Metodologías de Scale-Up para Escherichia coli y procesos de fermentación de

levadura
Se han compilado y revisado las técnicas de ampliación de la literatura para su aplicabilidad a los procesos de Escherichia coli y levadura.
Se estableció la consistencia de los parámetros de diseño y operación para los buques a escala piloto en una planta piloto de fermentación
existente, con un volumen nominal de 100 l a 19.000 l, y se comparó favorablemente con los enfoques encontrados en la literatura. Se
observaron diferencias en función de parámetros como la escala del fermentador, la geometría del recipiente, el tipo/tamaño del agitador y
la entrada de potencia sin gas/gasificado. Se realizaron análisis adicionales utilizando datos reales de fermentación para los procesos de
desarrollo históricos y recientes recopilados durante un período de 10 años, centrándose en las condiciones operativas a tasas máximas de
absorción de oxígeno en el cultivo. Las estimaciones de escalamiento se realizaron con base en la similitud geométrica, la velocidad de punta
del agitador, la potencia gaseada por unidad de volumen y el tiempo de mezcla. En general, los cálculos de escalamiento a partir de la escala
de 280 l fueron más similares a los parámetros del equipo instalado. Escalonamiento a partir de la escala de laboratorio de 30 l típicamente
infrapredijo los parámetros, siendo el escalonamiento a partir de la escala de 280 l el más apropiado. La instalación de fermentadores de
19.000 l presentaba una similitud geométrica notablemente diferente de las básculas de 280 l-1900 l, ya que su diseño debía adaptarse a
una amplia gama de volúmenes operativos. Se realizó un análisis de los resultados históricos y recientes del procesamiento para las
fermentaciones bacterianas o de levadura de una sola célula que desafiaron las condiciones máximas de funcionamiento de los
fermentadores. Se consideró que la identificación de cuestiones clave asociadas con la ampliación a escala para estos buques de planta piloto
específicos era fundamental para el desarrollo eficiente del proceso, la producción de material clínico y la transferencia de procesos esperada
a una planta de fabricación.

Van Brunt (1) ha abordado las preocupaciones generales
relativas a la ampliación progresiva del ADN recombinante.
Aunque las tres escalas principales para el desarrollo de
bioprocesos son laboratorio, planta piloto y producción (2),
Votruba y Sobotka han añadido a esta lista (3) la escala
Shake-flask. La proporción de ampliación suele ser de
aproximadamente 1:10 para los procesos biotecnológicos de
hasta 100.000 l (3), pero se han utilizado a menudo
proporciones inferiores de aproximadamente 1:5 para
aumentar los niveles de comodidad (es decir, disminuir el
riesgo de un rendimiento inesperado en la ampliación). Es
probable que la escala de producción para muchos
productos de ADN recombinante sea de unos 10.000 l, que
es la escala piloto más tradicional para otros tipos de
productos (4). La metodología exacta utilizada para la
ampliación a escala depende en gran medida de las
condiciones del proceso y de la existencia de datos
preliminares que demuestren que el procedimiento elegido
es aplicable (5).
Algunos autores sostienen que el ambiente total (Young[6]
acuñó este término para abarcar todas las variables químicas
y físicas relacionadas con el caldo de fermentación) de la
célula debe ser considerado (6). Reisman (7) detalla
extensamente un catálogo completo de factores afectados
por la escala, destacando también otros autores (1-6).
Además, el papel de los estudios de reducción gradual
puede ser significativo en la identificación y evaluación de
problemas a gran escala (8-11).
Los factores biológicos afectados por la escala incluyen el
número de generaciones asociadas con las fases de
desarrollo y producción del inóculo, la probabilidad de
mutación, la vulnerabilidad a la contaminación, la formación
de pellets y la presión de selección (8,12). Los factores
químicos afectados por la cal incluyen (i) agentes de control
del pH (es decir, tipo y concentración de ácido y/o base),
calidad media (es decir, pureza de los componentes) y
calidad del agua (8); (ii) carbohidratos (por ejemplo, aceite),
1
nitrógeno (por ejemplo, amoniaco), fósforo y
concentraciones de producto (6); (iii) potencial redox y
formación de espuma debido a cambios en la tensión
superficial (3). Los factores físicos afectados por la escala
incluyen la configuración del tanque, aireación, agitación,
contrapresión (y presión hidrostática), esterilización del
medio, control de temperatura/transferencia y remoción de
calor, y mezcla (3,8,12).
Existe un documento exhaustivo en el que se esbozan los
enfoques generales para la ampliación (13) y se incluyen
comentarios de varios otros autores sobre las consecuencias
de las tendencias generales de la ampliación (13). A menos
que se mantenga una constante específica con el
escalonamiento al fermentador más grande, el dióxido de
carbono disuelto (dCO2) es más alto en el recipiente más
grande que el recipiente más pequeño debido a la presión de
cabeza agregada, la variación de la fuerza cortante es más
alta, y la mezcla a granel es menos eficiente debido a los
tiempos de circulación más largos y las regiones estancadas
más grandes (8). Además, para el recipiente más grande, la
relación entre la altura del líquido y el diámetro del tanque
puede ser mayor, el gas se mueve hacia arriba con gradientes
de oxígeno disuelto vertical (DO) más limitados, si la mezcla
a granel es más lenta que las tasas de transferencia de masa,
y los gradientes radiales DO emergen ya que la velocidad de
corte disminuye rápidamente con la distancia del impulsor
(14). Otras tendencias en el escalamiento incluyen la
disminución de la superficie de transferencia de calor a la
relación de volumen, la disminución de la calidad de la
mezcla, por lo general mayor velocidad superficial del aire y
menor fuerza de corte media, aunque las fuerzas de
cizallamiento pico son mayores (14,15). Además, si se han
seleccionado componentes medios más baratos y de
composición variable para diferentes lotes a granel, puede
aparecer un patrón de crecimiento auxotrofico previamente
desapercibido (15), pero este fenómeno se reduce al mínimo
mediante el uso de un medio definido.
Hay varias descripciones publicadas de estudios de
ampliación y algunos ejemplos interesantes son dignos de
mención. La transferencia de oxígeno a menudo puede ser
más importante en el escalamiento debido a su baja
solubilidad en medio (16). La clave para escalar usando la
tasa de transferencia de oxígeno constante (OTR) es la
capacidad de medir o estimar el coeficiente de transferencia
de masa volumétrica, KLa, y la potencia gaseada por unidad
de volumen líquido, Pg/VL. Las correlaciones publicadas
pueden generar errores significativos como en el ejemplo de
los factores KLa para una fermentación a escala comercial de
la penicilina (17). La ampliación de la producción de bialafos
por parte de Streptomyces hygroscopicus basada en KLa y
Pg/VL no tuvo éxito debido a los grandes gradientes de
concentración de DO en el fermentador (18). En este ejemplo,
el cultivo no era sensible a los cambios de velocidad de la
punta del impulsor al aumentar la escala. El escalamiento
fue exitoso cuando la DO objetivo en el fermentador de
laboratorio se utilizó para controlar la DO del fermentador a
gran escala utilizando una sonda ubicada en la parte inferior
del fermentador a gran escala. Del mismo modo, durante el
escalamiento de la producción de milbemicina por S.
hygroscopicus se observó el síndrome de producción
deteriorada (SUDS) durante el escalamiento de la
producción de milbemycin cuando se utilizó la tasa de
agitación para controlar la DO como se hizo a pequeña escala
(19). El síndrome SUDS incluyó cambios morfológicos en el
cultivo que afectaron el volumen y la viscosidad de las
células empacadas, cambios en la absorción de fuentes de
carbono y disminución de la productividad. Se desarrolló
una estrategia alternativa de control de la DO utilizando una
tasa de aireación, contrapresión y temperatura, además de la
tasa de agitación, para mantener los rendimientos de
laboratorio al aumentar la escala.
Otros ejemplos adicionales se centran en parámetros
distintos a la transferencia de oxígeno. Para el escalamiento
de la producción de toyocamicina por un mutante sensible
al cizallamiento de Streptomyces chrestomyceticus, no se
pudo utilizar el método Pg/VL constante ni el método OTR
constante, y por lo tanto el escalamiento se hizo a la menor
velocidad de punta posible para el vaso mayor
geométricamente similar (20). Se comprobó que los tiempos
de mezcla y circulación eran más importantes que la
utilización de una tasa de absorción de oxígeno constante
(TOU) para el escalamiento de una fermentación de 2,3-
2
butanodiol por Enterobacter aerogénicos en condiciones
microaeróbicas en las que la homogeneidad era importante
(21). Aunque, en general, la ampliación basada en dCO2
sería aún más factible a medida que se dispusiera de
sensores dCO2 más fiables (16), la tasa específica de
evolución del dióxido de carbono seguía siendo útil para la
ampliación de los cultivos de metabolitos secundarios (22).
El propósito de este documento es describir y evaluar
brevemente varios métodos y enfoques de scale-up que
pueden ser aplicados al ejemplo E. coli y procesos de
levadura. El primer paso consistió en catalogar las
mediciones de características para los fermentadores de
laboratorio existentes (escala 30 l) y la planta piloto (escala
100 l-19.000 l) (cuadros 1 y 2). A continuación, se calcularon
y compararon los parámetros relevantes en función de la
escala basada en la geometría, la entrada de potencia por
unidad de volumen, el caudal de gas y el tiempo de mezcla
(cuadros 3-5). Se exploraron varios escenarios de
escalamiento basados en el mantenimiento de la similitud
geométrica (Cuadro 6), la velocidad constante del impulsor
(Cuadro 7) y la entrada de potencia constante por unidad de
volumen líquido (Cuadros 8 y 9). También se completó una
comparación basada en el esfuerzo térmico medio durante la
esterilización (Cuadro 10). Se desarrolló una lista de las
condiciones de procesamiento históricas y recientes
alcanzables (Cuadros 11 y 12), y se cuantificó la relación de
NUESTRA con KLa y Pg/VL con KLa para varios procesos
(Cuadro 13). Para mayor coherencia, todos los volúmenes
citados en este texto son volúmenes nominales de recipientes
(en lugar de volúmenes totales o de trabajo) a menos que se
indique lo contrario. Se seleccionaron unidades para
minimizar los errores de redondeo cuando fue posible.
I. MÉTODOS Y ENFOQUES DE AMPLIACIÓN A GRAN
ESCALA
A continuación, se describen varios métodos de ampliación
a escala, y se evaluaron enfoques de ampliación
seleccionados utilizando dos escalas como base: la escala
piloto de 280 l, que es una escala fermentadora común de
planta piloto de primera etapa, y la escala de laboratorio de
30 l, que es comúnmente utilizada para estudios de plantas
pre-piloto (laboratorio). Los detalles de algunos de estos
buques y sus impulsores se han discutido en otra parte (23-
25).
La figura 1 muestra un diagrama de fermentador típico con
las ubicaciones clave identificadas.
La similitud geométrica de la geometría del
reactor[DT/VT] 1/3 o (DT/VL) 1/3] La similitud geométrica
se expresa de la siguiente manera:
donde DTi es el diámetro del tanque y VTi es el volumen
total del tanque del recipiente, i. Alternativamente, se puede
utilizar el volumen de líquido, VLi. Asume una geometría de
impulsor razonablemente constante (es decir, diámetro del
3
impulsor, DI y número de impulsores, NI) como se
especifica a continuación. Basándose en el trabajo
objetivo/volúmenes totales obtenidos a partir de la similitud
geométrica (Tabla 6), el volumen de trabajo deseado en el
fermentador puede ser alterado durante la experimentación.
Los experimentos para obtener datos de varias correlaciones
empíricas utilizaron buques geométricamente similares.
Aunque la similitud geométrica es un prerrequisito para
aplicar las relaciones de escalamiento establecidas, en la
práctica rara vez es factible (26,27). Posteriormente, se
propuso un rango de aceptación de equivalencia (26) para
incluir lo siguiente: (i) DI/DT0.3-0.45, donde DI/DT es la
relación entre el impulsor y los diámetros del tanque; (ii)
HL/DT es menor o igual a 2 (no se dio rango), donde HL es
la altura del líquido en el recipiente; y (iii) dos o tres
impulsores. Como se muestra en la Tabla 3, los valores
DI/DT oscilaron entre 0.33-0.5 para todos los buques en esta
instalación. Específicamente, el rango fue de 0.33-0.39 para
los buques con impulsores de flujo radial Rushton (Lightnin,
Avon, NY, EUA), 0.462-0.5 para los buques con impulsores
de flujo axial Maxflo T (Chemineer, Dayton, OH, EUA), y
0.43-0.56 para los buques con impulsores de flujo axial A315
(Lightnin). En el caso de los buques estudiados, las
relaciones HT/DT oscilaron entre 2.1-3.3 donde HT es la
altura total del tanque. El rango de la relación tangente-a-
agente entre la altura del depósito y el diámetro del depósito,
HTT/DT (que se consideró más útil que HL/DT para
comparar ya que los volúmenes de trabajo del fermentador
pueden ser variables), fue de 1,7-2,9, con un valor de 2,9 para
el fermentador de 19.000 l muy por encima del resto, que
osciló entre 1,7 y 2,1. El fermentador de 19.000 l es un valor
entre 1,7 y 2,1. Todos los buques tenían dos o tres impulsores
excepto dos de los tres 19.000 buques (los impulsores
Rushton y Maxflo T) que tenían cuatro impulsores.
de trabajo variables para acomodar una gama más amplia de
tamaños de lotes esperados en una instalación multiuso.
La Tabla 6 muestra los parámetros de escalamiento del total
esperado y los volúmenes de trabajo calculados en base a la
similitud geométrica. Para la base de ampliación de 280 l, los
números calculados difirieron drásticamente de los equipos
instalados para las escalas de 30 l y 19.000 l, pero fueron
razonablemente cercanos (dentro de un 2-17%) entre las
escalas de 100 l y 1900 l. Aunque los valores esperados de
19.000 l fueron inferiores en un 30-47%, el valor de 30 l fue
mayor en un 46-55%. Para la base de ampliación de 30 l,
todos los números calculados fueron sustancialmente
inferiores a los valores instalados en un 19-45% entre las
escalas de 100 l y 1900 l y en un 52-65% para la escala de
19.000 l. Las razones de estas diferencias fueron evidentes al
comparar los valores del parámetro de similitud geométrica
(DT/VL) 1/3, que figura en la Tabla 3. Los valores para la
escala de 100 l a 1900 l oscilaban entre 0,935-0,99 (promedio
de 0,9580.019); los valores para la escala de 30 l y 19.000 l eran
notablemente diferentes (superior a 4,5-9,5 SD de la media).
El funcionamiento del fermentador a escala de 19.000 l con
un menor volumen de trabajo aproxima su similitud
geométrica al valor medio de los recipientes más pequeños.

Los fermentadores con una geometría estándar son

beneficiosos, ya que varias correlaciones publicadas de
escalamiento asumen que la geometría es constante (8). Sin
embargo, los fermentadores de laboratorio pueden tener
relaciones HT/DT sustancialmente más bajas de 1:1 en
comparación con los fermentadores a escala piloto de 3:1,
por lo que los datos a escala de laboratorio pueden ser
engañosos (8). Los fermentadores de producción y escala
piloto más grandes pueden ser diseñados para volúmenes

4
La velocidad constante de la punta del impulsor (ITS) o ITS
de corte se expresa como:
que asume que ITSNi DIi donde Ni y DIi son la velocidad
del impulsor y el diámetro del impulsor para el recipiente i
(8). La Tabla 2 muestra que las velocidades típicas de la
punta del impulsor instalado variaron de 3.8 a 7.6 m/s sin
una tendencia clara observada con escala, pero
aproximadamente un aumento de 25-37% con los
impulsores hidroala (A315 y Maxflo T) que los impulsores
de turbina de disco (Rushton) para la misma escala del
fermentador debido principalmente a sus diámetros más
grandes. La velocidad de la punta se utiliza como regla para
el scale-up cuando no hay una buena comprensión de la
relación entre cizallamiento y morfología para los cultivos
miceliales. Una regla general es que el daño celular puede
5
ocurrir a velocidades de la punta superiores a 3,2 m/s, pero
el valor exacto está influenciado por muchos factores como
la reología del caldo (28). Las velocidades calculadas de las
puntas suelen ser superiores a 3 m/s para fermentadores de
producción (29) y oscilan entre 5-7 m/s a partir de una
medición de fermentadores industriales (Einsele, A., Abstr.
5th Intern. Ferment. Symp., p. 69,1976). Se encontró que se
usaba una velocidad de punta constante en el rango de 5-7
m/s para el escalonamiento de fermentaciones antibióticas
(Einsele, Abstr. 5º Intern. Ferment. Symp., 1976). Aunque es
útil en la levadura ramificada, las fermentaciones
bacterianas y fúngicas filamentosas para estimar el potencial
de ruptura de las hifas y, por lo tanto, la alteración de la
morfología del caldo, la velocidad de la punta es menos útil
para las fermentaciones bacterianas de una sola célula o de
levadura.
Si el escalamiento se realiza utilizando una velocidad de
punta constante (con similitud geométrica), a menudo se
reduce el valor de Pg/VL, lo que puede afectar
negativamente a la eficiencia de la aireación. Es posible
recuperarse de esta deficiencia utilizando más impulsores en
el recipiente más grande y de esta manera puede ser posible
mantener constante tanto la velocidad de la punta como el
Pg/VL (30). La velocidad de la punta influye en el
cizallamiento del impulsor, que es proporcional al producto
de la velocidad de la punta del impulsor y el diámetro del
impulsor, NDI 2, para condiciones de flujo turbulento (29).
Como se muestra en la Tabla 7, para la base de ampliación
de 280 l, hubo un acuerdo razonable (dentro de un 2-24%)
6
entre el total esperado y el volumen real y el volumen de
trabajo para las escalas de 280 l-1900 l, pero los valores
esperados fueron sustancialmente más bajos (58-69%) en la
escala de 19.000 l y más altos (97-355%) para las escalas de 30
l y 100 l. Para la base de ampliación de 30 l, todos los valores
estimados fueron sustancialmente más bajos (40-85%) que
los valores instalados, excepto para el recipiente de 100 l, que
era sustancialmente más alto (131-175%) debido a su tasa de
agitación máxima más alta. Puesto que se utilizó la similitud
geométrica para calcular los valores en la Tabla 7, esto
explica por qué los valores de 30 l y 19.000 l eran
sustancialmente diferentes a los valores instalados y por qué
los valores para la base de ampliación de 30 l tampoco
estaban de acuerdo.
Los diseños de entrada de potencia constante sin gas o (más
a menudo) con gas por volumen líquido (Po/VL o Pg/VL)
Scale-up también pueden incluir la entrada de potencia sin
gas, Po, que se expresa como:
donde NP, el número de potencia, es un factor de
proporcionalidad basado en el diseño del impulsor (entre
otros factores) y es la densidad del caldo (8) que se considera
típicamente ligeramente superior al agua. El número de
potencia generalmente permanece constante con el
escalamiento si se utiliza el mismo tipo de impulsor.
La potencia constante sin gas, (Po/VL)i, para el buque, i, se
expresa como sigue:
donde c se encontró que era de 0,37 en la práctica, basado en
un estudio de plantas industriales de varias escalas y
procesos (Einsele, Abstr. 5th Intern. Ferment. Symp., 1976).
Se puede aplicar una relación similar para las entradas de
energía gaseada. Los valores generales de Po/VL son de 1-3
kW/m3 (1,3-4 hp/1000 l) para los buques de hasta 300 m3
(300.000 l) de volumen de trabajo (Einsele, Abstr. 5th Intern.
Ferment. Symp., 1976), y una regla general es que Po/VL es
de 2-4 kW/m3 (2,7-5,4 hp/1000 l) en la escala de producción
sin rango de volumen dado por Kossen y Ooster.
Si el escalamiento se realiza usando Po/VL constante con
similitud geométrica, entonces el tiempo de circulación, el
tiempo de mezcla y la velocidad de punta del impulsor
aumentan (30), pero el tamaño de los remolinos no cambia
(29). El Po/VL requerido para proporcionar un cierto OTR
generalmente disminuye con la escala (2). El aumento de la
escala sobre la base de Po/VL constante puede resultar en
un tamaño del motor más grande de lo necesario. Además,
es difícil tener una alta potencia por unidad de volumen de
entrada a gran escala (27) debido a limitaciones prácticas en
el tamaño del motor. Suponiendo que se trata de buques
geométricamente similares en los que DT1/DT2
(VT1/VT2)1/3 (5) y, a continuación, escalonamiento basado
en una potencia constante sin gas o gaseada por volumen
unitario (Po/VL o Pg/VL, respectivamente) simplifica a:

Esta expresión es muy similar al N2/N1 (VT1/VT2)1/3

utilizado en la Tabla 7, que se derivó para el scale-up en base
a la velocidad de punta constante y la similitud geométrica
(5). Aunque la influencia de la tasa de gaseado se incorpora
en el valor de Pg basado en mediciones o reducciones
esperadas en la pérdida de potencia durante el gaseado,
puede ser un reto contabilizar con precisión la eficiencia del
gaseado (aireación). Además, esta relación es más efectiva
para los flujos turbulentos observados durante los cultivos
de una sola célula E. coli y levadura y menos efectiva para
los cultivos miceliales de alta viscosidad (5).

Como se observa en la Tabla 4, los valores medidos de

Pg/VL a velocidades máximas de aireación (Qmax) y
agitación (Nmax) para los volúmenes de trabajo declarados
oscilaron entre casi 19 CV/1000 l y 2 hp/1000 l, ya que la
escala aumentó de 280 l a 19.000 l. Los valores medidos de
Po/VL fueron superiores a los de Pg/VL debido a la
disminución de potencia en el gaseo, y la relación de Pg/Po
varió de acuerdo con los valores de Pg/Po. Las tablas 8a
(para los impulsores de flujo radial Rushton) y 9 (para los
impulsores de flujo axial de hidroala Maxflo T y A315)
muestran que el escalamiento basado en Po/VL medido y
los valores de Pg/VL medidos se acordaron razonablemente
bien (dentro del 26%) con los valores esperados para las
escalas de 800 l, 1900 l y 19.000 l. La excepción notable fue la
escala de 19.000 l con impulsores Rushton, cuyo valor
esperado fue superior en un 85% al valor medido. Los
valores esperados para los fermentadores de escala de 1000
l y 1200 l fueron notablemente superiores en un 83-180%,
debido a que el Pg/VL medido para este recipiente de escala
fue menor que el Pg/VL típico (versus potencia del motor
instalado). Los valores medidos para las básculas de 30 l y
100 l no pudieron ser comparados ya que no se instaló
ningún dispositivo de medición de potencia.

La Tabla 8b muestra el uso de los valores instalados para

Po/VL del fermentador de 30 l como base para el
escalonamiento. La concordancia de los valores esperados y
reales en torno al 30% era evidente para todas las escalas,
excepto la escala de 1000 l, que era superior en un 70%.
Utilizando la escala de 1000 l como base (datos no
mostrados), los valores esperados fueron inferiores para
todas las escalas en al menos un 40%, una tendencia que
también se debe a la menor Pg/VL medido.
El número de Reynold del impulsor similar (NRe) Scale-up
se puede lograr basado en el número de Reynold del
impulsor constante, NRe:
Donde η está la viscosidad del caldo (8,31). Para el mismo
caldo, esta expresión simplifica a:
Para las máximas condiciones operativas de agitación (Tabla
1), el número de impulsores Reynold osciló entre 0.48-8.8106
para agua (o para caldos de célula única E. coli y caldos de
levadura con viscosidades similares al agua), sugiriendo que
para caldos filamentosos con viscosidades más altas el flujo
puede cambiar de turbulento a laminar. El uso del número
constante de Reynold's generalmente no ha funcionado bien
para el escalamiento de la fermentación desde que no se
incorporó el efecto de la aireación en el proceso (2), y el
número de impulsores Reynolds generalmente aumenta
para los diseños exitosos de escalamiento (26). Otros grupos
sin dimensiones también han sido examinados para su
ampliación con un éxito limitado, lo que a menudo resulta
en equipos técnicamente poco realistas y parámetros
operativos. Dado que es difícil mantener constantes todos
los parámetros sin dimensiones al escalar, los más

7
importantes para el proceso deben ser identificados con
precisión.
Tasa de absorción de oxígeno constante (OUR), coeficiente
de transferencia de masa (KLA) u oxígeno disuelto (DO) El
Scale-up basado en el OUR constante asume que el OTR es
igual al OUR:
donde Csat es la concentración de DO del caldo a la
saturación, CL es la concentración de DO del caldo medida,
es la tasa de crecimiento específica, X es la densidad celular
medida y YX/O2 es el rendimiento celular calculado por la
cantidad de oxígeno consumido (32). Los cambios en la
contrapresión y la presión hidrostática con escalamiento
influyen en los valores de Csat (y posteriormente CL).
También es posible utilizar el valor medio logarítmico de la
diferencia de concentración DO. Puesto que para la mayoría
de las fermentaciones aeróbicas la concentración crítica de
DO que afecta negativamente a la tasa de crecimiento es muy
baja, se supone que CL es cero.
Varias correlaciones de la forma general
existen para estimar el KLA utilizando la potencia gaseada
por volumen líquido, Pg/VL, y la velocidad superficial del
gas, Vs, para las fermentaciones (similar a la correlación Van
Riet para la transferencia de masa):
donde f2 es una constante de proporcionalidad en todas las
ecuaciones cuyo valor varía según el proceso específico y las
unidades de KLa, Pg/VL y Vs utilizadas en los cálculos.
Todos los volúmenes citados en la Ec. 9a-c son volúmenes
operativos. Para estas correlaciones, la dependencia de KLa
de Pg/VL es menor a medida que aumenta la escala de vasos
(es decir, disminuye el exponente). De manera similar, la
8
dependencia de KLa de las Vs también disminuye en el
escalamiento, pero principalmente entre la escala piloto y las
etapas de producción. Más comúnmente cuando la potencia
se cambia sólo aumentando la velocidad de agitación,
entonces la Ec. 9c simplifica a:
En los fermentadores a escala de laboratorio en los que las
mediciones de Pg/VL son difíciles de obtener con precisión,
pueden utilizarse los componentes clave del número de
potencia (N, DI):
donde, aunque el exponente de 0.42 se estableció para un
volumen de trabajo de 0.6 l, el rango de literatura es de 0.16-
0.68. Puesto que generalmente son más aplicables en o cerca
de las condiciones utilizadas para determinar los
exponentes, estas correlaciones podrían utilizarse mejor sólo
como guía cualitativa en los cálculos de escalamiento (28).
Como se muestra en la Tabla 5, los valores calculados de
(Pg/VL) a Vs b usando valores medidos de Pg/VL y Eq. 9a
y 9b son razonablemente similares (promedio[ave]: 7.8 1.9;
desviación estándar relativa[rsd]: 24%) de las escalas de 280
l a 19,000 l (180 l-15,000 l de volumen de trabajo). Cuando se
utilizan valores de diseño de Po/VL, se obtienen valores
mucho más altos de (Pg/VL) a Vs b como se esperaba,
siendo los valores razonablemente similares (ave: 11.02.2;
rsd: 20%) de las escalas de 800 l a 19.000 l y mucho más altos
por debajo de la escala de 800 l (600 l de volumen de trabajo).
Sólo una fracción de estos valores de diseño puede ser
entregada al caldo de fermentación con la cantidad
dependiente de la geometría del recipiente/agitador,
reología, velocidad del agitador y velocidad superficial (28).
Desde una medición de fermentadores industriales de hasta
100.000 l en volumen, los valores de KLa oscilaron entre 400-
800 h-1 (Einsele, Abstr. 5º Pasante de Ferment. Symp., 1976).
Los valores de KLA obtenidos en las Tablas 11 y 12 están
generalmente dentro de este rango asumiendo una constante
de ley de Henry de 1 mmol/l-atm. La KLA varía
aproximadamente con la inversa de la viscosidad aparente
del caldo (15). La aireación de superficie puede ser un
importante contribuyente para los fermentadores de menor
tamaño, concretamente un 33% para los buques de 5 l y un
10% para los de 50 l (15). Los fermentadores de escala piloto
con un volumen inferior a 250 l suelen tener una aireación
superficial significativa en comparación con los
fermentadores de mayor tamaño, por lo que, en general, es
mejor escalar a partir de los fermentadores de mayor tamaño
de unos 500 l-1000 l (8). La aireación de superficie disminuye
notablemente con la escala (27); por lo tanto, para recipientes
más grandes, los valores de KLa pueden interpretarse más
fácilmente. El escalamiento basado en KLa se complica por
el hecho de que es específico del proceso y que cambia a lo
largo de la fermentación (35), lo que dificulta una
cuantificación fiable.
Alternativamente, se puede determinar un valor óptimo
para la CL a partir de estudios de laboratorio y utilizarlo
para el scale-up (2). La ecuación 8 puede entonces ser
reordenada para calcular los valores de KLa durante la
fermentación a varias edades. El escalamiento basado en una
DO constante puede ser un método atractivo. Aunque KLa
y OUR pueden cambiar drásticamente en el transcurso de la
fermentación, el valor mínimo aceptable de CL es
generalmente conocido por los estudios de laboratorio. Una
9
CL por encima del 30-70% de saturación suele asegurar una
DO adecuada en regiones menos mixtas de una
fermentación micelial viscosa; para una E. coli menos viscosa
o fermentación de levadura, una CL por encima de un límite
inferior de 10-30% de saturación puede ser adecuada. El
Scale-up basado en la DO constante debe considerar el scale-
up de los métodos para controlar la DO, tales como
agitación, presión y caudal de aire (19). El control en cascada
de la DO por agitación, presión y caudal de aire puede ser
efectivo para mantener la DO por encima de los valores
críticos (35).
El número de flujo de gas constante (NA), la tasa de flujo
de gas volumétrico por unidad de volumen de líquido
(vvm o Q/VL), o la velocidad superficial (Vs) Scale-up
también se realiza en base al número de flujo (aeración),
NAQ/NDI3, donde Q es la tasa de flujo volumétrico. Un
rango típico para el número de caudal de los fermentadores
de producción es de 0,1-0,15 (29) que se compara
favorablemente con los valores de 0,12-0,13 para los
fermentadores de 19.000 l con impulsores de hidroala y es
muy inferior al valor de 0,3 obtenido para el fermentador de
19.000 l con un impulsor Rushton (Cuadro 4). Los números
de aireación para otros buques a escala piloto (100 l-1900 l)
oscilaron entre 0,027-0,14 con un número de aireación de
0,032 obtenido para el buque de laboratorio de 30 l (Cuadro
4).
También se debe examinar el escalamiento basado en la tasa
de flujo volumétrico de gas por unidad de volumen de
líquido (Q/VL o vvm) para asegurar que los valores
resultantes de la velocidad superficial sean razonables. Para
un proceso específico, debe lograrse un equilibrio. Si la tasa
de flujo volumétrico de gas por unidad de volumen de
líquido, Q/VL, se mantiene constante en el momento del
escalonamiento, entonces las Vs pueden aumentar hasta el
punto de inundación en los tanques a escala de producción
(2). De manera similar, si se desea mantener constantes las
Vs en el escalamiento, entonces se deben implementar
valores mayores de Q/VL en la escala menor (36). Los
valores típicos de Q/VL oscilan entre 1,67 y 1,0, y los valores
generalmente disminuyen a mayor escala (Cuadro 4).
Aunque el caudal de aire volumétrico tiene relativamente
poco efecto en el valor KLa, los mayores caudales de aire
pueden causar espumado espectacular (27) y mayor
retención de gas en el fermentador. Si la velocidad
superficial, Vs y Pg/VL son constantes, la retención de gas
no cambia con el scale-up (29).
La inundación ocurre cuando la velocidad superficial del
aire, Vs, se aproxima al 25-50% de la velocidad de aumento
de la burbuja ya que el volumen de retención del gas
fermentador sólo puede ser de un 20% o menos (15). En el
caso del agua con una velocidad media de aumento de la
burbuja de 22 cm/s, la inundación se produce a 5-10 cm/s
(15). Cuando se produce una inundación, el impeledor no
puede dispersar todo el gas suministrado, el gas sube a
medida que las burbujas grandes a la superficie del líquido
10
y la acción de bombeo del impeledor disminuye (2). Como
se muestra en la Tabla 5, las Vs oscilan entre 0,66-3,4 cm/s
para embarcaciones entre 30 l y 1900 l en volumen total,
saltando a 8,1 cm/s para la escala de 19.000 l. Basándose en
estas directrices, posiblemente las condiciones de escala
Qmax de 19.000 l puedan ser propensas a inundaciones.
Tenga en cuenta que la inundación también puede ocurrir a
bajas velocidades de agitación con un caudal de aire
demasiado alto para todas las escalas.
Tiempo de mezcla constante Alternativamente, el escalado
puede lograrse manteniendo constantes los tiempos de
mezcla estimados. Varias relaciones han sido derivadas o
desarrolladas empíricamente
de un estudio de fermentadores industriales de 50 l a 100.000
l en volumen (26; Einsele, Abstr. 5th Intern. Ferment. Symp.,
1976) y
para un proceso de tetraciclina de hasta 52.000 l de volumen
(Einsele, Abstr. 5th Intern. Ferment. Symp., 1976), donde k
es una constante de proporcionalidad en ambas ecuaciones.
Para depósitos similares geométricamente en la región de
flujo turbulento:
Por lo tanto, resolver la Ec. 10c asumiendo tiempos de consumo de oxígeno y sustrato, crecimiento celular y
mezcla iguales da la Ec. 10d (5): producción de calor.

y las entradas de potencia correspondientes son dadas por la

Ec. 10e (5):

Para recipientes geométricamente similares en la región de

flujo turbulento donde tanto el Po/VL como el tiempo de
mezcla son constantes, la Ec. 10e se convierte en (12)

La entrada de potencia volumétrica necesaria para mantener

el mismo tiempo de mezcla aumenta con el VL 2/3. Por lo
tanto, usando la relación de la Ec. 10f, Pg/VL puede llegar a Puede ser importante comparar el consumo de nutrientes y
ser prohibitivamente alto al escalar y generalmente es las tasas de transferencia entre sí, así como los tiempos de
sobreestimado. Esta técnica generalmente no ha funcionado circulación, para determinar si es probable que existan
bien para las fermentaciones (2). gradientes (11). Específicamente, para la fermentación del
ácido glucónico en un tanque mezclado por un cultivo de
También se ha propuesto un índice de mezcla, Im, (7) que no
hongos, puede ocurrir una limitación de oxígeno si el
supone similitudes geométricas:
consumo y las tasas de transferencia son similares en
magnitud. Si los tiempos de circulación del líquido también
son este mismo orden de magnitud, entonces se favorecen
Esta expresión puede ser particularmente útil para el los gradientes de oxígeno. En contraste, los gradientes de
escalonamiento de buques ya construidos en los que no se temperatura son menos propensos a ocurrir ya que, aunque
haya mantenido la similitud geométrica. Los tiempos de la producción de calor y las tasas de transferencia son
mezcla deben evaluarse en relación con las tasas de similares, a menudo son sustancialmente mayores que los
transferencia de masa de nutrientes para los cultivos por tiempos de circulación del líquido. Este análisis es aplicable
lotes alimentados en presencia de absorción de nutrientes a cultivos de alta densidad celular alimentados por lotes de
celulares. Para un cultivo (no especificado pero susceptible E. coli y levadura.
de ser una levadura) con una densidad celular de 20 g/l
Para los fermentadores de laboratorio existen tiempos de
creciendo a una tasa de 0,2 h-1 (doble tiempo de 3,5 h), si el
mezclado observados de varios segundos, para los
DO (CL) está al 20% de saturación, el oxígeno en el caldo se
fermentadores de laboratorio, de 20-30 s para los
agotaría en 2,5 s (32). En el caso de que la glucosa fuera el
fermentadores a escala piloto de 1000-2000 l y de 70-140 s
nutriente limitante, la glucosa podría agotarse tan rápido
para los fermentadores de producción de 60.000 l-120.000 l
como 4.5 s (32). Tiempos de mezcla más largos pueden
(4). Se han reportado tiempos de mezcla específicos para
causar tasas de glucosa localmente altas que a su vez pueden
estas básculas de 5 s para 10 l, 20 s para 1000 l, 29 s para 1800
causar niveles de DO localmente bajos debido a un
l, 67 s para 60.000 l, 100 s para 100.000 l y 140 s para 120.000
metabolismo celular más alto. Como consecuencia de ello,
l (14). Por último, se han comunicado tiempos de mezcla de
pueden producirse zonas locales de fermentaciones mixtas
15 s para 120 l, 40 s para 1200 l y 60 s para 12.000 l (20). Estos
de ácido E. coli, lo que produce rendimientos de biomasa
tiempos de mezcla fueron reportados para ambos
inferiores a escala (9). Por lo tanto, el escalamiento basado en
fluidos/caldos Newtonianos y no Newtonianos.
el tiempo de mezclado puede ser relevante para los cultivos
de E. coli y levadura alimentados por lote, especialmente en Estas estimaciones del tiempo de mezcla pueden ser
altas densidades celulares. graficadas (Fig. 3). La regresión lineal de estos puntos de
datos disponibles de la literatura produce la ecuación
El análisis de tiempo característico anterior puede ampliarse
y dividirse en tiempos característicos para fenómenos de
transporte (transferencia o suministro) y tiempos
característicos para tasas de conversión (consumo o
reacción) (11). Los fenómenos de transporte incluyen la
transferencia de oxígeno (incluyendo la transferencia de
oxígeno de la burbuja de gas al líquido), circulación líquida,
donde Tmix es el tiempo de mezclado en segundos y VL es
residencia de gas y transferencia de calor. Las tasas de
el volumen de trabajo del líquido en litros. Claramente, el
conversión incluyen las tasas de cero y primer orden para el
aumento del tiempo de mezcla con el volumen es más
11
pronunciado una vez que el volumen de trabajo es superior
a 60.000 l. La ecuación 10 h se utilizó para estimar los tiempos
de mezcla para cada escala de fermentador existente
(Cuadro 4). Las magnitudes relativas de estos tiempos
pueden ser comparadas con las obtenidas a partir de los
tiempos estimados usando la Ec. 10a y 10b asumiendo que la
constante de proporcionalidad, f3, permanece constante con
la escala.
Otras influencias Después de implementar las estrategias
iniciales esbozadas anteriormente, el diseño del recipiente
resultante necesita considerar otras influencias para
asegurar un rendimiento óptimo. La evolución del calor es
la combinación de calor mecánico del agitador y calor
metabólico del cultivo. La relación entre la evolución del
calor metabólico y el consumo de oxígeno es
aproximadamente 115 kcal de calor por mol de oxígeno
consumido para determinados cultivos de E. coli, levadura
y hongos (32,37). La cantidad total de oxígeno consumido
por el cultivo se puede estimar mediante la integración del
valor OUR frente a la curva de tiempo y luego multiplicando
por el volumen de trabajo del tanque. El coeficiente de
transferencia de calor deseado y el área de la camisa pueden
ser evaluados utilizando los caudales esperados del fluido
de enfriamiento y las temperaturas de entrada/salida.
Luego se establecen los requisitos para el tipo de chaqueta
(por ejemplo, hoyuelos, media bobina) y el área de la
chaqueta. Para fermentadores grandes de más de 5000 l,
puede ser difícil mantener NUESTROS Fermentadores por
encima de 300 mmol/l-h, ya que surgen problemas de
transferencia de calor.
Efectos de esterilización medios A medida que aumenta la
escala del fermentador, los tiempos de calentamiento y
enfriamiento se vuelven mayores. Regresión lineal de los
tiempos de mezcla de la literatura (Eq. 10h) reportados para
los procesos de laboratorio, escala piloto y producción
(4,14,20). 358 JUNKER J. BIOSCI. BIOENG. proporción del
ciclo de tiempo total de esterilización, como se muestra en la
Tabla 10. La parte de tiempo de calentamiento aumenta de
un 15% a un 37% aproximadamente, y la parte de
enfriamiento aumenta de un 10% a un 16% a medida que la
escala aumenta de 280 l a 19.000 l. Las escalas de 100 l y 1000
l son excepciones a esta tendencia, ya que requieren un poco
más de tiempo que los rangos esperados porque están
equipadas con un bucle de recirculación de camisa con
calentamiento y enfriamiento indirecto a través de
intercambiadores de calor. Los valores de Fo aumentaron de
75 a 91 minutos y los valores de Ro aumentaron de 57 a 87
minutos en el mismo rango de escalas (Cuadro 10;38). Estos
incrementos en Fo y Ro se traducen directamente en un
aumento del nivel de sobrecargas de esterilización y estrés
térmico medio, respectivamente, a medida que aumenta la
escala. El impacto adverso de la tensión térmica media
depende del proceso y puede ser minimizado con el uso de
la esterilización continua (alta temperatura, tiempo corto).
12
Factores biológicos Los factores biológicos, tales como el
número de generaciones a través de las cuales el organismo
progresará en el curso de la semilla y las fermentaciones de
producción, deben ser considerados en la selección de la
escala de producción final. Suponiendo un crecimiento
exponencial, el número de generaciones, Ng, puede
expresarse como (12)
donde XN es el número (o masa) final de la célula y XNo es
el número (o masa) inicial de la célula del inóculo. La
estabilidad del inserto de ADN recombinante y el requisito
de que un agente ejerza presión selectiva deben evaluarse
para el número de generaciones esperadas en el proceso más
un cómodo margen de seguridad.
Enfoques generalizados para ampliar la escala. Varios
autores han recomendado enfoques o combinaciones de
enfoques para la ampliación basados en las ecuaciones y
principios descritos anteriormente. No parece que ningún
método sea adecuado para todas las fermentaciones con una
alta probabilidad de éxito (5), y la aplicabilidad de un
método sobre otro es específica del proceso. El éxito depende
a menudo de la fiabilidad de las correlaciones empíricas de
escalamiento y de la integridad de los datos a pequeña
escala. A continuación, se destacan algunos ejemplos.
Método de Hubbard Este método (39) fue desarrollado como
una combinación de enfoques de otros autores. Durante la
fermentación a escala de laboratorio se mide el caudal de
aire, la velocidad del impulsor, el rendimiento y las
dimensiones geométricas del fermentador. Se determinan
las propiedades básicas del caldo, tales como densidad,
viscosidad, tensión superficial y coeficiente de difusión de
oxígeno. (De estas propiedades del caldo, probablemente es
más importante entender el comportamiento reológico del
caldo para los cultivos miceliales. Varias cantidades, como
Q/VL, NRe, ITS y NA, se calculan a partir de las condiciones
de fermentación a escala de laboratorio basadas en las
cantidades medidas.
Para el fermentador a escala de planta, se selecciona un
volumen basado en el rendimiento del producto y la
capacidad de la planta. La similitud geométrica se utiliza
para calcular las dimensiones del buque. La ampliación se
basa en la correspondencia de los valores de KLa y luego se
procede de una de las dos maneras siguientes. La primera
forma es calcular el caudal, Q, ya sea manteniendo constante
la Q/VL o la velocidad superficial, Vs, y luego calcular la
velocidad del impulsor, N, basándose en correlaciones
Pg/VL versus KLa (Eq. 9a-c). La segunda manera es
establecer N usando velocidad de punta del impulsor
constante, luego calcular Q a partir de las correlaciones
Pg/VL y KLa.
Una aplicación de este método es el uso de KLa para escalar
una fermentación de Bacillus thuringiensis. Este
escalamiento fue logrado usando la ecuación, KLaconstant
Na Vs b (obtenido combinando la Ec. 9, la proporción
esperada de Pg/VL, y la Ec. 3) con el escalamiento en base a
KLaPT donde PT es la presión total en el recipiente
incluyendo la presión de cabeza (40). Otra aplicación es
utilizar una estrategia iterativa basada en tasas
incrementales de flujo de aire para calcular los parámetros
resultantes del escalamiento y luego examinar cada conjunto
de parámetros para una tasa de flujo particular para
optimizar aún más los requisitos de potencia del compresor
y del agitador (36).
Método de Ju y Chase/Diaz y Acedevo Este método (2,41) se
centra en el escalamiento basado en OTR equivalente y no
en KLA. En primer lugar, se selecciona el volumen de
ampliación, y luego se utiliza la similitud geométrica para
obtener DT. Se supone que la velocidad de punta del
impulsor constante obtiene N. Usando la relación, se calcula
Pg/VLf1VL c (Eq. 4), Pg/VL y, usando relaciones empíricas
entre Pg/VL y KLa (Eq. 9a-c), se determinan los valores KLa
para el fermentador de escalamiento. Finalmente, la tasa de
OTR para el fermentador grande se iguala con la del
fermentador de pequeña escala y la contrapresión para el
fermentador grande se calcula suponiendo que CL es de 0
mmol/l.
El elemento clave de este método es que hay tres grados de
libertad para la ampliación. Éstos son comúnmente N, Q y
DI/DT (es decir, la geometría del reactor). Por lo tanto, sólo
se pueden especificar tres elementos como constantes para
la ampliación. Si se añade otro grado de libertad, como la
presión parcial de fase gaseosa, este valor también puede
especificarse para mantener la máxima constante de OTR.
Para determinar el efecto sobre el cultivo, generalmente es
útil realizar fermentaciones a pequeña escala utilizando
mezclas gaseosas para variar esta presión parcial de oxígeno
de entrada.
Método de Wang et al. En este método (42), se mantienen
constantes dos valores clave en el escalamiento: KLa
(calculado por Eq. 9a-c) e ITS. La proporción de DI/DT se
ajusta entonces dentro de límites razonables para completar
el diseño. Aunque no se mantiene la similitud geométrica, la
variación resultante de la relación DI/DT con escala a
menudo puede proporcionar una dispersión de gas
adecuada. Esta técnica añade flexibilidad para instalaciones
de fermentadores existentes.
Propuestas para mejorar los cálculos de escalamiento. Este
método simplificado (27) evalúa las cantidades clave de
interés para la ampliación basada en dos variables: N y DI.
El número del impulsor Reynold está representado por
NDI2, el número de Froude por N2 DI, el número Weber por
N2 DI3, la potencia gaseada por unidad de volumen líquido
por N3 DI2, la velocidad de punta del impulsor por NDI, y
Q/HT por DI/N (donde HT es específicamente la altura del
fermentador y no la altura del volumen líquido). Combina el
análisis de grupo sin dimensiones relevante con otros
parámetros empíricamente aplicables.
13
El análisis de escalamiento utilizando uno o más de estos
métodos ha sugerido métodos para operar fermentadores de
laboratorio con el mejor rendimiento de escalado. Por
ejemplo, se recomienda el aire diluido en nitrógeno.
Las prácticas actuales de escalamiento para los cultivos de E.
coli y levadura se basan en gran medida en mantener un
rendimiento equivalente de CL, KLA u OTR como primera
pasada. En estas fermentaciones, el suministro de oxígeno se
ve limitado por el escalonamiento debido a la alta demanda
de oxígeno celular y no por la alta viscosidad del caldo, como
en el caso de los cultivos de hongos. Posteriormente se puede
llevar a cabo una evaluación del impacto del tiempo de
mezclado, ya que afecta la DO y la distribución de
nutrientes, lo que se recomienda especialmente para cultivos
alimentados por lotes de alta densidad celular.
II. CONDICIONES DEL PROCESO DE
FERMENTACIÓN
Para evaluar el rendimiento operativo de los recipientes a
escala piloto existentes, se compilaron las condiciones del
fermentador (volumen de trabajo, caudal de aire, presión,
velocidad del impulsor, consumo de energía gaseada,
coeficiente de transferencia de masa, OUR) con base en los
registros históricos de varios E. coli (Cuadro 11a) y cultivos
de levadura (Cuadro 11b). El OUR se calculó sobre la base
de mediciones de la composición de gases por un
espectrómetro de masas (47). Los datos se tomaron en el
momento del pico OUR, que no correspondía
necesariamente al tiempo del coeficiente de transferencia de
masa máxima. Durante la última década, los cultivos se
llevaron a cabo en las escalas de 280 a 1900 litros. Además,
se realizaron estudios recientes específicos a varias escalas
(280 l-19.000 l) para un ejemplo de E. coli (E. coli DH5, Tabla
12a) y un ejemplo de proceso de levadura (Candida
chilensis, Tabla 12b) utilizando medios de fermentación
diseñados para promover la OTR de alta picos. Los datos
tabulados son representativos de las fermentaciones típicas
de ese proceso específico a la escala seleccionada.
Los parámetros de control para cada fermentación variaron
según los objetivos de desarrollo. Después de su
disminución inicial de los niveles de pre-inoculación, la DO
fue controlada generalmente entre el 30% y 80% de la
saturación, calibrada al aire a presión ambiente, utilizando
varias estrategias. En algunos casos, la fermentación se inició
con agitación, contrapresión y/o caudal de aire en cascada
con DO. En otros casos, cuando la necesidad de controlar el
DO en su punto de consigna provocó que los caudales de
agitación y de aire alcanzaran valores máximos, estos dos
parámetros se colocaron en modo automático en sus puntos
de consigna máximos y luego se colocó la contrapresión en
el control en cascada. Se utilizaron otras estrategias
dependiendo de los requerimientos específicos del proceso.
Por ejemplo, si la espumación ocurrió en la fermentación o
se deseaba una mayor concentración de dCO2, la
contrapresión se elevó típicamente a 1-1,5 kg/cm2 antes en
el proceso.
Se han publicado descripciones específicas del proceso para
algunos de los procesos descritos (E. coli RR1[48,49], E. coli
OP-50[50], E. coli PF436[51], Saccharomyces cerevisiae
QC2B[52], S. cerevisiae 1375[53], Pseudomonas aeruginosa
MB5001[54], y Candida sorbophila[55-57]). Otras
descripciones de procesos no se publican (E. coli DNA
polimerasa, E. coli K12, E. coli DH5, C. chilensis), pero son
consistentes con los procedimientos actuales de última
generación. Los procesos exactos ejecutados se basaron en
estas descripciones, pero en muchos casos se desviaron
significativamente para alcanzar los objetivos de desarrollo
de procesos.
III. RESULTADOS DEL ESCALONAMIENTO DE LAS
FERMENTACIONES ANTERIORES (1992 A
MEDIADOS DE 2001)
Entre 1992 y mediados de 2001 se llevó a cabo un estudio de
procesamiento en esta planta piloto de fermentación para
obtener información sobre las condiciones de proceso
alcanzables para las fermentaciones de E. coli (Tabla 11a) y
levadura (Tabla 11b). Los valores en negrilla representan el
funcionamiento dentro del 20% de las condiciones máximas
de agitación y aireación para los fermentadores de la planta
piloto que se muestran en la Tabla 1. En el caso de la
contrapresión del fermentador, el valor máximo deseado se
fijó en 1,5 kg/cm2, aunque durante este período de
funcionamiento (principios de los años 90) se realizaron
algunas fermentaciones a presiones de hasta 1,8 kg/cm2,
una contrapresión que afectó negativamente a la longevidad
del cierre mecánico doble del agitador. También durante este
período, las lecturas de consumo de energía no estaban
disponibles en la escala de 280 l y los transductores de vatios
instalados en la escala de 800 l, que no fueron corregidos
para las pérdidas de la caja de cambios (24), se saturaron. con
mayor consumo de energía.
La Tabla 11a ilustra que los cultivos históricos de E. coli
desafiaron predominantemente la velocidad máxima del
impulsor principalmente en las escalas de 280 l y 1000 l. Sólo
unos pocos cultivos de 280 l se acercaron simultáneamente a
las condiciones máximas de caudal de aire, agitación y
presión. Los valores de pico OUR oscilaban entre 38 y 260
mmol/l-h con valores de OUR superiores a 90 mmol/l-h
alcanzados para cada una de las cuatro escalas probadas. Los
valores Pg/VL y KLa calculados en el pico OUR oscilaron
entre 3,3-14,7 hp/1000 l y 167-738 mmol/l-h-atm,
respectivamente. Aunque hubo una amplia experiencia en
las escalas de 280 l y 1000 l con altas fermentaciones OUR, el
grado de desafío a la capacidad operativa de los recipientes
en las otras escalas fue limitado. Los valores de KLA
alcanzados en la escala más pequeña de 280 l eran
generalmente alcanzables al escalar a las escalas de 1000 l o
1900 l para aquellos procesos para los cuales este era un
objetivo de desarrollo (E. coli DH5, E. coli RR1). Los valores
de la constante de proporcionalidad, f2, de la Ec. 9b oscilaron
entre 55 y 143, indicando una variabilidad esperada en el
desempeño de cualquier correlación empírica de
14
escalamiento debido al proceso específico, escalamiento y
parámetros operativos.
La Tabla 11b resume datos históricos comparables para
cultivos de levadura. Como se señaló en el caso del
procesamiento de E. coli, se hicieron pocos desafíos a las
condiciones de operación pico excepto en las escalas de 280
l y 1000 l. Los valores máximos de OUR fueron notablemente
más bajos que en el caso de las fermentaciones E. coli, que
oscilaron entre 49 y 141 mmol/l-h con OUR superiores a 50
mmol/l-h alcanzados para cada una de las cuatro escalas
analizadas. Los valores Pg/VL y KLa calculados en el pico
OUR oscilaron entre 2,1 hp/1000 l y más de 15 hp/1000 l y
226-844 mmol/l-h-atm, respectivamente. Estos rangos
fueron similares a los observados para los procesos de E. coli.
Una vez más, la amplia experiencia en las escalas de 280 l y
1000 l no fue igualada en las otras escalas. En el caso de estos
procesos de levadura (C. sorbophila, C. chilensis y S.
cerevisiae 1375), los valores de KLa alcanzados en la escala
de 280 l fueron generalmente obtenidos en las escalas más
grandes de 800 l, 1000 l y 1900 l. Los valores de la constante
de proporcionalidad, f2, desde la Ec. 9b generalmente
oscilaban entre 62 y 218, lo que indicaba una vez más la
variabilidad esperada en el rendimiento debido al proceso,
la ampliación y los parámetros de funcionamiento. Para un
proceso específico a una escala específica, el rango era
sustancialmente menor.
IV. AMPLIAR LOS RESULTADOS DE LOS ESTUDIOS
ACTUALES
Sobre la base de este análisis histórico del rendimiento del
proceso, se realizaron estudios recientes (mediados de 2001
a la fecha) para mejorar las condiciones operativas máximas
del fermentador para las fermentaciones de E. coli y
levaduras. En el caso de las fermentaciones de E. coli, se
elevaron las concentraciones iniciales de carbono y
nitrógeno para aumentar el pico NUESTRO OUR más allá
de lo que normalmente podría observarse con este proceso.
Se deseaba realizar estudios específicos a escalas de 800 l,
1200 l, 1900 l y 19.000 l para obtener información más
completa sobre las capacidades de los equipos piloto
instalados. Se instalaron variadores de frecuencia variable
mejorados (VFD) en todos, pero los recipientes de escala de
19.000 l (que retenían sus transductores de vatios) en los que
se controlaba el consumo de energía directamente desde la
corriente eléctrica del VFD (Altivair 66; Schneider Electric,
Palatine, IL, EE. UU.) Esto dio lugar a una nueva capacidad
para medir el consumo de energía en la escala de 280 l y un
rango de medición ampliado para la escala de 800 l.
La Tabla 12a resume las condiciones de procesamiento
alcanzables para el proceso E. coli DH5 para un proceso
escalado basado en el mantenimiento de niveles mínimos de
DO similares. Para estos procesos aeróbicos, se requería que
la DO estuviera por encima de su valor crítico para
maximizar el crecimiento y la productividad. El pico de
OURs disminuyó ligeramente de 155-158 mmol/l-h a unos
96-116 mmol/l-h con el escalonamiento de las escalas de 280
l a 1900 l. Pg/VL disminuyó con la escala esperada de 18-19
hp/1000 l en la escala de 280 l a 6.1-8.8 hp/1000 l en las
escalas de 1200 l y 1900 l. Los valores calculados de KLa
disminuyeron sólo ligeramente con la escala, disminuyendo
de 475-572 mmol/lh-atm en la escala de 280 l a 354-465
mmol/l-h-atm en la escala de 1900 l. Los valores calculados
de KLa disminuyeron ligeramente con la escala de 475-572
mmol/lh-atm en la escala de 280 l a 354-465 mmol/l-atm en
la escala de 1900 l. Los valores de f2 en la Ec. 9b fueron
sustancialmente más uniformes que los encontrados con los
datos históricos, oscilando entre 40 y 70, igualando el rango
inferior encontrado con los datos históricos del proceso de E.
coli. Los valores eran relativamente consistentes con la escala
y las condiciones de funcionamiento, lo que sugiere que se
puede obtener una relación empírica fiable.
Las condiciones de procesamiento alcanzables para el
proceso de levadura C. chilensis se resumen en la Tabla 12b,
de nuevo basadas en el escalamiento usando niveles
mínimos similares de DO. Al aumentar la escala de 280 l a
19.000 l, el pico de OURs disminuyó ligeramente de 98
mmol/l-h a unos 74-82 mmol/l-h. Como era de esperar, el
Pg/VL disminuyó con una escala que va desde unos 9,6
hp/1000 l en la escala de 280 l a 1,1-2,0 hp/1000 l en las
escalas de 19.000 l. Tanto los valores pico de OUR como de
Pg/VL fueron notablemente más bajos para el proceso de
levadura que para el proceso E. coli. Los valores calculados
de KLa disminuyeron sólo ligeramente con la escala,
disminuyendo de unos 430 mmol/l-h-atm en la escala de 280
l a 343-380 mmol/l-h-atm en la escala de 19.000 l. Los valores
calculados de KLa disminuyeron ligeramente con la escala.
Los valores de f2 en la Ec. 9b variaron de 60 a 136 y fueron
menos uniformes con la escala y las condiciones de
funcionamiento que los encontrados con los datos actuales
del proceso de E. coli. Esta diferencia puede deberse a la
tendencia de este cultivo a agruparse e incluso ramificarse
durante el crecimiento. El rango de valores f2 también fue
menor que el encontrado con los datos históricos de la
levadura.
V. TENDENCIAS E IMPLICACIONES PARA LA
AMPLIACIÓN A ESCALA
Las relaciones establecidas para la ampliación a gran escala
pueden ser difíciles de utilizar debido a la falta de datos
suficientes sobre una serie de condiciones de procesamiento
de los conjuntos de datos típicos de desarrollo del proceso.
A menudo, la variedad de condiciones de proceso que se
necesitan entra en conflicto con la forma de ejecutar los
procesos de forma óptima, lo que dificulta la obtención de
datos y el cálculo retroactivo. Puede ser difícil variar las
condiciones dentro de un mismo cultivo como se hizo
anteriormente (58) sin afectar negativamente los datos
posteriores. Consecuentemente, no todos los
procesos/escalas fueron capaces de ser analizados si las
condiciones de operación en el pico NUESTROS valores para
cultivos individuales no variaban suficientemente.
La Tabla 13a resume la relación entre el pico OUR y KLA:
15
para determinados procesos históricos y actuales a
diferentes escalas, para los que los niveles de la D. O. del
caldo eran similares. La pendiente, A1, varía de 0.075 a 0.46,
lo que indica una gran dependencia del proceso y de las
condiciones de operación en la transferencia de masa. Para
un proceso específico, sin embargo, los valores cuando eran
alcanzables eran razonablemente constantes en el
escalamiento.
Los estudios previos de escalamiento en vasijas a escala
piloto se han basado en fermentaciones metabólicas
secundarias en las que se ha encontrado un acuerdo general
con las tendencias establecidas de KLa y Pg/VL (58). Desde
que el enfoque más reciente de los estudios de plantas piloto
se ha centrado en la ampliación a escala de cultivos de E. coli
y levadura, se han analizado los datos de pico de los estudios
recientes de ampliación a escala y se han presentado los
resultados en la Tabla 13b. El exponente de Pg/VL en la Ec.
9b, A2, fue calculado para los procesos históricos y actuales
seleccionados en varias escalas de acuerdo a las siguientes
escalas
Los valores obtenidos parecen ser consistentes tanto para el
E. coli como para los procesos de levadura y son
aproximadamente 0.96-0.98, en comparación con 0.58-0.8
encontrados previamente para un cultivo de bacterias
filamentosas y hongos (23,58). Los valores más altos reflejan
el mayor impacto de un cambio de KLa con NUESTRO para
estos cultivos de E. coli y levadura, probablemente debido a
su baja viscosidad de caldo y en gran parte morfología
celular única. Curiosamente, el valor más alto del exponente
parece ser más consistente con la correlación de escala de
laboratorio (Eq. 9a) que la correlación de escala piloto (Eq.
9b).
En el caso de los caldos miceliales, las características
reológicas influyen en la capacidad de ampliación. Las tasas
de transferencia de calor y oxígeno son del 5-50% de las
fermentaciones bacterianas y la mezcla a granel es más
pobre, lo que reduce la homogeneidad del caldo (28). Como
consecuencia de ello, los STI han sido a menudo una regla
empírica útil para la ampliación (27). La reología es menos
importante para las fermentaciones bacterianas y de
levaduras de una sola célula en comparación con las
magnitudes relativas de la absorción de nutrientes y las tasas
de suministro. Por lo tanto, la ampliación basada en DO,
NUESTRO o KLa a menudo ha sido más útil para estos
cultivos. Para las instalaciones con equipos instalados
existentes, la ampliación fiable se logra más fácilmente
mediante la selección de las condiciones de funcionamiento,
de manera que la DO mínima se mantiene similar entre las
dos escalas. Las implicaciones para otros parámetros clave
como OUR y KLa pueden ser fácilmente evaluadas.
Debido a la disponibilidad de E. coli recombinante y cultivos
de levadura con altas productividades específicas, los
volúmenes de producción típicos para proteínas
recombinantes a menudo no superan los 5000 l y/o pueden
no requerir procesos de alta densidad celular. A medida que
aumenta la demanda de capacidad, se pueden realizar
esfuerzos adicionales para mejorar la productividad
volumétrica y, de este modo, superar los límites de la
16
capacidad de diseño existente y futura del fermentador.
Cuando se adquiere más experiencia en la ampliación de una
amplia gama de volúmenes, se puede evaluar mejor la
utilidad de las diversas metodologías de ampliación. A lo
largo de estas evaluaciones, un modelo eficaz de reducción
gradual es clave para la resolución efectiva de problemas a
gran escala, y su desarrollo debe ser una prioridad.