DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICOCTRICO DE LA CASEÍNA.

KARLA XIMENA MENDOZA ANAYA.

MARCO TEÓRICO.

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se
dispersan en agua. Una característica de las proteínas es que la carga total que
adquieren depende del pH del medio.
Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el
que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas
de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente
(irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres
pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y
aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en
un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los
aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos
amino de Arginina y lisina están protonados (-NH3+).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría
cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían
desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su
carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio de las cargas positivas
y negativas, por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.

Para un aminoácido con solo un grupo amino y un grupo carboxilo, el pI se puede

calcular por el valor medio de los valores de pKa de esta molécula : pI= pKCOOH
+ pKNH3 / 2

El punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra

en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones
intermoleculares, por lo que precipita. A diferencia de muchas otras proteínas, la
caseína no precipita al calor. Precipita bajo la acción de la renina (enzima
proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. Al
precipitar por acción de ácidos se le llama caseína ácida. Este precipitado blanco
forma la base para la elaboración de todo tipo de quesos. La enzima tripsina
reduce la caseína a un hidrolizado fosfatado llamado peptona.

Los puntos isoeléctricos proporcionan información útil para razonar sobre el

comportamiento de los aminoácidos y proteínas en solución. Así, la presencia de
grupos ionizables en éstas moléculas tiene importantes consecuencias sobre la
solubilidad.
Los aminoácidos y las proteínas son menos solubles en su punto isoeléctrico si las
demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los iones dipolares
no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese pH.

1
El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis
cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Esto quiere decir que este
instrumento nos ayuda a determinar cuáles sustancias (proteínas, lípidos,
carbohidratos, ácidos nucleicos, entre otras), están presentes en una disolución y
en qué cantidad. Los espectrofotómetros pueden emitir radiaciones de diferentes
longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible.

Fig.1 Se puede
observar la ficha
tecnica la caseína.

OBJETIVO

Identificar el punto isoeléctrico de la caseína.

HIPÓTESIS.

Si la caseína se precipita se podrá obtener su punto isoeléctrico.

METODOLOGÍA

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 RESULTADOS.

Se prepararón las soluciones con las adicciones indicadas y se calibró

el potenciómetro con un buffer de pH 4.
Cuando el potenciómetro se encontraba
calibrado correctamente se calculó el pH Calibración
de las soluciones dando con buffer.
estos resultados:

Tubo Acetato Na Acido Acido pH aprox. pH

0.1 N (ml) acetico acetico determinado. Fig.1 Se observa que
que el potenciómetro se
0.1 N. (ml) 0.01 N (ml)
calibro a 4.00.
1 0.5 9.5 3.2 3.2
2 1 9 3.6 3.21
3 1.5 8.5 3.8 3.3
4 2 8 4 3.35
5 3 7 4.2 3.4
6 4 6 4.5 3.5
7 6 4 4.7 3.7
8 8 2 5.1 4.2
9 6 4 5.5 5.0
10 8 2 6.1 5.3

Se preparó la caseina con 5 ml de NaOH y acido acetico 1N y aforado con 50ml

de agua destilada.
Se añadio 1 ml de caseína a cada solución.

Soluciones con 1ml de caseína.

Se dejo reposara y se ajusto el espectrofotómetro a Fig.2: Se les añadio a las soluciones

caseina que fue preparada antes.
280 nm.

Espectrofotómetro
ajustado a 280 nm.

Fig.3 Se observa que el espectrofotómetro es

ajustado a 280 nm para la obtencion de la
absorbancia de las solucionees.

3
Se añadieron las soluciones al espectrofotómetro y se obtuvo la absorbancia de
cada solución.

Se obtuvieron los siguientes resultados en el espectrofotómetro:

Tubo Absorbancia. 8 0.642A

1 0.182A
2 0.381A
9 0.083A
3 0.438A
4 0.377A
5 0.410A
10 0.348A
6 0.285A
7 0.353A

Absorbancia en pH
0.7
3.2
0.6 3.21

0.5 3.3
3.35
0.4
3.4
0.3 3.5

0.2 3.7
4.2
0.1
5
0 5.3
0 1 2 3 4 5 6

La mayor absorbancia obtenida es de 0.642 que corresponde al pH de 4.2 por lo

que el punto isoeléctrico de la caseína es de 4.2

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

El punto isoeléctrico de la caseína teorica es de 4.6 y el de la caseína

experimental fue de 4.2, puede ocurrir una diferencia de punto isoeléctrico por el
metodo ocupado, la caseína ocupada o los pH obtenidos de sus soluciones.

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Puede obtenerse el punto isoeléctrico por la formula o por absorbancia, tambien
por el tipo de caseína utilizada, ya que puede ser obtenida por la leche o puede
ser proporcionada por el laboratorio, y tambien puede que su absorbancia sea
mayor o menor y el valor de su pH para poder determinarla.

La mayor parte de las proteínas poseen una absorción máxima a 280 nm debido a
que los grupos responsables de tal característica son los aminoácidos aromáticos
(Tirosina y Triptofano). Dado que muchas proteínas poseen restos de aminoácidos
aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido
para la estimación del contenido de proteína de una solución.
Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede variar
de acuerdo a su composición aminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se
puede considerar que una unidad de absorbancia se corresponde con una
concentración, se introduce un error en la medición, dado que estos absorben a
280 nm y gracias a esto se sabe que la absorción es proporcional.

La absorbancia es un concepto mas relacionado con la muestra puesto que nos

indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de
1/T en consecuencia : A = log 1/T = -log T = -log It/ Io.
Cuando la intensidad incidente y trasmitida son iguales (lo= lt), la trasmitancia es
del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda,
y entonces A vale log 1= 0, la cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia
que atraviesa la luz a través de la solución del cromóforo y de la concentración de
este. Es una característica propia de cada especie química y depende de su
estructura, el valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de
onda. Por consiguiente, al estar la caseína en precipitación tendrá bastantes
moléculas en suspensión por lo que absorberá una mayor cantidad de luz cuando
pase el haz de luz del espectrofotómetro El punto isoeléctrico es el punto en el
cual el número de cargas positivas, en la molécula proteica, es igual al número de
cargas negativas. En otras palabras, es el punto en el cual la molécula proteica es
eléctricamente neutra.

CONCLUSIONES.

Se puede concluir que se cumplio la hipótesis, ya que para determinar el punto

isoeléctrico de la caseína utilizamos el ácido acético, lo cual nos permitió que la
caseína se acidifique y disminuya el pH hasta llegar a un punto de equilibrio.
La caseína se precipita en una solución en su punto isoeléctrico porque el polo
positivo de una molécula proteica atrae el polo negativo de otra, provocando que
las moléculas se unan. Al estar precipitada la caseína esta incrementa la carga
negativa debido a un proceso de disociación de los iones de calcio en relación al
descenso de pH y después vuelve a descender este por la asociación con iones
de hidrógeno.

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FUENTES BIBLIOGRÁFICAS.

• http://bioquimicamarzo-julio.blogspot.com/2014/07/punto-isoelectrico.html
• http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/AMINO-ACIDOS-Y-
PROTEINAS-PARTE1_28808.pdf
• https://sites.google.com/site/laboratoriosbioquimica/bioquimica-i/obtencion-
de-caseina-reaccion-de-biuret-y-punto-isoelectrico
• https://www.ecured.cu/Punto_isoeléctrico
• http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/20
17/QuimicaBiol/1489768358.pdf