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GUÍA 1
ESTERILIZACIÓN, PRUEBAS DE ESTERILIDAD Y
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
1. INTRODUCCIÓN
La técnica física de esterilización que es más común en microbiología se hace con Calor Húmedo
dentro de un equipo llamado Autoclave (ver figura 1). Este equipo diseñado por Chamberland
en 1884 tiene una tapa metálica y una resistencia eléctrica adentro que calienta el agua. El vapor
en el interior del autoclave se desplaza por una válvula de purga dejando que se sature el vapor
a altas presiones y a temperaturas superiores a los 100ªC sin que se produzca ebullición (Leahy et
al., 1999; Pérez-Uz et al., 2011).
Docente: Camilo Andrés Correa-Cárdenas-Rodríguez
de Agosto del 2019
Los medios de cultivo como Agar Sangre, Agar Chocolate (sangre de cordero), Baird Parker
(yema de huevo), Agar enterococal (2,3, 5-cloruro trimetil tetrazólico), así como soluciones de
sueros o antibióticos se descomponen o denaturan a altas temperaturas (Phillips & Brock, 1991).
Aunque aquí usaremos la técnica de calor húmedo, hay que tener presente que existen otras
técnicas de esterilización como Radiaciones (luz ultravioleta), Calor Seco y Filtración.
Finalmente, una prueba de esterilidad es positiva cuando el material ó el ambiente está estéril y
consecuentemente no hay crecimiento microbiano.
Docente: Camilo Andrés Correa-Cárdenas-Rodríguez
de Agosto del 2019
Los medios de cultivo sean agares o caldos se preparan pesando las bases o ingredientes por
separado y disolviendo en el volumen apropiado de agua. Por lo general, podemos encontrar
todos los medios de cultivo pulverizados en el comercio. Usualmente las etiquetas de los medios
dicen cuántos gramos deben disolver para preparar un litro de agua destilada. Los medios los
disolvemos por agitación constante e hirviendo en un Erlenmeyer y posteriormente lo taponamos
con algodón y gasa y lo autoclavamos si éste es autoclavable.
Para cada caja de petri de 9cm de diámetro se sirven 20ml de medio que corresponde a
aproximadamente ¾ de la altura de la caja de petri.
Para cada tubo inclinado se agregan de 5 a 8ml de medio, dependiendo del tamaño del tubo.
(Brown & Brown, 2012).
Un estudiante necesita preparar 10 cajas de petri de agar nutritivo. ¿Cuántos gramos debe pesar
del medio pulverizado?
32g 1000ml
X 200ml
X = 32gx200ml
1000ml
X = 6,4g
“Este estudiante debe disolver 6,4g de Agar Nutritivo en 200ml de agua destilada.”
2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN
- ¿El material de trabajo esterilizado bajo calor húmedo en el autoclave será positivo?
- ¿Habrá coherencia entre lo observado y esperado en las pruebas de esterilidad?
3. HIPÓTESIS
- Hay diferencias entre el material de trabajo esterilizado y el no esterilizado.
- Hay diferencias en los microorganismos observados en AN y PDA.
Docente: Camilo Andrés Correa-Cárdenas-Rodríguez
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4. OBJETIVOS
- Esterilizar material de trabajo en microbiología bajo la técnica de calor húmedo.
- Evaluar diferentes pruebas de esterilidad del ambiente y materiales de trabajo en el
laboratorio para bacterias, levaduras y hongos filamentosos.
- Aprender a preparar medios de cultivo autoclavables como AN y PDA para bacterias y
hongos respectivamente.
5. METODOLOGÍA PRÁCTICA
5.3 Procedimiento
¡OJO! Cada grupo hará pruebas de esterilidad para AN ó PDA según les asigne el docente. En
consecuencia con el medio de cultivo asignado, cada grupo preparará AN ó PDA.
Antes de iniciar la práctica, todos deben desinfectar los mesones y sus guantes con alcohol e
hipoclorito de sodio. Esta actividad se debe volver una rutina en todas las prácticas de
microbiología.
- Hagan los cálculos siguiendo como modelo el ejemplo que se les da en la introducción. ¡LEAN
LAS ETIQUETAS DE LOS FRASCOS DEL MEDIO DE CULTIVO ASIGNADO!
- Usen la espátula y pesen en la balanza analítica la cantidad necesaria de AN ó PDA pulverizado
que necesitan para 4 cajas de Petri y dispóngalo en el Erlenmeyer de 250ml.
- Tomen el volumen necesario de agua destilada con la probeta y dispóngalo también en el
Erlenmeyer.
- Introduzcan un agitador magnético en el Erlenmeyer (o puede homogenizar con varilla de
vidrio) y calienten en la plancha de calentamiento a 80ªC hasta observar que se disuelve el
medio.
- Tapen el Erlenmeyer con un tapón de algodón, gasa y cinta de enmascarar (torunda de
algodón). Y autoclavar.
- Dejen abierta durante 15 – 30 minutos una caja de Petri con AN ó PDA “estéril”.
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- Marquen la caja por el borde del envés de forma específica (nombre de la prueba, fecha, tipo
de agar, grupo, docente).
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.
- Tomen uno de los dos hisopos estériles y frótenlo sobre una superficie de uso común en el
laboratorio como por ejemplo una válvula de gas, un interruptor de luz, una perilla de alguna
manija de algún equipo ó puerta del salón, el mesón, entre otros.
- Enciendan el mechero y abran la caja de Petri con AN ó PDA “estéril” cerca de éste. De esta
forma nos aseguramos que los microorganismos que allí crezcan sean los procedentes de la
superficie frotada.
- Froten el hisopo sobre toda la superficie del medio de cultivo y cierren la caja.
- Marquen la caja por el borde del envés de forma específica (como se ha indicado
anteriormente).
- Sellen con parafilm
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.
- Sellen con parafilm los bordes de una caja de Petri con AN ó PDA “estéril”.
- Marquen la caja por el borde del envés de forma específica.
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.
UNA VEZ HAYAN SALIDO LOS MATERIALES ESTÉRILES DEL AUTOCLAVE, PODEMOS
CONTINUAR CON EL SIGUIENTE PUNTO.
- Marquen por el envés una caja de Petri con “Caja estéril” y otra caja con “Caja no estéril” (esta
es la caja que no se autoclavó).
- Enciendan el mechero y abran las cajas de Petri vacías.
- Adicionen 20ml del medio fundido sea AN ó PDA. El medio está listo para servir cuando el
Erlenmeyer es tolerable al tacto (45ªC aproximadamente).
- Homogenicen el medio haciendo movimientos en L ó en 8 muy suavemente, evitando que el
medio se pegue en la tapa de la caja de Petri.
- Dejen solidificar el medio (10 minutos aproximadamente).
- Lleven a incubar a 37ªC si es AN para bacterias ó a 25ªC si es PDA para hongos durante 48 horas.
- Hagan lectura de sus resultados.
1). Construyan una tabla de resultados de las pruebas de esterilidad comparando lo observado
con lo esperado. Deben tabular los resultados de otro grupo que haya trabajado el mismo medio
de cultivo que ustedes para que puedan comparar y tener replicas experimental. Recuerden que
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una prueba de esterilidad (+) significa que dio estéril y no creció ningún microorganismo, por el
contrario un resultado (-) significa que no era estéril y crecieron microorganismos. Lo ideal sería
que tomen fotografías para el informe.
Condiciones de esterilización:
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2). Describan de forma muy general macro y microscópicamente una bacteria, levadura u hongo
filamentoso que ustedes deseen de alguna de sus pruebas de esterilidad. Lo ideal sería que tomen
fotografías para el informe.
Tamaño de la
colonia en
milímetros
Color
Forma
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
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Tamaño de la
colonia en
milímetros
Color
Forma
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
PREGUNTAS QUE DEBEN SER RESUELTAS Y DISCUTIDAS EN EL INFORME TIPO ARTÍCULO CIENTÍFICO
CON SUS RESPECTIVAS CITAS BIBLIOGRÁFICAS.
- ¿Fueron coherentes los resultados de las pruebas de esterilidad en todos los casos?
Justifique cada resultado y compare con estudios previos.
- ¿Los medios AN y PDA inhibieron el crecimiento de hongos y bacterias respectivamente?
Justifique su resultado según las características de estos medios de cultivo.
- ¿Qué podríamos discutir de los resultados de bacterias frente a los de hongos en cada
uno de los casos?
- ¿Qué se podría afirmar con respecto a la esterilidad del ambiente y materiales de trabajo
en el laboratorio de microbiología de la Universidad Central? ¿Qué se sugiere ó se
propone en cualquier caso?
7. CONCLUSIONES
8. REFERENCIAS
Brown, A. E., & Brown, A. E. (2012). Benson\? s microbiological applications: laboratory manual in
general microbiology (No. QR63 B76 2012).
Leahy, T.J.; Kerry, L.R. y Christopher, M.R. 1999. Microbiology of sterilization processes. En: Validation
of pharmaceutical processes: sterile product. Carleton, F.J. y Agalloco, J.P. Ed. Pp: 353-380.
Pérez-Uz, B., de Silóniz, M. I., Torralba, B., & Vázquez, C. (2011). Metodología de esterilización en el
laboratorio microbiológico. Reduca (Biología), 3(5).
Phillips, J. A., & Brock, T. D. (1991). Laboratory manual: biology of microorganisms. Prentice Hall.