= INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL =

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Unidad Santo Tomás

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Laboratorio de Métodos de Análisis

EFECTO DEL pH Y LA CONCENTRACIÓN EN LA

INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE RIBOFLAVINA

ALUMNA: González Roldán Cecilia

CARRERA: Químico Bacteriólogo Parasitólogo

GRUPO: 5QV1

SECCIÓN: 1

PROFESORA: Macías Martínez Víctor Manuel Luis

FECHA DE REALIZACIÓN: 14 de marzo de 2018

FECHA DE ENTREGA: 21 de marzo de 2018

Objetivo personal:
♠ Determinar el efecto de diferentes sustancias que contienen diferentes pH
sobre la riboflavina, variando la concentración.

Fundamento de la técnica:
Cuando una sustancia absorbe luz, uno de sus electrones pasa a un estado excitado
(de mayor energía) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de
energía se libera en forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor
energía) a la de excitación. La concentración será directamente proporcional a la
intensidad de luz transmitida.
El espectro de fluorescencia de muchos compuestos aromáticos conteniendo
grupos funcionales ácidos o básicos son sensibles al pH. Los cambios en la emisión
de los compuestos de este tipo, provienen del número de especies resonantes
diferentes que están asociadas con las formas ácidas o básicas de las moléculas.

Resultados:
TABLA 1: Resultados de la curva de calibración de la riboflavina en diferentes
medios.
Intensidad de Intensidad de
Intensidad de Intensidad de
Riboflavina fluorescencia fluorescencia
fluorescencia fluorescencia
(ppm) en CH3COOH en NaOH
en H2O en HCl 0.1 M
0.9 M 0.1 M
0.0 4.92 4.85 4.93 4.92
1.0 5.89 5.03 5.68 4.93
2.0 6.74 5.19 6.14 4.96
3.0 7.56 5.33 6.75 4.95
4.0 8.27 5.48 7.62 4.96
5.0 9.07 5.61 7.89 4.76
10.0 11.64 6.13 10.20 5.00
50.0 17.44 7.40 14.89 4.66
pH 5.5 1.0 3.0 – 4.0 13.0
 20
18
16
Intensidad de emisión

14
12
10
8
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración (Riboflavina [ppm])

H2O HCl CH3COOH NaOH

FIGURA 1: Curva de calibración de la riboflavina en diferentes medios.

Representación de la intensidad con todas las concentraciones trabajadas

10

8
Intensidad de emisón

0
0 1 2 3 4 5
Concentración (Riboflavina [ppm])

H2O HCl CH3COOH NaOH

FIGURA 2: Curva de calibración de la riboflavina en diferentes medios.

Representación de la intensidad solo a concentraciones de 0.0 a 5.0 ppm.
Discusión:
En un fluorómetro se maneja la incidencia de la longitud de onda que excita al
electrón, esta excitación hará que los electrones de valencia salten a un orbital más
energético, lo cual con la energía generada se emite una lectura.
La riboflavina en su estructura posee enlaces conjugados y la capacidad de la
deslocalización de estos le da la capacidad de fluorescer, al irradiar a la riboflavina,
se envía una longitud de onda energética, esta longitud de onda llega a los enlaces
conjugados y actúa sobre los electrones , estos electrones tienen la capacidad de
absorber luz y excitarse, al regresar a su estado basal, este libera esa energía en
forma de luz que emite, esta luz tiene una mayor longitud de onda, por lo tanto la
energía es menor y otra porción de energía se regresa en forma de calor. Cada
reacción química o bioquímica se ve influenciada por el medio en el que se
encuentra, el variar el pH de una solución afecta directamente ciertos factores, al
poner la riboflavina en solución con otras sustancias, las cuales afecten su pH, la
capacidad de fluorescencia se ve afectada, las sustancias que se utilizaron en la
práctica fueron NaOH, HCl, H2O y CH3COOH.
Se considera un ácido o una base fuerte por su capacidad de disociarse, el H2O y
el CH3COOH tienen la capacidad de favorecer la deslocalización los electrones ,
ya que el pH de estas sustancias va de 3 a 5.5 favorecen a la forma neutra en la
molécula de riboflavina, esta forma es la que más fluoresce ya que es un pH cercano
a 4, por lo tanto, estas favorecen la capacidad de fluorescencia de la riboflavina,
mientras que en NaOH al tener un pH 13, el cual es un pH muy básico y el HCl al
tener un pH 1, el cual es muy acido, no favorecen este efecto de la fluorescencia,
debido a que se rigidiza la molécula de riboflavina y esto no favorece la
deslocalización de los electrones, por lo tanto su capacidad de fluorescer se va a ir
perdiendo.
La concentración de la riboflavina afecta la longitud de onda que será emitida, en
una mayor concentración, la energía que se libera es menor, por lo tanto la longitud
de onda será mayor, ya que son directamente proporcionales.
Esto se ve reflejado en las gráficas, en la Figura 1 se observan el total de los valores
de las longitudes de onda, con los diferentes compuestos que fueron utilizados, se
observa que la longitud de onda emitida por la riboflavina en agua y en CH3COOH
se ve favorecida, ya que conforme la concentración va aumentando, también la
intesidad que es captada por el fluorometro, mientras que las longitudes de onda
emitidas son constantes, por lo tanto nos indica que no favorecen la capacidad de
fluorescencia de la riboflavina.
En la Figura 2 solo se observan los valores de concentración de 0.1 a 0.5, con esto
se puede observan la diferencia de los valores de las longitudes de onda emitidas
a esas concentraciones, ya que la tendencia que siguen es la misma que en la
Figura 1.
Conclusiones:
 La energía que se emite es inversamente proporcional a la longitud de onda.
 La intensidad de fluorescencia a diferentes concentraciones vario más en
H2O y en CH3COOH.
 No hay variación notable en la intensidad de la fluorescencia a pH muy básico
y muy ácido.
 Para la fluorescencia se requieren enlaces conjugados en la molécula.
Cuestionario:
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima
excitación y de máxima emisión?

Debido a que estos son dos parámetros requeridos para la determinación

cuantitativa por fluorometría; la longitud de onda de máxima excitación es el
parámetro en el cual absorbe energía radiante y la longitud de onda de
máxima emisión es el parámetro al que emite la radiación electromagnética.

2. Diga cuales son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su

papel en el metabolismo celular.

La riboflavina es el precursor de las coenzimas: Flavín adenín dinucleótido

(FAD) y Flavín mononucleótido (FMN). Estas actúan como transportadores
de electrones en cierto número de reacciones de oxidación-reducción
(Redox) involucradas en la producción de energía en numerosas rutas
metabólicas.

♠
3. Preguntas extras del profesor.
 a) Diferentes regiones del espectro electromagnético.

b) Partes del fluorómetro

Bibliografía:

 Skoog, Duglas A.; F. James Holler; T. A. Nieman. 2001. Principios de Análisis

Instrumental. 5a ed., Editorial Mc Graw Hill Interamericana de España,
Madrid, España.
 AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox (1995) “Principios de Bioquímica” 2ª Ed,
Editorial Omega.
♠ Riboflavina, Disponible en:
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html