Cromatografia 2019

1
Universidad de Concepción
Facultad de Farmacia
Departamento de Farmacia
ANÁLISIS DE MEDICAMENTOS
CROMATOGRAFÍA
Dra. C. Gloria Godoy Mosciatti

M.Sc. Marta de Diego Glaría
Dr. Ricardo Godoy Ramos
Dra. C. Gloria Godoy M., MSc. Marta de Diego G., Dr. Ricardo Godoy R.
Departamento de Farmacia. Facultad de Farmacia. Universidad de Concepción
2
ÍNDICE
Contenidos Nº Página
Introducción 2
Métodos Cromatográficos- Resumen 4
Parámetros Cromatográficos 5
Mecanismos Cromatográficos 10
Tratamiento de Datos 18
Sistemas Cromatográficos: 21
1. Cromatografía de Líquidos
a) Planar. 22
b) Columna.
Cromatografía líquida de alta eficiencia 26
2. Cromatografía de Gas 35
Bibliografía 47
3
INTRODUCCIÓN
Sin duda el método más utilizado para realizar separaciones analíticas es la

cromatografía, un método que tiene aplicación en todas las ramas de la
ciencia. La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la
migración diferencial de los compuestos entre dos fases, una estacionaria y
otra móvil (1, 2, 4, 5).
La cromatografía agrupa un importante y diverso conjunto de métodos que

permite separar compuestos químicos estrechamente relacionados en mezclas
complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. En
todas las separaciones cromatográficas, la muestra se disuelve en una fase
móvil (FM) que puede ser un gas, líquido o fluido supercrítico. Esta FM se hace
pasar a través de una fase estacionaria (FE) inmiscible, que puede ser un
sólido o un líquido y que se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de
la muestra se distribuyen entre la FM y la FE. Aquellos compuestos que son
retenidos con fuerza por la FE se mueven lentamente con el flujo de la FM; por
el contrario, los componentes que interactúan débilmente con la FE, se
mueven con rapidez. Como consecuencia de la diferencia en la movilidad, los
compuestos de la muestra se separan en bandas diseminadas que pueden
analizarse cuali y/o cuantitativamente (5).
Las cromatografías más comunes son: papel, capa fina, de líquidos y gas. A
pesar de sus diferencias, los mecanismos involucrados en la separación son
básicamente los mismos, donde los dos principales son la adsorción y partición
o reparto (4):
La cromatografía debe su crecimiento espectacular durante las pasadas cuatro

décadas en parte a su rapidez, simplicidad, relativamente bajo costo y a su
gran aplicabilidad como herramienta de separación y como un método de
análisis cualitativo y cuantitativo. La cromatografía cuantitativa se basa en la
comparación de la altura o del área del pico del analito con la de uno o más
estándares (5).
La Cromatografía de líquidos tiene aplicación en el análisis cualitativo o de

identidad y cuantitativo de diversas especies químicas, incluyendo a los amino
ácidos en cromatografía de intercambio iónico y la separación de mezclas
complejas de productos naturales. El análisis de formas farmacéuticas
dosificadas, especialmente aquellos con mezclas de fármacos puede realizarse
por HPLC, al igual que el estudio de estabilidad de fármacos, donde la molécula
intacta debe distinguirse de sus productos de degradación (2).
Respecto a la Cromatografía de Gas, su alta sensibilidad y especificidad

analítica permite la separación y determinación de: enantiómeros (isómeros),
solventes residuales e impurezas farmacéuticas volátiles y gran cantidad de
fármacos y excipientes en una variedad de formulaciones. Además requiere de
4
muy bajas concentraciones de muestra (µg) debido a la alta sensibilidad de los

detectores (2, 3).
En la actualidad la variedad de detectores que se incorporan a los sistemas

cromatográficos de líquidos o de gas, incluyendo los detectores de masa y de
infrarrojo, hacen de ésta técnica la más utilizada para el análisis de
medicamentos tanto cuali, como cuantitativamente.
5
METODOS CROMATOGRÁFICOS DE ÁNALISIS
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
1. Según fases estacionaria y móvil.
FE FM Denominación
Sólido Líquido Sólido – Líquido
Líquido Líquido Líquido – Líquido
Sólido Gas Sólido – Gas
Líquido Gas Líquido – Gas
2. Según tipo cromatografía.

• Planar.
• Columna.
3. Según el objetivo
• Analítica.
• Preparativa.
4. Según el mecanismo de separación

• Adsorción.
• Reparto.
• Exclusión.
• Intercambio Iónico.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA.
1. Plana.
• Clásica.
Papel PC.
Capa fina TLC.
• Instrumental HPTLC.
2. Columna.
• Clásica LC.
• Instrumental HPLC.
CROMATOGRAFÍA DE GAS.
1. Columna:
• Gas - Sólido GSC
• Gas - Líquido GLC
CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
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PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Dan una idea de la calidad del sistema cromatográfico. Existen requisitos de los
métodos que tienen relación con estos parámetros.
a) RETENCIÓN.
• tM = Tiempo que transcurre desde el punto de inyección hasta punto
de detección de un analito no retenido.
• tR’ = tR – tM. Medida de la interacción del analito con el sistema
cromatográfico.
tM Vm.
tM = Tiempo muerto.
tR = Tiempo retención.
tR’ = Tiempo retención corregido.
Vm = Volumen muerto.
A = área o altura.
b) CAPACIDAD (k).
tR − tM tR´
k= =
tM tM
Valores de k: tR = tM k= 0 tR = ∞ k= ∞ 0<k<∞
Valores óptimos: 2 ≤ k ≤ 10
Depende de la naturaleza del analito.
c) SELECTIVIDAD (α).
kb tR´b A y B son dos analitos vecinos
α= =
ka tr´a
Valores óptimos: 1,1 ≤ α ≤ 2
Depende de la afinidad del analito con la Fase Móvil (FM) y Fase Estacionaria
(FE), es independiente de las dimensiones de la columna.
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d) EFICIENCIA.
Se mide en función de los platos teóricos (N) y la altura equivalente del plato
teórico (AEPT). Para que dos analitos se separen debe ser pequeño el ancho de
la base del pico, a menor ancho, mayor número de platos teóricos, menor AEPT y
mayor eficiencia del sistema cromatográfico.
L
AEPT = L = Largo columna
N
2
 tR 
N = 16 ⋅   Wb = Ancho de la base del pico
 Wb  para picos simétricos.
2
 tR  Wh/2 = Ancho a media altura
N = 5.54 ⋅  1 
 W /2  para picos asimétricos.
Ecuación de Van Deemter.

A = Factor de Eddy o de tortuosidad.
B
AEPT = A + + C ⋅ μ B
C
=
=
Factor de difusión longitudinal.
Factor de resistencia a la transferencia de masa.
μ
µ = Flujo de FM.
A = Factor de Eddy o de tortuosidad.

Se relaciona con el tipo de empaque de la columna. A es constante por que no
sufre modificaciones por cambios de flujo, por lo tanto, sólo depende del sistema.
Si el relleno es homogéneo y de tamaño de partícula pequeño, A será menor y se
tendrá una mayor eficiencia.
Se produce a medida que las moléculas del compuesto se desplazan por la
columna hacia el detector.
AEPT
8
B = Factor de difusión longitudinal.
Tiene que ver con la difusión longitudinal de la FM, por lo tanto, se relaciona con la
densidad y viscosidad de esta. Como los gases tienen mayor difusión que los
líquidos, es más importante en cromatografía de gas que de líquido.
Depende de la difusión de la FM en el sentido del eje de la columna. Es
inversamente proporcional a la velocidad del flujo, cuando el flujo es menor se
producirá mayor difusión longitudinal y mayor ensanchamiento del pico.
AEPT
C = Factor de resistencia a la transferencia de masa.

Para que se produzca equilibrio del analito entre la FM y FE se necesita de un
tiempo, si la velocidad de flujo es alta, es menor el tiempo de que dispone el
analito para que se cumpla la constante de equilibrio (K), por lo tanto, se favorece
el ensanchamiento del pico con velocidades de flujo altas. Más importante en
cromatografía líquida que de gas.
AEPT Masa analito FE

K=
Masa analito FM
De la ecuación de Van Deemter se puede obtener el flujo óptimo: Donde está la

menor AEPT, aumentando de esta forma la eficiencia del sistema cromatográfico:
9
e) RESOLUCIÓN.
Es la medida de la calidad de la separación.
2 picos vecinos
2 ⋅ (tRB − tRA )
Rs =
WbB + WbA
α −1 k N
Rs = ⋅ ⋅
α 1+ k 4
Valores óptimos: 1,5 < RS < 2
Modificación de la resolución para optimizar la separación

FM.
• Naturaleza: Polaridad, pH.
• Flujo: Encontrar flujo óptimo.
FE.
• Largo de la columna.
• Tamaño y uniformidad de partículas FE.
Temperatura.
f) ASIMETRÍA DEL PICO.

Cuantifica el grado en que se aleja el pico de la forma gausiana. Mientras más
simétrico el pico, mejor calidad del sistema cromatográfico.
A+B
T=
2A
ALGUNAS CONSIDERACIONES.
Información que se puede obtener a partir de un cromatograma.
• Complejidad de la muestra.
• Identidad de los analitos.
• Cantidad de los analitos.
• Características y calidad del sistema cromatográfico: Resolución, factor
cola, desviación estándar de las inyecciones consecutivas de un estándar.
La separación de una mezcla compleja en varios analitos se debe a que éstos

interactúan en forma diferente con el sistema. Esto va a depender de:
• Naturaleza del analito. • Mecanismo de separación.
• Naturaleza y composición de • Velocidad de flujo de FM.
FM y FE. • Temperatura.
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MECANISMOS CROMATOGRÁFICOS
1. ADSORCIÓN.
Es un fenómeno de superficie que se presenta en CGS y CLS, es decir, en
cromatografías en que la FE es un sólido.
Las principales interacciones que ocurren son:

• Puente Hidrógeno.
• Unión dipolo-dipolo.
• Complejos de transferencia de carga.
Ocurre por competencia por la FE entre la FM y el analito. Si la unión analito-FE

es débil, el analito será poco retenido. Las FE más utilizadas son:
• Sílica gel.
• Alúmina.
• Carbonato de calcio.
• Silicato de magnesio.
En general, éste mecanismo se utiliza para compuestos polares, debido al uso de

sílica gel (naturaleza polar) como FE.
Sílica Gel
OH OH
Si O Si
O Si O O
O Si OH
Si O
O Si OH
OH
H
O Posee en su superficie grupos silanoles, uniones puente-Hidrógeno,
H uniones siloxano. Estos grupos presentan diferentes fuerzas de
H interacción con el analito. Los más activos son los silanoles que atraen
el agua presente en el ambiente, por lo tanto, la sílica gel siempre
O tiene agua adsorbida en su superficie, lo cual hace necesario secarla
H
con calentamiento para poder utilizarla, es decir, ACTIVARLA.
H
O
H
H
O Dra. C. Gloria Godoy M., MSc. Marta de Diego G., Dr. Ricardo Godoy R.
Si
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3ª capa, agua adsorbida, unión débil, se pierde a 70ºC, reversible
2ª capa, agua adsorbida, se pierde a 120ºC, reversible
1ª capa, agua fuertemente unida, se pierde a 200ºC, reversible
Grupo Silanol, pasa a siloxano (inactivo) a 450º, irreversible
Si OH Q Si
O + H2O
Si OH
Si
Las Fases Móviles usadas en cromatografía de adsorción son.
En CGS: Nitrógeno, Helio, Argón, Hidrógeno, mezclas de ellos.

En CLS: solventes como Hexano (menor polaridad) o Agua (mayor polaridad),
pero en general se usa una mezcla de solventes de la serie elutrópica.
Serie elutrópica.
Solvente Constante
dieléctrica
n-hexano 1.88
n-heptano 1.92
Eter etílico 4.33
Cloroformo 4.80
Tetrahidrofurano 7.58
Diclorometano 10.70
n-propanol 21.80
Etanol 24.30
Metanol 33.62
Acetonitrilo 37.50
Agua 80.37
La polaridad de los solventes se puede obtener consultando tablas que contienen

las constantes dieléctricas de ellos.
En consecuencia, los analitos que se separan deben tener cierta polaridad para
poder interactuar con la sílica gel (muy polar).
12
Analitos polares.
Ácidos y bases
Alcoholes polaridad
Compuestos carbonílicos disminuye
Ésteres
Hidrocarburos
Mecanismo Tipo Muestra FE FM

Cromatografía
Adsorción Fase Normal R-NH2 Sílica Gel CH3-CO-CH3
Mayor polaridad Mayor polaridad
Mayor retención Mayor poder eluyente
La sílica gel es insoluble en agua hasta pH = 7,5. Sobre éste pH la sílica se

disuelve, lo cual limita su uso para algunos analitos, por lo que se hace necesario
desarrollar adsorbentes poliméricos.
2. REPARTO O PARTICIÓN.
La interacción más importante es la entre FM y FE. Es el mecanismo de

solubilidad. No hay competencia por separación que predomina en CGL y
los sitios activos de la FE. El analito CLL, es decir, cuando la FE es un
se distribuye según su solubilidad líquido.
Fase Estacionaria.
Son líquidos inmiscibles con la FM. Como deben ocupar un lecho estacionario
grande, se preparan rellenos de la columna utilizando soportes sólidos a la forma
de pequeñas partículas recubiertas con FE. Tienen muy poca duración por lo que
ya no se usan. Actualmente se utilizan las Fases Enlazadas o Fases Unidas para
HPLC.
a) Preparación Fases Enlazadas.

Consiste en modificar la estructura de la sílica gel derivándola con diferentes
reactivos para obtener una estructura menos polar. Se obtiene una unión química
de la FE con la sílica gel.
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b) Tipos de reacciones químicas.

I. Unión Éter: Si-OR
----Si-OH + R-OH ----Si-OR + H2O
II. Unión Amino: Si-NR2
----Si-OH + SOCl2 ----Si-Cl

----Si-Cl + HNR2 ----Si-NR2 + H2O
III. Unión Carbono: Si-CR3
IV. Unión siloxano: Si-O-Si-R3
----Si-OH + Cl-SiR3 ----Si-O-Si-R3
Según el Nº de átomos de carbono de R será C-8, C-18, etc.

R puede también hacerse más polar introduciendo grupos Ciano, Amino, Diol.
Mientras más pequeña es la cadena mayor cantidad de grupos silanoles van a
reaccionar porque no existirá el impedimento estérico de las cadenas largas, y, por
lo tanto, quedarán grupos silanoles libres que actuarán por adsorción con analitos
de bajo PM y en el cromatograma se observarán picos con cola debido a que
ocurrirán también fenómenos de adsorción.
Para eliminar los silanoles libres se hace una SILANIZACIÓN con Trimetilsiloxano.
Este procedimiento se conoce como “END CAPPING”.
El R corresponde a diferentes cadenas que se introducen al sistema, logrando así

una FE de mayor o menor polaridad. Así, podemos clasificar a las fases unidas en:
• Apolares: C-8, C-18

----Si-O-Si--(CH2)n----
• Polares:
Ciano: ----CH2-CH2-CH2—CN
Amino: ----CH2-CH2-CH2—NH2
Diol: ----(CH2)3--O-- CH CH2

OH OH
Nitrofenil:
----(CH2)3--- NO2
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Fases móviles usadas en cromatografía de reparto

Se clasifican en polares y apolares.
• FM polares: Agua y Tampones. Se les puede agregar modificadores
orgánicos que le otorgan selectividad a la FM, por ejemplo:
Acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano.
• FM apolares (cromatografía en fase normal): Hexano. En este caso los
modificadores orgánicos utilizados son: Acetona, tetrahidrofurano.
Tipos de cromatografía de reparto.

Fase FE FM
Normal Polar Menos polar
Reversa o Inversa Apolar Más polar (> uso)
3. EXCLUSIÓN.
Fenómeno de separación que se basa en la diferencia de tamaño de las
moléculas. Es una cromatografía sólido-líquido.
Fase Estacionaria.
Son partículas formadas por GELES de mayor o menor grado de
entrecruzamiento, lo cual confiere las características de la FE. Las partículas de la
FE son esféricas y porosas y cuando se humectan con la FM pierden su forma
rígida y se transforman en un gel, el cual mantiene los poros. Del diámetro de
éstos dependerá la exclusión de los solutos.
Algunos Parámetros.
Vo = Volumen Interpartícula o Volumen de Exclusión Total. En él eluyen todas
las partículas de tamaño mayor que el poro de la FE.
Vt = Volumen de Permeación Total. En él eluyen todas las partículas capaces
de penetrar la FE hasta el fondo del poro.
Vi = Volumen Intrapartícula. Eluyen selectivamente los analitos según la
profundidad de penetración en el poro de la FE.
Esquema Mecanismo de Exclusión.

Columna (FE)
A B
A, B, C = analitos
C
poro
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A = Partículas más grandes que el tamaño del poro, por lo tanto, no interactúan
con la FE.
B = Partículas de tamaño intermedio, que penetran el poro según el tamaño de
éste, la profundidad será mayor mientras menor sea el tamaño de partícula.
C = Partículas que penetran hasta el fondo del poro, por lo tanto su volumen de
elución es mayor.
Los analitos cuyo tamaño sea mayor que C y menor que A podrán ser separados
selectivamente por cromatografía de exclusión.
VR = Volumen de Retención.
KD = Coeficiente de Distribución (depende del tamaño del analito).
VR = VO + KD * Vi
Si KD = 0 ⇒ VR = Vo
Si KD = 1 ⇒ VR = VO + Vi = VT
Por lo tanto, KD debe estar entre 0 y 1 ⇒ Selectividad
Fases Estacionarias.
Corresponden a geles poliméricos de carbohidratos y se pueden clasificar en:
a) Geles Blandos.
• Tienen baja resistencia mecánica, por lo tanto, no se pueden usar en
HPLC.
• Tienen gran capacidad de hidratación (hinchamiento).
b) Geles semirrígidos.
• Polímeros de alto grado de entrecruzamiento.
• Pueden ser usados en HPLC por ser estables mecánicamente.
• Son termolábiles.
c) Geles rígidos.
• Se preparan con sílica porosa o vidrio unido a grupos dioles.
• Tienen alta resistencia mecánica.
• Son termoestables.
• Son menos eficientes en la separación.
Fases Móviles.
Pueden ser de dos tipos
a) Solventes Orgánicos. a) Tampones.
• Tetrahidrofurano.
Esto se debe a que en cromatografía de exclusión existen dos tipos de

separaciones:
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I) Permeación: Se aplica para analitos solubles en solventes orgánicos. Se le

denomina Cromatografía de Permeación de Geles (CPG). Se usa en la
separación de polímeros sintéticos.
II) Filtración: Se aplica para analitos solubles en solventes acuosos. Se le

denomina Cromatografía de Filtración de Geles (CFG). Se usa en la
separación de polímeros biológicos.
4. INTERCAMBIO IÓNICO.
• Es una cromatografía Sólido-Líquido.
• La separación ocurre por una interacción iónica entre la FE iónica y el
soluto iónico de signo opuesto. La FM también es iónica y existe una
competencia de FM y soluto por la FE. La FE retiene el analito iónico de
signo opuesto a ella, intercambiándolo por iones de la FM.
• Es un proceso reversible y puede ser aniónico o catiónico.
• Los analitos son moléculas cargadas o ionizadas y la FE está constituída
por RESINAS DE INTERCAMBIO IÓNICO que constan de una matriz y
grupos funcionales que pueden tener carga aniónica o catiónica.
• La matriz puede ser un núcleo de sílice o polímeros como el Estireno o
Divinilbenceno, al cual se le adosan los grupos funcionales cargados.
Fases Estacionarias.
a) Resina de intercambio aniónico.
+ +
- -
O ----N-(CH3)3 NH4-CH3 -COO
analito FE FM
b) Resina de intercambio catiónico.
+
NH3 - + -
R SO3 Na HCOO
H3C CH COOH
analito FM
FE
La mayor aplicación es el análisis de aminoácidos.

Fases móviles.
Corresponden a tampones de pH y fuerza iónica conocidos y controlados. Se les
puede agregar modificadores orgánicos para aumentar la selectividad del proceso.
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Sales más usadas para Intervalo útil de pH

tampones (ion activo)
(Fosfato) Amónico 2.2 - 6.5
(Formiato) Sódico 3.0 - 4.4
(Acetato) Sódico 4.2 - 5.4
(Acetato) Amónico 8.6 – 9.8
(Borato) Sódico 8.0 – 9.8
(Fosfato) Hidrógeno y Sodio 2.0 – 6.0
Ejemplo:
FE.
Intercambio Catiónico Intercambio Aniónico
Ácido Fuerte Ácido Débil Base Fuerte Base Débil
-SO3H -COOH NR3+ NH3+
-PO3H
Matriz.
CH=CH2 CH=CH2
(1) (1)
CH=CH2
(1) = En éstas posiciones se unen los grupos funcionales cargados para darles
las características aniónicas o catiónicas.
Intercambio Catiónico.
Fuerte Débil
SO3- H+ COO- H+
Intercambio Aniónico.
Fuerte
Débil
CH2-NR3+ Cl- CH2-NH3+ Cl-
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TRATAMIENTO DE DATOS
ANÁLISIS CUALITATIVO
1. Retención.
• tR – tR´.
• Correlación con la estructura. Se realiza con series homólogas.
n-alcanos
log tR n-alcoholes
Nº átm C
• Datos bibliográficos
2. Recarga.
• Se utiliza principalmente para mezclas complejas.
Muestra sola
Si se cree que X es el analito que
se quiere identificar (ej. Aspirina), se
realiza una recarga, en la cual se
introduce la muestra más un
estándar de aspirina.
Muestra más recarga

Se realizó la recarga y se obtuvo un
nuevo cromatograma, en el que se
produce un aumento del pico de X,
con lo cual se puede decir que
probablemente X era aspirina.
Si aparece un nuevo pico, X
X definitivamente no era aspirina.
3. Identidad post elución.

• Espectroscopía I.R.
• Espectrometría de masa.
Se trabaja por comparación de espectros.
19
ANÁLISIS CUANTITATIVO.
1. Altura del pico.
2. Área del pico.
a) Normalización interna.
Fundamento.
• La cantidad de un compuesto es el porcentaje de área de él relativo al
área total.
Requisitos.
• Cada analito origina un pico.
• Todos los analitos son eluidos.
• El detector entrega igual respuesta a cada analito. Si esto no ocurre se
deben calcular los factores de respuesta para cada analito.
Procedimiento.
ÁreaC Respuesta del detector igual para

%C = x 100 todos los analitos.
ΣÁreas
ÁreaC x Factor C
%C = x 100 F = Factor respuesta
ΣÁreas x ΣFactor
% Compuesto en la mezcla
F= se calcula con estándares puros.
Área
b) Estándar externo
Fundamento.
• Comparación del área o altura del analito y el área o altura del estándar
obtenidas por separado.
Requisitos.
• Inyección reproducible.
• Condiciones cromatográficas estables.
• Respuesta lineal amplia del detector.
• Matriz del estándar similar al analito.
Se aplica principalmente para análisis de muestras simples.
Procedimiento.
• Fórmula.
M = muestra.
AM
CM = x CS S = Estándar.
AS A = Área o altura.
C = concentración
• Curva calibración.
20
c) Estándar interno.
Fundamento: Comparación del área o altura de muestra y estándar relativos a un
estándar interno.
M = Muestra.
S = Estándar.
SI = Estándar
Interno.
M SI S SI
Requisitos estándar interno.

• Puro.
• Eluir bien resuelto.
• No contenido en la muestra.
• Nivel de concentración similar al analito.
• Características físicoquímicas similares al analito.
Características.
• Muy preciso.
• Independiente del volumen inyectado.
• Adecuado para matrices complejas.
Procedimiento:
• Fórmula.
M = muestra.
S = Estándar.
AM/ASI
CM = x CS SI = Estándar Interno
AS/ASI A = Área o altura.
C = concentración
• Curva calibración.
21
SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS
ELECCIÓN DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO
• Debe elegirse según las características del analito.

• La cromatografía más usada para el análisis de compuestos orgánicos de
interés biológico, es la de líquidos.
• La cromatografía de gas se prefiere para analitos volátiles.
MUESTRA
ANALITOS
VOLÁTILES NO VOLÁTILES
CROM GASEOSA PM > 30000 PM < 30000
C. PERMEACIÓN GELES CROM. LÍQUIDOS

C. FILTRACIÓN GELES (Fase normal o reversa)
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CROMATOGRAFÍA PLANAR
DEFINICIÓN.
Método de separación por migración diferencial de los analitos de una mezcla, que
se realiza entre FM y FE.
CARACTERÍSTICAS
FE = lecho que se distribuye homogéneamente sobre una superficie plana
(≈ 0.15 mm de espesor) que puede ser una placa de vidrio o papel.
MÉTODO CROMATOGRÁFICO.
Principalmente adsorción.
ETAPAS.
1. Introducción de la muestra o siembra.
Consiste en depositar la muestra disuelta en un solvente volátil sobre la FE. Puede
hacerse de dos formas:
Con aplicador.
Con micropipeta.
La cantidad de muestra que se siembra debe ser pequeña para no producir
deformaciones en la distribución del analito (diámetro no mayor a 0.5 cm).
2. Separación de los analitos o desarrollo.

Se realiza en cámaras de desarrollo (verticales y horizontales) perfectamente
herméticas. Se produce el desplazamiento de la FM a través de la FE por
capilaridad.
Dentro de las cámaras se coloca una pequeña cantidad de FM (1 a 2 cm de altura
en las cámaras verticales). En un tiempo determinado se produce el equilibrio
entre la FM líquida y gas. De esta forma, en las cámaras de desarrollo existe una
fase gas de FM, que si cambia sus características a través del tiempo y puede
provocar diferencias en la separación. Para evitar este problema se introduce un
gas inerte como helio o nitrógeno. De ésta forma se asegura que el sistema
permanezca uniforme durante todo el desarrollo cromatográfico.
En esta etapa se verifican los mecanismos de separación ya mencionados, que
dependerán de la interacción del soluto con la FE.
El desarrollo puede ser de tres tipos:
• Ascendente (capilaridad).
• Descendente (gravedad).
• Circular (capilaridad radial).
23
3. Detección o revelado.
Existen tres métodos distintos:
• Método Químico: Se basa en reacciones de reconocimiento (análisis
funcional). Se puede aplicar por ASPERSIÓN ó INMERSIÓN.
• Métodos Físicos:
IRRADIACIÓN ULTRAVIOLETA: Por fluorescencia del analito, o bien por
fluorescencia de la FE.
RADIOACTIVIDAD.
• Métodos Biológicos:
Reacción Enzima-Sustrato para analitos específicos.
Microbiológicos.
4. Tratamiento de datos.
Se obtiene una placa o un papel, del cual se puede hacer un análisis cualitativo y
cuantitativo.
Análisis Cualitativo.
a = desplazamiento FM
b
RF = b = desplazamiento analito
a
• a
b
•
RF = factor de retardo, que es la razón entre la distancia recorrida por el analito y

la distancia recorrida por la FM. Es muy dependiente de las condiciones de
temperatura, humedad, espesor de FE, tipo de FE. Por ésta razón siempre debe
hacerse el desarrollo con estándares en forma simultánea (ventaja).
Los valores de RF fluctúan entre 0 y 1 (0 indica que el analito no migra y 1 indica
que se desplaza junto con la FM) y están tabulados para cada analito en
condiciones de trabajo específicas.
También se puede identificar el analito retirándolo de la placa para practicarle
análisis espectroscópicos UV, IR, espectrometría de Masas.
Análisis Cuantitativo.
a) Retirar el analito desde la placa raspando o recortando cuando la FE es
papel, se separa el analito desde la FE con un solvente adecuado y con
ésta solución se practica el análisis cuantitativo: absorciometría,
fluorescencia, reactivo cromogénico.
b) Determinación directa sobre la placa midiendo transmitancia. Lo que más

se utiliza es la reemisión, que consiste en hacer llegar luz a la placa en
cierto ángulo, y se mide la luz reflejada, si existe un analito que absorba a
cierta longitud de onda, obtendremos una medida cuantitativa según la
Ley de Lambert-Beer (HPTLC).
24
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS.
1. Resolución.
d1 ∆X
∆x RS =
0.5 (d 1 + d 2 )
d2
2. Selectividad y eficiencia.
a)
b) Aumento eficiencia:
- cambio tamaño de FE
- usando cámaras más estrechas
- modificando FM
c) Aumento selectividad:
- cambio tipo FE
- cambio tipo FM
Desarrollo Bidimensional.
Se utiliza cuando hay analitos difíciles de separar. Se logra una mejor resolución.
Se desarrolla la placa con una FM en un sentido, luego se gira la placa en 90º y se

desarrolla en otro sentido con la misma o con otra FM:
•
• • •
• • •
•
• • S1 • • • • • • S2
con un solvente con otro solvente
25
OPTIMIZACIÓN DE LA DETECCIÓN.
Se logra a través de la preparación de derivados, con reactivos reveladores,
dependerá de la función principal del analito.
Se pueden realizar:
1. Derivados UV ó VIS absorbentes:
N, N-dimetil-p-aminobenzaldehído para alcoholes, fenoles, aminas.
2,4-dinitrofenilhidrazina para cetonas, aldehídos.
Isotiocianato de Fenilo para aminoácidos.
2. Derivados Fluorescentes:
Cloruro de Dansilo para aminas, fenoles, aminoácidos.
Dansilhidrazina para aldehídos, cetonas, azúcares.
o-ftaldehído para aminoácidos, azúcares.
Fluorescamina para alcaloides, aminoácidos.
26
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS EN COLUMNA CLÁSICA

DEFINICIÓN.
Al igual que la cromatografía planar, es un método de separación por migración
diferencial de los analitos de una mezcla entre FM y FE, su principal diferencia es
que es un sistema cerrado que emplea columnas para la separación.
Actualmente la mayor aplicación de la cromatografía en columna clásica es en
análisis preparativos.
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA

DEFINICIÓN.
Su principal diferencia con la cromatografía de líquidos en columna clásica es el
aumento de la eficiencia por disminución del tamaño del gránulo de la FE, con lo
cual, se hace necesario utilizar bombas que den mayor presión a la FM.
Variación de la presión según tamaño de partícula y tipo de FM

(flujo 1 mL/ min)
Fase Móvil Tamaño Presión

Partícula (psi)
Agua 5 2000
10 600
40 200
Hexano 5 600
10 200
40 100
CARACTERÍSTICAS.
Fase móvil.
• En recipiente cerrado Fase gas y líquido en relación constante
debido a que contienen solventes orgánicos volátiles Variación de la
composición de la FM a través del tiempo.
• Filtrada y desgasificada: Ultrasonido – Ebullición – Gas adsorbente (He)
– Filtración al vacío (filtros 0,45 µ).
27
Bombas.
• En serie o paralelo.
• Poseen válvulas unidireccionales que permiten flujo en un solo sentido;
Deben lavarse luego de realizar los análisis.
MECANISMOS CROMATOGRÁFICOS.
• Principalmente Adsorción y Reparto.
• También Exclusión e Intercambio iónico
SISTEMA CROMATOGRÁFICO.
ETAPAS.
1) Introducción de la muestra.
• Mediante válvulas de inyección: Dispositivos que muestran variación de
precisión no mayor que 0.5%. La mayoría posee 6 puertas (conectadas
de a dos).
• La muestra disuelta en solvente adecuado se introduce en el bucle
mediante jeringas. Luego se gira la válvula, la FM entra al bucle y se
produce el paso de la muestra a la columna.
• Bucle o Loop: Tubos de acero inoxidable de volumen exacto, conectados
a la entrada de la muestra. Se debe inyectar volumen mayor que el del
bucle para asegurar que se llene completamente, el exceso se elimina
por drenaje.
28
Válvulas de Inyección
Características de la muestra para análisis por HPLC.

• Solución libre de partículas (centrifugación y/o filtración).
• Solvente miscible con la FM.
• Solubilidad del soluto en la FM, especialmente en gradientes de
composición.
• Compatibilidad del solvente de la muestra con el detector y la FE.
2) Separación de los analitos.

El sistema de separación son las columnas cromatográficas.
• FE recubriendo soporte • Largo: 3-30 cm.
(relleno). • Preparadas
• Material: Acero, vidrio o comercialmente con
plástico (con protección rellenos homogéneos.
metálica).
• Diámetro interno: 2-6 mm.
Criterios para seleccionar la FM.

• Naturaleza química de los componentes de la muestra y su solubilidad en
la FM.
• Mecanismo cromatográfico.
• Compatibilidad con el detector.
• No debe contener cloruros (reacciona con el acero).
• Costo.
• Indice Refracción: Debe conocerse cuando se utiliza un detector de
índice de refracción.
• Corte al UV: Mínima λ que permite trabajar en forma cuantitativa. Ej.
Metanol λ corte= 204.
• Punto ebullición: Importante cuando se utiliza temperatura para optimizar
la separación.
• Viscosidad: Importante por la presión que soporta la cabeza de la
columna. A mayor presión, menor será su vida útil.
29
Cuidado columnas cromatográficas.

Pre columnas: Pequeñas columnas con relleno similar a la columna
cromatográfica, pero con partículas de diámetro mayor, cuyo objetivo es evitar la
contaminación de la FE por analitos retenidos en forma irreversible (los analitos
se quedarán retenidos en la pre columna). Se colocan entre la válvula de
inyección y la cabeza de la columna.
Fases estacionarias.
a) Cromatografía en fase normal.
• Amino : -NH2
• Ciano : -CN
• Diol : -Si-O-CH2-CH-CH2-OH
O OH
-Si-
b) Cromatografía en fase inversa

• Dimetilsilil : -Si-(CH3)2.
• Octilsilil : -Si-CH2-(CH2)6-CH3.
• Octadecilsilil : -Si-CH2-(CH2)16-CH3.
• Fenilsilil : -Si-C6H5.
c) Cromatografía de adsorción
• Alúmina : -Al-O-Al-
• Gel de -Si-O-Si-
sílice :
OH OH
Fases estacionarias modernas.

a) Núcleo sólido
Las columnas de núcleo sólido, están hechas de un núcleo sólido y una capa
porosa (superficie cromatográficamente activa) para una separación altamente
eficiente con una velocidad de flujo rápida y una contrapresión relativamente baja
b) Monolíticas
Las columnas monolíticas están hechas de una única pieza de varillas monolíticas
altamente porosas de sílice con una estructura de poro bimodal, de macroporos y
mesoporos. Los macroporos permiten un flujo rápido de la fase móvil a baja
presión y los mesoporos proporcionan un alto área superficial para una buena
eficiencia.
30
3) Detección de los analitos.

Los detectores miden una característica del analito y lo entregan a la forma de
señal electrónica, siendo su respuesta proporcional a la concentración del analito.
Características de la respuesta de un detector.
N = ruido
CMD = Conc. mínima detectable
R = respuesta
C = Concentración
Sensibilidad : ∆R/∆C
La calidad de un detector está determinada por

• Ruido • Linealidad
• Sensibilidad • CMD
Tipos de detectores en HPLC.

a) Índice refracción.
b) Ultravioleta.
• λ Variable.
• Fila de diodos.
c) Electroquímico.
d) Fluorescencia.
e) Infrarrojo.
f) Espectrometría de masa.
a) Indice de refracción.
Posee una cubeta en la cual por un lado pasa FM y por el otro lado FM más
analito separado, produciéndose de esta forma una diferencia en el IR lo que se
traduce en un pico cromatográfico.
Características:
• Universal. • Sensible a cambios de
• Moderada sensibilidad. temperatura.
• Generalmente no útil para • Difícil de usar con elución en
análisis de trazas. gradiente.
• No destructivo.
31
b) Ultravioleta.
Según grupos funcionales del compuesto, se utiliza o no un detector UV. Los
siguientes compuestos no absorben a 254 nm.
• Azúcares. • Triglicéridos.
• Esteroides. • Barbitúricos.
• Metilésteres. • Hidrocarburos.
• Ácidos carboxílicos. • Polímeros (la mayoría).
- λ variable.
Posee lámpara de deuterio y monocromador para seleccionar la longitud de onda.
Características:
• Alta sensibilidad. • No destructivo.
• Rango lineal amplio. • Capacidad de elución en
• Bajo límite de detección. gradiente.
• Fácil manejo. • La λ puede ser seleccionada.
- Fila de diodos (DAD).

Trabaja con diferentes λ en una misma corrida. Entrega un cromatograma
tridimensional, lo que permite determinar la pureza de una muestra. Permite
obtener el cromatograma y espectrograma.
c) Electroquímico.
Responde a compuestos que se oxidan o reducen.
Características.
• Alta sensibilidad.
d) Fluorescencia.
Posee lámpara de xenón cuya luz pasa a través de un filtro de excitación, el cual
proporciona la longitud de onda deseada para excitar las moléculas del analito.
Características.
• Alta sensibilidad.
• Alta selectividad.
Comparación detectores.
Parámetro Indice Abs. Electro- Fluores-

Refrac. UV-VIS químico cencia.
Lím. detección (ng) 100 0.1 0.01 0.001
Sensibilidad (g/mL) 10-7 10-8 10-10 10-11
Rango Lineal 104 105 106
102
Gradiente No Si No Si
32
OPTIMIZACIÓN.
1. Optimización de la detección.
a) Preparación de derivados.
Pre columna : El derivado se prepara antes de inyectar la muestra.
Post columna : Requiere de un dispositivo especial con un reactor.
Derivados.
Tipo analito Reactivo Detección
O
Ácidos U.V (HPLC) pre columna
C
carboxílicos
CH2Br
Bromuro de Fenacilo
(Phenacyl-8)
SO2Cl
Aminas Fluorescencia (HPLC) pre columna

primarias U.V (HPLC) pre columna
N(CH3)2
Cloruro de Dansilo
CHO
Captura electrónica (GC) pre columna
CHO Fluorescencia (HPLC) pre o post columna
Orto Aldehido
O
OH
Aminas Visible (TLC, HPTLC. HPLC) post columna
primarias OH
secundarias O
y Ninhidrina
alcoholes
N C S U.V (HPLC) pre columna
Fenilisotiocianato
b) Uniendo detectores en serie:

I. Refracción + UV-VI. UV-VIS + Electroquímico.
Dos U.V a diferente λ.
33
2. Optimización de la separación.
a) Variación de la proporción de FM.

PH. Polaridad. Fuerza iónica.
Metanol : Agua (60:40) Acetonitrilo : Agua (50:50)
1 2 3 4 1 2 3 4
Tetrahidrofurano : Agua (37:63) ACN : THF : Agua (14:19:67)
1 2 3 4 1 2 3 4
b) Modificación del solvente de la muestra.

La muestra puede interaccionar con el solvente en que está disuelta modificando
los cromatogramas, por lo tanto, siempre se debe tratar de usar FM como el
solvente de la muestra.
Fase móvil Metanol Isopropanol
N = 8382 N = 6526 N = 4272
c) Columnas conectadas.
Se utiliza principalmente en mezclas de varios compuestos con el fin de mejorar la
resolución. Requiere de válvulas de alta sincronización.
d) Variación del flujo.

Aplicando la ecuación de Van Deemter, para la obtención del flujo óptimo que
originará la menor HEPT.
34
APLICACIÓN AL ANÁLISIS DE MEDICAMENTOS
• Determinación cuantitativa de fármacos en materias primas y formas

farmacéuticas diversas.
• Determinación de la estabilidad y productos de degradación de
medicamentos.
• Determinación de fármacos en líquidos biológicos.
35
CROMATOGRAFÍA DE GAS
DEFINICIÓN.
La cromatografía de gas es una técnica de separación de compuestos volátiles por
percolación de una fase móvil al estado de gas que los transporta, en una fase
estacionaria que se encuentra dentro de una columna.
CARACTERÍSTICAS.
• La retención de los analitos depende del tipo y grado de interacción con la
fase estacionaria y de su volatilidad.
• La columna se somete a una temperatura controlada para aumentar la
volatilidad de los analitos y reducir los tiempos de retención.
CLASIFICACIÓN.
• Cromatografia de gas-sólido.
• Cromatografia de gas-líquido.
MECANISMO CROMATOGRÁFICO.
• Principalmente reparto.
SISTEMA CROMATOGRÁFICO.
Permite la separación de mezclas de analitos al estado gaseoso, consta de los
siguientes elementos:
1. Sistema de suministro de fase móvil.
2. Sistema de introducción de la muestra.
3. Sistema de separación.
4. Sistema de detección.
5. Sistema de procesamiento de datos (integrador, registrador, computador).
36
Fase móvil.
El uso de un gas como fase móvil permite que se establezcan rápidos equilibrios
entre las dos fases, los gases tienen baja resistencia al flujo por lo que se puede
utilizar columnas largas con alto poder de separación. Las condiciones de flujo
deben mantenerse constantes y reproducibles. El sistema de suministro de fase
móvil consta de los siguientes elementos:
a) Cilindro de gas o generador.
b) Regulador de dos etapas.
c) Trampas: tamiz molecular (vapor de agua o aceites) y catalizadores de
cobre o níquel (oxígeno).
d) Reguladores de presión y/o flujo.
e) Controlador de flujo.
f) Controlador de presión.
Medidores de flujo: rotámetro, medidor de burbuja de jabón.
Características del gas de arrastre.

• Inerte frente a la muestra y al sistema.
• Puro.
• Compatible con el detector.
• Bajo costo.
Los gases más utilizados son helio, hidrógeno, nitrógeno y argón.
ETAPAS.
1. Sistema de introducción de muestras.
El inyector es una cámara que se conecta a la columna. Su función es recibir la
muestra al estado de gas líquido o solución, vaporizarla instantáneamente y
entregar el material vaporizado en la cabeza de la columna analítica.
Muestras líquidas.
Líquidos, mezclas de líquidos, sólidos en solución.
Jeringas: volumen de muestra a inyectar:
• Columnas empacadas : 1 a 5 µL.
• Columnas capilares : 0,1 a 2,0 µL.
Requisitos del solvente de la muestra.

• Solubilizar todos los componentes de la muestra.
• No ser retenido por la fase estacionaria.
• No reaccionar químicamente con el sistema cromatográfico.
• No contaminar el detector.
37
Espacio de cabeza.
Es un sistema especial de introducción de muestras. El análisis del espacio de
cabeza determina en forma indirecta los constituyentes volátiles de muestras
líquidas o sólidas, analizando la fase vapor que está en equilibrio termodinámico
con la muestra en un espacio cerrado.
Muestras gaseosas.
• Válvulas, reproducibilidad 0,5% relativo al portamuestra.
• Jeringas herméticas hasta 50 mL, reproducibilidad 1%.
• Inyectores automáticos: procesan un gran número de muestras, son
dispositivos generalmente neumáticos, controlados electrónicamente.
2. Sistema de separación: columnas

La columna es el componente principal del sistema cromatográfico, en la que se
verifican las interacciones selectivas analito-fase estacionaria que permiten la
separación de los componentes de la muestra.
Todos los componentes de la muestra, que han sido volatilizados en el inyector,

permanecen el mismo tiempo en la fase móvil. La separación de ellos ocurre por el
retardo diferente que experimentan al interaccionar con la fase estacionaria.
La columna es un tubo abierto por ambos extremos. En su interior se encuentra la

fase estacionaria dispuesta como una fina película, ya sea recubriendo la pared
interior del tubo (columnas capilares), o bien rodeando partículas pequeñas de un
material sólido con el que se rellena la columna (columnas empacadas).
Características de la columna.
a) Material del tubo.
• Metálicas: cobre, aluminio, acero, níquel.
• Vidrio: borosilicato, cuarzo.
• Polímeros: teflón.
El material del tubo se elige según el tipo de muestra, la temperatura
requerida y la inercia química del material.
b) Largo y diámetro del tubo.

• Capilares: 10 a 100 metros x 0,2 a 0,75 mm
• Empacadas: 2 a 6 metros x 2 a 20 mm
Las dimensiones de la columna se seleccionan de acuerdo al objetivo del
análisis cromatografía preparativa o analítica.
38
c) Características del relleno.

Material sólido que sustenta la fase estacionaria llamado soporte. El
relleno debe ser homogéneo, la fase estacionaria debe recubrir por
completo los gránulos del soporte para que así éste no intervenga en la
interacción con los componentes de la muestra.
Soporte.
El soporte ideal debe ser.
• Químicamente inerte para todo tipo de muestras. Depende de la
naturaleza del material.
• Forma regular y tamaño uniforme.
• De gran superficie.
• Capaz de sostener a la fase líquida en forma de película.
• De una gran relación área/peso.
Naturaleza del soporte.

En más de un 90% de las aplicaciones de la cromatografía de gas con columnas
empacadas, el soporte utilizado es la tierra de diatomeas o derivados de ella, cuyo
componente principal es silica amorfa con pequeñas cantidades de alúmina e
impurezas como óxidos metálicos.
Otros materiales de soporte de alguna importancia son: Fluorcarbonos como

Teflon-6, Fluoropak-80, Chromosorb T, Perlas de vidrio.
La aplicación de la cromatografía de gas al campo biomédico y de contaminación

ambiental, puso de manifiesto que los soporte diatomáceos no eran lo
suficientemente inactivos.
Para desactivar o reducir la actividad del soporte se utilizan diversos métodos.

• Recubrir las partículas con un material inerte como plata, teflón o
polivinilpirrolidona.
• Tratamiento con ácido o base para eliminar las impurezas metálica.
• Silanización. Los grupos activos silanoles y siloxanos se transforman a
silileteres por reacción con dimetildiclorosilano (DMCS),
hexametildisilazano (HMDS), trimetilclorosilano (TMCS) ó una
combinación de estos reactivos.
Forma y tamaño de partícula.

Se obtiene mayor eficiencia de la columna con el menor tamaño posible del
gránulo del soporte.
39
Fase estacionaria.
Las separaciones en cromatografía de gas se verifican debido a las interacciones
selectivas entre soluto y fase estacionaria. Todos los solutos permanecen el
mismo tiempo en la fase móvil gas, la que cumple sólo el rol de transportar los
analitos volatilizados.
Las interacciones más simples son las que corresponden a los solutos no polares
y son las fuerzas de dispersión.
Este tipo de interacción es no selectiva y por ello la elución de solutos no polares
en cualquier columna cromatográfica es por orden creciente de sus puntos de
ebullición.
La fase estacionaria ideal debe ser:

• Buen disolvente de los componentes de la muestra.
• Presentar solubilidad diferencial.
• Baja presión de vapor.
• Baja viscosidad a la temperatura de operación.
• Químicamente inerte al sistema y a la muestra a la temperatura de
trabajo.
• Estabilidad térmica y amplio intervalo de temperatura de operación.
En cromatografía de gas-líquido, la fase estacionaria es un líquido a la

temperatura de trabajo.
Clasificación de las fases estacionarias según su polaridad:

• Apolares (metilsilicona, escualano)
• Polares (propilenglicol, carbowax).
• Semipolares (fenilmetilsilicona, cianofenilsilicona).
Las fases tipo hidrocarburo son apolares y se utilizan como fases de referencia en
las tablas diseñadas para medir selectividad de fases más polares.
Columnas de tubo abierto o capilares.

Consisten en un tubo abierto largo y de pequeño diámetro en el que la fase
estacionaria se distribuye a la forma de una delgada película recubriendo las
paredes internas del tubo, que constituye una vía de libre paso para el gas de
arrastre.
• Largo: 15 a 100 metros.
• Diámetro: 0,20 a 0,75 mm.
• Espesor de la fase estacionaria: 0,1 a 3,0 µm.
En las columnas capilares se obtiene una gran eficiencia en la separación: al no
existir relleno, el factor A de la Ecuación de Van Deemter es igual a 0 y por lo tanto
40
la altura equivalente del plato teórico depende de los factores B, C y la velocidad

lineal del flujo.
Las columnas capilares presentan alrededor de 2000 platos / metro.
3.- Sistemas de detección.

Dispositivo que mide la concentración o masa de los componentes de la muestra y
genera una señal eléctrica proporcional a la concentración o masa.
Clasificación.
Según el principio físico de su respuesta.
• Detectores de ionización
• Detectores ópticos
• Detectores electroquímicos.
Según la naturaleza de la respuesta.

• Universales.
• Selectivos.
• Específicos.
Características.
• Sensibilidad.
• Ruido.
• Cantidad mínima detectable.
• Rango lineal.
Tipos de detectores en cromatografía de gas.
a) Detector de conductividad térmica.

Se basa en el principio de que un cuerpo caliente perderá calor a una velocidad
que depende de la composición del gas que lo rodea.
La diferencia en conductividad térmica de los gases depende de la movilidad o
velocidad a la cual difunde la molécula del gas, mientras menor es la molécula,
mayor es su movilidad y mayor su conductividad térmica.
Consiste en 2 pares de filamentos de tungsteno que se calientan por medio de una
corriente eléctrica. Por uno de los pares de filamentos fluye sólo gas de arrastre y
por el otro gas de arrastre más la muestra, de esta forma se obtienen 2
resistencias diferentes.
41
Esquema
Características.
• Cantidad mínima detectable: 10-8g.
• Respuesta: Universal.
• Linealidad: 10 4
• Gas de arrastre: He, H2.
• Tº límite: 400º C.
• No destructivo, moderadamente estable, sensibilidad moderada, barato,
fácil de manejar.
• Usado frecuentemente en análisis de gases permanentes y en trabajos a
escala preparativa.
Precauciones.
• Mantener constante el flujo de gas.
• Usar gas de alta conductividad térmica.
• Los filamentos del detector se dañan irreversible en presencia de HCI, CI2,
F, haluros alquilo, fluoruros orgánicos.
b) Detector de ionización de llama.

Se basa en el principio de que la conductividad eléctrica de un gas es
directamente proporcional a la concentración de las partículas cargadas dentro del
gas.
Consiste en un micromechero alimentado con H2 y aire formando una mezcla
combustible de alto poder calórico que produce pirólisis de analitos carbonados.
El gas de arrastre pasa de la columna a la llama, la cual ioniza algunas de las
moléculas orgánicas presentes en la corriente gaseosa. La presencia de partículas
cargadas (iones +, iones -,electrones) entre los electrodos polarizados, origina una
corriente que pasa a través de una resistencia incorporada en el circuito eléctrico.
42
Esquema.
Características.
• Cantidad mínima detectable: 10-10g,
• Respuesta: Todos los componentes orgánicos.
• Linealidad: 10 6.
• Gas de arrastre: He, H2, N2.
• Estabilidad: muy reproducible.
• No dan respuesta: aire, H2O, gases inertes, CO, CO2, CS2, NO, SO2,
H2S.
c) Detector de captura electrónica.

Mide la disminución de la señal eléctrica en vez del aumento. A medida que el
gas portador N2 pasa por el detector, una lámina de 3H o 63Ni radiactivo ioniza las
molécula del N2 y forma electrones lentos. Estos se desplazan hacia el ánodo,
cuyo potencial es de 90 V, y se produce una corriente constante que se amplifica
por un electrómetro. Esta corriente de fondo es de unos 10-8A. Al pasar un
compuesto cuyas moléculas posean un átomo electronegativo que capture
electrones, se producirá una pérdida de esa corriente. Con la calibración
adecuada puede relacionarse la pérdida de la corriente con la concentración o
cantidad del compuesto en la muestra.
43
Esquema.
Características.
• Cantidad mínima detectable: 10-12g.
• Respuesta: selectiva.
• Linealidad: 10 2.
• Gas de arrastre: N2 o ó Ar + 10% CH4.
• No destructivo.
• Muy sensible a moléculas como haluros de alquilo, carbonilos conjugados,
nitrilos, nitrocompuestos y compuestos organometálicos.
• El gas portador debe estar seco.
• Fuente radiactiva de corta duración y fácilmente contaminable. La lámina de
3
H sólo es utilizable hasta 220ºC y el 63Ni puede calentarse hasta 350ºC.
44
4.- Sistema de procesamiento de datos.

La señal del detector es procesada a través de distintos sistemas como
registradores, integradores o computadores, para obtener una serie de datos:
• Cromatograma.
• Tiempos de retención.
• Areas y/o alturas de los picos.
Con estos resultados se pueden lograr distintos objetivos del análisis:
• Conocer la calidad del sistema cromatográfico.
• Conocer la complejidad de la muestra.
• Identificar los compuestos separados.
• Cuantificar los compuestos separados.
• Obtención de compuestos.
OPTIMIZACIÓN EN CROMATOGRAFÍA DE GAS.

a) Control de temperatura y flujo.
Es más fácil regular la temperatura que el flujo, para lo cual se trabaja empleando
un gradiente de temperatura se parte con temperatura baja y luego se va
aumentando para disminuir el tiempo de retención de los analitos que salen más
tarde.
1 2 3
1 se puede mejorar ↓ el flujo o ↓ la temperatura.

2 y 3 se pueden mejorar ↑ el flujo o ↑ la temperatura.
Para realizar un gradiente de temperatura se requiere:

Horno para la columna, el detector y el inyector estén bien separados.
Dispositivo que permita variaciones de la Tº con velocidades de
calentamiento de 0,1ºC/min. a ± 20ºC/min.
Regulador diferencial de flujo del gas de arrastre, para mantener el flujo
constante a pesar de variar la Tº.
b) Cambio de fase estacionaria.
45
c) Preparación de derivados.
Tipo analito Reactivo Detección
CH3
N
Carbohidratos H3C Si N FID, pre columna
CH3
N-trimetilsililimidazol
F O
Aminas I, II N ECD, pre colmna
F C C N
y alcoholes FID
F
Trifluoracetilimidazol
F F
Ác. carboxílicos,
fenoles, F CH2Br ECD, pre columna
sulfonamidas
Ác. grasos
F F
Bromuro de pentafluorbencilo
CH3
Barbitúricos
xantinas N CH3OH
alcaloides FID, pre columna
CH3
APLICACIÓN AL ANÁLISIS DE MEDICAMENTOS
• Determinación cuantitativa de fármacos poco polares, volatilizables en materias

primas y formas farmacéuticas diversas.
• Determinación de impurezas orgánicas volátiles.
• Determinación de fármacos en líquidos biológicos.
46
BIBLIOGRAFÍA
(1). Farmacopea de los Estados Unidos. The United States Pharmacopeial

Convention. USA, 2017.
(2). British Pharmacopeia. The Stationery Office. London, 2011.
(3). Quantitative Chemical Analysis. Daniel C. Harris, 8ª edición, 2010.
(4). A textbook of Pharmaceutical analysis. Connors, K, 3a edición. John
Wiley & sons Inc. USA, 2011.
(5). Practical HPLC Method Development. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J.
L. Glajch, John Wiley, 2ª edición, 1997.
(6). Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals. John Adamovics,
Marcel Dekker, 1990.
(7). Handbook of Pharmaceutical Analysis. Lena Ohannesian, Anthony J.
Streeter, Marcel Dekker, 2002.
Introducción de la Guía
(1) The systematic identification of organic compounds. Shriner, R;

Hermann, CH, 7ª edición. Chapter 3. John Wiley & Sons Inc. USA, 1998.
(2) A textbook of Pharmaceutical analysis. Connors, K, 3a edición. John

Wiley & sons Inc. USA, 2011.
(3) Chromatographic analysis of Pharmaceuticals. Adamovics, J. A,

Vol. 49. Marcel Dekker, Inc. New York, 1990.
(4) Chemical separations. Meloan, C.E. John Wiley & Sons Inc. USA,
1999
(5) Análisis Instrumental. Skoog, D; Leary, J. 4ª Ed. Saunders College

Publ. Copyright. España, 1996.

Cromatografia 2019

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1

Dra. C. Gloria Godoy Mosciatti

Métodos Cromatográficos- Resumen 4

Sin duda el método más utilizado para realizar separaciones analíticas es la

La cromatografía agrupa un importante y diverso conjunto de métodos que

La cromatografía debe su crecimiento espectacular durante las pasadas cuatro

La Cromatografía de líquidos tiene aplicación en el análisis cualitativo o de

Respecto a la Cromatografía de Gas, su alta sensibilidad y especificidad

muy bajas concentraciones de muestra (µg) debido a la alta sensibilidad de los

En la actualidad la variedad de detectores que se incorporan a los sistemas

METODOS CROMATOGRÁFICOS DE ÁNALISIS

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

1. Según fases estacionaria y móvil.

2. Según tipo cromatografía.

4. Según el mecanismo de separación

CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Depende de la naturaleza del analito.

Ecuación de Van Deemter.

A = Factor de Eddy o de tortuosidad.

B = Factor de difusión longitudinal.

C = Factor de resistencia a la transferencia de masa.

AEPT Masa analito FE

De la ecuación de Van Deemter se puede obtener el flujo óptimo: Donde está la

Valores óptimos: 1,5 < RS < 2

Modificación de la resolución para optimizar la separación

f) ASIMETRÍA DEL PICO.

La separación de una mezcla compleja en varios analitos se debe a que éstos

Las principales interacciones que ocurren son:

Ocurre por competencia por la FE entre la FM y el analito. Si la unión analito-FE

En general, éste mecanismo se utiliza para compuestos polares, debido al uso de

3ª capa, agua adsorbida, unión débil, se pierde a 70ºC, reversible

2ª capa, agua adsorbida, se pierde a 120ºC, reversible

1ª capa, agua fuertemente unida, se pierde a 200ºC, reversible

Grupo Silanol, pasa a siloxano (inactivo) a 450º, irreversible

Las Fases Móviles usadas en cromatografía de adsorción son.

En CGS: Nitrógeno, Helio, Argón, Hidrógeno, mezclas de ellos.

La polaridad de los solventes se puede obtener consultando tablas que contienen

Mecanismo Tipo Muestra FE FM

La sílica gel es insoluble en agua hasta pH = 7,5. Sobre éste pH la sílica se

La interacción más importante es la entre FM y FE. Es el mecanismo de

a) Preparación Fases Enlazadas.

b) Tipos de reacciones químicas.

----Si-OH + R-OH ----Si-OR + H2O

II. Unión Amino: Si-NR2

----Si-OH + SOCl2 ----Si-Cl

III. Unión Carbono: Si-CR3

IV. Unión siloxano: Si-O-Si-R3

----Si-OH + Cl-SiR3 ----Si-O-Si-R3

Según el Nº de átomos de carbono de R será C-8, C-18, etc.

El R corresponde a diferentes cadenas que se introducen al sistema, logrando así

• Apolares: C-8, C-18

Diol: ----(CH2)3--O-- CH CH2

Fases móviles usadas en cromatografía de reparto

Tipos de cromatografía de reparto.

Esquema Mecanismo de Exclusión.

Por lo tanto, KD debe estar entre 0 y 1 ⇒ Selectividad

Esto se debe a que en cromatografía de exclusión existen dos tipos de

I) Permeación: Se aplica para analitos solubles en solventes orgánicos. Se le

II) Filtración: Se aplica para analitos solubles en solventes acuosos. Se le

La mayor aplicación es el análisis de aminoácidos.

Sales más usadas para Intervalo útil de pH

CH2-NR3+ Cl- CH2-NH3+ Cl-

Muestra más recarga