Laboratorio de Fisiología Vegetal

CULTIVO DE CALLO VEGETAL

ALUMNA KAREN ESTEVES ZÚÑIGA

PROFESORA JAVIERA GONZÁLEZ CRUZ

FECHA 24/11/17
 INTRODUCCIÓN

El cultivo in vitro de plantas puede definirse como el cultivo de células, tejidos, órganos, embriones y plantas enteras,

en condiciones asépticas, dentro de recipientes adecuados conteniendo un medio nutritivo y en un ambiente

controlado, cuyo objetivo es la formación y producción de células o productos deseados.

Un callo consiste en una masa amorfa de células no diferenciadas, no organizadas y de rápido crecimiento que pueden

ser producidas en todas las especies de plantas en respuesta a un suplemento de hormonas endógenas o externas.

Los cultivos de callos de plantas (callos que crecen asépticamente en medios líquidos en matraces o bioreactores) han

incrementado su uso en Biotecnología como una herramienta para la manipulación genética de plantas,

micropropagación, estudios del metabolismo y de desarrollo celular de plantas, así como para la producción comercial

de productos naturales (metabolitos primarios y secundarios) (Mc Donald, y Col.1995).

La característica más importante del callo, desde un punto de vista funcional, es que este crecimiento anormal tiene el

potencial de desarrollar raíces, brotes, y embriones que pueden formar plantas. Las características de crecimiento

generales de un callo implican una relación compleja entre el material vegetal utilizado para iniciar el callo, la

composición del medio y las condiciones ambientales durante el período de incubación.

¿Porqué utilizar zanahoria?

Stewart y Reinert en 1958 descubrieron embriogénesis somática a partir de tejido de zanahoria, desde entonces se

estableció como un sistema modelo, porque además demuestra totipotencia de plantas superiores. Este descubrimiento

abrió las puertas al cultivo de tejidos vegetales y la regeneración de plantas modificadas por ingeniería genética.

Muchas de las plantas cultivadas no pueden ser propagadas directamente por multiplicación vegetativa. Sin embargo,

explantes de raíz colocados en un medio con los nutrientes adecuados pueden dar origen a un callo, que es una masa

de células no diferenciadas. En el callo aparecen, eventualmente, embriones que pueden ser transferidos a un medio de

diferente composición, donde se desarrollarán regenerando a planta entera (DODDS et al., 1995).
OBJETIVO GENERAL

Familiarizarse con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro, y así establecer cultivos de callos.

MATERIALES

1 Zanahoria (Daucus carota) sana y fresca

4 vasos precipitados de 250 ml

3 cajas Petri

Bisturí, navajas de bisturí y pinzas de disección estériles.

Pelador de verduras

Equipos

Campana de flujo laminar

Autoclave

pHímetro

Balanza analítica

Reactivos

Etanol al 70%

Solución de hipoclorito de sodio blanqueador comercial (5.5% de cloro libre)al 10%

HCL 1.0 N

NaOH 1.0 N

1.0 litro de agua destiladas estéril

Frascos con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparado:

 MS 2% Sacarosa

 MS 2% Sacarosa, 1mg/L ANA

 MS 2% Sacarosa 1mg/L BAP,0,1 mg/L ANA

Reguladores de crecimiento: Auxina (ANA) y Citoquinina (BAP)

METODOLOGÍA

1. Preparación del medio de cultivo

Se calculó los gramos de MS necesarios para formar 500 mL medio MS a razón 1X (4,33g/L), y luego se

calculó los gramos de sacarosa 20 g/L y agar –agar 6.0 g/L necesarios para 500 mL.

Protocolo

Pesar MS, sacarosa y agar agar

Agregar gramos de MS y sacarosa en frascos schot en 200 ml de agua destilada

Ajustar pH a 5,5 con NaOH 1N

Agregar agar agar

Llevar a 500 ml con agua destilada

Revolver manualmente

Esterilizar en autoclave a 221° C y 15 lb de presión durante 15 minutos.

Una vez que el medio este tibio, se agregó las vitaminas MS (1X) 1.0mg/L BAP y 0,1 mg/L ANA,se

esterilizó con filtro de 0.22 um.

Se vertió alrededor de 50 ml por frasco

Finalmente se pesó las placas.

2. Material vegetal desde Daucus carota

Se utilizó zanahorias de 20 cm de longitud y 4 cm de diámetro.

Se lavó las zanahorias con agua y lavaloza

Se peló las zanahorias con un pelador de vegetales, se eliminó 2mm del tejido

Se cortó a las zanahorias en rebanadas de un 1cm de grosor

Se sumergió las rebanadas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos, posteriormente estas rebanadas

se sumergió en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, Tween 0,1 % durante 10 minutos ,a partir de este

paso se trabajó en la campana de flujo laminar.

Se lavó el material vegetal cinco veces con agua destilada para así quitar todo el hipoclorito utilizado en el

paso anterior, con agitación dentro de un vaso precipitado, durante 30 segundos.

Del vaso precipitado, se tomó una a una las rebanadas y se transfirió a una placa Petri y con ayuda de unas

pinzas de disección, se cortó 9 cubos de la zona del cambium de 1 cm por placa (figura 1).

Figura 1.Cortes de la zona de cambium

Se pesó las placas antes del cultivo. Se colocó tres cortes del cambium por placa con medio procurando que la

superficie de uno de los lados del cubo quede en contacto con la superficie del medio de cultivo.

Volver a pesar los frascos y calcular el peso de los explantes por diferencia.

Se colocó los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 de

oscuridad a una temperatura de 20-22 ºC. l. Se observó cada tres días el desarrollo de los cultivos, luego se

anotó las apariencias y cambios que van sufriendo los explantes.

Posteriormente, se separó los frascos con explantes necrosados y contaminados y se describió si se trata de

contaminación bacteriana o fúngica (pasto o pelos). Es de particular importancia determinar el tiempo de

aparición de los callos.

 RESULTADOS

FECHA: 20/10/17

*MEDICIONES ANTES DEL PLAQUETEADO

MS (CONTROL) 37,6913 g

MS ANA (AUXINA) 42,3643 g

MS ANA (AUXINA) +BAP( CITOQUININA) 39,2010 g

*MEDICIONES DESPUÉS DEL PLAQUETEADO

MS (CONTROL) 38,2646 g

MS ANA (AUXINA) 43,1584g

MS ANA (AUXINA) +BAP( CITOQUININA) 39,8627 g

FECHA: 02/11/17

MS (CONTROL) 36,6334 g

MS ANA (AUXINA) 39,6097g

MS ANA (AUXINA) +BAP( CITOQUININA) 38,4839 g

FECHA: 14/11/17

MS (CONTROL) 34,039 g

MS ANA (AUXINA) 35,69g

MS ANA (AUXINA) +BAP( CITOQUININA) 37,42 g

FECHA: 17/11/17

MS (CONTROL) 33 g

MS ANA (AUXINA) 34,74g

MS ANA (AUXINA) +BAP( CITOQUININA) 37,21g

Figura 2.Medios de cultivos con y sin reguladores de crecimiento (Auxina y Citoquinina)

Resultado ideal

Placa con indicios de callo

*muestra de Cesar Cordero

DISCUSIÓN

Cuando un callo es cultivado bajo condiciones adecuadas de luz, temperatura y nutrientes, pero sobre todo cuando el

cociente de citoquinina /auxina es elevado, algunas células inician una división ordenada para dar lugar a un brote que

se desarrolle en un tallo (caulogénesis).

Si al transferirse a un medio fresco con una concentración de auxina y citoquinina menor, en muchos casos carente de

citoquinina se induce a la formación de raíces.

A elevadas concentraciones de auxina los callos forman raíces directamente, pero son incapaces de formar tallos al

transferirlas a un medio con elevada citoquinina.

Desde la fecha de inicio del práctico hasta el fin del mismo, se observó una reducción en el peso de cada cultivo, esto

ocurrió debido a que la muestra de zanahoria empezaba a consumir los nutrientes del medio, y empezaban a transpirar
REFERENCIAS

DODDS J.H., ROBERTS L.W. 1995. Experiments in plant tissue culture, third edition. Cambridge, Cambridge

University Press.

Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A Laboratory Manual. WCB Wm.

C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne, Australia; Oxford, England.

Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J. And Dandekar, A. 1995. Applied Biochemistry and Biotechnology. 54. 93-

108.