Copia de Guia de Laboratorio de Microbiologia, LDC, Agosto de 2016b (5) - 1

GESTIÓN DE LABORATORIOS Código:
GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

GENERAL
L.D.Caicedo Página 1 de 86
GUÍA DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL
PRIMERA PARTE (BÁSICA)
POR:
LUZ DARY CAICEDO BEJARANO
Elaboró Luz Dary Caicedo Bejarano Elaboró
Cargo Docente Cargo
Fecha 08.08.2106 Fecha


GENERAL
MATERIALES QUE DEBEN TRAER Y TENER DISPONIBLES EN EL MOMENTO

QUE SE NECESITEN
PERSONALES:
1. Bata de laboratorio. (Sin excusa)
2. Mascarillas, para personas que sean alérgicas a los hongos
3. Guantes (opcional)
4. Cuaderno cuadriculado enumerado o un cuaderno de actas (hacer las anotaciones, escribir los
resultados, hacer los diagramas de flujo y para hacer la relación del material que piden)
POR GRUPO:
Paños de dulce abrigo para limpiar Jabón en polvo
Esponja para lavar
Guantes de caucho para el lavado del material
Guantes de tela para la manipulación de los medios de cultivo
Cinta de enmascarar o esparadrapo
1 caja de portaobjetos
1 caja de cubreobjetos
Papel aluminio
Hipoclorito de sodio
1 Encendedor (sin excusa)
Marcador de vidrio o lápiz vidriograf (sin excusa)
1 Paquete de toallas de papel
Guía de Laboratorio de Bioquímica General


GENERAL
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

1. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. No fumar, ni tocarse la cara o los
ojos con las manos.
2. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable

vestir ropa sencilla, que proteja la mayor parte del cuerpo, de preferencia de algodón, zapatos
cerrados, con suelas gruesas y sin tacones o plataformas, así como traer el pelo recogido.
3. Los mesones de trabajo deben ser superficies lisas, fáciles de limpiar y desinfectar.
4. Use guantes cuando debe manipular material infeccioso.
5. Subcultivos de microorganismos patógenos deben hacerse en cabina de seguridad
6. Cada vez que se derrame material, cubra la mesa con toallas de papel, impregne esta zona con
sustancias bactericidas como jabones o soluciones cloradas (hipoclorito de sodio al 10%)
7. No pipetear con la boca material contaminado. Obture las aberturas superiores de las pipetas con
algodón antes de esterilizarlas.
8. Pipetas usadas deben sumergirse inmediatamente en desinfectantes y esterilizar en autoclave.
9. El material contaminado debe ser colocado en recipientes adecuados y deben ser esterilizados
en autoclave.
10. Nunca humedezca etiquetas con la lengua
11. Antes y después de cada sección de trabajo limpie los mesones con sustancias desinfectantes.
12. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso
cuando salgan por breves periodos.
13. Las paredes, pisos y demás accesorios deben ser hechos de materiales fáciles de limpiar y que
resistan el uso continúo de soluciones bactericidas.
14. De cuenta inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como cortaduras,

quemaduras o derrames de cultivos. Tome las precauciones posibles para evitar accidentes.
15.Las agujas de transferencia y las asas bacteriológicas deben ser esterilizadas a la llama, poniendo
al rojo todo el alambre, antes y después de su uso. Cuando tenga residuos de crecimiento
microbiano es necesario calentarlas inicialmente en el cono frío de la llama para evitar aerosoles.

GENERAL
16.No lleve materiales muy contaminados al laboratorio y elimine lo más pronto posible los cultivos
que lo estén.
17.Cuando se saca parte de un producto de un recipiente y sobra algo, deséchelo luego de su uso.
18. Todos los reactivos y equipos deben dejarse organizados y en sus sitios respectivos al final de
cada práctica.
19. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales
potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o
cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir
del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el
teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc. Tras quitarse los guantes,
se realizará un lavado de manos.
20. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculación y de generación de

aerosoles.
21. Al manipular sustancias químicas corrosivas o peligrosas se utilizarán guantes, lentes protectores
y/o mascarillas. No se deberá pipetear oralmente ningún tipo de solución o cultivo microbiano.
Siempre se utilizarán propipetas adecuadas para este fin.
22. Evitar la acumulación de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades
de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes.
23. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.
EXIGENCIAS:
1. Antes de entrar a trabajar al laboratorio, léase el texto de las prácticas que va a realizar y haga el
plan de trabajo con todo cuidado.
2. Cada práctica de laboratorio debe iniciarse con una corta explicación. No empiece a trabajar hasta
que haya recibido las instrucciones. Pregunte cuando no entienda. La buena técnica de laboratorio
depende de que usted sepa lo que va a hacer.
3. Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento de hacerlas. El examen de

prácticas se referirá no solo a las información proporcionada en el manual, sino también a sus
propias observaciones y deducciones.
4. Los resultados o preinformes de laboratorio deben estar disponibles en cualquier momento,

después de realizada cada práctica.

GENERAL
5. Al iniciar cada práctica, el estudiante debe disponer de todos los materiales necesarios. (La lista
de materiales se debe pasar al menos el día anterior a la práctica) NO SE DEBEN PASAR EL MISMO
DIA POR QUE NO SERÁN ATENDIDOS POR LOS FUNCIONARIOS DE LA UNIVERSIDAD.
OTRAS RECOMENDACIONES:
Según las prácticas, las bacterias se deben dejar a temperatura ambiente o en incubador durante
24 a 48 horas. Después de este tiempo se deben guardar en la nevera para su posterior estudio o
identificación. Los hongos y levaduras se deben dejar a temperatura ambiente durante 5 a 8 días, al
cabo de los cuales deben ser guardados en la nevera para su posterior caracterización. El no
seguimiento de las anteriores recomendaciones trae consigo un crecimiento excesivo de los
microorganismos que hace imposible su posterior utilización. En estos casos la práctica se deberá
repetir.

GENERAL
LABORATORIO No. 1 LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN:

El estudiante de un curso de microbiología general debe familiarizarse con el concepto y manejo de
métodos de esterilización, ya que para el estudio de determinada vida microbiana se debe descartar
cualquier tipo de contaminación y esto se obvia trabajando únicamente con material estéril.
INTRODUCCION:
La limpieza y desinfección son una serie de procedimientos para mantener el laboratorio libre de
contaminación ambiental y proporcionar un área de trabajo limpia, saludable y segura. El
cumplimiento de estos procedimientos asegurara la reducción de la contaminación y mayor calidad
de los resultados esperados. En este capítulo se mencionan algunos términos relacionados con el
proceso de limpieza y desinfección, compuestos utilizados y los procedimientos básicos de limpieza
y desinfección de las áreas.
Es importante mantener los laboratorios y el material limpios, ya que el propio trabajo crea un flujo
microbiano. Estos microorganismos vienen del exterior:
· Con materias u objetos contaminados
· Con el aire, el agua
· Con el hombre mismo, que se comporta como reservorio natural de las bacterias
La limpieza y la desinfección tiene como fin asegurar una buena higiene, tanto a nivel de los locales,
los materiales, el personal y el ambiente. La limpieza regular y periódica permite mantener una flora
microbiana ambiental reducida necesaria y suficiente para ciertas actividades.
OBJETIVO:
Describir los procedimientos de limpieza y desinfección que deben aplicarse en el laboratorio de
microbiología para garantizar la inocuidad de los medios elaborados y la seguridad y confiabilidad
de los resultados.
GLOSARIO:
Desinfección: Es el conjunto de operaciones que tiene como objetivo la reducción temporal del
numero total de microorganismos vivos y la destrucción de los patógenos y alterantes; sin embargo
, la esterilización busca la obtención definitiva de un medio completamente exento de gérmenes
Desinfectante: Cualquier agente que limite la infección matando las vegetativas de los
microorganismos.
Detergente: Material tensoactivo diseñado para remover y eliminar la contaminación indeseada de
alguna superficie de algún material
Eficiente: Que produce realmente un efecto satisfactorio
Esterilización: Es la destrucción o eliminación de todas formas de vida. Puede llevarse a cabo por
procesos físicos o químicos.
Higiene: Todas las medidas necesarias para garantizar la sanidad e inocuidad

GENERAL
Limpieza: Es el conjunto de operaciones que permiten eliminar la suciedad visible o microscópica.

Estas operaciones se realizan mediante productos detergentes elegidos en función del tipo de
suciedad y las superficies donde se deposita
TABLA 1. LOS PRODUCTOS DE LIMPIEZA: AGENTES DESINFECTANTES
Solución: Combinación de un sólido o de un producto concentrado con agua, para obtener

una distribución homogénea de cada uno de los componentes.
Suciedad libre: Impurezas no fijadas en una superficie, fácilmente eliminables.

GENERAL
Suciedad adherente: Impurezas fijadas que precisan una acción Mecánica o química para
desprenderlas del soporte
Suciedad incrustada: Impurezas introducidas
ETAPAS DE LA LIMPIEZA Y DESINFECCION:LIMPIEZA:

Recoger y desechar los residuos del producto, polvo o cualquier otra suciedad presentes en el lugar
a limpiar
 Humedecer con suficiente agua potable el lugar o superficie que se va a limpiar
 Preparar la solución de detergente que se va a usar
 Enjabonar la superficie por limpiar, esparciendo la solución de detergente con esponja o
cepillo
 Restregar la superficie fuertemente con ayuda de un paño o cepillo, eliminando toda la
suciedad posible
 Dejar la solución de detergente aplicada por un tiempo corto para que este actúe
 Enjuagar con suficiente agua asegurándose de que todo el detergente se Elimine
 Observar detenidamente el lugar que se limpio para verificar que haya sido eliminada toda
suciedad
DESINFECCION:
 Asegurarse de que la superficie este limpia, si no es así limpiar como se explico
anteriormente
 Antes de proceder a desinfectar se debe tener lista la solución desinfectante
 Aplicar la solución desinfectante sobre el lugar o superficie que se va a desinfectar
 La solución desinfectante se deja sobre el lugar que se esta desinfectando por un tiempo
mínimo de un minuto, dependiendo de la sustancia utilizada Durante este tiempo, se esta
logrando eliminar la mayor cantidad posible de microorganismos, de modo que la superficie
a limpiar queda bien desinfectada.

GENERAL
TABLA 2. MECANISMO DE ACCION DE LOS DESINFECTANTES:
Desinfectante Mecanismos de acción Espectro de acción Usos

Alcoholes Los alcoholes actúan Los alcoholes poseen El alcohol se utiliza muy
destruyendo la una rápida acción y frecuentemente
membrana amplio espectro de para la desinfección
celular y actividad, actuando o limpieza de la piel, Su
desnaturalizando las sobre bacterias aplicación está también
proteínas. Su acción es Gramnegativas y indicado en
rápida, Grampositivas, la desinfección de
incluso desde los 15 incluyendo material no crítico como
segundos, aunque no micobacterias, hongos y termómetros
tiene efecto persistente. virus pero no son
Sus efectos esporicidas. El etanol al
biológicos de daño 70% destruye alrededor
microbiano del 90% de las bacterias
permanecen por varias cutáneas en dos
horas. minutos
Aldehídos Actúan mediante la Los aldehídos tienen un

alquilación de los grupos amplio espectro de
químicos de las proteínas actividad contra
y ácidos nucleicos de las microorganismos y
bacterias, virus y hongos. virus. El formaldehído
es bactericida,
esporicida y virucida,
pero trabaja más
lentamente que el
glutaraldehído.
Formaldehídos El formaldehído actúa El formaldehído es un Esterilización de

sobre las proteínas por producto químico objetos inanimados,
desnaturalización. El extremadamente como instrumentos.
glutaraldehído actúa de reactivo y que Desinfección de
forma similar en pH interactúa con material de metal,
alcalino. Sobre la pared proteínas, ADN y ARN in caucho y plástico.
celular. vitro. Desinfección de alto nivel
de hemodializadores
Al 20% a 30% es
astringente.

GENERAL

Glutaraldehìdos El glutaraldehído actúa al Su actividad biocida se Desinfección y
nivel de los puentes debe a la alteración del esterilización de
cruzados del ARN, ADN y síntesis de plásticos y caucho de equipos
peptidoglicano. El proteínas. de anestesia
Desinfecta en 45
glutaraldehido, cuando la
minutos a 25ºC, eliminando
solución es alcalina (pH gérmenes
7,5 a patógenos y
8,5) se activa y posee vegetativos,
Actividad esporicida. El incluyendo M.
glutaraldehído alcalino al tuberculosis,
2% es bactericida, Pseudomonas
fungicida, virucida, en aeruginosa y VIH 1 y 2.
cortos periodos de Esteriliza en 10 horas,
tiempo, pero necesita 6 destruyendo todas las
esporas.
horas de contacto para
Activo contra virus en 10
destruir las esporas minutos a 20ºC.
bacterianas. Tiene una
acción moderada frente a
micobacterias.
Hipocloritos El mecanismo de acción Los hipocloritos tienen El hipoclorito de

sobre un extenso espectro de sodio se presenta
los microorganismos es actividad, son en solución a una
poco bactericidas, virucidas, concentración de
conocido, pero se postula fungicidas y esporicidas, 5,25%. Para las
que pero actividad variable desinfecciones, las
actúan inhibiendo las frente a micobacterias, diluciones en uso
reacciones enzimáticas y según la concentración son entre 0,1% y
desnaturalizando las en que se use. 1%. Limpieza de vajilla.
proteínas Lavado de ropa en general.
Cloración del agua.
Desinfección de
algunos alimentos.
Desinfección de
desechos líquidos
contaminados

GENERAL

Compuestos Los compuestos yodados El yodo tiene una La desinfección de
yodados son poderosa la piel sana.
agentes oxidantes, se actividad germicida, El tratamiento de
combina ataca afecciones de la piel
irremediablemente con bacterias Grampositivas causadas por
residuos tirosina de las y Gramnegativas, bacterias y hongos.
proteínas. Precipitan las micobacterias, La limpieza de las
proteínas bacterianas y esporas, hongos, virus, heridas, en solución
ácidos nucleicos. Alteran quistes y protozoos. acuosa
las membranas celulares
al unirse a los enlaces C=C
de
los ácidos grasos. Actúa
disminuyendo los
requerimientos de
oxígeno de los
microorganismos
aerobios,
interfiriendo la cadena
Yodoforos Tienen amplio espectro La yodopovidona es El lavado de las manos,

de actividad contra activa contra bacterias como antiséptico.
bacterias y hongos y Grampositivas, La limpieza de la piel sana
presentan el mismo Gramnegativas, hongos, en procedimientos
mecanismo de acción y virus y micobacterias. Es quirúrgicos. La limpieza de
espectro de actividad de efectiva contra el S. objetos de superficie dura.
los yodados. El más aureus MRSA y
conocido de los especies de enterococo.
yodóforos es la Resistencia significativa
yodopovidona compuesta a yodopovidona no ha
de yodo y sido reportada
polivinilirrolidona
Fenoles Son bactericidas a bajas Los fenoles se utilizan En la actualidad,
concentraciones, más como sólo se emplea para la
causando daño a las desinfectantes, tienen desinfección de puntos
membranas con pérdida propiedades críticos en la industria,
de los constituyentes antibacterianas aplicándolo a
citoplasmáticos, frente a estreptococos, superficies, ropa blanca,
inactivando estafilococos y instrumentos,
Escherichia coli, sanitarios y excreta

GENERAL

irreversiblemente las y también propiedades
oxidasas y antifúngicas y
deshidrogenasas de antivirales
membrana y produciendo
desnaturalización de las
proteínas.
oxidantes Los oxidantes Su espectro de actividad Su espectro de
(peroxígenos) son es sobre bacterias actividad es sobre
productos que liberan vegetativas, bacterias
oxígeno naciente. virus, micobacterias y vegetativas, virus,
Considerados como esporas. micobacterias y
compuestos bactericidas esporas.
útiles, su mecanismo de
acción consiste en la
inactivación de
proteínas enzimáticas
actuando sobre los
grupos -SH de las
proteínas de estructura y
de las proteínas de
función de las bacterias.
Peróxido de El peróxido de hidrógeno Es activo frente a Antiséptico tópico
Hidrogeno tiene efectos oxidantes bacterias y en solución al 3%.
por producir OH y virus, según la
radicales libres, los cuales concentración y
atacan a los componentes condiciones de
esenciales de los utilización.
microorganismos como Estudios in vitro de
lípidos, proteínas y ADN. soluciones de peróxido
Es un agente oxidante de de hidrógeno al 3% han
efecto fugaz por ser mostrado amplio
descompuesto por espectro de eficacia,
las catalasas de los tejido con mayor actividad
frente a bacterias
Grampositivas
Compuestos Son sustancias que Activos para eliminar Desinfección de superficies
cuaternarios de lesionan la membrana bacterias Grampositivas no críticas. Acción
amonio. celular debido a que y Gramnegativas, desodorante. Limpieza de
desorganizan la superficies ásperas
disposición de las o difíciles.

GENERAL

proteínas y fosfolípidos, aunque éstas últimas en
por lo que se liberan menor grado. Son
metabolitos desde la bactericidas,
célula, interfiriendo con fungicidas y virucidas,
el metabolismo actuando sobre virus
energético y el lipofílicos pero no
transporte activo. sobre los hidrófilos. No
tiene acción sobre las
micobacterias,
ni son esporicidas.
TABLA 3. ELEMENTOS A DESINFECTAR.

ELEMENTOS A DESINFECTAR PARTES POR MILLON
(PPM)
Agua potable 0,2
Desinfección de manos 50
Desinfección de mesas e instrumental de acero inoxidable 200
Desinfección de pisos, mesones en baldosín, ropa, útiles de aseo y 500
material plástico
Desinfección de material orgánico 5000
PREPARACION DE DESINFECTANTES
Para la preparación de los agentes desinfectantes a las concentraciones deseadas se emplea la
siguiente formula:
V1C1=V2C2
DONDE:
V1= V2*C2/ C1
V1= Volumen deseado
C1= Concentración conocida
V2= Volumen conocido
C2= Concentración deseada
Ejemplo: Hipoclorito comercial al 13% y se desea preparar al 6% un volumen de 50 mililitros = 50cc

de hipoclorito al 6%.
V1C1=V2C2
V1 (13%) =( 50ml) (6%)
V1= (50ml) (6%)/(13)%
V1= 24 ml

GENERAL
FACTORES QUE AFECTAN LA EFICACIA DE LOS ANTISEPTICOS Y

DESINFECTANTES
CONCENTRACIÓN DEL AGENTE Y TIEMPO DE ACTUACIÓN
Existe una estrecha correlación entre la concentración del agente y el tiempo necesario para matar
una determinada fracción de la población bacteriana. Si se modifica la concentración se provocan
cambios en el tiempo para lograr un mismo efecto. Un ejemplo es con los fenoles: un pequeño
cambio en la concentración provoca cambios muy acentuados en el tiempo para lograr un mismo
efecto, así, si reducimos la concentración de fenol desde un valor dado a la mitad, necesitamos
emplear 64 veces más tiempo para conseguir matar una misma proporción de bacterias.
Refiriéndonos al tiempo, no todas las bacterias mueren simultáneamente, ni siquiera cuando se
aplica un exceso del agente.
pH
Afecta tanto la carga superficial neta de la bacteria como el grado de ionización del agente. En
general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a través de las membranas
biológicas y por lo tanto son más efectivos. Los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a pH
ácidos; los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos.
TEMPERATURA
Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes. Para muchos
agentes el aumento en 10º C supone duplicar la tasa de muerte.
NATURALEZA DEL MICROORGANISMO Y OTROS FACTORES ASOCIADOS A LA POBLACIÓN

MICROBIANA.
Según la especie, fase de cultivo, presencia de cápsula o de esporas y número de microorganismos
se afecta la potencia. El bacilo tuberculoso suele resistir a los hipocloritos mejor que otras bacterias.
La presencia de cápsula o esporas suelen conferir más resistencia.
PRESENCIA DE MATERIALES EXTRAÑOS

La presencia de materia orgánica como sangre, suero o pus afecta negativamente la potencia de los
antisépticos y desinfectantes de tipo oxidantes, como los hipocloritos y de tipo desnaturalizante de
proteínas, hasta el punto de hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante.
LIMPIEZA Y ESTERILIZACION DE MATERIALES LIMPIEZA DE VIDRIERIA: La vidriería puede ser

limpiada en una solución diluida o concentrada de dicrómato de potasio y Acido sulfúrico (mezcla

GENERAL
sulfocrómica). Estas soluciones limpian y también destruyen las esporas y demás estructuras de
microorganismos que pueden ocasionar problemas en el laboratorio.
LIMPIEZA DE PORTA Y CUBRE OBJETOS: Se hace una solución de dicrómato de potasio al 5X en agua
caliente, adicionando ácido sulfúrico a bajas concentraciones en intervalos de 5 a 10 minutos. La
mezcla se debe mantener caliente por lo menos 30 minutos. Se lavan luego en agua corriente por
12 horas, se enjuagan en agua destilada y se conservan en alcohol etílico de 95%, hasta que se
necesiten. Agua, jabón y amoniaco son suficientes para remover la capa de grasa de los porta y
cubre objetos
ESTERILIZACION: Consiste en la destrucción, muerte o eliminación de las diferentes formas de vida

existentes en los objetos o sustancias y que para su utilización deben hallarse libres de dichas
formas. Entre los procedimientos más comunes para esterilizar están los siguientes: - Flameado,
incineración o combustión. - Calor seco - Calor húmedo. - Filtración. - Rayos ultravioleta. -
Desinfectantes Flameado Incineración o combustión. Se utiliza para la destrucción de objetos o para
la esterilización de aquellos que resisten el fuego directo tales como agujas, asas, vidriería especial,
cuchillas, etc. Las agujas y cuchillas deben calentarse al rojo como prueba de esterilidad, pues
aunque una exposición mucho más breve es suficiente, puede dejar dudas. Los objetos de vidrio se
dejan a la llama un tiempo prudencial procurando que la exposición a la llama llegue a toda la
superficie. Este método de esterilización es seguro, de fácil aplicación aunque de uso muy limitado.
CALOR SECO O AIRE CALIENTE. Este proceso se realiza en hornos de doble pared y recubiertos de
material aislante para conservar el calor. El aire circulante se calienta por mecheros de gas o
resistencias eléctricas. Estos aparatos tienen un termómetro en la parte superior de un dispositivo
automático para regular la temperatura. Mediante este procedimiento suelen esterilizarse los
objetos de vidrio como pipetas, cajas de Petri, tubos de ensayo, jeringas, matraces, frascos tapados
con algodón, productos químicos secos como aceites, petrólatos, óxido de zinc, carbonato de calcio,
y objetos do porcelana y metálicos. En general, cualquier objeto seco que no se ha dañado por
temperaturas altas. Para asegurar la esterilización, los objetos deben ser calentados de 150 a 180
°C por espacio de 2 a 3 horas. La temperatura de 150 °C parece ser la mínima práctica y el límite
superior, 180°, Puede ocasionar inconvenientes al carbonizar materiales como los tapones de
algodón o el papel utilizado para envolver el material de vidrio. Se debe tener en cuenta que la
eficacia de un horno de esterilización depende en gran parte de la libre circulación del aire caliente
en su interior. Se puede también utilizar el proceso, empleando temperaturas mas bajas (6O a 8O
°C) asimilándolo al método de Tyndall. (Ver página siguiente).
CALOR HÚMEDO:
a. Ebullición: Este procedimiento probablemente rara vez logra la eliminación completa de

microorganismos viables, condición de la esterilización, ya que aunque pocos minutos son
suficientes para matar las formas vegetativas, las esporas suelen resistir muchos minutos e incluso

GENERAL
horas. Desde el punto de vista práctico se constituye en un método satisfactorio si se descarta el

problema de las bacterias esporógenas, como también la contaminación del agua con patógenos
intestinales, caso que se solucionaría al hervirla durante 15 a 20 minutos. Este proceso se utiliza
generalmente para "esterilizar" jeringas, agujas, pinzas, etc. La temperatura de ebullición del agua
puede elevarse agregándole diversas sales, pero esto no tiene mucha aplicación porque ellas
pueden deteriorar el instrumental. A continuación se dan las temperaturas de ebullición de las
soluciones acuosas saturadas con algunas sales: Carbonato de sodio (NaC03) 140 °C. Cloruro de
sodio (NaCI) 109 °C Nitrato de potasio (KNO3) 115 °C Carbonato de potasio (KCO3) 135 °C Cloruro
de calcio (CaCI) 179 °C.
b. Tindalización: El material a esterilizar por ese método se calienta con vapor o con agua hirviendo
durante 30 minutos por tres días consecutivos. La primera exposición mata las células vegetativas;
una incubación durante 24 horas, después del primer calentamiento hace germinar las esporas. El
segundo calentamiento mata las células vegetativas provenientes de las esporas germinadas; en el
segundo período de incubación germinaran las esporas que dejaron de hacerlo en la primera
incubación y durante el tercer calentamiento morirán estas últimas formas vegetativas. Este
método se utiliza cuando no pueden emplearse temperaturas mayores a la de ebullición. En algunos
casos es conveniente no superar rangos o puntos precisos por ejemplo cuando es necesario
esterilizar medios como el suero sanguíneo que se coagula a 65 °C. El método de Tyndalización se
considera dispendioso y puede alterar la materia orgánica del medio, razón por la cual se usa en
raras ocasiones.
c. Vapor a presión: Es el método de esterilización más satisfactorio y más empleado en laboratorios,

hospitales y en industrias como la conservación de alimentos. El autoclave, aparato empleado para
este propósito consiste básicamente en un recipiente metálico de paredes resistentes con una tapa
o puerta diseñada para soportar altas presiones, todo complementado con un manómetro, un
termómetro, una válvula de escape y un aditamento de seguridad. Al emplear este aparato deben
tener en mente las siguientes recomendaciones:
1. Asegúrese que se le ha extraído todo el aire. Esto se comprueba cuando el vapor sale en forma
continua por la válvula de escape que debe dejarse abierta desde el inicio de la operación.
2. Una vez comprobado lo anterior, se cierra la citada válvula y se espera hasta alcanzar una presión
de 15 libras que simultáneamente debe coincidir con una temperatura de 121 °C, en este momento
se empieza a contar el tiempo de esterilización.
3. Una exposición a 1.5 libras por pulgada cuadrada durante 15 a 20 minutos es suficiente para
destruir las formas microbianas más resistentes, (las esporas bacterianas).
4. El punto anterior es suficiente si los materiales están incluidos en recipientes pequeños y

dispuestos en tal forma que el vapor penetre a todas las partes del autoclave.

GENERAL
5. Los recipientes de mayor tamaño que contengan líquidos o medios así como los apósitos y las
batas quirúrgicas, necesitan mayor tiempo de exposición.
6. Cuando ha terminado el tiempo de esterilización se deja bajar la presión lentamente pues de otra
manera el cambio brusco hará ebullir en forma violenta los líquidos, lo que ocasionaría la expulsión
de los tapones.
Testigos de esterilización en autoclave: Las pruebas de la eficiencia de esterilización se hacen

necesarias cuando a esta técnica son sometidos materiales inactivos, a diferencia de los medios de
cultivo en los que la falla del proceso se comprueba por crecimiento posterior de bacterias u hongos
contaminantes. Estas pruebas se hacen utilizando gérmenes vivos y mezclas químicas. Gérmenes
vivos: Son empleados bacilos esporulados tales como Bacillus subtilis y Bacillus mesentericus de alta
resistencia al calor. Al terminar la esterilización se hacen siembras y se incuban de 24 a 48 horas, lo
cual indicará la eficacia de la esterilización.
Mezclas Químicas: (a) Safraninia 0.01 gramo Benzonaftol 100.00 gramos La mezcla toma. color rojo
cuando es sometida a 110 °C. (b) Verde brillante 1.00 gramo Acetanilida 100.00 gramos La mezcia
da color azul se torna de color verde oscuro a 115 °C. (c) Metil violeta 1.00 gramo Hidrato da terpina
100.00 gramos La mezcla de color violata pálido se torna violeta oscuro a 117 °C. 9 (d) Acido
benzoico con puntos de fusión de 121 y 123°C adicionados de violeta de genciana y verde brillante.
Las mezclas testigos se colocan en tubos cerrados a la llama junto al material que se va a esterilizar.
Filtración: las soluciones de medios líquidos que se deterioran o pierden sus propiedades útiles por
calentamiento tales como sueros, soluciones do azúcar, soluciones para inyecciones, etc, pueden
ser esterilizados por filtración. Mediante este procedimiento se hacen pasar Ios líquidos a través de
filtros que detienen los microorganismos y las micelas orgánicas. La eficacia de estos filtros depende
del tamaño de los poros, su carga eléctrica., de Ios microorganismos, así como de las sustancias en
suspensión, coloides o grasas de los líquidos a filtrar que en muchas ocasiones hacen imposible
utilizar estos métodos Los filtros se fabrican en forma do cilindros huecos abiertos solo por una
extremidad, de porcelana, tierra de infusorios, o en forma de discos o cojincillos planos de asbesto.
Los más corrientes son los siguientes:
a. Filtros de Chamberland:
Son hechos de porcelana porosa y su grado se designa con la letra L y un número que va de l a 13
como puede verse enseguida.
L1 Deja pasar todos los microorganismos y actúa como un clarificador.
L3 Detiene esporas de Clostridium.
L5 Deja pasar partículas de 0.2 micras.
L7 Detiene los P.P.L.O.
L11 Detiene algunos virus.
L13 Deja pasar los bacteriófagos.

GENERAL
b. Filtros Berkefeld
Son hechos de tierra de infusorios más asbesto y materiales orgánicos, vienen en los siguientes
grados:
N – Normal Diámetro de los poros de 8 a 12 micras.
V - Mediano Diámetro de los poros de 5 a 7 micras.
W - Denso Diámetro de los poros do 3 a 4 micras.
c. Filtros Mandler.
Son similares a los anteriores en cuanto a los materiales de fabricación y Son hechos en 3 tipos de
porosidades: :
Preliminar.
Regular.
Fina
d. Filtros Seitz
Son discos de pasta de asbesto prensado fabricados en 2 tipos:
Seitz R clarificante, con dos grados K3, K5.

Seitz EK esterilizante que detiene bacterias.
Fuera de los anteriores están los filtros de cristal sintetizado, de colodión y los discos de celulosa-
ester. Los filtros y los aditamentos complementarios utilizados en este proceso, se esterilizan
inicialmente en autoclave a 121°C, 15 libras de presión y de 30 a 60 minutos. Este material
previamente debe ser envuelto en papel para evitar la contaminación una vez efectuada la
esterilización. En la Figura 4 se puede observar el montaje de uno de los filtros. Una vez utilizado un
filtro debe ser desinfectado y luego limpiado antes de ser esterilizado para un uso posterior.
Aunque el tratamiento depende de las clases de filtros, en general los de porcelana y tierra de
infusorios se tratan así:
1. Se hace pasar agua limpia en dirección opuesta al proceso normal de filtración
2. Se hace pasar en la misma forma NaOH al 5% para separar materiales proteínicos.
3. Nuevamente agua destilada para lavar NaOH
4. Se seca completamente.
En los filtros de vidrio se sustituye el NaOH por ácido sulfúrico concentrado caliente para evitar el
efecto disolvente del álcali sobre el vidrio.
Testigos de esterilización por filtración

Para comprobar la eficacia de este proceso se pueden seguir dos métodos:
1. Hacer siembras del líquido filtrado, incubar y observar a las 48 horas.
2. Agregar al líquido que se filtra, bacterias, como Pasteurella multocida (0.25 a 1.25 micras) e
investigar su presencia en el filtrado. Se puede aprovechar por ejemplo, la alta sensibilidad del
conejo a P. multocida que al ser inyectado por vía subcutánea muere en pocas horas.

GENERAL
TABLA 4. TIPOS DE FILTROS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA
Rayos Ultravioleta (UV)

El proceso de esterilización con Luz UV se basa en la capacidad microbicida exhibida por el espectro
electromagnético a nivel de los 4000 A. cuando este poder aumenta a medida que disminuye la
longitud de onda alcanzando un máximo a 2750 A. En las lámparas denominadas sterilamps basadas
en luz de arco de mercurio encerrado en cuarzo, se transmite una radiación de 2537 A muy próximo
al optimo y superficies metálicas, de vidrio o similares donde no cuenta su poder de penetración.
TABLA 4. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
OBJETIVOS:
1. Preparar y esterilizar el material de vidrio para su uso en el laboratorio de microbiología de
acuerdo a lo consultado y a la explicación del profesor.
2. Seleccionar y utilizar los diferentes métodos de esterilización de acuerdo con el tipo de material
contaminado.

GENERAL
MATERIALES Y MÉTODOS:
Por grupo de trabajo:
4 Cajas de Petri por estudiante
Papel kraft
LIMPIEZA DE LAS CAJAS DE PETRI

1. Esterilizar en autoclave a 121 grados Centígrados y 15 psi durante 20 minutos o más tiempo si
están muy contaminadas.
2. Quitar los desperdicios o materiales adheridos a las cajas y enjuagarlas con agua corriente.
3. Sumergir el material en una solución detergente bactericida al 2 ó 5% durante 10 minutos.
4. Lavar bien cada pieza por separado
5. Enjuagar con suficiente agua corriente, cerciorándose de que no queden restos de jabón en las
paredes.
6. Enjuagar con agua destilada.
7. Secar las cajas a temperatura ambiente o en un horno.
8. Envolver las cajas de Petri con el papel Kraft de acuerdo a la orientación del profesor.
9. Esterilizar en autoclave a 121 grados centígrados y 15 psi durante 15 minutos o en un horno
esterilizador a 180 grados centígrados durante 2 horas. El uso del autoclave asegura una mejor
esterilización.
10. Si utiliza el autoclave, debe secar las cajas en el horno.
11. Almacenar las cajas en un lugar limpio hasta el momento de su uso. Lo mismo se hace con las
pipetas y demás material que se necesite para el laboratorio de microbiología.
NOTA: Las pipetas deben llevar algodón en la parte superior. Éste se debe colocar antes de
esterilizarlas.
CUESTIONARIO:
1. Qué métodos son utilizados en el momento para la esterilización de materiales y medios de
cultivo del laboratorio de microbiología.?
2. Para que son utilizados el óxido de etíleno, las radiaciones ionizantes provenientes de Cobalto 68
y Cesio 139 y los rayos catódicos provenientes de generadores y aceleradores de electrones.
3. Qué son las membranas millipore. Para qué se utilizan.?
4. Cuál es el fundamento de la tindalización o esterilización intermitente.
5. Cuál es más eficaz como agente esterilizante, el calor seco o el calor húmedo. Porqué?
6. A qué temperatura en grados F equivalen 121 grados centígrados

GENERAL
Bibliografía:
1. Rogers, Wayne: “Sterilization of Polimer Healthcare products”. Rapra Technology Limited, p.205,
2005, U.K.
2. Agostini, Helga Sager: “Nociones básicas sobre la esterilización por Óxido de etileno”, FUDESA,
Noviembre 2002.
3. Christensen, E.A. and Kristensen, H. in: Russell, A.D.; Hugo, W.B.; Ayliffe, G.A.J.: “Principles and
Practice of Desinfection, Preservation and Sterilization, 2nd edition. Chapter 20: Gaseous
Sterilization”, p. 557. Blackwell Scientific Publications; Oxford, 1992.
4. Gardner, J.F. and Peel, M.M.: “Introduction to Sterilization and Disinfection: Sterilization by
gaseous chemicals”. Edimburgh, Churchill Livingstone, 1991.
5. Phillips, J.J. and Kaye,S.: “The sterilizing action of gaseous ethylene oxide”. Review. American
Journal of Hygiene, Vol. 50, p. 270-279, 1949.
6. Ernst RR, Shull JJ. “Ethylene oxide gaseous sterilization. Influence of method of humidification”.
Applied Microbiology, vol. 10:p. 337-341, 1962.
7. EN ISO 11135-1: 2007: “Esterilización de productos sanitarios con óxido de etileno. Parte 1:
Requisitos para el desarrollo, la validación y el control de rutina de un proceso de esterilización para
productos sanitarios”, 2007.
8. Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) Standard 24:1999:

“American National Standard for Automatic, General purpose ethylene oxide sterilizers and
Ethylene oxide sterilant sources intended for use in health care facilities”. Arlington, VA: AAMI,
1999.
9. EN 1422: 1998: “Sterilizers for medical purposes- Ethylene oxide sterilizers- Requirements and
test methods”. 1998
10. Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) Standard 41:1999:
“Ethylene oxide sterilization in health care facilities. Safety and Efectiveness”. Arlington, VA: AAMI,
1999.
11. Resolución 102: 2008: “Directrices de organización y funcionamiento de Centrales de

Esterilización y procesamiento de productos médicos en establecimientos de salud públicos y
privados”, p.12-13. Ministerio de Salud, 2008.

GENERAL
12. NFPA 560- “Standard for the Storage, Handling and Use of Ethylene Oxide for Sterilization and
Fumigation”. National Fire Protection Association, Quincy, M.A., 1996.
13. ISO 11138-2: 2006: “Sterilization of Health Care products. Biological Indicators. Parte 2: B.I. for
Ethylene oxide sterilization processes”, 2nd ed, 2006.
14. ISO 11140-1: 2005: “Sterilization of Health Care products.Chemical indicators. Parte 1: General”;
2nd ed, 2005.
15. Resolución 1547:2007: “Guía de procedimientos y Métodos de Esterilización y Desinfección para

Establecimientos de salud públicos y privados”, p.20-22. Ministerio de Salud, 2007.
16. ISO 10993-7: 2008: “Biological evaluation of medical devices- Ethylene oxide sterilization
residuals”. Second edition, Oct. 2008
17. Fowles, Jefferson: “Ethylene oxide in a food supplies: an assesments of health risks Reviews in
Food and Nutrition toxicity”, Ed. By Watson and Preedy, p. 350-353; 2004
18. International Agency for Research on Cancer (IARC): Summaries and Evaluations. Ethylene oxide
(Group I). Vol. 60 p. 73, 1994.

GENERAL
LABORATORIO No. 2: MEDIOS DE CULTIVO: (TEORÍA)
Son sustancias naturales o artificiales que los microorganismos pueden utilizar como nutrientes.
1. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Hay tres tipos principales de medios de cultivo: Naturales, sintéticos y vivos. Varían en su forma y
composición dependiendo de las especies de microorganismos que se vayan a cultivar y los
propósitos del cultivo.
1.1. Medios de cultivos naturales:
Son los medios empleados tal y como se encuentran en la naturaleza para el cultivo de los
microorganismos, como la leche, sangre diluida, jugos vegetales, etc.
1.2. Medios de cultivos sintéticos:
Tienen una composición definida. Ejemplo de éstos son los medios deshidratados que se consiguen
en el comercio en forma d polvos o granulados; son los más usados hoy en día en los laboratorios.
Aunque para trabajos de investigación se recomiendan los medios de cultivo que sean
químicamente definidos y se puedan reproducir en cualquier parte del mundo.
1.3. Medios vivos:
Son aquellos que contienen células u organismos vivos: Células de riñón de mono, huevos
embrionados, etc.
2. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
2.1 Medios de cultivo simples:
Tienen los requerimientos de cultivos mínimos y son utilizados para bacterias que son poco
exigentes.
2.2. Medios enriquecidos:
Contienen elementos altamente nutritivos a veces en forma natural como sangre,suero, huevo, etc
o enriquecidos con sustancias químicas.
2.3. Medios diferenciales:


GENERAL
Son utilizados cuando se desea poner de manifiesto una propiedad especial de una bacteria.
2.4 Medios selectivos:
Se utiliza cuando se desea suprimir el crecimiento de unos microorganismos y favorecer el desarrollo

de otros. Los medios de cultivo pueden ser líquidos, semisólidos ó sólidos. Estos medios se obtienen
mediante adicción de sustancias químicas según el caso.
3. PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
3.1. Humedad: Es necesaria para el crecimiento microbiano, para evitar la desecación que mata a
la mayor parte de microorganismos.
3.2 Fertilidad
3.3 pH. Los microorganismos tienen un pH óptimo, el cual se les debe procurar en los medios de
cultivo.
3.4 Transparencia: Es calidad primordial para observar el crecimiento microbiano.
MEDIOS DE CULTIVO (PRÁCTICA)

I.- PREPARACIÓN Y ENVASE DE MEDIOS DE CULTIVO:
Los medios de cultivo deben poseer todos los elementos necesarios para permitir la multiplicación
de los microorganismos. Pueden ser:
Líquidos: Semejantes a un caldo casero, filtrado y/o esterilizado, se envasan en tubos, frascos,
matraz.
Sólidos: A un medio líquido se le puede agragar una sustancia gelificante como el agar, de modo
que el medio se convierte en sólido, con una consistencia como de gelatina. Por calentamiento se
funde y se puede verter en diversos recipientes como tubos, frascos, y cajas de Petri.
OBJETIVOS:
1.- Diferenciar los medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología.
2.- Utilizar las técnicas necesarias para la buena preparación y conservación de un medio de cultivo.
1 Erlenmeyer de 1000 ml

GENERAL
1 Probetas de 500 ml
2 Agitador magnético
1 Espátula
2 Mecheros
1 Plancha de calentamiento con agitación
1 Balanza
Marcador o lápiz vidriograft (debe traerla el grupo)
Papel aluminio (debe traerlo el grupo)
Cinta de enmascarar
1 Encendedor (Debe traerlo el grupo)
1 Dulceabrigo o toalla para limpiar (Debe traerla el grupo)
Guía de Laboratorio de microbiología
1 Guantes de cocina (Debe traerlo el grupo)
MATERIALES SOLICITADOS POR EL PROFESOR:
25 Cajas de Petri estériles por grupo

Papel kraft
Agua destilada
Agar nutritivo o agar plate count
Agar Papa dextrosa agar (PDA)
Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC)
Cloruro de sodio
Cloranfenicol
Algodón
PROCEDIMIENTO:
1. Preparar 500 ml de agar nutritivo o plate count

2. Preparar 500 ml de agar nutritivo o plate count más 5% de cloruro de sodio
3. Preparar 500 ml de agar PDA + 5% de cloruro de sodio
4. Preparar 500 ml de DRBC
PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS:
1.- Pesar en erlenmeyer o pesasales la cantidad de medio de cultivo que va a necesitar.

2.- Agregar el agua destilada y dejar en reposo 5 minutos
3.- Al cabo de este tiempo se hierve esta solución teniendo cuidado que no se vaya a derramar.
4.- Dejar reposar un poco, taponar con algodón y sellar con papel aluminio o papel kraft.

GENERAL
5.- Colocar el erlenmeyer dentro del autoclave y esterilizar a 121 grados centígrados y 15 psi.
6.- Una vez esterilizados los medios se envasan en las cajas de Petri, siguiendo las indicaciones del
instructor. Estos procedimientos se trabajan en un ambiente estéril.
TABLA 6: COMPOSICIÓN DDE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU ESTADO FÍSICO, COMPOSICIÓN
Y PROPÓSITO.

GENERAL
PREINFORME 1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (HACERLO EN GRUPO)
Nombres del estudiante: _________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
fecha: __________________________
1. Qué nutrientes requieren los microorganismos para su crecimiento?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2. Qué propiedades deben tener los medios de cultivo?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3. Cómo es la presentación comercial de los medios de cultivo para microorganismos? Qué

ventajas tiene un medio de cultivo granulado?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4. Cómo se clasifican los medios de cultivo según su estado físico, composición y propósito?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5.- Cómo se deben conservar los medios de cultivo?


GENERAL
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- Qué requisitos se deben cumplir para una buena preparación de un medio de cultivo?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7. Qué cuidados se deben tener para el vertido del medio en las cajas de Petri y en los tubos con
agar inclinado.?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
8.- Qué posibles defectos se pueden encontrar en la manipulación y preparación de los medios
de cultivo?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
9. Cuántas clases de medios de cultivos podemos encontrar?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

GENERAL
10.
II MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE:

La presencia de microorganismos en cualquier ambiente es de especial significado para los trabajos
realizados en microbiología. El conocimiento de este hecho debe tenerse en cuenta con el propósito
de mantener libre de microorganismos los materiales hasta su utilización.
El aire carece de una microbiota propia, ya que todos sus gérmenes se encuentran allí
accidentalmente y en forma general se hallan sobre partículas sólidas en suspensión o en pequeñas
gotas de agua. Los microorganismos llegan al aire por medio del polvo, tierra seca, salpicaduras de
la corriente de agua, gotitas expulsadas al toser, estornudar o hablar, hongos que crecen en las
paredes, techos, suelos, alimentos, etc.
Los microorganismos presentes en el aire como no alcanzan a desarrollarse sólo se mantienen ahí,
persisten por lo tanto, las especies más resistentes a la desecación como las conidias y esporas de
hongos, cualquier clase de bacteria (sobre partículas de polvo o gotitas de agua), predominando los
cocos; también se pueden encontrar levaduras. El número de microorganismos está dado por
factores como: Movimiento del aire, luz solar, humedad, situación geográfica, cantidad de agua y
polvo suspendidos.
OBJETIVOS:
1. Observar el grado de contaminación de un área determinada.

2. Aislar, cuantificar y tratar de identificar los microorganismos que habitualmente se encuentran
en el área de trabajo.

GENERAL
PROCEDIMIENTO:
a) Diríjase al sitio que le corresponde analizar.

b) Destape 1 caja con agar PDA + 5% de sal, 1 caja con DRBC, 1 caja con agar plate count y una caja
con plate count agar + 5%.
c) Déjela expuesta al aire durante 20 minutos.
d) Tape la caja y séllela con cinta de enmascarar o preferiblemente con esparadrapo
e) Déjela incubando a temperatura ambiente. Observe diariamente el crecimiento de bacterias, si
tiene agar plate count o de hongos, si tiene agar PDA o DRBC.
f) Guárdelas en la nevera, cuando ya observe crecimiento en los medios de cultivo para bacterias.
g) Se harán observaciones macro y microscópicas de estos hongos y bacterias el próximo
laboratorio.
h) Se Dejerá una caja de cada medio sin abrir (Como testigos de esterilidad)
RESULTADOS:
Escribir y presentar un informe bien detallado con las diferentes observaciones realizadas. Número
de Unidades formadoras de colonias (UFC) y descripción macroscópica de hongos y bacterias.
CUESTIONARIO:
1. Porqué se utiliza el plate count

2. Que clase de microorganismos crece en agar PDA? Porqué?
3. Que sitios creen ustedes que deben permanecer libres de contaminación y cómo han
sido tratados para obtener completa esterilidad.
4. Qué otras técnicas se utilizan para el análisis microbiológico del aire.

GENERAL
BIBLIOGRAFÍA:
1. Storey E, Dangman, KH., Schenck, P., DeBernardo, RL., Yang, CS., Bracker, A., Hodgson, MJ.
Guidance for the Clinicians on the Recognition and Management of Health Effects Related to
Mold Exposure and Moisture Indoors. University of Connecticut Health Center, Division of
Occupational and Environmental Medicine, Center for Indoor Environments and Health,
Farmington, CT. 2004.
2. Hyvärinen, A., et al. Temporal and spatial variation of fungal concentrations in indoor air.
Aerosol Science & Technology, 2001; 35(2): 688-95.
3. Harmage S, Bailey, M., Raven, J., Mitakakis, T., Thien, F., Forbes, A., Guest, D., Abramson, M.,
Walters, EH. Prevalence and residential determinants of fungi within homes in Melbourne.
Australia. Clin Exp Allergy 1999; 29:1481-9.
4. Yau YH, Chandrasegaran, D., Badarudin, A. The ventilation of multiple-bed hospital wards in the
tropics: a review. Building and Environment 2011;46( 5):1125-32.
5. Guieysse B, Hort, C., Platel, V., Munoz, R., Ondarts, M., Revah, S. . Biological treatment of indoor
air for VOC removal: Potential and challenges. Biotechnology Advances. 2008.; 26(5):398-410.
6. Haas D, Habib, J., Galler, H., Buzina, W., Schlacher, R., Marth, E. Reinthaler, FF. Assessment of
indoor air in Austrian apartments with and without visible mold growth. Atmospheric
Environment 2007;41(25):5192-201.
7. Khan AAH, Karuppayil, S.M. Practices contributing to biotic pollution in Airconditioned indoor
environments. Aerobiologia. 2011;27: 85-9.

GENERAL
ESTUDIO DE AMBIENTES
PROYECTO DE AULA
ESTUDIO DE HONGOS AMBIENTALES EN INTERIORES Y EN FOSAS NASALES DE

ESTUDIANTES DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 2016B Y SU RELACIÓN CON
ALERGIAS RESPIRATORIAS
OBJETIVO GENERAL:
Cuantificar e identificar los principales géneros de hongos ambientales en ambientes interiores y

fosas nasales de estudiantes de laboratorio de microbiología 2015B y relacionar la presencia hongos
con síntomas de alergias respiratorias.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Cuantificar e identificar los principales hongos ambientales presentes en ambientes interiores de

las casas o lugares de trabajo de los estudiantes de laboratorio de Microbiología.
Conocer el número y género de hongos aislados en las fosas nasales de los estudiantes de
laboratorio de microbiología 2015b.
Determinar la sensibilización cutánea a los alérgenos fúngicos (Prick test) de los principales hongos
alergénicos presentes en el ambiente y fosas nasales.
Establecer si hay asociación entre los síntomas de alergias y el número y género de hongos aislados
en ambientes y fosas nasales de los estudiantes que manifestaron tener o haber tenido síntomas de
alergias respiratorias.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño del estudio: Se plantea realizar un estudio descriptivo, observacional de corte transversal.
Se ha diseñado un estudio para conocer la frecuencia y distribución de hongos en el interior de las
casas de los estudiantes de la asignatura de laboratorio microbiología del período 2016B.
El muestreo microbiológico se realizará utilizando un método gravimétrico aplicando la fórmula de
Omeliansky con dos medios de cultivo diferentes para hongos y bacterias. De igual forma se tomaran
muestras de fosas nasales las cuales serán sembradas en el medio de cultivo SDA. Se diseñará un
protocolo de estudio para conocer la sensibilización alérgica de la población expuesta mediante
una encuesta epidemiológica, por medio de un cuestionario anónimo y voluntario.

GENERAL
Metodología del estudio hongos ambientales
Localización del estudio: Santiago de Cali, es la capital del departamento de Valle del Cauca. Tiene
2.342.000 habitantes, posee un área de 564 km². La ciudad está ubicada en las coordenadas
3°27′00″N 76°32′00″O. Geográficamente Cali está en el valle del río Cauca, este valle tiene 35 km de
ancho y la zona urbana esta sobre el costado occidental del río. La parte occidental de la ciudad se
encuentra custodiada por Farallones de Cali, que hacen parte de la Cordillera Occidental de los
Andes colombianos.
La ciudad es plana con una elevación promedia de 1.000 msnm. Varios ríos descienden de la
Cordillera Occidental pasando por el área municipal de Cali. En el norte del municipio nacen la
Quebrada el Chocho y el río Aguacatal. En el occidente del municipio nace el río Cali, entre los
corregimientos de Felidia y La Leonera, entra al área urbana entre los cerros de Cristo Rey y las Tres
Cruces y finalmente tributa sus aguas al río Cauca en el norte de la ciudad. Más hacia el occidente
del municipio nace el río Pichindé, que marca el límite entre el corregimiento homónimo y el de Los
Andes, y muere en el río Cali cerca de El Saladito. Los ríos Cañaveralejo, Melendez y Lilí nacen en el
centro del Municipio y terminan en el Canal Intersector CVC Sur, el cual vierte sus aguas en el río
Cauca en el sur de la ciudad. En el Corregimiento de Pance, nace el río homónimo el cual tributa sus
aguas en el río Jamundí, este a su vez desemboca en el río Cauca al suroriente del municipio.
El clima es de sabana tropical. La cordillera Occidental bloquea los frentes de aire húmedo
provenientes del Océano Pacífico aunque es notable que la brisa marina llega a la ciudad. La
Cordillera Occidental tiene 2.000 m de altitud promedio en el norte de la ciudad y alcanza los 4.000
m en el sur, esto hace que en la ciudad la región suroccidental sea más lluviosa que la noroccidental.
En promedio la precipitación anual va desde los 900 mm en las zonas más secas hasta los 1.800 mm
en las zonas más lluviosas, con 1.000 mm promedio sobre la mayor parte del área Metropolitana de
Cali. La temperatura media es de 23.6 °C (74.4 °F) con un mínimo promedio de 18.7 °C (66 °F) y un
máximo promedio de 30 °C (86 °F), con un máximo absoluto de 38 °C y mínimo absoluto de 15 °C.
Las estaciones secas van de diciembre a febrero y de julio a agosto y la estación de lluvias de marzo
a mayo y de septiembre a noviembre. Si es otra localidad hacer la descripción de forma similar.
Caracterización de cada casa o lugar de trabajo. VER Cuestionario 1.
Condiciones metereológicas: La consulta de las condiciones metereológicas se harán en la Base de
datos de la Red Meteorológica Automatizada– RMA, los cuales se pueden consultar en este enlace
http://miel.cenicana.org/clima_/index.php. O a través de la estructura de la red de monitoreo de
calidad del aire – RMCA a cargo del Departamento administrativo de gestión de medio ambiente -
DAGMA que cuenta con 8 estaciones fijas y una móvil www.cali.gov.co/dagma y www.sisaire.gov.co.
Se tomaran los datos de la fecha, hora, en los diferentes sitios de muestreo. La información que se
necesita es Temperatura y Radiación Solar, Dirección y Velocidad del Viento, Pluviometría, Presión
Barométrica CO.

GENERAL
Método de muestreo ambiental: Para el muestreo de hongos anemófilos y bacterias se utilizará el

método de “deposición gravitacional horizontal con dos medios de cultivo Agar PDA + NaCl 5% y
agar DRBC para hongos y agar plate count y plate count más 5% de cloruro de sodio para bacterias.
Las placas de agar serán colocadas aproximadamente a 1,50 m del suelo, durante 20 minutos. La
técnica consiste en retirar la tapa a una placa de Petri, que contiene el medio de cultivo de manera
que la superficie del agar queda expuesta al aire durante un tiempo determinado. El método de
sedimentación en placa permite una estimación cualitativa de los microorganismos presentes en el
ambiente.
Acabado el tiempo de muestreo, la placa se incuba a temperatura ambiente, aislada de cualquier
contaminación externa, y se evitará la exposición de las mismas a la luz solar. Durante el período de
incubación hasta el desarrollo completo de las colonias viables captadas, todas las placas serán
monitorizadas, realizando conteos de las Unidades Formadoras de Colonias. 24 a 48 horas para
bacterias (después de 48 horas guardar las cajas de Petri en la nevera) y 4 a 8 días para hongos.
Hacer el recuento del número de colonias que se han desarrollado y hacer el cálculo necesario para
expresar el valor en Unidades Formadoras de Colonias por centímetro cúbico. VER PREINFORME 1.
Cultivo de hongos a partir de muestras de fosas nasales: Para obtener las muestras cada sujeto
utilizará un escobillón estéril que ha sido remojado previamente en solución salina estéril, lo
introducirá en ambas coanas, penetrando un mínimo de 15 mm y y lo rotará con suavidad para
conseguir una muestra representativa de la mucosa nasal. Los escobillones se conservaron en
solución fisiológica estéril hasta su cultivo posterior, que se realizó en un máximo de 18 horas
después de la recolección. 0,1 mL de cada muestra serán sembradas en medio Sabouraud Dextrose
Agar (Merck, Ref. 107315).
Medios de cultivo: Agar PDA con 5% de cloruro de sodio, y agar DRBC medios recomendados por
diferentes autores. El agar PDA + 5% de NaCl, es un medio de cultivo utilizado para cultivo de mohos
y levaduras patógenas y no patógenas. Se suspenden 65 g de medio deshidratado en un litro de
agua destilada, se le agrega la sal y el cloranfenicol (antibiótico) a una concentración de 50mg/L.
Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante 1 minuto para disolver completamente los
ingredientes. Evitar el sobrecalentamiento. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Distribuir y
enfriar a temperatura ambiente antes de su utilización. El medio de cultivo agar dicloran rosa de
bengala cloranfenicol (DRBC) y el APC se preparará de acuerdo a las indicaciones de la casa
comercial.
Identificación de los hongos: Para la identificación de los hongos presentes en la placa Petri se
realizará una observación macroscópica de cada colonia, analizando su anverso y el reverso.
Enseguida, se realizaban un análisis microscópico. Para la identificación microscópica de los hongos,
se harán disociaciones de las colonias y se utilizará el sistema de la cinta adherente. Se utilizará una
cinta de celofán de buena calidad, de una anchura suficiente para colocarla sobre un portaobjetos
de vidrio. Se utilizará azul de lactofenol en los dos casos.

GENERAL
El procedimiento es el siguiente, se debe seleccionar la colonia a identificar, se coloca la cinta

haciendo un poco de presión y se retira con mucho cuidado, se depositará la cara adherente con la
muestra sobre un portaobjetos de vidrio limpio y desengrasado, al que previamente se había
colocado una gota de solución de azul de lactofenol. Se extenderá la cinta sobre el portaobjetos y
con un material absorbente (algodón, gasa y/o papel secante) se presionará sobre la cinta para
eliminar el exceso del colorante y las burbujas. A partir de ese momento ya se podía realizar la
observación microscópica
Para la identificación morfológica se utilizaran las descripciones y claves (De Hoog 2000)
Cuestionario para determinar posibles afecciones alérgicas:
Se utilizarán un cuestionario adaptado a partir de un modelo estandarizado (El International
Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) en su versión validada al español para conocer
la prevalencia de asma, rinitis alérgica, conjuntivitis, eccema atópica y urticaria. VER cuestionario
2.
Se valorará el orden de las respuestas Sí/No, bien como las discursivas.
Sobre el cuestionario: Pregunta 2: Respuesta positiva para por lo menos una de las preguntas 2.2,
2.3, 2.4: se clasificará como Rinitis no diagnosticada. Comentario: La meta principal de esta pregunta
es distinguir entre individuos riníticos y no riníticos de esta población. Respuesta positiva para la
pregunta: 2.5 y/o 2.6: Conjuntivitis no diagnosticada Respuesta positiva para la pregunta: 2.7: Asma
no diagnosticada. Ver anexo 1.
3.5. Base de datos y análisis estadístico:
La descripción de las variables cuantitativas se efectuará mediante las medidas de centralización y
dispersión al uso (media y desviación típica), empleando como estimador la mediana y algunos
indicadores de posición característicos (cuartiles, rango intercuartílico y valores adyacentes superior
e inferior) en los casos de dispersión amplia o atípica de los datos.
Se compararán diferencias entre porcentajes de variables cualitativas, determinando el intervalo
de confianza del 95% de la diferencia de porcentajes apreciados o empleando la prueba estadística
de Chi cuadrado (Chi2) (o prueba exacta de Fisher), según requiera cada circunstancia.
La comparación de valores promedio en variables cuantitativas se efectuará mediante la prueba T
de Student (para datos independientes); U de Mann-Whitney, (en el caso de una distribución no
normal), o la prueba de Kruskal-Wallis (en los casos de comparaciones múltiples). O en su defecto
se aplicara ANOVA de una vía según el caso. Se utilizará para los contrastes de las variables la prueba
Chi -Square o la prueba exacta de Fisher, en función de las condiciones de aplicación. Podrán utilizar
cualquier base de datos. Les recomiendo infostat. Se aceptará un nivel de significancia con un error
α = 0.05%.

GENERAL
ESTUDIO DE MICROORGANISMOS AMBIENTALES
CUESTIONARIO 1
NOMBRE: ____________________________________ Código:______________
Email: ____________________________________________________________
I. Datos del sitio de la toma de muestra:
Ciudad: __________________ Dirección: _________________________________
Comuna: ___________ Barrio:______________________ Estracto social:________
Ubicación geográfica: Norte ( ) oriente ( ) occidente ( ) sur ( ) si es en Cali.
II. Condiciones en el momento de la toma de muestra:
Hora: __________________________ minutos de exposición: _____________________
Sitio de la casa donde expuso las cajas: ______________________________
¿Cómo se percibe el sitio? Húmedo ( ) seco ( ) cerrado ( ) abierto ( )
¿Cuántas ventanas y puertas hay en el sitio de muestreo? _________________________


GENERAL
Describa los elementos que están cerca del sitio de toma de muestra, por ejemplo, muchos libros,
muchos adornos, cortinas de tela, sitios difíciles de limpiar, sitio muy lleno de cosas entre otros.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________
¿Había corrientes de aire? Si ( ) No ( ) ¿Hay caños cerca de la casa: Si ( ) No ( )
Si la pregunta anterior es positiva trate de calcular la distancia al caño: ___________
¿Considera que cerca del sitio de la muestra hay árboles: pocos ( ) 1 a 3; moderados ( ) 4 – 5;
abundantes ( ) más de 5.
Temperatura aprox: ________Día estaba lluvioso ( ) seco ( ) soleado ( ) húmedo ( )


GENERAL
CUESTIONARIO 2
SOBRE LA CALIDAD DEL AIRE DE INTERIORES RELACIONADA CON POSIBLES REACCIONES
ALÉRGICAS PROVOCADAS POR HONGOS
Por este medio se requiere su consentimiento para contribuir a obtener algunos datos relacionados
a la condición de salud, indispensables para el estudio aeromicológico de la calidad del aire. Se los
posibles síntomas y signos, de ciertas patologías relacionadas con la calidad del aire. Si acepta
participar en este estudio responda las siguientes preguntas. Se les garantiza la confidencial de los
datos.
Fecha: _________________________________
Iniciales del nombre y apellidos ___________ Firma: _______________________
Código: ____________________
1. Tienes el diagnóstico médico de padecer alergia: SI ( ) NO ( )
1.1 Asma bronquial ( ) 1.2 conjuntivitis ( ) 1.3 Rinitis ( ) 1.4 Eccema o
urticaria: ( ) 1.5 otro ( ); especificar: ______________________________
1.6 ¿Te han especificado que alérgenos te afectan? ( ) Indicar cuál (es) ______
_______________________________________________________________
2. Si has marcado NO en la anterior pregunta:
2.1 ¿Presentas algunos de estos síntomas fuera de los procesos gripales o
Resfríos comunes?
2.2 Estornudos: ( )
2.3 Secreción abundante de moco nasal: ( )
2.4 Obstrucción y congestión nasal: ( )
2.5 Picor ocular: ( )


GENERAL
2.6 Lagrimeo: ( )
2.7 Dificultad para respirar con ruidos (pititos) en el pecho: ( )
2.8 Otros, síntomas: ( )
2.9 Indicar cuáles: _________________________________________________
______________________________________________________________
3. ¿En los últimos meses cuando ha presentado los síntomas anteriores?
3.1 Primer trimestre ( ) 3.2 Segundo trimestre 3.3 Tercer trimestre ( )
3.4 Cuarto semestre 3.5 Verano: ( ) 3.6 Invierno ( )
4. Los síntomas indicados ¿Dónde suelen presentarse con mayor frecuencia?
En ambientes exteriores 4.1.1 Urbano: ( ) 4.1.2 Rural: ( )
En ambientes interiores 4.2.1 Casa: ( ) 4.2.2 Laboratorio ( )


GENERAL
LABORATORIO 3
CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS DE BACTERIAS Y HONGOS
Después de practicada una siembra y dadas las condiciones re queridas de nutrientes, temperatura,
tiempo de incubación, presencia o ausencia de Oxígeno, según el tipo de bacteria investigada,
observamos la aparición macroscóspica de las bacterias en poblaciones, originadas a
partir de una célula y que denominamos colonias. En los medios de cultivo sólidos las colonias se
desarrollan sobre la superficie del medio presentando una morfología con características comunes
y particulares según los grupos microbianos y que constituyen uno de los primeros pasos en la
identificación de éstos.Estas características pueden presentar variaciones de pendiendo de la
composición química del medio empleado como también de las condiciones ambientales. En los
medios líquidos el crecimiento se hace aparente por turbidez en el medio. Con fines didácticos se
ha escogido los siguientes criterios que se deben tener en cuenta para la descripción de las colonias:
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS EN CAJA DE PETRI :

I. TAMAÑO
1. Grande
2. Mediana.
3. Pequeña
4. Puntiforme
II. FORMA, BORDES Y ELEVACIÓN: ( Figura 3.1)
III. SUPERFICIE
1. Lisa
2. Rugosa
IV. CONSISTENCIA:
1. Blanda
2. Dura
3. Mucoide
V. ASPECTO
1. Brillante u opaco
2. Mate o translúcida
VI PIGMENTO
1. Amarillo
2. Rojo
3. Verde
VII HEMOLISIS
1. Parcial (alfa)
2. Total (beta)
3. No hemolítica

GENERAL
Figura 3.1 Forma, bordes y elevación de las colonias bacterianas


GENERAL
1. Amarillo
2. Verde
3. Azul
CARACTERÍSTICAS MACROSCÒPICAS DE LAS COLONIAS DE HONGOS
Después de practicada una siembra y dadas las condiciones requeridas de nutrientes,

temperatura, tiempo de incubación, presencia o ausencia de Oxígeno, según el tipo de
hongo se observará la apariencia macroscópica de hongos en poblaciones, originadas a
partir de una célula y que denominamos colonias.
En los medios de cultivo sólidos las colonias se desarrollan sobre la superficie del medio
presentando una morfología con características comunes y particulares según los grupos
microbianos y que constituyen uno de los primeros pasos en la identificación de éstos. Estas
características pueden presentar variaciones de pendiendo de la composición química del
medio empleado como también de las condiciones ambientales.

GENERAL
Con fines didácticos se ha escogido los siguientes criterios que se deben tener en cuenta
para la descripción de las colonias:
Características de las colonias de hongos:
I. TEXTURA: (Se observa en el anverso de la caja de Petri)

1. Algodonosa
2. Afelpada
3. Granular
4. Polvosa
5. Pastosa
6. Algodonosa-granular
II. TOPOGRAFÍA: (Se observa por el reverso de la caja de Petri)

1. Lisa
2. Radiada o Rugosa
3. Verrugosa
III. CONSISTENCIA: (levaduras)

1. Cremosa
2. Mucosa
3. Dura- Pastosa
IV COLOR: Amarillo, Verde, Azul


GENERAL

GENERAL
B. SIEMBRA DE BACTERIAS
INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten
cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones
experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el
laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este
procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros
microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren
y contaminen los cultivos en estudio. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar
a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros,
facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma
desmembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio
OBJETIVOS:
1. Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.
2. Organizar el material para su fácil manejo e identificación.
3. Manipular adecuadamente los cultivos puros.
4. Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.
TEORÍA:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de
cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en
un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se
denomina cultivo puro ó axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se
denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es
conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste
en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros
en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-
existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.
Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio.
A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los
microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y
recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes
deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener
un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido
o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y
se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de
células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande
como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido.

GENERAL
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe
ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no
pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no
introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o carga microbiana de la
muestra (inóculo) a sembrar. Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena
conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las
superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de
una muestra microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen
los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la
esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del
microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al
conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica
aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
1. La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
2. La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de
utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se
trabaja con cultivos de microorganismos patógenos. Con relación a la concentración del inóculo, un
error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una
colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de
microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa,
será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso

microbiológico, la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta
Pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula
y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación,
hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos
dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por
ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón
o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante un asa microbiológica, un
hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo
de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie
o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la
posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de los microorganismos aerobios, por otra parte, en
este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fácil homogenizarlas, lo que
permite estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, es que en ellos es
difícil detectar contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta
Pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido

GENERAL
y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja

solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para
favorecer la separación de microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno. Los medios
sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, después
de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa,
inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al
multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les
denominan colonias, las que presentan características que varían con el tipo de microorganismo
cultivado y el medio de cultivo empleado.
En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la
mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o
ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo
de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben
proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo
de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas
con la de su hábitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren
temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas
temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura
constante, en tanto que para los microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a
temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura
ambiente.
En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de
temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos
funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. En el estudio
de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen:
tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de
esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características en medios líquidos y sólidos
en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las
colonias.
Técnicas de aislamiento
El método de siembra por estría en placa:
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de
siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la
superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri. Conforme se van haciendo estrías en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos.
A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se
continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo
este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban

GENERAL
en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de
divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon
derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan
juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos
obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada
en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad,
cultivos axénicos.
Los métodos de vertido en placa y siembra en superficie:

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa.
Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se
puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por
mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por
mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez,
pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión
bacteriana a 9 ml de medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para
diluir las células y permitir el proceso, se repite cuantas veces sea necesario. A continuación se
puede proceder de dos maneras diferentes.
En el método de vertido en placa: Las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten
en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las
colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.
En el método de siembra en superficie: Las muestras diluidas se siembran directamente en la

superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La
suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas
técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias.
Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen
en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido
en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por
dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que
el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir
de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
Para obtener un cultivo axénico mediante este método:

(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos
pocos cientos de bacterias
(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa
Petri.

GENERAL
(c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie

(más grandes).
Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un cultivo axénico:
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero
(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra
(c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri.
(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de
estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta
conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas.
(e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es
puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una
segunda placa.
Conservación de los cultivos axénicos

Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar
con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un
medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede
mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen
en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección.
Muchos laboratorios poseen una colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han
obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen
un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas
técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación
(eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Los cultivos generalmente se
desecan por liofilización (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo
líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger
las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vació para su
sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células
permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se
mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar
un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche
descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan
por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en unultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas
temperaturas.
Materiales que deben traer o pedir:

2 mecheros de gas
2 Asas bacteriólogicas/ estudiante
2 Asas micológicas

GENERAL
1 estereoscopio
1 Lámpara de mercurio
1 marcador sharpie (estudiante)
Cinta de enmascarar
Lápiz
Si desean colores
METODOLOGÍA:
1. Limpiar y esterilizar el área de trabajo
2. Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.
3. Hacer observación de bacterias y hongos
4. Describir las características de las colonias de bacterias y hongos de acuerdo con la teoría anterior.
5. Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que presente un cono azul bien marcado.
6. Marcar las cajas de Petri con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.
7. Hacer las siembras de acuerdo con las indicaciones de la profesora.
Técnicas de estriado:
a) estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de
la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe
el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera, ahora, toma una placa con agar
estéril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un
extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas),
oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un
balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.
Figura 1. Siembra por agotamiento:


GENERAL
b)estriado en cuadrantes: la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que
permite obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se
toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la
superficie de la placa con medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no
dañar el medio. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite
sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se
lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta
técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de
bacterias.
c) Siembra en caja de Petri por siembra masiva:
Este es un método para obtener un gran número de microorganismos en la superficie del agar.

GENERAL
d) Siembra en caja de Petri por la técnica de punción:


GENERAL
PREINFORME 1.
INFORME DE LOS RESULTADOS DE BACTERIAS EN AMBIENTES INTERIORES
INTERIOR ( )
No. de UFC de bacterias en APC: __________________
No. de UFC de bacterias en APC + sal: __________________
CÁLCULOS:
Contar el número de UFC en cada caja y calcular según la siguiente fórmula:
Área de la placa en cm2 ______________________ No. de UFC

1 cm2 ______________________ X
Área de la placa: π (pi) x D2/4
Donde π (pi)= 3.1416 D= Diámetro de la caja de Petri.

UFC= unidad formadora de colonias
INTERPRETACIÓN:
Límites máximos aceptables: Microorganismos mesófilos = 0.32 UFC/cm2

Bacterias patógenas = 0.025 UFC/cm2

GENERAL
INFORME DE LOS RESULTADOS DE HONGOS EN AMBIENTES INTERIORES

Para el muestreo de hongos anemófilos y bacterias se utilizará el método de “deposición
gravitacional horizontal, con la fórmula de Omeliansky” con dos medios de cultivo Agar PDA
+ NaCl 5% y agar PDA. Las placas de agar serán expuestas durante 20 minutos. La técnica
consiste en retirar la tapa a una placa de Petri, que contiene el medio de cultivo de manera
que la superficie del agar queda expuesta al aire durante un tiempo determinado. El método
de sedimentación en placa permite una estimación cualitativa de los elementos fúngicos
presentes en el ambiente.
Acabado el tiempo de muestreo, la placa se incuba a temperatura ambiente, aislada de

cualquier contaminación externa, y se evitará la exposición de las mismas a la luz solar.
Durante el período de incubación hasta el desarrollo completo de las colonias viables
captadas, todas las placas serán monitorizadas, realizando conteos de las Unidades
Formadoras de Colonias. 4 a 8 días después del muestreo, se realizará el recuento
definitivo del número de colonias que se han desarrollado y se hará el cálculo necesario
para expresar el valor en Unidades Formadoras de Colonias por centímetro cúbico. VER
ANEXO 1.
Contar el número de UFC y aplicar la siguiente fórmula:
Fórmula de Omeliansky: N = 5a x 104 (bt)-1
N = UFC/cm3
a = No. de colonias en la caja de Petri.
b = área de la caja de Petri
t = Tiempo de exposición

GENERAL
DATOS RESPUESTAS/RESULTADOS
Código (de la universidad)
Lugar
Zona
Comuna
Barrio
Arborizado
Caños o río cerca
Tráfico vehicular
Clima del día de la muestra
Altura a la que tomo la muestra
Hora exacta del día/tomo la muestra
Obra en construcción cerca
Sistema de ventilación
LAS SIGUIENTES RESPUESTAS DEBEN IR CON LOS SIGUIENTES CÓDIGOS:

LUGAR: 1: casa 2: Lugar de trabajo
ZONA: 1: Norte 2: Centro 3. Sur
ARBORIZADA*: 1: abundante 2: moderado 3. Escaso
CAÑOS O RÍOS CERCA: 1: SI 2: NO
TRÁFICO VEHICULAR**: 1:Pesado 2: moderado 3. Escaso
CLIMA: 1. Soleado 2. Lluvioso
OBRA EN CONSTRUCCIÓN: 1: SI 2: NO
SISTEMA DE VENTILACIÓN: 1: Natural 2. Ventilador 3. Aire acondicionador
*ABUNDANTE= árboles frondosos rodeando la casa o lugar de trabajo, MODERADO: presencia de arbustos
pero dan poca sombra. ESCASOS: presencia de plantas pequeñas que no dan sombra.
** Pesado (autopista o calle principal) moderado (calles alternas) escaso: (pasillos, pasan lejos de la casa).
DATOS METEREÓLOGICOS EN EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA:

FECHA DATOS METEREOLÓGICOS VALORES
T°C: Promedio de temperatura

TM°C: Temperatura máxima
Tm°C: Temperatura mínima
H% : Porcentaje de humedad
PPmm: Precipitación pluvial en mm
V K/h: Velocidad en Kilómetros/hora
VM K/h: Velocidad máxima en
Kilómetros/hora

GENERAL
RECUENTOS DE BACTERIAS EN LOS DOS MEDIOS DE CULTIVO
Medio Recuentos UFC/m3 Medio Recuentos UFC/m3
APC TOTAL: APC + sal TOTAL:

Bacteria 1 Bacteria 1
TOTAL TOTAL
RECUENTOS DE HONGOS EN LOS DOS MEDIOS DE CULTIVO
Medio/hongos Recuentos UFC/m3 Medio/hongos Recuentos UFC/m3
DRBC TOTAL PDA + sal TOTAL

Cladosporium Cladosporium
Aspergillus Aspergillus
Penicillium Penicillium
Fusarium Fusarium
Alternaria Alternaria
Acremonium Acremonium
Curvularia Curvularia
Paecilomyces Paecilomyces
Trichoderma Trichoderma
Micelio estéril Micelio estéril
Otros hongos Otros hongos


GENERAL
BACTERIAS
BACTERIAS CARACTERÍSTICAS
MACROSCÓPICAS CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICA
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Bacteria 1
Elevación: ___________________
Medio de cultivo:
( )
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Bacteria 2
Elevación: ___________________
Medio de cultivo:
( )
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Bacteria 3 Medio de
Elevación: ___________________
cultivo:
( )

GENERAL
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Bacteria 4
Elevación: ___________________
Medio de cultivo:
( )
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Elevación: ___________________
Bacteria 5
Medio de cultivo:
( )
T Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Elevación: ___________________
Bacteria 6
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Bacteria 7
Elevación: ___________________
Medio de cultivo:
( )
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Elevación: ___________________
Bacteria 8
Medio de cultivo:
( )
Textura: _____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Elevación: ___________________
Bacteria 9
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
Superficie____________________
Color: _______________________
Forma: ______________________
Borde: ______________________
Bacteria 10
Medio de cultivo: Elevación: ___________________
( )
HONGOS
HONGOS CARACTERÍSTICAS
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Hongo 1
Medio de cultivo: Consistencia: __________________
( )
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Consistencia: __________________
Hongo 2
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Consistencia: __________________
Hongo 3
Medio de cultivo:
( )
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Consistencia: __________________
Hongo 4
Medio de cultivo:
( )
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Consistencia: __________________
Hongo 5
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Hongo 6
Consistencia: __________________
Medio de cultivo:
( )
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Consistencia: __________________
Hongo 7
Medio de cultivo:
( )
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
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Hongo 8
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
HONGOS CARACTERÍSTICAS
Textura: _____________________
Color: _______________________
Topografía: ____________________
Hongo 9
Medio de cultivo: Consistencia: __________________
( )
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Hongo 10
Consistencia: __________________
Medio de cultivo:
( )
Textura: _____________________
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Consistencia: __________________
Hongo 11
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
Textura: _____________________
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Consistencia: __________________
Hongo 12
Medio de cultivo:
( )

GENERAL
LABORATORIO 4
COLORANTES
DEFINICION DE COLORANTE: Los colorantes son compuestos orgánicos o inorgánicos que tiene la
capacidad de colorear, dichos compuestos son más o menos complejos en cuanto a su estructura
molecular y de acuerdo a eso se clasifican en diversos grupos:
1.- Colorantes según su origen:
1.1.- Naturales: Son extraídos de animales y sobre todo de plantas. Ejemplos: Hematoxilina, extraída
por oxidación del tronco de una planta (HEMATEINA), el Carmín extraído de un animal
(COCHINILLA).
1.2.- Artificiales: Son preparados artificiales obtenidos en su mayoría del Alquitrán de Hulla. Son
colorantes de anilina, pueden ser ácidos, básicos y formar sales para ser neutros. Ejemplo: Cristal
Violeta, Violeta de Genciana, Fucsina Básica, Azul de metileno etc.
2.- Colorantes según su comportamiento químico: Constituidos fundamentalmente por un anillo

bencénico al que se unen distintos radicales de los cuales uno de ellos será coloreado y
corresponderá al radical cromoforo. Así pues a mayor numero de radicales cromoforos mayor será
el poder colorante de la solución.
2.1.- Ácidos o Aniónicos (-).- la carga del radical (cromoforo) es negativa. Corresponden
fundamentalmente a colorantes citoplasmáticos, ya que los citoplasmas de las células se consideran
básicos, captando muy bien los colorantes ácidos. Ejemplo: Las eosinas, las auraminas, etc.
2.2.- Básicos o Catiónicos (+).- la carga del ion cromoforo es positiva. Corresponden a colorantes que
tiñen estructuras nucleares o similares, que son acidas, es decir, cargadas negativamente. Ejemplo:
Fucsina Básica, Cristal Violeta o Violeta de Genciana, Azul de Metileno, etc.
2.3.- Neutros.- son sales compuestas de un colorante acido y un colorante básico por ejemplo el
Eosinato Azul de Metileno que, en general posee propiedades de colorante ácido y básico.
2.4.- Colorantes Indiferentes.- son insolubles en agua y solubles en alcohol donde no predomina ni
la carga positiva ni la carga negativa, pero, tampoco tienen un carácter neutro, son los colorantes
de los lípidos. Ejemplo: Sudan III, Sudan Negro, etc.
“EL PROCESO DE TINCION SUPONE UNA REACCION DE INTERCAMBIO DE IONES ENTRE EL

COLORANTE Y LOS SITIOS ACTIVOS DE LA SUPERFICIE O DEL INTERIOR DE LA CELULA, DE TAL
FORMA QUE, LOS IONES TEÑIDOS DEL COLORANTE REEMPLAZAN LOS IONES DE LOS
COMPONENTES CELULARES”

GENERAL
COLORACIÓN DE BACTERIAS
Para comprender como tiñe un colorante a la célula bacteriana, hay que saber antes que es un
colorante. Los colorantes son generalmente, sales en las que uno de sus iones tienen color. Una sal
es un compuesto formado por un ion cargado positivamente y un ion cargado negativamente. El
colorante simple azul de metíleno es la sal cloruro de azul de metileno, que se disocia de la siguiente
manera:
CAM CLORURO (-) + AZUL DE METILENO (+)
El color del colorante reside en el ion azul de metileno cargado positivamente. Las células
bacterianas tienen una débil carga negativa cuando el pH del medio externo esta cerca de la
neutralidad que es lo que generalmente ocurre. La célula bacteriana cargada negativamente se
combina con el ion azul de metileno cargado positivamente, con lo cual se tiñe la bacteria. Las
diferencias en las cargas dan lugar a una afinidad entre el colorante y la célula bacteriana.
Los colorantes se pueden dividir en dos grupos básicos y ácidos. Si el color reside en el ion positivo
se dice que es un colorante básico, si el color reside el ion cargado negativamente se dice que es un
colorante ácido.
PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS PARA LA TINCIÓN:

Con un asa de siembra coloque una gota pequeña de agua o solución salina estéril y mezcle bien
con un poco del crecimiento bacteriano del cultivo.
2. Extienda la gota sobre el portaobjetos formando una capa fina.
3. Seque los portaobjetos al aire.
4. Cuando se halla secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama del bunsen con la
capa hacia arriba. Un calor excesivo estropearía la forma normal y la estructura de los
microorganismos que se van a teñir. El propósito de fijar es matar los microorganismos, coagular el
protoplasma de la célula y como se ha dicho adherirla al portaobjetos
COLORACION DE BACTERIAS:
Debido a que las bacterias son en su mayoría casi incoloras o transparentes, se hace necesario
teñirlas aumentando el contraste de color con el medio que las rodea y facilitar su observación al
microscopio.
Objetivos:
1. Preparar extendidos o frotis en portaobjetos a partir de cultivos bacterianos del medio ambiente
y de superficies.
2. Identificar los diferentes reactivos usados para la coloración de bacterias, de acuerdo con la
estructura que se desea resaltar.
3. Utilizar las técnicas de coloración de bacterias.

GENERAL
Figura 4.1 Preparación de un frotis para colorear.


GENERAL
Materiales:
Que deben traer por grupo:
Cultivos bacterianos del medio ambiente de la clase anterior
1 caja de portaobjetos
1 caja de cubreobjetos
Cinta de enmascarar
Marcador
Encendedor
Papel períodico
Que deben pedir al almacen:

2 Mecheros Bunsen
5 Asas bacteriológicas/grupo
Cubetas para coloración
Que lleva el profesor:

Goteros con solución salina estéril
Cristal-violeta
Lugol
Alcohol-acetona
Safranina
Palillos estériles
Aceite de inmersión
COLORACIÓN DE GRAM
Uno de los procedimientos más importantes y utilizados en la caracterización de las bacterias es la
tinción de Gram. Esta técnica de tinción esta basada en la habilidad de las bacterias para retener el
cristal violeta, después de ser sometidas a la decoloración con alcohol.
Las bacterias que retienen el cristal violeta se denominan Gram positivas y aparecen de color azul
oscuro o violetas y las que se decoloran y aparecen teñidas con el colorante de contraste safranina
se observan de color rosado.
En la coloración de Gram se utilizan cuatro soluciones:

1. Cristal-violeta como colorante básico
2. Lugol como mordiente- fija el colorante primario
3. Alcohol-acetona. Retira el colorante básico si no ha quedado bien fijado.
4. Safranina – colorante de contraste- colorea las células decoloradas con el alcohol-acetona.

GENERAL
PROCEDIMIENTO
Prepare los frotis para coloración de bacterias de acuerdo al enunciado anterior (Preparación y
fijación de bacterias).
1. Tiña los frotis con el cristal violeta durante 1 minuto.
2. Lave suavemente con agua para remover el exceso de colorante
3. Aplique al frotis el lugol durante 1 minuto
4. Lave el lugol con agua (Suavemente)
5. Decolore con alcohol-acetona durante 1 minuto o hasta que no se desprenda colorante
primario.
6. Lave con agua suavemente el exceso del alcohol
7. Tiña con el colorante de contraste – safranina durante 30 segundos.
8. Lave la safranina con agua (suavemente)
9. Espere que se seque al medio ambiente
10. Observe al microscopio utilizando aceite de inmersión.
OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE PLACA BACTERIANA:

1. Coloque una gota de solución salina sobre la lámina portaobjetos.
2. Obtenga placa dental (cada estudiante) de las siguientes áreas con palillos individuales:
a) Superficie proximal
b) Superficie lingual
3. Mezcle el material obtenido con la gota de agua, en forma rotatoria
4. Marque su lámina Proceda a realizar la coloración de Gram
5. Examine las láminas con aceite de inmersión

GENERAL
TINCIÓN DE ESPORAS
Fundamento: Las especies de los géneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de formar
endosporas que son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas temperaturas y medios
adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los
nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.), formándose una espora
por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y
libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. La formación de
endosporas es un carácter de gran importancia en la biología de un microorganismo. La pared
celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana bacteriana frente a la
tinción, por lo que se utilizan técnicas especiales de coloración con verde malaquita o fucsina básica
(en caliente) como colorantes.
Material:
-Cultivo de Bacillus en medio sólido.

-Portaobjetos.
-Asa de siembra.
-Mechero Bunsen.
-Papel de filtro.
-Verde malaquita (solución acuosa al 2%).
-Safranina.
-Microscopio.
Método:
1. Hacer un frotis de cultivo en medio sólido (preferentemente de al menos 48 horas) de Bacillus

sphaericus y Bacillus thuringiensis. Secar al aire y fijar con calor.
2. Colocar el porta sobre un trípode y cubrir la preparación con papel de filtro de aproximadamente
el mismo tamaño que la extensión (tienen por objeto mantener húmeda la preparación y evitar que
los bordes del porta se manchen de colorante).
3. Añadir la solución de verde malaquita (solución acuosa al 2%), calentar con el mechero
nuevamente, sin que llegue a hervir, hasta la emisión de vapores blancos. 32 Prácticas de
Microbiología General (1º I.A.) Continuar calentando durante 5 minutos. Añadir más colorante si
éste se evapora. Es importante que la muestra no se seque.
4. Lavar con agua intensamente y quitar el papel de filtro.


GENERAL
5. Teñir con safranina (como colorante de contraste) durante 1 minuto.
6. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión. Se verá la endospora
teñida de color verde y las células vegetativas de color rojo. Interpretación de los resultados: La
posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter
taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Por ejemplo, Bacillus
sphaericus posee una endospora esférica con localización terminal y deformante de la célula
vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene
localizada la endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca un
abombamiento característico denominado en huso.
TINCIÓN DE CÁPSULA
Fundamento: La cápsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas
bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulación de material mucoso o
viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. Las cápsulas se pueden clasificar en
función del grado de asociación con la superficie celular, o por su consistencia: Cápsula rígida: con
suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partículas como las de tinta china
o nigrosina. Suele tener un límite exterior definido. Cápsula flexible: poca consistencia, de modo
que no excluye partículas. Además, es deformable y carente de límites precisos. Cápsula integral:
íntimamente asociada con la superficie celular, con la pared celular Cápsula periférica: asociada a la
superficie celular sólo en determinadas condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior.
Hay una cierta confusión en la nomenclatura de las cápsulas. Por eso cabe destacar que CÁPSULAS
en sentido estricto son aquellas de tipo rígido e integral. Capas mucilaginosas son las de tipo flexible
y periférico. Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas”, carentes de papel activo (metabólico)
pero que confieren a las bacterias importantes propiedades: • Adhesión a otras células:
microcolonias y consorcios • Adhesión a sustratos inertes o vivos: colonización de sus nichos
ecológicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores) • Protección contra agentes antibacterianos La
estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenación regular radial, o a veces en
láminas concéntricas. El material capsular se compone de macromoléculas asimétricas que, en
muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas: polisacáridos o polipéptidos.
Material:
- Cepas bacterianas: Klebsiella en medio líquido

- Tinta china
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Microscopio óptico

GENERAL
Método:
La observación a microscopía óptica en fresco es difícil, ya que su índice de refracción es similar al

del medio. Se recurre a tinción negativa por medio de nigrosina o tinta china.
1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, añadir una gota de tinta china y
mezclar bien.
2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensión de células con tinta china. Evitar que se
formen burbujas.
3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. Presionar con los
dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será absorbido por los papeles.
4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las manos con jabón.
5. Observar al microscopio, se debe de ver la célula teñida de negro y la cápsula en blanco. Trabajar
con el diafragma del condensador cerrado para aumentar el contraste de las células.
PREPARACIÓN DE COLORANTES DE GRAM:

COLORACIÓN GRAM DE HUCKER
• Cristal violeta:
- Cristal violeta Certificado (90–95% contenido del colorante)…… 40 g
- Etanol 95% ………………………………………………………………………………...400 ml
Almacenar en un frasco oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente.
• Solución de oxalato de amonio (1%):
- Oxalato de amonio (grado reactivo)…………………… 16 g
- Agua destilada………………………………………………………….. 1600 mL
Disolver y mezclar en un frasco oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente.
 Cristal violeta: Solución de trabajo
- Solución stock de cristal violeta………………………………… 40 Ml
- Solución de oxalato de amonio (1%)…………………………..160 mL


GENERAL
Filtrar la solución stock de cristal violeta en una botella de vidrio. Una vez que ha filtrado
completamente, filtrar a continuación la solución stock de oxalato de amonio. Mezclar de
acuerdo a las cantidades indicadas. Rotular y Almacenar a Temperatura ambiente.
 Mordiente:
Lugol de Gram - Cristal de yodo…………………………….. 1 gr
- Yoduro de potasio………………………… 2 gr
- Agua destilada……………………………… 300 mL
Mezclar los cristales de yodo con el yoduro de potasio en un mortero. Agregar el agua destilada
en pequeñas cantidades. Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro. Rotular y Almacenar a
temperatura ambiente. Precaución: El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la
inhalación, ingestión o contacto con la piel.
 Decolorante:
Alcohol – acetona (1:1) - Etanol 95% 500 mL - Acetona 500 mL Mezclar el Etanol con la Acetona.
Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro. Rotular y Almacenar a temperatura ambiente. La
decoloración también se puede realizar con Alcohol Etílico 95-96%. Algunos utilizan hasta
Alcohol Etílico al 90%.
 Colorante de contraste:
Safranina Solución Patrón: - Safranina O (certificada)………………….. 2,5 gr
- Etanol (95%)………………………………………. 100 mL
Prepare la solución patrón de safranina, combinando la safranina O con el alcohol etílico al 95%.
Solución de Trabajo:
- Solución Patrón de Safranina…………… 10 ml
- Agua destilada………………………………….. 90 ml Combine 10 ml de la solución patrón con 90 ml

de Agua destilada.
Almacenar la solución preparada en un frasco oscuro.


GENERAL
POSIBLES RESULTADOS
Cocos
Bacilos:
espirilos

GENERAL
BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Cocos Gram-positivos
Racimos: forma típica de Staphylococcus sp,

como S. aureus
Cadenas: forma típica de Streptococcus sp,

como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B
Tetradas: forma típica de Micrococcus sp


GENERAL
Bacilos Gram-positivos
Gruesos: forma típica de Clostridium sp,

como C. perfringens, C. septicum
Finos: forma típica de Listeria sp
Ramificados: forma típica

de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii
gráficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm


GENERAL
BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS
Cocos Gram-negativos
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N.

meningitidis
También Moraxella sp y Acinetobacter

sp aparecen con morfología de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces

aparece como coco Gram-positivo.
Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp,

que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y,
a menudo, Gram-variable.
gráficos obytenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm


GENERAL
Bacilos Gram-negativos Bacilos finos: forma

usual de enterobacteriaceae, como E. Coli
Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp,

como H. influenzae
Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V.

cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni
Forma de aguja fina: forma usual

de Fusobacterium sp

GENERAL
RESULTADOS COLORACION DE GRAM DE PLACA BACTERIANA
ZONA INTERPROXIMAL:
BIBLIOGRAFÌA
Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory Manual in General Microbiology.

Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers.
Dubuque, lowa Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos
Generales (segunda edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.
Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth edition. Mc Graw-Hill Book
Company. Seely. H; Van Demark, P. 1962.
Microbios en acción. Manual de Laboratorio para Microbiología. Editorial Blume. Madrid-España.

Tortora, Funke and Case. Introducción a la Microbiología. 9na Edición 2007. Editorial Médica
Panamericana.

GENERAL
LABORATORIO: COLORACIÓN DE HONGOS

OBJETIVOS:
1. Identificar las diferentes estructuras somáticas y reproductivas que poseen los hongos y
que son útiles para su identificación.
2. Utilizar las diferentes técnicas de montaje y coloración de hongos.
MATERIALES:
Portaobjetos y cubreobjetos
Encendedor
Marcador para vidrio
Tapabocas (personas alérgicas)
Cinta transparente adhesiva
Asas en punta dobladas
Papel toalla
Mechero Bunsen
Azul de lactofenol (ALF)
Cajas de Petri con hongos aislados del medio ambiente y superficies.
PROCEDIMIENTO:
Colonias de hongos:
Existen dos técnicas de montaje:
1. La técnica de las dos agujas:

a) Colocar una gota de azul de lactofenol (ALF) en el centro de un portaobjetos
b) Tomar con un asa curva una porción de colonia de hongos y colocarlo encima de la gota
de azul de lactofenol.
c) Con ayuda de una aguja recta estéril disociar el micelio con el objeto de hacer más
delgada la preparación que permita una mejor visualización de las estructuras del hongo.
d) Observar al microscopio primero con objetivo de 10x y posteriormente con objetivo de
40x.
2. La técnica de la cinta adhesiva transparente:

a) Colocar una gota de ALF en el centro de un portaobjetos

GENERAL
b) Tomar un pequeño fragmento de cinta transparente entre los dedos pulgar e índice, con
el lado adhesivo hacia afuera.
c) El lado adhesivo se presiona sobre la superficie de la colonia de moho
d) Colocar la cinta con el lado adhesivo hacia abajo y pegarla sobre el portaobjeto con el
ALF.
e) Observar al microscopio con objetivos de 10x y 40x.
RESULTADOS:
La observación microscópica de los hongos permite su identificación. Ud. debe tener en
cuenta:
a) Tipo de hifa: septada – no septada; pigmentada o hialina.
b) Forma, tamaño y ornamentaciones del conidioforo
c) Tipo de conidias (microconidias, macroconidias, artroconidias, clamidoconidias,
esporangiosporas, blastoconidias, poroconidias aleuroconidias).
CUESTIONARIO:
1. Qué estructuras de hongos observa
2. Son hongos hialinos o pigmentados
3. Qué géneros de hongos encontró en el medio ambiente
4. Cuáles estructuras son de reproducción asexual:
5. Cuáles estructuras son de reproducción sexual:
6. Qué estructuras se deben tener en cuenta para la identificación de los hongos.

GENERAL
LABORATORIO: ESTRUCTURAS DE LOS HONGOS

Estructura DIBUJAR DEFINICIÓN
Hifa hialina septada
Micelio

GENERAL
Blastoconidias
Artroconidia
Clamidoconidia

GENERAL
Macroconidias y microconidias
Candida albicans
Clamidosporas
Sinemas
Graphium

GENERAL
Cleistotecios (ascomicetos)
Peritecios
Chaetomiun
Zigosporas de Zigomicetos
Estructura de reproducción sexual


GENERAL
Aspergillus - fialides
Scopulariopsis-anelides
Rhizopus - esporangios

Copia de Guia de Laboratorio de Microbiologia, LDC, Agosto de 2016b (5) - 1

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GESTIÓN DE LABORATORIOS Código:

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

Elaboró Luz Dary Caicedo Bejarano Elaboró

Cargo Docente Cargo

Fecha 08.08.2106 Fecha

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

MATERIALES QUE DEBEN TRAER Y TENER DISPONIBLES EN EL MOMENTO

1. Bata de laboratorio. (Sin excusa)

2. Mascarillas, para personas que sean alérgicas a los hongos

Paños de dulce abrigo para limpiar Jabón en polvo

Esponja para lavar

Guantes de caucho para el lavado del material

Guantes de tela para la manipulación de los medios de cultivo

Cinta de enmascarar o esparadrapo

1 Encendedor (sin excusa)

Marcador de vidrio o lápiz vidriograf (sin excusa)

1 Paquete de toallas de papel

Guía de Laboratorio de Bioquímica General

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

2. El uso de bata en el laboratorio es obligatorio cuando se realizan experimentos. Es recomendable

4. Use guantes cuando debe manipular material infeccioso.

5. Subcultivos de microorganismos patógenos deben hacerse en cabina de seguridad

8. Pipetas usadas deben sumergirse inmediatamente en desinfectantes y esterilizar en autoclave.

10. Nunca humedezca etiquetas con la lengua

14. De cuenta inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como cortaduras,

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

20. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculación y de generación de

23. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.

3. Anote cuidadosamente todas las observaciones en el momento de hacerlas. El examen de

4. Los resultados o preinformes de laboratorio deben estar disponibles en cualquier momento,

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

LABORATORIO No. 1 LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN:

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

Limpieza: Es el conjunto de operaciones que permiten eliminar la suciedad visible o microscópica.

TABLA 1. LOS PRODUCTOS DE LIMPIEZA: AGENTES DESINFECTANTES

Solución: Combinación de un sólido o de un producto concentrado con agua, para obtener

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

ETAPAS DE LA LIMPIEZA Y DESINFECCION:LIMPIEZA:

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

TABLA 2. MECANISMO DE ACCION DE LOS DESINFECTANTES:

Desinfectante Mecanismos de acción Espectro de acción Usos

Aldehídos Actúan mediante la Los aldehídos tienen un

Formaldehídos El formaldehído actúa El formaldehído es un Esterilización de

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

Desinfectante Mecanismos de acción Espectro de acción Usos

Hipocloritos El mecanismo de acción Los hipocloritos tienen El hipoclorito de

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

Desinfectante Mecanismos de acción Espectro de acción Usos

Yodoforos Tienen amplio espectro La yodopovidona es El lavado de las manos,

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

Desinfectante Mecanismos de acción Espectro de acción Usos

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

Desinfectante Mecanismos de acción Espectro de acción Usos

TABLA 3. ELEMENTOS A DESINFECTAR.

Ejemplo: Hipoclorito comercial al 13% y se desea preparar al 6% un volumen de 50 mililitros = 50cc

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Versión 0.0

FACTORES QUE AFECTAN LA EFICACIA DE LOS ANTISEPTICOS Y

NATURALEZA DEL MICROORGANISMO Y OTROS FACTORES ASOCIADOS A LA POBLACIÓN

PRESENCIA DE MATERIALES EXTRAÑOS

LIMPIEZA Y ESTERILIZACION DE MATERIALES LIMPIEZA DE VIDRIERIA: La vidriería puede ser

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