UNIVERSIDAD SAN MARTIN DE PORRES – FILIAL NORTE

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N° 6 – METABOLISMO DE LÍPIDOS

l. INTRODUCCIÓN.

A diferencia de los carbohidratos. que se clasificaban en función de los grupos funcionales

que poseían, los lípidos no pueden clasificarse de esta manera porque no poseen un grupo funcional
característico. En este sentido, los lípidos son sustancias de origen biológico, solubles en disolventes
orgánicos (cloroformo. benceno. etc.), y nada solubles en agua. Como consecuencia de ello. el
término lípido abarca a un gran número de compuestos orgánicos con estructuras muy diversas; no
obstante, poseen algo en común. La porción principal de su estructura es de naturaleza
hidrocarbonada.

Los lípidos desempeñan diversas funciones biológicas de gran importancia, ya que

constituyen las principales reservas energéticas de los seres vivos: forman parte de las membranas
celulares y regulan la actividad de las células y los tejidos.

Así, las grasas, aceites, ciertas vitaminas y hormonas y la mayor parte de los Componentes
no proteicos de las membranas son lípidos.

Una forma de clasificar los lípidos es la que se basa en su comportamiento frente a la

reacción de hidrólisis en medio alcalino (SAPONIFICACIÓN). Los lípidos saponificables son los que se
hidrolizan en medio alcalino produciendo ácidos grasos, que están presentes en su estructura; en
este grupo se incluyen las ceras, los triacilglicéridos, los fosfoglicéridos y los esfinqolípidos. Los
lípidos no saponificables son los que no experimentan esta reacción (terpenos, esteroides y
prostaglandinas, en este último grupo también estarían incluidos los ácidos grasos).

Consecuentemente con su definición, la obtención de los lípidos tendrá que realizarse

utilizando como fuente algún tejido vivo y como material de extracción a alguno de los solventes no
polares u orgánicos. A pesar de que en general todos los lípidos son solubles en estos tipos de
solventes resulta que, de acuerdo con las características estructurales que presentan, serán más o
menos solubles en los diferentes tipos de solventes orgánicos; así el cloroformo será un buen
diluyente para casi todos ellos, en tanto que el etanol y la acetona serán más específicos. La acetona
por ejemplo, resulta un buen disolvente de los esteroides, en tanto que el etanol lo será para los
ácidos grasos de cadena corta. De esta manera utilizando diferentes combinaciones de solventes no
sólo se logra la extracción de los lípidos a partir de la materia orgánica. sino que también se podrán
diseñar métodos que permitan la obtención selectiva de algunos de ellos.

En la práctica, trabajando con muestras de suero sanguíneo, probaremos kits comerciales

para la determinación de parámetros de un perfil lipídico.
II. OBJETIVOS.

1. Determinar la concentración de colesterol, triglicéridos y lipoproteínas en sangre.

2. Analizar los valores normales y patológicos de un perfil lipídico.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:

3.1 Materiales y equipos

3.1.1. Materiales:

1. Biológico.

• Suero sanguíneo

2. De vidrio:

• 12 Tubos de ensayo 13- x 100

• 02 Pipetas de 5 mL

3. Reactivos:

• 01 Kit de determinación de triglicéridos

• 01 Kit de determinación de colesterol

• 01 Kit de determinación de lipoproteínas (HDL y LDL)

• Alcohol etílico (50 mL)

• Agua destilada (50 mL)

• Agua helada (200 mL)

3.1.2. Equipos e instrumentos:

• 01 Baño maría 37ºC

• 01 Espectrofotómetro

• 01 Centrífuga

• Micropipetas de 2-20uL, 50-100uL, 100-1000uL.

• 02 Gradillas

3.1.3. Otros:

• 02 pares de guantes descartables

• 01 Marcador indeleble

• 05 Torundas de algodón

• 03 Agujas descartables 20 x ½”
 • 20 Tips de micropipetas (2-50 y 100-1000 μL)

• 10 Cubetas para espectrofotómetro 1 mL

• 01 Ligadura

• 01 Calculadora

3.2 Procedimientos.

3.2.1: Determinación de Colesterol en sangre (Wiener lab. ®).

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Extraer suero de manera usual y realizar la prueba de determinación

de colesterol de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubo Blanco Estándar Muestra

Muestra (suero) (uL) --- --- 10
Estándar (uL) --- 10 ---
Reactivo de trabajo (uL) 1000 1000 1000
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o 20 minutos a temperatura del ambiente (25°C) y leer a
505 nm., llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo. El color de la reacción es estable
120 minutos.

• Cálculos:

Colesterol Total (mg/dl) = Factor x Absorbancia de la muestra

Factor = _______200_________

Absorbancia del Estándar

• Valores de Referencia:

Deseable : < 200 mg/dl

Moderadamente elevado : 200 – 239 mg/dl

Elevado : ≥ 240 mg/dl

3.2.2. Determinación de triacilglicéridos en sangre (Wiener Iab. ®) .

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno (12 horas).

• Extraer suero de manera usual y realizar la prueba de determinación de triglicéridos de acuerdo
al siguiente cuadro:

Tubo Blanco Estándar Muestra

Muestra (suero) (uL) --- --- 10
Estándar (uL) --- 10 ---
Reactivo de trabajo (uL) 1000 1000 1000
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o 20 minutos a temperatura del ambiente y leer a 505 nm.,
llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo. El color de la reacción es estable 60
minutos.

• Cálculos:

Triglicéridos (mg/dl) = Factor x Absorbancia de la muestra

Factor = _______200_________

Absorbancia del Estándar

• Valores de Referencia:

Normal : < 150 mg/dl

Moderadamente elevado : 150 – 199 mg/dl

Elevado : 200 - 499 mg/dl

Muy elevado : ≥ 500 mg/dl

3.2.3. Determinación de HDL en sangre (Wiener Iab. ®) .

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Extraer suero de manera usual y realizar la prueba de determinación de lipoproteínas de alta

densidad (HDL) de acuerdo a lo siguiente:

En un tubo de ensayo 13 x 100 medir 500 ul de suero y agregar 50 ul de reactivo precipitante.

Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos y dejar 30 minutos en refrigerador
(4-10°C) o 15 minutos en baño de agua a la misma temperatura. No colocar en congelador.
Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Usar el sobrenadante límpido como muestra. Trabajar en 3
tubos 13 x 100 como sigue:
Tubo Blanco Estándar Muestra
Muestra (sobrenadante) (uL) --- --- 50
Estándar (uL) --- 10 ---
Reactivo de trabajo (uL) 1000 1000 1000
 Mezclar e incubar 15 minutos a 37°C, retirar del baño de agua y leer a 505 nm., llevando el
aparato a cero con el blanco de reactivo. El color de la reacción es estable 120 minutos.

• Cálculos:

HDL (g/l) = Factor x Absorbancia de la muestra

Factor = _______0.457_________

Absorbancia del Estándar

• Valores de Referencia:

Normal : 40 – 60 mg/dl

Riesgo de ECC : < 40 mg/dl

Protectivo de ECC : > 60 mg/dl

3.2.4. Determinación de LDL en sangre (Wiener Iab. ®) .

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Extraer suero de manera usual y realizar la prueba de determinación de lipoproteínas de baja

densidad (LDL) de acuerdo a lo siguiente:

En un tubo de ensayo 13 x 100 medir 100 ul de suero y agregar 50 ul de reactivo precipitante.

Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos y dejar 15 minutos en baño de agua a
20-25°C. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Separar INMEDIATAMENTE el sobrenadante y
usarlo como muestra. Trabajar en 3 tubos 13 x 100 como sigue:
Tubo Blanco Estándar Muestra
Muestra (sobrenadante) (uL) --- --- 50
Estándar (uL) --- 10 ---
Reactivo de trabajo (uL) 1000 1000 1000
Mezclar e incubar 15 minutos a 37°C, retirar del baño de agua y leer a 505 nm., llevando el
aparato a cero con el blanco de reactivo. El color de la reacción es estable 120 minutos.

• Cálculos:

LDL (g/l) = Colesterol Total – [Factor x Absorbancia de la muestra]

Factor = _______0.624_________

Absorbancia del Estándar

• Valores de Referencia:

Riesgo bajo o nulo de ECC : < 129 mg/dl

Riesgo moderado a elevado de ECC : 130 - 189 mg/dl

Riesgo muy elevado de ECC : > 190 mg/dl

IV. FUNDAMENTACIÓN

4.1. Metodología

COLESTEROL. El colesterol es oxidado por la colesterol oxidasa (CHOD) previa hidrólisis enzimática
de los ésteres mediante una lipasa. El agua oxigenada generada en la oxidación produce la unión
oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la
peroxidasa (POD). El producto es una quinonimina roja (4-[p-benzoquinona monoimino]-fenazona)
más agua.

El esquema de la reacción es el siguiente:

Lipasa

Ésteres de colesterol colesterol + ácidos grasos

CHOD

Colesterol + O2 colesten-3-ona + H2O2

POD

H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + H2O

TRIGLICÉRIDOS. Los triglicéridos son degradados enzimáticamente por la lipoproteinlipasa a glicerol

y ácidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por una cinasa en presencia de ATP, para dar glicerol
fosfato. Este al ser oxidado por la glicerol fosfato oxidasa (GPO), produce peróxido de hidrógeno y
dihidroxiacetona fosfato. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la unión oxidativa
del clorofenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la peroxidasa
(POD). El producto es una quinonimina roja (4-[p-benzoquinona monoimino]-fenazona) que se mide
a 505 nm.

El esquema de la reacción es el siguiente:

Lipoprotein lipasa

Triglicéridos glicerol + ácidos grasos

 Glicerol kinasa

Glicerol + ATP glicerol-1-P + ADP

GPO

Glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetona fosfato

POD

2 H2O2 + 4-AF + clorofenol quinonimina roja

HDL. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las
lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de ácido
fosfotúngstico en presencia de iones magnesio. Las HDL quedan en el sobrenadante separado por
centrifugación, donde se realiza la determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el
sistema enzimático Colesterol oxidasa / Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/4-AF).

LDL. Las lipoproteínas de baja densidad (LDL o β-lipoproteínas) se separan del suero precipitándolas
selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar,
en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL); el colesterol ligado a las mismas
se determina empleando el sistema enzimático Colesterol oxidasa / Peroxidasa con colorimetría
seqún Trinder (fenol/4-Af).

Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol

unido a las LDL.

4.2. Aplicación Clínica

El perfil lipídico corresponde a un panel o grupo de exámenes relacionados con los lípidos para
evaluar el riesgo de enfermedad arterial de las coronarias por ateroesclerosis. El estudio mínimo
incluye colesterol total. triglicéridos y las lipoproteínas que son proteínas cuya principal función es
transportar los lípidos en la sangre. Estas lipoproteínas se agrupan en lipoproteínas de baja densidad
(LDL), de muy baja densidad (VLDL) y de alta densidad (HDL). La HDL es un transportador de
colesterol y su objetivo es eliminar el colesterol de los tejidos periféricos y transportarlo al hígado
para su excreción. Además, las HDL tienen un efecto protector al evitar que las células capten
colesterol y lípidos. Las LDL transportan el colesterol que se puede detectar en tejidos periféricos y
se asocia con un aumento de enfermedad cardíaca, por lo tanto los niveles altos de LDL son
aterogénicos, Las VLDL transportan triglicéridos sanguíneos y niveles altos de estas se asocian con
un mayor riesgo de enfermedad oclusiva arteriosclerótica.

El perfil lipídico no solo es de utilidad para evaluar la hiperlipidemia como un índice que determina
el riesgo de enfermedad coronaria arterial sino que permite identificar oportunamente aquellos
individuos con riesgo y disminuir la morbi-mortalidad derivada de las dislipidemias. Además de la
utilización del perfil lipídico para detectar enfermedad arterial, la prueba permite identificar a
pacientes con endocrinopatías, especialmente relacionadas con la presencia de hipotiroidismo,
cirrosis biliar primaria, diabetes mellitus y falla renal, entre otras enfermedades asociadas con las
hiperlipoproteinemias secundarias. Colesterol superior a 220 mg/dl requiere tratamiento y se debe
tener una cifra de triglicéridos inferior a los 150 mg/dl. Una cifra superior, es compatible con mayor
ingestión de grasas animales de las necesarias y son materia prima para fabricar a la LDL. Fisiológica
pero perjudicial en exceso, porque se deposita en la capa íntima arterial y va obstruyendo la arteria
lentamente. El índice arterial nos refleja el grado de ateroesclerosis que estamos fabricando y debe
estar lo más cerca de cuatro o mejor con cifra inferior.

COLESTEROL.

El colesterol es un componente estructural de la membrana celular y las lipoproteínas plasmáticas

y es indispensable en la producción de esteroides, síntesis de hormonas femeninas (estrógenos),
además es el principal componente de la bilis e interviene activamente en la síntesis de los
andrógenos. La mayor parte del colesterol ingerido procede de alimentos de origen animal. El
hígado metaboliza el colesterol hasta su forma libre. El colesterol es transportado en el torrente
sanguíneo por lipoproteínas. Casi el 75% del colesterol está unido a lipoproteínas de baja densidad

(LDL) y el 25% a lipoproteínas de alta densidad HDL. Por lo tanto la dosificación de los niveles de
colesterol tiene como finalidad evaluar el riesgo de arteriopatía coronaria, el metabolismo de la
grasa, facilitar el diagnóstico de síndrome nefrótico, pancreatitis, hipotiroidismo e hipertiroidismo.
Valores por encima de los 220 mg/dl se deben controlar. De esta cifra en adelante se inicia el riesgo
coronario, que está influenciado por factores genéticos, alimentación, sistema de vida,
concentración de HDL, ingestión de grasas animales, vida sedentaria, entre muchos otros.

La determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica limitada. Se ha visto que
el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado que las
complicaciones arterioscleróticas prevalecen en Individuos hipercolesterolémicos.

Estudios epidemiológicos demuestran que el riesgo de contraer enfermedad cardíaca coronaria

para individuos de más de 40 años con colesterolemia menor a 2.10 g/l es 3 veces menor que entre
individuos con más de 2.30 g/l y 6 veces menor que entre individuos con más de 2.60 g/l de
colesterolemia.

Niveles aumentados de colesterol (hipercolesterolemia) se pueden encontrar en hiperlipidemias,

hipotiroidismo, diabetes mellitus descontrolada, síndrome nefrótico, embarazo, dieta rica en
colesterol, xantomatosis, hipertensión, infarto de miocardio, aterosclerosis, cirrosis biliar, estrés y
nefrosis.

Niveles disminuidos de colesterol (hipocolesterolemia) se pueden encontrar en trastornos de mal

absorción, desnutrición, hipertiroidismo, anemia perniciosa, enfermedad hepática, sepsis, estrés,
entre otros desórdenes psiquiátricos.

TRIGLICÉRIDOS. Los triglicéridos son lípidos absorbidos en la dieta y también producidos en forma
endógena a partir de los carbohidratos. Son una familia de complejos lipídicos resultantes de la
esterificación del glicerol con tres ácidos grasos (saturados o insaturados) de la misma o diferentes
longitudes.

Los triglicéridos no son solubles en la sangre, en donde son transportados como quilomicrones
(triglicéridos de origen exógeno) o como lipoproteínas de muy baja densidad o VLDL (triglicéridos
de origen endógeno). Los triglicéridos constituyen el 95 % del depósito de grasas del organismo. Los
triglicéridos están integrados en su mayor parte por las VLDL y su exceso se manifiesta por
depositarse como tejido graso. Mientras más elevado este su nivel, mas materia prima se tiene para
fabricar LDL. Los triglicéridos se elevan con la obesidad y en las hepatopatías y nefropatías crónicas.
Está plenamente demostrada la relación que existe entre diabetes mellitus e hipertrigliceridemia.

Los valores más altos están íntimamente relacionados con la posibilidad de desarrollar una
pancreatitis. Otras enfermedades en las cuales hay hipertrigliceridemia son enfermedad de depósito
de colágeno, hiperlipoproteinemias tipo I, IIb, III, IV, y V, hipotiroidismo, síndrome nefrótico, infarto
de miocardio y embarazo. También la hay en pacientes alcohólicos, situación que se normaliza con
la abstinencia.

Niveles disminuídos se pueden encontrar en síndrome de mala absorción y desnutrición. La

determinación de los triglicéridos puede ser utilizada para “calcular” indirectamente las
lipoproteínas LDL mediante la fórmula de Friedewald. LDL = colesterol total – HDL – (triglicéridos/5).

Su medición es importante en el diagnóstico y manejo de las hiperlipidemias. Estas enfermedades

pueden tener origen genético o ser secundarias a otras tales como nefrosis, diabetes mellitus y
disfunciones endocrinas. El aumento de triglicéridos se ha identificado como un factor de riesgo en
enfermedades ateroscleróticas.

HDL. Las lipoproteínas plasmáticas son partículas esféricas que contienen cantidades variables de
colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas. Los fosfolípidos, el colesterol libre y las proteínas
constituyen la superficie externa de la partícula lipoproteica, mientras que su núcleo contiene en
mayor proporción colesterol esterificado y triglicéridos. Estas partículas solubilizan y transportan el
colesterol en el torrente sanguíneo. La proporción relativa de proteína y lípido determina la
densidad de estas lipoproteínas y provee las bases sobre las cuáles establecer una clasificación.

Estas clases son: quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL-very low density
lipoproteins), lipoproteínas de baja densidad (LDL-low density lipoproteins) y lipoproteínas de alta
densidad (HDL-high density lipoproteins). Numerosos estudios clínicos han demostrado que las
diferentes clases de lipoproteínas tienen distintos y variados efectos en el riesgo de enfermedad
coronaria.

La función principal de las HDL en el metabolismo lipídico es la captación y transporte de colesterol

desde los tejidos periféricos al hígado en un proceso conocido como transporte reverso de
colesterol (mecanismo cardioprotectivo).

El HDL-colesterol bajo. está asociado con un alto riesgo de enfermedad cardíaca. Por este motivo la
determinación de HDL-colesterol es una herramienta útil en la identificación de individuos de alto
riesgo.
LDL. El contenido aproximado de colesterol en cada familia de lipoproteínas es (en % por unidad de
peso): 1% en los quilomicrones, 18% en las VLDL, 50% en las LDL y 23% en las HDL. Dado que cada
familia posee distinta actividad biológica, el significado clínico de un aumento de colesterol depende
de la o las lipoproteínas que se encuentran en exceso. Por otra parte, los mecanismos reguladores
de los niveles plasmáticos de lipoproteínas son muy complejos y pueden ser afectados por múltiples
factores (genéticos, ambientales, fisiológicos o patológicos), siendo posible encontrar valores de
colesterol total cercanos al rango normal acompañados de alteraciones en las fracciones
lipoproteicas.

Las HDL y las LDL han sido las más estudiadas por su importante actividad biológica:

- Las LDL, producto del metabolismo de las VLDL en plasma, son las encargadas del transporte
del colesterol exógeno (y en mucho menos proporción, endógeno) hacia el interior de las
células.
- Las HDL, sintetizadas en el hígado, remueven el colesterol no utilizado por las células (dentro
de ciertos límites de concentración), transportándolo hacia el hígado para su degradación.

Diversos estudios epidemiológicos han confirmado que el exceso de colesterol LDL con respecto a
un valor crítico (1,9 g/l) debe ser considerado factor de riesgo para el desarrollo de enfermedad
cardíaca coronaria, considerando que el efecto protector de las HDL sólo parece tener relevancia
dentro de cierto rango de concentraciones de colesterol circulante. Tales hallazgos permiten deducir
que los valores aislados de colesterol HDL o de LDL no pueden tomarse como índices predictivos de
riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los valores de colesterol total,
colesterol HDL y colesterol LDL.

DISLIPIDEMIAS. Los defectos del metabolismo de las lipoproteínas dan lugar a los trastornos
conocidos como hiperlipidemias o dislipidemias.

El incremento del flujo a través de la vía de transporte de combustible suele ser debido a un
aumento de la síntesis de VLDL. Esto ocurre en dos situaciones muy frecuentes: obesidad y diabetes.
La dislipidemia diabética afecta tanto a la vía de transporte de combustibles como al transporte
inverso del colesterol; los patrones frecuentes de lipoproteínas incluyen un incremento en la
concentración plasmática de triacilglicerol combinado con una disminución del colesterol HDL. Los
pacientes diabéticos a menudo tienen un colesterol LDL normal porque la vía de rebosamiento
permanece relativamente sin afectar. La pérdida de peso disminuye la actividad de esta vía. Otro
cuadro frecuente que origina el incremento de la producción de VLDL es el abuso de alcohol. Sin
embargo, a diferencia de la diabetes, aunque aumenta las VLDL, el exceso de alcohol se asocia a una
elevación de concentración de HDL.

La vía de transporte de combustibles también puede estar sobrecargada si la hidrólisis de los

quilomicrones o de las VLDL es poco eficaz. Esto puede suceder también en la diabetes porque la
falta de insulina inhibe la lipoproteína lipasa, da lugar a concentraciones plasmáticas
extremadamente elevadas de triacilglicerol.

La carga de lipoproteínas en la vía de transporte de combustibles está relacionada con la ingesta de

alimentos y con el ciclo de ayuno – alimentación. Actualmente se acepta cada vez más que un
incremento en los remanentes de lipoproteínas aterogénicas estimulado por una comida contribuye
a la aterogenesis.

La dislipidemia familiar es un cuadro herediterio que afecta la última etapa de la vía de transporte
de combustible y la captación de los remanentes lipídicos. Esta enfermedad esta causada por las
mutaciones de la apoE, que disminuye su unión con el receptor apoB/E. La disbetalipoproteinemia
familiar se asocia con concentraciones plasmáticas elevadas de remanentes y está relacionada con
la enfermedad cardiovascular prematura.

La alteración de la vía de rebosamiento da lugar a las hipercolesterolemias, entre ellas la

hipercolesterolemia familiar. El defecto más importante del metabolismo de las LDL es su captación
celular defectuosa, debido a la mutación en el receptor apoB/E. Los pacientes con
hipercolesterolemia familiar tienen una concentración elevada de LDL debido a una captación
celular defectuosa.

El aumento de las LDL también puede ser secundario a un incremento de la síntesis de VLDL si existe
un aumento de la transformación de remanentes en las LDL. Esto sucede en la dislipidemia familiar
combinada. Finalmente, la ingesta dietética de grasa saturada también afecta la concentración de
LDL. Una dieta baja en grasa puede disminuir las LDL y la concentración plasmática de colesterol en
un 10 – 15 %.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. D´ocon Navaza MC. García-Saavedra MJ. Vicente García JC. Fundamentos y Técnicas de
Análisis Bioquímicos. Principios de análisis instrumental. 2ª ed. España: Thompson –
Paraninfo: 2005.
2. Govantes J. Lorenzo P. Govantes C. Manual Normon. 8ª ed. Madrid España: Laboratorios
Normon S.A. 2006.
3. Wiener Lab. Group. Vademecum de Reactivos [en línea] 2010 [acceso: 2010 agosto 29].
Disponible en: http://www.wiener-lab.com.ar/wienerw/corp/vademecum.vsp