concentración de este carbohidrato en el medio de cultivo.
Análogos no metabolizables de glucosa carecen de este efecto. Las bases moleculg
res de dicho efecto aún no se han establecido, pero se ha reportado que l a repre-
sión no es revertida por AMP cíclico. ( 'I ).
Otras fuentes de carbono como sacarosa, fructuosa y galactosa afectan nega-
tivamente l a formación del antibiótico en un grado similar al ejercido por glucosa.
Polímeros de glucosa, tales como almidón, inhiben parcialmente la síntesis
de metabol itos secundarios. ( 9 ).
111.4.2. Regulación por l a fuente de Nitrógeno. La formación del antibiótico,
la intervencidn de los aminoácidos L-alfa-amino adípico, L-cisteína y L-valina y
por tanto su formación como regulación pueden influenciar en l a formación de ami-
noácidos precursores.
Hace algunos años, Hunter y Segel (1980) reportaron que el micelio de Penici
11ium crysogenum crecido en diferentes condiciones experimentales, acumulaba ele-
vadas concentraciones de L-glutamato. Y se observó que la poxa se incrementa al
final de l a trotafase. ( i ).
"La concentration de glutamato sobrepasa a l a del resto de aminoácidos y su
acumulación procede l a síntesis de penicilina". ( i ).
Recientemente se ha reportado que el glutamato estimula l a síntesis del an-
tibiótico en el micelio del hongo que ha sido cosechado durante l a Idiofase y re-
suspendido en un medio mínimo; y no provoca el incremento de aminoácidos disponi-
bles, también se uti1izaron algunos análogos.
Las bases bioquímicas de esta acción han sido establecidas al demostrar que
el glutamato induce l a (L-alfa-aminoadipil) L-cisteina sintetasa, primera enzima
de l a vía que sintetiza l a penicilina.
El incremento de l a concentración intracelular del glutamato, al final del
P. crysogenum, induce l a sintesis de penicilina e in--
crecimiento logarítmico de -
crementa l a poza de glutamina en la Idiofase, a la que a su vez podría donar los
grupos alfa-amino de los aminoácidos precursores de l a molécula de penicilina y -
de esta forma iniciar su síntesis. ( 2 ).
Otra fuente de nitrógeno como el Amonio, también influye en la formación de
penicilina. Dicho ión afecta negativamente la formación del metabolito secundario
Y su acción es proporcional a la concentración que guarda en el medio de cultivo.
La penicilina se produce en condiciones de fermentación sumergida, en medio de --
cultivo generalmente compuesto por sales minerales, un precursos de la cadena la-
teral -ácido fenilacético - , una fuente de nitrógeno (licor de maíz, el cual es-
timula la formación del antibiótico) y en presencia de concentraciones limitantes
de glucosa, a valores de pH que oscilan entre 5.5 y 6.0. Bajo estas condiciones, I
Penicillium crysogenum puede producir cantidad de antibióticos que pueden variar I
desde 2 unidades/mililitro hasta más de 50,000 dependiendo de la cepa que se uti-
lice. ( 2 ).

I I I . 5. Fermentación Líquida.
111.5. Fermentación Líquida. Fermentación Batch. En los primeros inicios -
de producción de penicilina en fermentación batch, se le reconoce a Coghill (1944) I

durante la étapa de la Segunda Guerra Mundial. En 1954, en la historia de la pro - !

ducción de penicilina es reconocida por Silvester y Coghill. I

La primera obtención de penicilina (Perlman, 1974) fue del orden de 2 unida-

~

des por mililitro.

E l proceso sumergido de un medio con lactosa y licor de maíz fue desarrolla -
do por Silvester y Coghill, (1954), Hockenhull, (1959), (1963); Perlman, (1970).
La lactosa fue agregada para la producción de penicilina como fuente de carbono -
improvizado (Moyer y Coghill, 1946) la lactosa es un carbohidrato hidrolizado en-
zimaticamente. ( 3 ).
Si existe una acumulación de la hexosa provista en la hidrólisis enzimática
(Matelova, 1976) el cual puede causar una inhibición en la síntesis de penicilina.
En los trabajos realizados destacó mucho el ácido fenilacético como precur-
sor para la producción de penicilina (Smith y Bide, 1948; y Mead y Stack, 1948) -
resultante en la síntesis natural de penicilina G . ( 3 ).
Cuando el ácido fenilacético o un derivado, es añadido en un medio (0.2-0.
8 kg. por metro cúbico), dependiente del pH, la producción de penicilina G se in-
I
crementa grandemente y en otras penicilinas decrecen (Moyer y Coghill, 1947).
Después se propuso que el carbono del licor de maíz y la glucosa son meta-
l izados rápidamente, desarrol landose el mice1 i o ocurre la fermentación, comenzan-
i
do a utilizar la lactosa (Silvester y Coghill, 1954). Los compuestos de nitróge- !
no en el licor de maíz son desaminados y el amoniaco es formado.
Parte de la Penicilina G, hoy en día, es usada en el área farmaceútica, pe-
ro el flujo de trabajo de la producci6n de penicilina G es para la conservación -
de otros antibióticos beta-lactama. ( 8 ). j
j
i
V. OBJETIVOS

1.- Búsqueda, evaluación y selección de un medio de cultivo para l a produc- I!

ción ,de penicilina.

2.- Búsqueda, evaluación y selección de una cepa de Penicillium crysogenum.

3.- Búsqueda, evaluación y selección de un método de conservación y manejo

de cepa.
MATERIAL Y METODOS Y TECNICAS O ACTIVIDADES A DESARROLLAR.

Para el método de Esporulacibn:

Ma ter i al Reacti vos

3 tubos de ensaye Papa Dextrosa Agar (PDA)
1 probeta Agua destilada
1 asa e s t é r i l
1 o l l a express
3 matraces Erlenmeyer Incubadora a 29" C.

Método
Preparar 3 tubos de ensaye con 15 ml de Papa Dextrosa Agar (PDA) cada tubo, tapo-
narlo con tapón gasa-algodón.
E s t e r i l i z a r a 15 lbs de presión durante 15 min.
Dejar e n f r i a r a temperatura ambiente en posición inclinada y s o l i d i f i c a r , procu--
rando que el PDA quede inclinado sin tocar el tapón.
Inocular con Penicillium chrysogenum de l a cepa original en condiciones e s t é r i l e s
( s i s e tienen 1 o 2 tubos inoculados de p. chrysogenum del cepario solo s e traba-
j a r á con un solo tubo). Se inoculan l o s tubos con PDA inclinados y solidificados
con una asa e s t é r i l en una área de trabajo perfectamente fenolizada.
Incubar a 29°C durante 5 o 6 días.
Antes de sacar l o s tubos de l a incubadora, se preparan 3 matraces erlenmeyer de -
250 ml con 30 ml de PDA cada matraz.
E s t e r i l i z a r a 15 l b s de presión por 15 min.
Dejar e n f r i a r y s o l i d i f i c a r .
Inocular con P. chrvsoqenu m del tubo inclinado-incubado con una asa estéril a los
matraces ya preparados con 30 ml de PDA.
Incubar de 5 a 6 días a una temperatura de 28°C (hasta obtener un buen crecimien-
t o de esporas).

!
 Método de suspensión de Esporas.

Material Reactivos

2 matraces E r l enmeyer Tween 20

10 cuerpos .de ebullición o una Agua destilada
barra magnética
1 pipeta de 1 m l e s t é r i l
1 pipeta de 10 m l
1 pipeta Pasteur
1 probeta de 10 m l
1microscópio
1cámara de Newbawer

I
,%todo

E s t e r i l i z a r 2 matraces Erlenmeyer de 250 m l que contenga cada matraz, 50 m l de --

agua destilada, 10 cuerpos de ebullición o mosca magnética, 3 gotas de Tween 20 a
15 l b s de presión durante 15 min.
Dejar enfriar los matraces y pasar e l contenido de uno de ellos a l matraz que con
-
tiene l a s esporas crecidas en PDA (Método I ) .
Agitar para desprender l a s esporas (manual en el caso de los cuerpos de ebullición
o en una p a r r i l l a en e l caso de l a mosca magnética) s i n romper e l PDA, quedando -
el matraz que contenía e l agua-tween vacío.
Pasar a l matraz vacío el agua suspendida con esporas.
Se repite l a misma operación con e l o t r o matraz de esporas crecidas en PDA con l o s

. 50 m l agua-tween-barra magnética del o t r o matraz.

Los 2 matraces con l a suspensión de esporas-agua se mezclan homogeneamente obte--
niendo así 100 m l de suspensión de esporas.
Tomamos una alícuota de 1m l de esta suspensión de esporas con l a pipeta de 1m l
previamente e s t é r i l y se pasa a l a probeta de 10 m l aforando así a un volumen de
10 m l con agua destilada (dilución 1:lO)
Agitar perfectamente esta dilución.
Tomar de esta solución una pequeña cantidad con una pipeta Pasteur y l l e n a r l a --
Cámara de New-bawer.
Cuantificar e l número de esporas que hay en l o s 2 cuadros de l a cámara l e e r 5 d i -
visiones de cada cuadro y sacar el promedio, r e a l i z a r esta operación por l o menos
4 a 5 veces para tener una lectura más confiable.
-
Para la cuantificación de esporas, aplicar la siguiente f6rmula:

r Promedio de los 5 cuadros X 25 X dilución X 1 X lo4 # de esporas en

la susp/ml I

?"

Sacar una regla de 3 para saber cuanto debemos agregar para que el inoculo
. lleve i x io6 esporas.

. Asi determinaremos cuantos ml llevaremos para inocular el medio de crecimiento.

.. ,
I

!
 Método. Bioensayo para Producción de Penicilina. (3)
Curva Estandar.

Material
10 cajas Petri
2 matraces Erlenmeyer
15 tubos de ensaye con tapón
gasa-al godón, estéril es
5 pipetas estériles de 5 ml
5 pipetas estériles de 1 ml
5 pipetas estériles de 10 ml
1 microjeringa
25 discos de papel para bioensayo
de 12.2 mn de diámetro (estériles)
Schleider & Schull.
1 pinza de disección estéril
1 balanza analítica
10 matraces aforados de 5 y 10 ml
1 olla express y mecheros
1 probeta de 30 ml

Reactivos
Medio de Caldo Nutritivo
Penicilina G Sódica (Likeside) (1 X lO'U/ml)
Agar Nutritivo
Fenol al 20%
Solución buffer de fosfatos
-
Cepa: Sarcina lútea NRRLB 1018

Método
- Medio de Crecimiento de la Cepa Sarcina -lútea (NRRLB 1018):
Disolver 239 de agar nutritivo en 1000 ml de agua destilada -- preparar solamente
30 ml del medio.
Disolverlo muy bien, si es necesario calentar brevemente por espacio de 1 min., y
vaciar un volumen de 10 m l a cada tubo de ensaye (3) previamente etiquetados y tg
parlo con tapón gasa-algodon.
Esterilizar 15 lbs de presión por 15 min. en la olla express.
Sacar y dejar solidificar en posición inclinada.
Inoculación: Sembrar los medios.
Fenolizar el área de trabajo y prender 2 mecheros para empezar a inocular.
Con el asa estéril sembrar Sarcina -lútea a los tubos inclinados en espiral o es--
tría.
Tapar con .su tapón (algodón-gasa) y etiquetarlos.
Incubar a 37°C durante 3-5 días (color amarillento).
Medio Caldo Nutritivo: Crecimiento de Sarcina lYtea para Bioensayo.
Preparar 30 ml de caldo nutritivo en un matraz erlenmeyer de 250 ml.
Tapar con tapón (algodón-gasa) y un gorrito de papel.
Esterilizar a 15 lbs de presión - 15 min.
Dejar enfriar a temperatura ambiente e inocular con un tubo de Sarcina -lútea con
una asa estéril (la sarcina del paso anterior).
Incubar a 37°C en agitación de 200 rpm.

Método de la Curva Estandar del Bioensayo.

Curva Estandar.
Pesar el contenido de un frasco de 106U/ml de Penicilina G Sódica, hacer la rela-
ción siguiente:
Si todo el frasco pesa 0.61979 y contiene 106U/ml; pesar 0.15499 que contendrán -
250,00OU/ml.
Los 0.15499 se disuelven en lOOml de buffer de fosfatos y se tiene una concentra-
ción de 2500 U/ml .
A 1 ml de esta solución llevarlo a 5 ml de buffer de fosfatos (dilución 1:5) para
obtener la Solución Madre con concentración de 500U/ml.
Realizar la siguiente dilución: los microlitos de la solución madre adicionarlos
en los matraces aforados de 10 ml con una microjeringa y aforar a 10 ml con solu-
ción buffer de fosfatos:
CIVl = c2v2 Si C1 = 500U/ml
V1 = 10 ml X lU/ml
= 20 microlitros + 1 U/ml
500U/ml

Método de Preparación del Buffer de fosfatos.

0.2 M sol. de fosfato de sodio monobdsico.
31.29 NaH2P04.2H20 en 1000 ml P.M. 137.99
disolver 27.59 en 1000 ml tetrahidratado. Preparar 200 ml.
.. 0.2 ml sol. de fosfato de sodio dibásico.
28.399 NaHP04
_- 71.699 NaHP04.12 H20 en 1000 nil P.M. 358.15
-- disolver 71.699 en 1000 dodecahidrato. Preparar ZOO ml.

r-
\Y.:,*<,/loom\

Mezclar las 2 soluciones con agitación a 25°C.

Ajustar el pH a 6.9

- Determinaci6n de la Curva Estandar

Para realizar la curva estandar: Se preparan las siguientes diluciones de la solu-
ción madre con buffer de fosfatos:
U/ml micro1 i tros de la Volumen del buffer
solución madre para el aforo (mi)
1 20 9.98
2 40 9.96
4 80 9.92
6 120 9.88
8 160 9.84
10 200 9.80
l
es decir, de 1 U/ml son 20 microlitros de soluci6n madre aforados a lOml de buffer
de fosfatos.
Se agitaran muy bien estas soluciones y de cada una de ellas se tomarán siempre 20
microlitros.
Una vez hechas las diluciones, esterilizar 10 cajas Petri, pipetas de 1 y 10 ml. --
los discos de papel filtro, probeta de 30 ml (o 50 mi), las pinzas, a 15 lbs de prg
sión por 15 min.
Preparar 75 ml de agar nutritivo, calentar durante 1 min. y agregarlos en tubos de
ensaye, cada uno con 15 ml de agar, (se pueden medir l o s 15 ml con la pipeta de --
10 ml o con la probeta de 30 ml.
Tapar con tapones gasa-algodón.
Esterilizar 15 lbs de presión por 15 min.
 Una vez esterilizado todo el material y fenolizado el área de trabajo empezaremos -
el bioensayo:

- Bioensayo
El agar nutritivo contenido en los tubos de ensaye (cada tubo con 15 mi) a una tempe
-
I
ratura de 38-40°C se agregan a las cajas Petri.
Cada caja Petri con 15 ml de agar nutritivo se inoculará con 0.5 ml de la Sarcina --
del paso .
Agitar homogéneamente este medio agar-sarcina y dejar solidificar todas las cajas --
Petri.
Una vez solidificadas las cajas se colocaran 2 discos de papel filtro con unas pinzas
de disección estériles a una distancia adecuada.
Rotular cada una de las cajas por concentraciones de 0,1,2,4,6.8 y 10 U/ml. con su -
duplicado.
Se inyectará a cada disco con 20 microlitros con una microjeringa de las diferentes
I
concentraciones, con su duplicado.
Dejar que los discos absorban todo el antibiótico.
Refrigerar las cajas en posición normal durante 1 hora.
Sacar las cajas refrigeradas e incubarlas durante 24 horas a 35-37OC.
Después de 24 hrs. medir el halo de inhibition, 3 veces cada halo.
Graficar diámetro vs. logaritmo de la concentración.

Método de Determinación de Biomasa.

Para determinar la biomasa en la producción de penicilina se llevaron los siguientes I
pasos :
1 ) Se pone a peso Cte. papel filtro watman. Tomando el peso del papel.
I
\

2) Se filtra la biomasa en un embudo con una trampa de vacío.

I

3) El filtrado, líquido de color amarillo intenso, de olor característico a penici-

I
lina (humedad) se guarda en un vaso de precipitado o frasco pequeño para análisis
de cuantificación de penicilina (Bioensayo), pH y determinación de azúcares re--
ductores.
I
4) La biomasa recuperada en el papel filtro se coloca en una estufa a 60°C durante i
24 hrs.
I
5) Sin humedad la biomasa, se pesa
w
y se determina la cantidad de biomasa:
Peso del papel c/muestra - Peso del papel s/muestra = Biomasa
~

6) Se hace la gráfica de Biomasa vs. tiempo y se discute.

 DE D F T F R UACION DE AZUCARES REDUCTORES.

Método del uso del reactivo del ácido d i n i t r o s a l i c í l i c o para l a determinación de -

Azúcares Reductores ( 9 ).
Reactivo: 1% ácido dinitrogal i c í l ico.
0.2% fenol.
0.05% s u l f i t o de sofio.
1.0% hidróxido de sodio.

Método modificado por e l departamento de Biotecnología UAM-I.

De l a muestra de producción de penicilina (líquido amarillo) se ma una alícuota -
de 1.0 ml y s e lleva a un tubo de ensaye, se agrega 1.0 ml del reactivo, se tapa y
s e a g i t a en vortex.
Se l l e v a a baño María a ebullición durante 5 m i n . , (cambia de c o l o r de anaranjado a
café-naranja). Se saca del baño y se pone en baño de hielo. Se agrega 8.0 ml de -
agua destilada y se agita.
Se l e e al espectrofotocolorímetro a una longitud de onda de 575 nm.
De l a misma forma se r e a l i z a una curva estandar con glucosa.
...
r DESARROLLAR UNA FERMENTACION LIQUIDA PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA
. Realizando l a técnica para el método de esporulaci6n con la cepa -
P. chrysogemim --
NRRL 1951 - Biomédicas, así como el método de la suspensi6n de esporas obtenemos l a
siguien te cuantificaci6n de esporas :

3 b t 65+"1t32+\%= iV7/5- 39.7

*..

. ..

.
..
.
.

-. El medio de crecimiento se inoculará con 0.5076 ml de suspensión de esporas.

Se preparará solamente 200 ml del medio de crecimiento

Medio de crecimiento
.. G1ucosa 20.0 gr/lt.
. Sacarosa 6.84 "

L-.
(NH4)2SOq 15.0 'I

KH2P04 9.088 " El pH del medio de crecimiento

r

Caco3 3.0 debe ajustarse a 5.0

-..
ZnS04 0.02 "
-.,_
CUSO$ O. 005 "
-.
M W 4 0.02 "

..~.
L.. Repartir el medio de crecimiento a matraces de 250 ml, cada uno con 50 ml.
... Esterilizar a 15 libras de presión, 15 min.
Enfriar a temperatura ambiente.
En condiciones estériles se inoculará cada matraz con 0.5076 ml de l a suspensión de
esporas.
..
Incubar cada matraz a 26O.C durante 60-66hrs. para tener un buen crecimiento de mice
-
e-"
lie,en agitación a 250 rpm.
Elegir los medios que tenga mejor crecimiento, mezclarlos en condiciones estériles
*-. para el inoculo al medio de producción.
....
..
-..
r.
 Medio de Producción

Licor de maíz 30.0 gr/lt.

Lactosa 30.0 I'

G1ucosa . 5.0 "

Caco3 3.0 "

El pH del medio de producción

Manteca 1.87 "
debe ajustarse a 7.0
NaN03 3.0 "

Zn SO4 O. 044 "

Mg so4 0.250 "

Feni1acetamida 0.05 "

(precursor)

Preparar 600 ml del medio.

Distribuir el medio de producción a matraces de 250 ml, cada matraz con 50 ml.
Tapar con tapón algodón-gasa.
Esterilizar 15 libras de presión durante 15 min.
Enfriar a temperatura ambiente.
Etiquetar cada matraz con los tiempos a determinar.
En condiciones estériles inocular cada matraz con 10 ml. del medio de crecimiento -
ya seleccionados y mezclados. (mice1io).

Nota: Se depe preparar el medio de producción antes de las 66 hrs. de crecimiento - 1

de micelio, cumplidas las 66 hrs., inocular el medio de produccibn.
I
Incubar a 26°C con agitación de 250 rpm durante los tiempos a determinar, tomando - I
tiempos cada 24 hrs. J
Determinar análisis de pH, producción de biomasa. producción de penicilina y consumo
de azucares reductores.
 F E RMENTACION TlPlCA

*/-

Ir I

I .e

T\empo
-
hwa5). ~

!
i
i
i
 sis de Resultados.
Anali

PH El medio de producción desde su inicio tuvo un comportamiento bueno en relacián

al pH del medio, no excediendo el rango de l a fermentación (5.0
determina una buena producción.
- 8.0) por l o que -
I
I
I
I
Biomasa.
t

La producción de biomasa aumenta cada 24 hrs. teniendo una alta producción de biomc
sa a las 72 hrs., posteriormente se observa una lisis de l a biomasa. !

.,, .
Prod. de Penicilina. j
-_..
j
r
.
.
Se obtuvo una prod. de penicilina máxima a las 48 hrs. y 72 hrs. observándose una - !
--
recaída a las 96 y 120 hrs., esto se ve reflejado en l a prod. de biomasa y consumo I
de azucares.
L

-..
~,..
Consumo de Azucares Reductores.
I

.. Se consume poco a poco los azucares, observándose un descenso hasta las 96 hrs., con
I.
sumiéndose totalmente a las 120 hrs.
... Dado a que se esperaba este comportamiento de l a cepa p. chrysogenum NRRL 1951 --
Biomédicas, se realizaron otras fermentaciones liquidas, que nos llevaran a una coz

i
-.

.... paración de producción de penicilina con otros medios y con otras fuentes de carbono.

-.
I
v
.
-
I

...
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... I
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...
1
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.
..
...

c
COMPARACION DE MEDIOS DE PRODUCCION SELECCIONADOS Y ELECCION DEL MAS CONVENIENTE --
DE ACUERDO A SUS CARACTERISTICAS PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA

Medios que se desean investigar: Esporulacibn, Crecimiento y Produccibn.

Medios de Esporulacibn:
Este medio puede ser el de Papa-Dextrosa - Agar. Preparar 30 ml en un matraz Erlen-
meyer de 2501111.

Medio de Producción:

1. Casida; L.E. Jackson 1958.

% %
Sdlidos de Licor 3.5 a 4 KH2p04 0.4
Lactosa 1.0 Aceite 0.25
G1ucosa 1.0 Precursor de
Caco3 1.0 Penicilina ----
Con alta aereacibn y buenas condiciones de agitacibn se puede aumentar l a cantidad
de lactosa hasta 4 a 5%. pH 5.5 y 6.0

2. Casida; L.E. Coghill 1954.

gr/lt. gr/lt.
Sólidos Licor de
maíz 30.0 MgS04 0.25
Lactosa 30.O ZnS04 O. 044
G1ucosa 5.0 Caco3 3.Q
NaN03 3.0 Feni1acetamida 3.05
(precursor)
La lactosa se degrada muy lentamente produciendo glucosa + galactosa; favorece l a -
producción de penicilina.

3. Sin bibliografía Traders Guide.

gr. gr.
Caldo de maíz 16.0 Lactosa 16.0
Farmamedia 8.0 Caco3 4.0
KH2P04 2.4 (NH4)2S04.7 H20) 4.0
MgS04.7 H20 O. 16 Aceite de soya 1.6
__ 3. Hockknhull
.. Medio Sintético
Medio C.S.L. % %
".
Lactosa 3-4 3.0
... Glucosa 0-0.5 1 .o
,-. Al mi d6n - 1.5
A. Acético 0.05 0.25
.... A.Láctico 0.5 Cítrico 1.0
.... Feni 1 eti lamina - A. F. A. -
Aminoácidos - ( "4 $04 -
.. - et i 1 ami na 0.3
"4
,.. S61 idos Totales 8-9 8.5
... Nt O. 15-0.20 0.2
.,

L
Temperatura a 25°C. E l ajuste a pH con buffer de ca, Mg, NH4 (PO4) a 7.0. A un
!
I
I
,, . pH alto en presencia de Zn O Cu, la penicilina se hidroliza a ácido peniciloico. -
.x Agitación de 200-250 rpm.
~..

i.. Medio de Crecimiento.

..
.. Pueden ser los mismos medios que para producción con la diferencia de NO adicionar
... lactosa como fuente de Carbono sino glucosa; los precursores sólo se adicionarán -
al medio de producción y NO al de crecimiento.

.-. Para realizar la fermentación líquida de comparación de medios de producción lleva-

I-.
mos a cabo el método de Esporulación y el método de suspensión de esporas. Tomamos
L . una alícuota de la suspensión ( 1 mi) con una pipeta de 1 ml estéril y se pasa a la
-. probeta de 10 ml, después se afora a un volumen de 10 ml con agua destilada, se agJ
. - ta y tomamos una pequeña cantidad para llenar la cámara de New-bawer y cuantifica--
..
mos : 3 b t % t W + i > + b O = ZO3/5: i 0 . G !
I

,. .
( \ ~ ~ ( s ) ( \ % I oi.015
'+)= esp /WI.
...
I . o \x\o'+~
~ e5y - i mi

.~. 1% io6& ese- % = 0.00485-1

. 0.00905m\ [SO-\ ¿e wedto) = O.*iCixb ml
-- Ya realizada la cuantificación se prepara el medio de crecimiento (400 ml), se este
-
i

r i l i z a a 15 l i b r a s de p r e s i ó n durante 15 min., se e n f r i a a temperatura ambiente.

i
En condiciones e s t é r i l e s se i n o c u l a cada matraz con 0.4926 m l . de l a suspensión -
7
de esporas, se incuba durante 60-66 hrs. a 26°C - 250 rpm.
Se e l i g e l o s medios con mayor c r e c i m i e n t o de m i c e l i o , se mezclan y se toma una a l i -
cuota de 10 nil para cada matraz como i n ó c u l o a l medio de producción. (Preparado - iI
anteriormente antes de l a s 60-66 hrs.). Etiquetados.
L
Ya inoculado cada matraz se procede a incubar a 26"C, 250 rpm.
1
I
r
Se toma un matraz de cada medio de producción cada 24 h r s . para r e a l i z a r a n á l i s i s -
- de pH, prod. de biornasa, prod. de p e n i c i l i n a y consumo de azucares.
!
I
I
r
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I

i
i

I
COMPARACION DEL MEDIO DE PRODUCCION SELECCIONADOS Y ELECCION DEL MAS CONVENIENTE.

De acuerdo a la actividad desarrollada de comparar el medio de producción seleccig

nados (Hochenhull, Jackson, Coghill y un medio Modificado), se llego a los siguien-
t e s cuadros de resultados:

Hockenholl

Jackson
 Coghill

Modificado
 MEDIO DE PRODUCCION
HOCKENHULL

.t

3.
I
2.

I .

I
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.... . MEDIO DE PRODUCCION
JACKSON

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, .. MEDIO DE PRODUCCION
COGHILL
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. MEDIO DE PRODUCCION
MODIFICADO
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H o c kenhu I I Jackson

C og hiI I
M o d i f i cado
 B ¡ o m a s a ( mg i m l )
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2 .
Discusi6n de Resultados.

Analizando los resultados, se comparó cada uno de los parámetros de cada medio:

pH. El pH en. los 4 medios se mantuvo entre 5 y 8, sin embargo, el comportamiento -

de este varía de medio a medio; Jackson se mantuvo a un pH de 6 no ideal para la --
producción de penicilina; Coghill se mantiene a 5, sube hasta 6.8 a las 48 hrs., --
desciende a las 72 hrs., para llegar hasta 8 a las 96 hrs., este comportamiento en
esta última étapa también lleva consigo destrucción de biomasa y alta producción de
penicilina; Hockenholl al igual que Jackson mantiene el pH entre 5 y 6 el cual es -
muy bajo y puede ser la causa de l a nula producción de penicilina.

Azucares. En 3 de los medios el azúcar se consume casi totalmente a las 48 hrs., -

como son Jackson, Coghill y el medio Modificado. En Hockenholl l a asimilación fue
más lenta se agotó a las 72 hrs., este medio tiene poco licor de maíz y mucha lacto
-
sa, sobre todo comparando Coghill con Modificado, se podrá decir que probablemente
el licor de maíz contribuya con azucares de fácil asimilación, pues en el medio doc
de no hay glucosa también se nota su consumo a las 48 hrs. interpolando pendientes.

Biomasa. Por ser l a penicilina un metabolito secundario, l a bilmasa deberá permang

cer constante. En Hockenholl y Jackson la biomasa se incremento hasta las 72 hrs.
hasta casi duplicarse y triplicarse respectivamente en los 2 medios, debe notarse -
que en los 2 medios hasta las 72 hrs. no hay producción de penicilina, posiblemente
el medio estaba todavía en crecimiento. En el medio Modificado el micelio creció -
hasta las 24 hrs. y después se mantuvo más o menos constante.

Penicilina. Hockenholl no proudce penicilina, observandose que el micelio sigue --

creciendo, por lo que no hay penicilina activa. En Jackson no hay producción hasta
las 72 hrs., pero es mínima y aparentemente hay destrucción de biomasa y empieza la
producción de penicilina, muy poco %. En Coghill fue el medio que produce más can-
tidad de penicilina, en este medio l a producción de penicilina empezó a las 24 hrs.
y siguió aumentando hasta las 96 hrs. en donde se alcanzó 7 U/ml.

El medio que se eligió para l a producción que por contener los nutrientes mínimos -
necesarios y el ser un medio sencillo fue el medio de Coghill (Coghill 1954).
La cepa utilizada en este método de producción de penicilina fue:

Penicillium crhysogenum NRRL 1951 - Biomédicas.

...
,.. .
Al real izarse fermentaciones para observar el medio de producción seleccionado, se
., . desarrollaron fermentaciones para ver el efecto de sustituir en el medio de produg
*.. ción la fuente de carbono (lactosa) por almidón, con la cepa Penicillium chrysoge-
..., -
num NRRL- 1951-Biomédi cas.
... '
Llevando a cabo la fermentación 14quida, se realizó el método de Esporulación y -
-.
Suspensión de esporas, obteniéndose la siguiente cuantificación: 99,000,000 número
.~.
de esporas / mililitro en una cuantificación y en otra 1.89 X lo8 número de espo-
. .. ras / mililitro.
I .,
De 99 X lo6 número de esporas / mililitro se tiene 0.5050 ml de inóculo,
De 1.89 X lo8 número de esporas / mililitro se tiene 0.2645 ml de inóculo.
La sumatoria de ambos inóculos es de 0.3849 ml, aprox. 0.40 ml.
Se prepara el método de producción de penicilina: E l medio de crecimiento (medio
semilla) es el mismo medio de fermentaciónes anteriores preparandose 300 ml del --
medio, se inocula y se lleva a cabo el mismo proceso durante la fermentación, la -
Única variante es que existen dos medios de producción: medio de producción Coghill
que tiene como fuente de carbono-LACTOSA- y el medio de producción con la fuente -
de carbono-ALMIDON-, se prepara 600 ml de cada medio, cada matraz con 50 ml.
La manteca se pone la cantidad necesaria a cada matraz después de haberse ajustado
el pH a 7.0., se esteriliza, se inocula e incuba a 26°C a 250 rpm.
I I .

1."
Medio de Producción u LACTOSAn
...
...
..
*."

I.

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- -.
...
c

L
I
Discusión de Resultados.

PH
En la determinación de pH se observó un comportamiento poco similar en el medio de -
almidón observando un pico a las 72 hrs., en cambio el comportamiento del medio - -
Coghill fue gradual.

Bi oma sa.
En la determinación de biomasa en el medio de lactosa se observa más cantidad de bio
-
masa lo que provoca un reflejo en la producción de penicilina, en comparación con el
medio de almidón se observa el mismo comportamiento pero a diferente escala.

Producción de Penicilina.
La producción de penicilina en el medio de almidón es irregular observandose un pico
a las 24 hrs. y un descenso a las 48 hrs., de nuevo otra alta y posteriormente una -
1 isis total.
El medio de lactosa tiene un mejor desarrollo y producción de penicilina consumiendo
así gradualmente los azucares del medio.
Esa alta y baja que presenta el medio de almidón es debido también a que consume más
rápidamente l o s azucares del medio.
Se observa la influencia de la fuente de carbono en el medio de producción,ya que el
almidón debe romperse para que el micelio pueda asimilar el carbohidrato necesario -
para la producción de penicilina; en cambio el medio de Coghill que contiene como --
fuente de carbono la lactosa se degrada lentamente produciendo glucosa y galactosa
favoreciendo así la producción de penicilina.
Otra observación es que el medio de lactosa produce una coloración amarillo fuerte -
y un olor característico a penicilina en el medio, en cambio el medio de almidón pre
-
-
senta una coloración amarillo-café y sin olor, esto es en el transcurso de la fermen
tación.
Efecto de sustituir la fuente de carbono - LACTOSA - en el medio de produccidn por
- HARINA DE YUCA -.
Se realizaron 2 fermentaciones con diferente equipo de Agitación:

- Agitador New-Brunswick (OEA).

- Agitador Cajón de Madera improvisado con agitación y regulador

de temperatura.

Dichas fermentaciones se realizaron con l a cepa Penicillium chrysogenum NRRL-1951-

Biomédicas.
La harina de yuca fue tamizada a malla 20.

Fermentación con el agitador New-Brunswick

Se lleva a cabo el método de producción de penicilina en fermentación líquida: Meto

-
do de Esporulación y Suspensión de Esporas con la siguiente cuantificación: 1.42 X 108
número de esporas / milimetro. esto es 0.3521 ml para inocular.
Se procede a preparar el medio de crecimiento y el medio de producción (se preparan
dos medios de producción uno con lactosa (350 ml de medio) y el medio con harina de
yuca (350 ml de medio)), a cada matraz con 50 ml de medio se el agrega l a cantidad
de manteca que l e corresponde. (0.6545g/350ml de medio).
Se procede al tratamiento ya efectuado en fermentaciones anteriores, incubando a --
26°C con agitación de 250 rpm.
Se determina pH, biomasa, consumo de azucares reductores y producción de penicilina.
...
Medio de Producción uLACT0SA *
... New - Brunrwick
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Medio de Producción u YUCA n

New - Brunrwick
Discusión de Resultados.

Pardmetro de pH.
El pH inicial en ambos medios fue de 6.0.
El rango de pH del medio de lactosa fue de 6.0 a 7.4.
El medio con harina de yuca tuvo una baja a las 72 hrs. ; al presentarse altas y ba-
jas de pH refleja un comportamiento desfavorable para la producción de penicilina.

Produccidn de Biomasa.

El micelio inoculado al medio de produccidn es el mismo en ambos medios, pero se oh

tuvo incremento de biomasa a las O hrs. en el medio de harina de yuca por la canti-
dad de esta en el medio.
La biomasa presentada en el medio de lactosa va aumentando gradualmente dando la --
curva de Monod.
El medio de harina de yuca presenta un pico a las 72 hrs. y posteriormente una lisis.
La biomasa tenia un aspecto de algodoncillo -líquido de color café obscuro. El fil-
trado para realizar el método de bioensayo era de color café durante toda la fermen
tacidn en comparacidn con el medio de lactosa "Coghill" de color amarillo y de olor
característico a penicilina.

Producción de Penicilina.

La produccidn de penicilina fue muy comparativa en esta fermentacidn ya que se ob--

servó que el medio de lactosa lleva siempre el mismo efecto con la cepa Penicillium
chrysogenum, en cambio el medio que contiene harina de yuca como fuente de carbono
fue muy lenta la degradacidn de la harina para el micelio observandose un pico a --
las 72 hrs. lo que se ve reflejado en el consumo de azucares.
Esta fermentaci6n fue satisfactoria al hacer la comparación del efecto de sustituir
la fuente de carbono por harinas u/o carbohidratos.
Realizando otra fermentación líquida con la misma suspensión de esporas (con 2 se-
manas en el refrigerador) en un equipo de cajón de madera, con el objeto de ver el
efecto del cambio de la lactosa por otra fuente de carbono -harina de yuca- como -
también el efecto del cambio de equipo. I

Se prepara el medio de crecimiento inoculado con 0.3521 ml de suspension de esporas

dejando incubar, y llevar a cabo el método de la fermentación líquida. En esta -
fermentación se tomarán l o s tiempos de muestra cada 24 hrs. tomando duplicados los
tiempos de t = 24, 48, 72, 96 hrs. para el medio de harina de yuca, y el medio de
lactosa solo se tomarán los tiempos t = O. 48, 72 y 96 hrs.

Se lleva paso a paso el método ya mencionado anteriormente, y se determinan los --

siguientes parámetros: pH, producción de biomasa, consumo de azucares reductores y
producción de penicilina.
Medio de Producción u LACTOSA n

Agitador de modera.
Medio de Producción uYUCA

A q i t o d o r de madero.

f
*.

,).. Discusidn y Resultados.

.~.
r.
Al comparar los resultados y las gráficas con la fermentacidn anterior, la produc-
... cidn de penicilina del medio de lactosa fue favorable y se observd: que el pH de --
1
,

esta fermentacidn es semejante a la anterior fermentación, en cambio el medio de ha

.,... ,
rina de yuca se mantuvo en un rango de 5 a 8, influyendo en su produccidn.
. .
? .
La biomasa en ambos medios fue buena hasta las 72 hrs., esto es reflejado en la prg
duccidn de penicilina teniendo un pico a las 72 hrs. y posteriormente una lisis to-
...
tal.
I ,~
El consumo de azúcar es rápido de O a 48 hrs. y se agota gradualmente en ambos me--
..- dios.
r,.
Esto demuestra que el medio que contiene lactosa es el que produce más cantidad de
._. penicilina que otros medios que contienen otras fuentes de carbono.
, ~ , ~
Es más rápida la degradacidn de la lactosa en glucosa y galactosa y posterjormente
.... su asimilación, que otros carbohidratos o harinas.
I "
i
.... Ambas fermentaciones fueron comparativas y demostraron que los equipos uti1 izados -
(con agitación y temperatura controlada) tienen que ver s610 en el crecimiento de -
biomasa, es decir, forma algodoncillos y pelex de tamaiio mediano (biomasa aglomera-
... da en forma circular) esto fue en el aparato de madera y en cambio el aparato New-
~ . , ,
Brunswick la biomasa tiene la forma adecuada y el aspecto esperado.
L...

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-.
COMPARACION DE LAS CEPAS UTILIZADAS EN LAS FERMENTACIONES SOLIDAS Y ELECCION DE --
LAS MAS CONVENIENTES PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA.

Se realiza una cinética de crecimiento de las cepas: I

- Penicillium chrysogenum Wisconsin-Biomédicas W-54-1255

I
- Penicillium chrysogenum Wisconsin- USA 9-176.

El método es el mismo para el medio de crecimiento. Se esporula.

Se prepara una Suspensión de Esporas de l a s 2 cepas obteniendo las siguientes cuan- !
tificaciones de esporas: ~

i
i
Para Penicillium chrysogenum Wisconsin-Biomédicas W-54-1255: I
I
6
-
5 X 10 esporas / ml que corresponden para 1 X IO6 a 10 ml. I
!
j
Para Penicillium chrysogenum Wisconsin-USA Q-176:

24,500,000 esporas / ml que corresponde para 1 X IO6 a 2.04 ml.

Se prepara el medio de crecimiento (250 m l para cada cepa) y se ajusta el pH a 5.0

se esteriliza y se inocula e incuba a 25OC a 250 rpm.
Se toman dos matraces cada 24 hrs. y se observan al microscópio.
Se determina el parámetro de pH y biomasa.
 Cinética de Crecimiento P. c h r y r o g e n u m

W.¡sconsin - U S A

r-

..
.
 FERMENTACION LIQUIDA DE LAS CEPAS J . CHRYSOGENUM WISCONSIN BIOMEDICAS Y USA.

Se realiza una fermentación 14quida para l a producción de penicilina con las cepas
I
Penicillium chrysogenum Wisconsin-Biomédicas W-54-1255 y Penicillium chrysogenum -
Wiscow in-USA Q-176.
I
El equipo es con l a incubadora con agitación de New-Brunswick.

Se realiza la msima metodología de las fermentaciones anteriores, se pone la cepa - !

a esporular y se obtiene una suspensión de esporas para cada una: ~

-F? chrysogenum Wisconsin-Biomédicas W-54-1255:

6 3
335 X 10 número de esporas / m l = 2.985 X 10 ml (50 mi) = 0.149 m l

P. chrysogenum Wisconsin-USA 9-176:

-
6
20 X 10 número de esporas / ml = 0.05 ml (50 mi) = 2.5 ml.

L
,..
Se preparan los medios para l a fermentación y se toma una muestra cada 24 hrs. de -
cada cepa; se realiza análisis de pH, biomasa, azúcares reductores y producción de
._~. penicilina.
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 F e r m e n t a c i ó n LÍqu'ida P. W i s c o n s i n - Biomédicar

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 Fermentación Liquida P . Wisconsin- USA

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.
... Resultados.

Determinación de pH:
.. . El pH de las dos cepas se comportaron semejantes sin tener cambio hasta las 120 hrs.

. ' Concentración de Biomasa:

La biomasa de l a cepa Wisconsin-USA fue l a de mayor concentración desde el inicio -

de la fermentación, en cambio Wisconsin-Biomédicas tuvo poca concentración y esto -
F .. da un reflejo en l a producción de penicilina y en el consumo de azúcares.
,..

-. Producción de Penicilina:
i_

La producción de penicilina en l a cepa de Wisconsin-USA presentó más concentración

. ..,
de penicilina que la cepa Wisconsin-Biomédicas, esto origina l a observación de que,
l a producción de penicilina varia de cepa a cepa y esto mismo se ve reflejado en -
L

~..~ el consumo de azucares.

.." Al realizar fermentaciones con estas cepas, se reflejo los mismos resultados pres-
.-" tados en esta fermentación, por l o que se opto en hacer conservaciones de las cepas
.-. para realizar fermentaciones liquidas y tener bien dominada l a metodología de las -
-.- fermentaciones y análisis de cepas en l a fermentación liquida para dar pie a fermeE
.._.. taciones futuras como las fermentacuones sólidas.
. ."

.
...

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...
*..
 Montaje de una fermentación líquida para ver el efecto de tener l a suspensión de -
esporas en refrigeración durante 0.1.2 y 3 semanas.

.. Se llevo el siguiente esquema de trabajo:

.-
I.

, i

c.

._ Se llevo a cabo la metodología de la fermentación líquida y se tuvo la cuantifica-

P- cion de esporas;

I. ..
25,250,000 esporas / ml. = 0.0396 ml (50 ml medio) - 1.980 ml para inóculo.

.~..
Se preparan los medios de crecimiento y producción y se tomaron los siguientes --
. .
tiempos:
._,

horas
-. muestra s
.I.,

.. Se determinó pH, producción de biomasa, producción de penicilina y consumo de azu-

._ cares.

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 F e r m e n t a c i o n L i q u i d a Wibconbin- U 5 A

S e m a n a (O)
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Fermentaci6n Liquida Wirconrin-U S A

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 Fermentación Liquida W-USA

20. Semana.
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 Fermentación LÍquida W - USA

3a. Semana.

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Semana ( 2 ) hwA5
 Discusión de Resultados.

La producción de penicilina fue satisfactoriamente desarrollada teniendo justifica-

ción el hecho de utilizar l a suspensión de esporas hasta una 3a. semana y al reali-
zar una 4a. semana no hubo crecimiento de esporas ni de micelio.

El pardmetro de pH se mantiene en un rango de 5 a 6.0 hasta la 3a. semana.

En cada semana de fermentación, l a biomasa tuvo un comportamiento semejante hasta -

las 72 hrs., disminuyendo a l a 3a. semana.

El consumo de azucares fue el esperado y se refleja directamente en la producción -

de penicilina.

El hecho de utilizar l a suspensión de esporas hasta un determinado tiempo es bueno

desde el punto de vista experimental ya que se puede montar fermentaciones líquidas
y sólidas con l a suspensión de esporas directamente o haciendo crecer el micelio en
medio semilla.

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 *, .
.

PRUEBAS DE METODOS DE CONSERVACION DE CEPAS EN TIERRA Y CONGELADO.

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r".
Se presentaron dos métodos de conservación de cepas de Penicillium chrysogenum: cor^
servación en tierra y conservación en congelado.
I

-
* I .

La cepa de -
P. chrysogenum Wisconsin-USA 4-176 ya que fue l a cepa seleccionada por
-..
los resultados de fermentaciones anteriores.
r..

.. -- Método de Conservación de Cepas en Tierra Estéril.

-. Se selecciona y se prepara la tierra para l a conservación de l a cepa, las caracte--

L. rísticas de l a tierra seleccionada es Arcilla 70%, Limo 20% y Arena 10%.
c.
Método: Se preparan tubos de ensaye con 6 g. de tierra, se tapan con tapón algodon-
~.
gasa, se esteriliza a 15 lbs-15 min, 6 veces. Se realiza pruebas de esterilidad en
C<. PDA, Agar nutritivo tomando un tubo tierra que contienen 2 ml de agua-estéril (sus-
. pensión). Se incuba a 27-29OC durante 60 hrs.
__._
Resultados.
c. ..
No se presentó contaminación ni crecimiento de ningún microorganismo.
r-.

..- -- Inoculación de la Cepa en l a Tierra Estéril.

v--

Se procede a tomar la cepa-original y hacer una suspensión de esporas (la suspensión

I

de esporas es l a misma para los dos métodos de conservación). Se inocula la tierra

c..
con una pequeña cantidad ( 2 gotas).
c..

.- -- Método de Conservación de Cepas en Congelado.

.....
De l a suspensión de esporas se toma una alícuota y se lleva a esporulas y hacer otra
suspensión de esporas (método ya mencioando) de esta suspensión se toma una alícuo-
I

ta de 2.5 ml y se pone en tubos de rosca (previamente esterilizados), se lleva a --

r-'
congelación a 20°C.
L
En este método se hace una esporulación y posteriormente una suspensión, es decir -
un paso en crecimiento de l a cepa.
L. ~.
r '. Ver l a siguiente figura. Ilica+<a51

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...

--
c.

..

I.
Fermentaci6n Liquida de la Cepa -
P. chrysogenum Wisconsin-USA conservada en tierra y
congelado.
r-

-.
r.
Se realiza una fermentación líquida llevando a cabo los pasos ya mencionados, del --
.. .
tubo de tierra se lleva a esporular y suspender las esporas para montar la fermenta-
ción, teniendo una cuantificación de esporas de 39,500.00 número de esporas / ml. =
r...
1.2658 ml para inocular el medio de crecimiento.
~, .
Y de la cepa conservada en congelado, se descongela a temperatura ambiente, de esta
._,
suspensión se lleva a esporular y real izar una suspensión de esporas, cuantificando:
.. 34,000,000 número de esporas / ml igual a 1.470 ml. para inocular el medio de creci-
c*
mien to.
...
Se prepara la fermentación a las mismas condiciones de temperatura (26OC) y agitación
(250 rpm). y se determina el pardmetro de pH, biomasa, produccián de penicilina y --
.I.

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consumo de azúcares.
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F E R M E N TAC I O N 1 IQU IDA

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I.

FERMENTACiON 1 IQUlDA .
r.
C* CONGELADO.

I
1
T
RESUMEN.

La inestabilidad de l a s cepas a l t a s productoras de metabol i t o s secundarios hace ne-

cesario u t i 1i z a r cuidadosos métodos de preservación y manejo.

E l objetivo de este proyecto fue evaluar métodos de conservación y manejo de l a cepa

y seleccionar uno para l a producción de penicilina en fermentación líquida que ser-
v i r á como apoyo para l a producción de penicilina en medio sólido.

Se comparó l a producci6n de penicilina de Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255

y Wisconsin 4-176, resultando una producción 3 veces mayor con Wisconsin 4-176.

Por tanto l o s métodos de conservación y manejo se hicieron con l a cepa p. chrysoge-

num Wisconsin
- 4-176 y se compararon l o s siguientes métodos de conservación:
I) Esporas en tierra; 2) Esporas en t i e r r a con un paso en PDA; 3) Esporas con-
geladas a -20°C y 4) pasos sucesivos en PDA (tener l a suspensión de esporas en re--
frigeracidn por semanas.)

La productividad del hongo conservado por estos métodos, se evaluó por fermentación
líquida en matraz agitado con medio de Sylvester & Coghill (1950). En varios expe-
rimentos l a mayor producción 178 U/ml 5 8.8 se obtuvo con e l método en t i e r r a con
un pase,l25ü/ml ?l.4..fqihbtodo de pases sucesivos mantiene su producción hasta una
3a. semana y posteriormente baja su producción.

Estos resultados indican que e l método en t i e r r a es e l adecuado para obtener pro- -

ducciones constantes y confirman l a importancia de l o s métodos de conservación y m
a
nejo de cepas en l a producción de metabolitos secundarios.
CONCLUSIONES.

-
La evaluación y seleccibn de metodologías de fermentaciones líquidas para l a produc
ción de penicilina de apoyo al montaje de fermentaciones s61idas para l a producción
con soportes como: harina de yuca, bagazo de caña, plástico sintético (esponja), --
yute, etc.

Además las metodologías de conservación en tierra y congelado es un nuevo enfoque -

tanto para la producción de penicilina como para otros métodos de producci6n de di-
ferentes metabolitos secundarios, así de un conocimiento más afondo de l a fisiolo--
gía de l o s productos fungicos.

.... . ........_l_.,..-.,.._l_l..-.- -~ . -
VIII. LITERATURA CITADA.

Fernando Lara, Rosa del Carmen Mateos, Guadalupe Vázquez and Sergio Sánchez.
Induction of Penicillin Biosynthesis by L-glutamate in Penicillium-chrysogenum.
Biochemical and Biophysical Research.
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Sergio Sanchez, Ma. Elena Flores y Rosa del Carmen Mateos.

Aspectos Bioquímicos y Regulatorios de l a Biosintesis de l a Penicilina.
Depto. de Biotecnología del Instituto de Investigaciones Biomédicas.

George J. M. Hersbach., Cees P. Van Der Beek, and Piet W. M. Van Dijck.
The Penicillins: Properties, Biosynthesis, and fermentation.
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Filomena R. Ramos
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