METODOS DE CONSERVACION DE

MICROORGANISMOS
17 de septiembre de 2018
Olarte Andres1; Téllez Sebastian2
163310151; 163310112

RESUMEN

Los microorganismos constituyen una gran importancia en los campos aplicados del ámbito
médico, industrial, económico, ambiental y biotecnológico, sin embargo se observa
regularmente que los microorganismos pierden sus propiedades de producción deseadas.
Esto puede ser consecuencia de un mantenimiento en condiciones que puedan producir
cambios genéticos no esperados, por lo tanto el objetivo de esta práctica de laboratorio es
determinar qué método de conservación es apropiado para cada microorganismo usando
tres métodos diferentes e inoculándolos en su respectivo agar semi selectivo para analizar
su viabilidad, pureza y estabilidad genética, obteniendo como resultado una proliferación
deseada para el método de conservación por congelación

Palabras claves: Microorganismos, métodos de conservación, cambios genéticos

ABSTRACT

Microorganisms are of great importance in the applied fields of the medical, industrial, economic,
environmental and biotechnological fields, however it is regularly observed that microorganisms
lose their desired production properties. This may be due to maintenance in conditions that may
produce unexpected genetic changes, therefore the objective of this laboratory is to determine
which preservation method is appropriate for each microorganism using three different methods
and inoculating them into their respective semi-selective agar to analyze its viability, purity and
genetic stability, obtaining as a result a desired proliferation for the method of conservation by
freezing

Key words: Microorganisms, conservation methods, genetic changes

INTRODUCCIÓN Los microorganismos han sido de utilidad

para el hombre aun desde antes del
conocimiento de su existencia, ya que el
estudio de los microorganismos y el
discernimiento sobre ellos ha sido
aplicado en una gran variedad de ámbitos
tanto ecológicos como biotecnológicos
(Snell, J.J 1997)
Cabe mencionar la importancia de estos
ámbitos gracias a la información genética
que alberga en ellos para su aplicación en
la microbiología. Se han logrado obtener
cepas sobre-productoras de metabolitos
para uso industrial, y en la actualidad han
podido adicionar los genes de estas rutas
a microorganismos, generalmente
bacterias, que no los producen y así poder
obtenerlos por procesos biotecnológicos
Por lo tanto es importante mantener la
estabilidad genética, ya que la necesidad
de proveer y disponer de cultivos de
calidad impuso la introducción de
métodos de conservación de
microorganismos que reducen al mínimo
la posibilidad de contaminación y
garantizan supervivencia (Ralf J 2001)
Los métodos de conservación de
microorganismo son técnicas básicas que
están encaminada al mantenimiento de las
cepas altamente productivas durante
largos períodos de tiempo sin que se
produzcan cambios fenotípicos,
especialmente en las características
relacionadas con la producción de los
metabolitos secundarios de interés. Para
lograr estas condiciones se han
establecido varios métodos de
preservación con los cuales se trata de
mantener el cultivo viable y con un
mínimo de cambios genéticos, los
métodos más conocidos son la
conservación por congelación y posteriormente se tomó una buena
conservación restringida (Hawk D. 1995)
La conservación por congelación
funciona congelando las células en
suspensión en un líquido con un agente
crioprotector y se guardan a temperaturas
inferiores a cero grados centígrados, con
lo que el agua se congela. De esta forma,
al no disponer las células de agua en
forma líquida, no hay crecimiento.
Cuando se quiere trabajar con las células
así conservadas, se recuperan subiendo la
temperatura. Este es el mejor método de
conservación desde todos los puntos de
vista, pero tiene el inconveniente de
requerir instrumentos especiales.
En la conservación restringida se
engloban métodos no empleados
habitualmente, pero a los que es necesario
recurrir a la hora de conservar grupos de
microorganismos muy determinados que
no resisten bien la liofilización o la
congelación. En este caso para este
método de conservación se utiliza un
papel bastante absorbente (Whatmann nº
3) que se impregna con una solución muy
densa de células y se deja secar al aire (en
condiciones estériles), el objetivo de esta
práctica es determinar cuál método de
conservación es mejor para Pseudomona
sp y Escherechia coli
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron los microorganismos
Pseudomona sp y Escherechia coli para
cada una de las pruebas de conservación
Conservación por congelación
Se preparó una solución crioprotectora en
la cual se usó 500µl de glicerol al 10% y
se agregó en un eppendorf,
cantidad de microorganismos por
consiguiente se suspendió en la solución
crioprotectora y por último se sometió a
un proceso de congelación gradual hasta
llegar a -20 ℃
Método alternativo
a) Se agregó 500 µl de agua
destilada más 500 µl
microorganismo y se agregó en un
eppendorf, posteriormente se sometió
a un proceso de congelación gradual
hasta llegar a la temperatura de -20 ℃
b) Se agregó 500 µl de solución
salina más 500 µl del microorganismo
y se agregó en un eppendorf,
posteriormente se sometió a un
proceso de congelación gradual hasta
llegar a la temperatura de -20 ℃
Método restringido
Se cortó papel filtro whatmann 4 en un
tamaño lo suficientemente pequeño para
entrar al eppendorf, posteriormente se
tomó 100µl del microorganismo y se
impregnó en el papel filtro, se dejó secar
y por último se coloca en el eppendorf
Finalizada cada una de las pruebas de
conservación, se inoculó en agares semi
selectivos en este caso Escherechia coli
en Macconkey y Pseudomona sp en agar
Centrimide y posteriormente se
analizaron sus resultados
RESULTADOS
Método de elección o de conservación a
largo plazo
Tabla 1: valoración del método a largo
plazo (Glicerol al 25%)
La Conservación por congelación para
Escherichia coli presentó un buen
crecimiento aunque la siembra no fue
Se prepararon inóculos de Escherichia
coli y Pseudomonas spp congelado las
células para ser utilizadas posteriormente
en una siembra después de 8 días, se
buscó probar que tan efectivo es el
del método de conservación, para esto se
llevaron las células en una suspensión
líquida con un agente crioprotector y se
guardó a temperaturas inferiores a cero
grados centígrados, con lo que el agua se
congeló. Las células se vieron afectadas
al no tener agua líquida, por esta razón
sus funciones metabólicas se vieron
ralentizadas, y su mecanismo celular se
volvió más lento hasta el punto de no
haber crecimiento.
FACTORES EVALUADOS EN EL
METODO DE CONSERVACION
(GLICEROL 25%)
FACTORES EN PORCENTAJE
Viabilida 75% 100%
d
(crecimie
nto)
Pureza 100% 100%
Estabilid 100% 100%
ad
genética
Microorg Escherichia Pseudomon
anismos coli as spp
Imagen
de la
cepa en
el agar
correspo
ndiente
masiva la pureza de la cepa en
MacConkey fue estable al no presentar
ninguna anomalía y en la tonalidad del
medio donde esta bacteria utiliza la
lactosa del medio por lo cual el PH baja
hasta producir las colonias que se
observan en la Tabla 1. La estabilidad que no resisten bien la liofilización o la
genética se puede indicar mediante la congelación.
capacidad de fermentar lactosa la cual es
CONSERVACIÓN POR
una característica de bacterias entéricas,
SUSPENSIÓN EN AGUA
los fenotipos observados nos permiten
DESTILADA ESTÉRIL
creer que no hay cambios. Para un mejor FACTORES EN PORCENTAJE
examen de la estabilidad se pueden Viabilida 50% 100%
realizar pruebas moleculares para d
comparar los fragmentos en una librería o (crecimie
realizar pruebas químicas. nto)
Pureza 100% 100%
cabe resaltar que Pseudomonas sp tubo
Estabilid 100% 100%
una respuesta muy parecida a
ad
Escherechia coli respecto a la genética
proliferación en el medio ya que presentó Microorg Escherichia Pseudomon
un crecimiento notorio, además de anismos coli as spp
encontrar varias colonias aisladas Imagen
mostrando así que Pseudomonas sp de la
utilizó de manera efectiva la peptona cepa en
como nutrientes para su desarrollo el agar
microbiano correspo
ndiente
Tabla 2. Conservación por suspensión en
agua destilada estéril para Escherichia
Método Alternativo coli y Pseudomonas spp

Estos son métodos no empleados Fueron inoculados en frascos con agua

habitualmente, pero son utilizados en el destilada estéril, mantenidos a
momento de recurrir a conservar grupos temperatura de refrigeración y su
de microorganismos muy determinados viabilidad evaluada después de 8 días los
congelada expande las células (muchas de
las células sufren daño.

CONSERVACIÓN CON AGUA

DESTILADA ESTÉRIL SALINA
resultados muestran un porcentaje inferior
FACTORES EN PORCENTAJE
Viabilida 50% 100%
d
(crecimie
al 70%, debido que el agua congelada se nto)
cristaliza y las células corren el riesgo de Pureza 100% 100%
Estabilid 100% 100%
sufrir daño debido a que el agua
ad conservación, por lo tanto efectivamente
genética el agua destilada genera cambios ligeros
Microorg Escherichia Pseudomon al momento de conservar
anismos coli as spp microorganismos
Imagen
de la
cepa en
Método restringido
el agar
correspo Se utiliza un papel bastante absorbente
ndiente que se impregna con una solución muy
densa de células y se deja secar al aire (en
condiciones estériles).

VALORACIÓN DE UN MÉTODO
DE RESTRICCIÓN (PAPEL FILTRO)
Tabla 3. Conservación con agua destilada FACTORES EN PORCENTAJE
estéril salina para Escherichia coli y
Pseudomonas spp Viabilida Poco 100%
d crecimiento
Este método presentó una baja tasa de (crecimie
supervivencia de 50% para Escherechia nto)
coli, estos resultados coinciden Pureza 100% 100%
atribuyendo a que dependiendo del rango Estabilid 100% 100%
de temperatura, no se detiene el ad
metabolismo celular y los genética
microorganismos puede continuar con su Microorg Escherichia Pseudomon
anismos coli as spp
crecimiento y dado que no hay nutrientes
Imagen
en el, las celular pierde su viabilidad.
de la
Además en Pseudomonas sp a pesar que cepa en
tuvo más crecimiento a comparación de el agar
Escherechia coli si se nota una correspo
disminución en la formación de colonias ndiente
comparación del primer método de
Tabla 4. Desecación en papel filtro para Escherichia coli y Pseudomonas spp
conservación de Escherichia coli y presentan presentan un bajo crecimiento
Pseudomonas spp Tabla 4.
Las bacterias utilizadas para esta prueba DISCUSIÓN
no utilizan la celulosa debido a que no
En la conservación de microorganismos
tiene el sistema enzimático para degradar
se busca alcanzar objetivos para
este biopolímero, por este motivo su
conservar correctamente las células, se
viabilidad se ve afectada al no poder
mira siempre que las cepas sean puras
cumplir con sus exigencias metabólicas.
como se pueden observar en las cepas de
Escherichia coli y Pseudomonas spp
utilizadas. Se evita la producción de
contaminaciones durante el proceso de
conservación, además se espera que
durante el tiempo de conservación
sobrevivan al menos el 70-80% de las
células, siempre manteniendo su
estabilidad genética
menores de 70°c debido a la gran
concentración de solutos que existen en la
suspensión celular (BARRAGAN, 2009),
su punto de congelación baja y por tal
razón no se permite que la temperatura
esté variando y ocasione daños celulares.
Por este motivo se usa el crioprotector no
iónico (glicerol) para disminuir el hielo
que se produce. La conservación por
congelación fue considerado el mejor
método según los resultados obtenidos
debido que la viabilidad fue mayor Tabla
1. pero esta técnica presenta algunas
complicaciones en la temperatura
durante el almacenamiento donde los
instrumentos utilizados de refrigeración y
descongelación tienen que ser los
adecuados para obtener buenos
resultados. además para estos métodos
hay que tener en cuenta la Edad de las
cepas donde se recomienda usar células
maduras del inicio de la fase estacionaria
de la curva de crecimiento.
La conservación por suspensión en agua
destilada es un método alternativo muy
utilizado y que da altos porcentajes de
viabilidad en diversos tipos de
La velocidad en la congelación y
descongelación son factores que influyen
en los resultados en la conservación, es
mejor que las variaciones de la
temperatura sean rápidas, tanto para la
congelación como para la descongelación,
para descongelar conviene poner las
células a 37ºC, Guardar los tubos
cerrados y bien sellados, las temperatura
debe ser
microorganismos,. Consiste en suspender
en agua estéril unas cuantas células del
cultivo que se quiere conservar.
CONCLUSIONES
las características macro y microscópicas
determinaron que los métodos de
conservación implementados presentan
diferencias en la viabilidad mientras su
estabilidad genética y pureza son
estables. donde el mejor metodo de
conservacion es con glicerol al 25%
todos los métodos utilizados presentan
ventajas y desventajas donde se estudian
para mirar cual es el adecuado para el
microorganismo que se quiere conservar
La enorme diversidad de microorganismo
soportará determinados métodos de
conservación mejor que otros, o será
necesario tomar precauciones especiales
en su conservación, no existe un método
general de conservación de los
microorganismos, aunque se puede
determinar el más aconsejable en cada
caso.
Bibliografía
BARRAGAN, D. (2009). COMPARACION DE DOS METODOS DE CONSERVACION,
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Merck E. Microbiology Manual. Second Edition. Darmstat. Merck KGAa Edition, 407-
410, 2000.

· ANEXOS:
1. Importancia de los métodos de conservación de los microorganismos

Es por esto que la conservación de los microorganismos es un tema de gran importancia

para mantenimiento de cepas microbianas, sin que estas alteren sus características típicas
(genéticas), ni pierdan la viabilidad y conserven su pureza durante largos periodos de
tiempo; por esto se han desarrollado diferentes métodos que permitan conservar los
microorganismos, para luego ser empleados en futuras investigaciones. Los métodos de
conservación permiten frenar el metabolismo de los microorganismos, de manera que no
se pierda viabilidad y se conserven las características típicas del microorganismo por
largos periodos de tiempo. Puesto que no todos los microorganismos se comportan
igualmente, no hay un método estandarizado para todos los microorganismos. Lo
importante es conocer que método es el mejor para cada tipo de bacteria que se desea
conservar y de esta forma asegurar una mayor conformidad con el método de elección
para cada especie.

2. Ventajas y desventajas de cada uno de los tres métodos de conservación

(Conservación a largo plazo, Conservación Alternativa, Conservación Restringida.

MÉTODO DE CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO

Ventajas: De mejor y mayor elección. se garantiza al máximo la estabilidad genética
por evitarse la aparición de generaciones sucesivas.
Desventajas: Debe estar constante monitoreo, el proceso es complejo y caro.
METODO DE CONSERVACION ALTERNATIVA
Ventajas: Se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, ya sea
por carecer de los equipos necesarios o porque la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservación por estos métodos
Desventajas: No empleados habitualmente, no resisten bien la liofilización o la
congelación.

METODO DE CONSERVACION RESTRINGIDA

Ventajas: puede utilizarse para preservar hongos esporulados si no está disponible la
conservación por liofilización o almacenamiento.
Desventajas: utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, ya sea
por carecer de los equipos necesarios o porque la cepa microbiana no resiste los
tratamientos de la conservación por estos métodos y resulta difícil evaluar
detalladamente su confiabilidad.

3. Otros métodos actuales que se utilicen para conservar microorganismos,

diferentes a los estudiados anteriormente.
Inmersión en Aceite: Algunas bacterias pueden sobrevivir meses e incluso años inmersas
en aceite mineral estéril grado medicinal o con la utilización de parafina de gravedad
específica 0.865 - 0.890. El aceite se esteriliza en calor seco a 180ºC x 2 horas, la
autoclavación no es recomendable, luego se debe chequear la esterilidad del aceite en un
caldo nutritivo
Secado: Los métodos de secado consisten básicamente, en la remoción de agua y prevenir
la rehidratación. Este método es ampliamente utilizado para la conservación de hongos.
Suelo, Arena: Varias especies de hongos esporulados sobreviven por periodos superiores
a cinco años, sin pérdida en las características (Altlkinson 1954). Las esporas son más
resistentes si ellas son secadas adicionalmente en un secador con un medio higroscópico
(suelo, arena), favoreciendo la formación de esporas en organismos esporoformadores.
Las esporas nos son necesariamente más resistentes por su protección contra la
deshidratación.
Discos de gelatina: Se ha reportado que las bacterias pueden sobrevivir por períodos
prolongados de tiempo por este método. Este método ha sido ampliamente utilizado para
la conservación de bacterias heterótrofas. La suspensión de microorganismos se
centrifuga y se resuspende (108 - 109 células mL) en un medio con gelatina a 30ºC,
utilizando pipeta de pasteur estéril se coloca una gota de esta suspensión en la base de
una caja de petri y se permite la solidificación, luego se coloca la caja en un desecador con
pentóxido de fósforo, después de secados los discos se transfieren a un tubo tapa rosca y
se almacenan. Se realizan pequeños tapones de gelatina, los cuales pueden ser secados
por liofilización y almacenados sobre sílica gel y ó pentóxido de fósforo. El éxito del
almacenamiento depende de la temperatura, se ha reportado una mayor recuperación a -
20ºC, comparada con la temperatura de refrigeración ó a medio ambiente. Para la
recuperación de las células se resuspenden un disco de gelatina en el caldo apropiado en
condiciones de asepsia.