FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: Código:

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PRACTICA 1: EXTRACCION DE ADN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

1. Realizar la extracción de ADN a partir de células humanas de la mucosa bucal

2. Discutir la importancia de la extracción de ADN en la investigación.

3. Analizar el efecto de los diferentes reactivos empleados en la técnica de extracción de ADN.

4. Comprender la utilidad de la técnica de electroforesis en el estudio del ADN.

5. Conocer el fundamento de la cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

1. FUNDAMENTO TEORICO

Los ácidos nucleicos tienen como principales funciones la transmisión y expresión de la información
genética. A través de estas funciones determinan no solo la estructura, también, regulan todos los
procesos fisiológicos y metabólicos de los seres vivos. Existen dos tipos de ácidos nucleicos,
denominados ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN), los cuales son polímeros
de nucleótidos, que a su vez se conforman de tres moléculas diferentes (azúcar pentosa, base
nitrogenada y fosfato).
En las células eucarióticas el ADN se encuentra en el núcleo asociado a proteínas denominadas
histonas formando la cromatina (figura 1). También, puede encontrase en organelas como las
mitocondrias y los cloroplastos. En procariotas (Ej: bacterias) el ADN se localiza en el citoplasma ya
que estas carecen de membrana nuclear.

Figura No 1. Niveles de organización del ADN en células eucariotas. Tomado de La química del genoma
en Locos por la biología. Julio 20, 2011. Disponible en la web:
http://locosporlabiologia.wordpress.com/2011/07/20/la-quimica-del-genoma/
El ARN es un tipo de ácido nucleíco de menor tamaño que el ADN. Existen varios tipos de ARN:
mensajero (ARNm), ribosomal (ARNr) y de transferencia (ARNt) con diferentes funciones, todas
asociadas con la expresión de la información contenida en el ADN. El ARN es sintetizado en el
núcleo en el proceso de transcripción, y en la mayoría de los casos, debe ser transportado al
citoplasma para que pueda ejercer sus funciones.

El estudio de la estructura y función de los ácidos nucleicos ha permitido entender muchos

procesos biológicos, y de esta forma poder diseñar estrategias para el diagnóstico y tratamiento
de enfermedades genéticas e infecciosas, resistencia a antibióticos, diseño de vacunas,
producción de fármacos, mejoramiento de la calidad nutricional de especies vegetales y
animales, resistencia vegetal a plagas, control de enfermedades parasitarias, terapia y
regulación génica.

Los ácidos nucleicos de una célula eucariota, pueden ser aislados mediante la ruptura de la
membrana celular y nuclear, para su posterior limpieza y precipitación. Para ello es necesario
someter a las células a un choque osmótico (ej; NaCl 3M), una homogenización mecánica,
digestión enzimática (ej; proteinasa K) y tratamiento con detergentes (ej; SDS) o ácidos (ej;
HCl). Posteriormente, una ronda de centrifugación permite descartar las células intactas,
organelas y restos de membranas, dejando los ácidos nucleicos solubles en el sobrenadante, el
cual es tratado con agentes como fenol, mezclas de cloroformo-alcohol isoamílico o una
solución concentrada de sales (ej: cloruro de sodio 5M) que permiten separar las proteínas, que
se encuentran unidas a los ácidos nucleicos, al desnaturalizarlas. El ADN que era soluble en la
fase acuosa se precipita adicionando etanol frio, lo que permite su aislamiento. Después de ser
secado y disuelto en un buffer apropiado, el ADN puede ser visualizado en un gel de agarosa,
usando SYBR Green, un fluoróforo que se une con gran afinidad al surco menor del DNA
bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1000 veces. Bajo luz ultravioleta estas
moléculas son fluorescentes y por estar unidas al ADN se pueden observar indirectamente las
moléculas de ADN con un color verde, producto de la capacidad de fluorescencia del colorante.

Una forma de cuantificar la concentración de ácidos nucleicos extraída en una muestra es

mediante su capacidad de absorber luz ultravioleta. En esta práctica tendrá la oportunidad de
interactuar con un espectrofotómetro y determinar la concentración y pureza de la muestra
analizada.

Disfrute la práctica.
 2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

• Bata de laboratorio
• Guantes de nitrilo
• Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su intercambio con
los demás compañeros de laboratorio.

2.3 Manejo de Residuos químicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos
generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales están
debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y
potencialmente peligrosas. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el
desarrollo de la práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio,
quien le indicará la forma correcta de hacerlo.

3. METODOS

3.1 REACTIVOS:

Tabla 1. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM CANTIDAD
Solución de SDS al 10% 5ml
Etanol al 96%, frío a -20ºC 20ml
Solución de NaCl 5M 60l
Solución de SYBR Green 50 µl para todo el curso
Buffer de carga 5X 100 µl para todo el curso

Buffer TE (Tris-HCl10 mM /EDTA 1mM) 500 ml para todo el curso

Buffer TBE 1X 600 ml para todo el curso

Agarosa 0,8 g para todo el curso
Agua destilada -
3.2. MATERIALES

Tabla 2. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM CANTIDAD x equipo

Probeta de 10ml 1
Pipeta graduada de 5ml 1
Pipeta graduada de 10ml 1
Propipeta 1
Micropipeta de 20l 1
Micropipeta de 100l 1
Pipeta Pasteur 2
Vaso de precipitados de 50mL 2
Vaso de precipitados de 100mL 1
Tubo Falcon de 50mL 1
Tubo eppendorf de 1,5mL 4
Puntas para medir 2- 10 l 1 caja para todo el curso
Puntas para medir 10- 200 l 1 caja para todo el curso
Papel parafilm 1 rollo para todo el curso
Plancha de calentamiento con agitador 1 para todo el curso
Magneto 1 para todo el curso

3.3. EQUIPOS

ITEM CANTIDAD PARA EL CURSO

Cámara de electroforesis pequeña 1
Transiluminador Ultravioleta 1
Fuente de poder 1
Vortex 1
Espectrofotómetro 1

3.4. PROCEDIMIENTO

I. EXTRACCIÓN DE ADN DE CÉLULAS DE MUCOSA ORAL

1. Deposite en una probeta una muestra de saliva (aproximadamente 5mL).

2. Tome 2,5 mL de la muestra y deposítela en un tubo Falcon. Adicione 2,5mL de solución SDS
al 10% y agite por inversión.

3. Adicione 50L de solución de NaCl 5M y nuevamente agite.

4. Añada 10mL de etanol al 96% (debe estar a una temperatura de -20ºC). Agite por inversión (muy
suavemente).

5. Anotar observaciones.

6. Remover el ADN con una punta de micropipeta, y transferirla a un tubo eppendorf.

7. Secar el botón de ADN a 55ºC por 20 minutos.

8. Adicionar 1mL de Buffer TE. Use el vortex para homogenizar.

4. ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA:

1. Retire el peine de un gel de agarosa preparado al 0.8%, el cual ha sido depositado en una
cámara de electroforesis horizontal. Cúbralo con buffer TBE 1X.

2. Corte un pedazo de papel parafilm. Deposite 3 µl de buffer de carga 5X y mézclelos con 5L
de la solución de ADN.

3. Adicione los 8 ul anteriores al pozo que le corresponda en el gel.

4. Una vez el gel ha sido servido, cierre la cámara, conéctela a la fuente de poder y deje correr
por espacio de 30 minutos a 60 voltios.

5. Proceda a observar bajo luz ultravioleta (transiluminador)*

*NOTA: La exposición al Ultravioleta puede quemar su retina irreversiblemente, y lastimar su

piel. Por ello, es imprescindible que use el equipo de protección adecuado.

5. CUANTIFICACIÓN DE ADN:

1. Realizar una dilución 1:100 (10 µl de la muestra en 990 µl de buffer TE).

2. Calibrar a cero el espectrofotómetro con el buffer TE.

3. Una vez calibrado, adicione la dilución de la muestra en una cubeta de cuarzo. Mida y
registre el valor de la D.O. a 260 y 280 nm.

4. Estime la concentración de ADN en la muestra utilizando la siguiente relación:

[ADN] = 50 µg.mL-1x D.O.260nm x factor de dilución

5. Calcule de relación 260/280 a partir de los resultados de la D.O

6. RESULTADOS
Electroforesis:
1. Tome una foto del gel en el transiluminador. Señale el carril por el que su muestra corrió.
Determine el peso molecular de la banda y agregue la leyenda de la imagen
2. Con la misma fotografía del gel, compare su muestra con la de otro grupo. Determine si hay
variación en el peso, la intensidad lumínica y grosor entre las dos bandas describiéndolo y haciendo
referencia a la imagen.
Cuantificación de ADN:
1. En una tabla reporte la concentración de ADN y la relación 260/280 e incluya la leyenda
correspondiente.
7. ANÁLISIS

Extracción de ADN:

1. Explique la función o fundamento de los siguientes reactivos en la extracción de ADN:

a) El SDS
b) El cloruro de sodio
 c) El etanol al 96%

Electroforesis en gel de agarosa:

1. Qué diferencia esperar encontrar en un gel de agarosa al 0.8% frente a uno al 2%?
2. Cuál es la función del buffer TBE 1X sobre la electroforesis?
3. Explique porque es posible observar el ADN con Luz UV cuando se tiñe con SYBR Green o
con Bromuro de etidio. ¿Cuál es el mecanismo de tinción de estos reactivos?
4. Explique en que se basa la separación de moléculas de ADN en geles de agarosa usando
como ejemplo lo que observó en el gel que se realizó en la práctica de laboratorio
5. Cuál es la función del buffer de carga? Qué implicaciones tendría el no combinarlo con la
muestra que se pretende visualizar en el gel? Detalle su respuesta.

Cuantificación de ADN:

1. A partir de los resultados obtenidos en las técnicas de electroforesis y cuantificación de ADN,

identifique la utilidad de cada una de ellas, partiendo de que en ambos casos la muestra es
ADN total.
2. ¿A qué parte de la estructura de la molécula del ADN se debe la absorción de luz ultravioleta
observada en el espectrofotómetro?
3. ¿Por qué considera que es necesario estimar la concentración del ADN aislado?
4. Qué indica la relación 260/280 sobre la calidad del ADN?
5. Con base en la concentración y pureza de la muestra de ADN que extrajo en el laboratorio,
determine si el protocolo de extracción usado fue eficiente o no, según lo reportado en la
literatura.

8. Bibliografía.

1. Bioquímica de Stryer
2. Bioquímica de Lehninger
3. SAMBROOK J, FRITSCH E, MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold S, Spring Harbor Laboratory.1989.
4. Sitios de internet:

− platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bio/ADN/adn3/ppal.htm
− www.hospitalameijeiras.sld.cu/.../...
− http://www.hospitalameijeiras.sld.cu/hha/mpm/documentos/BIOLOGIA%20MOLE
CULAR%20Y%20GENETICA/GP/EXTRACCION%20DE%20DNA%20A%20PAR
TIR%20DE%20MUCOSA%20BUCAL.pdf

5. Alberto Checa Rojas. (2017). Método: Gel de electroforesis Agarosa. 2018, Diciembre 5,
Conogasi.org Sitio web: http://conogasi.org/articulos/metodo-gel-de-electroforesis-
agarosa/