НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ОРЛОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

УДК: 57.043:612.111:352.462

ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСМОТИЧЕСКУЮ И

ТЕМПЕРАТУРНУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ

03.00.19 - криобиология и криомедицина

Диссертация на соискание научнойстепени

кандидата биологических наук
Научный руководитель
кандидат биологических наук,
ст. науч.сотр.отдела криофизиологии клетки
ИПКиК НАН Украины
Шпакова Наталия Михайловна

ХАРЬКОВ 2001 г
 2
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................3
ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................12
1.1. Динамическая структура мембраны эритроцита...............................12
1.2. Гипертонический стресс и холодовой шок клеток............................21
1.3. Действие амфифильных соединений на структуру клеточных
мембран........................................................................................................26
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................33
ГЛАВА 3 ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ К ГИПЕРТОНИЧЕСКОМУ
СТРЕССУ И ПОСТГИПЕРТОНИЧЕСКОМУ КРИОГЕМОЛИЗУ...................40
3.1. Гипертонический стресс эритроцитов в присутствии......................43
амфифильных веществ................................................................................43
3.2. Влияние амфифильных соединений на чувствительность исходно
дегидратированных эритроцитов к гипертоническому стрессу..............52
3.3. Постгипертонический криогемолиз эритроцитов в присутствии
амфифильных веществ................................................................................63
Выводы.........................................................................................................67
ГЛАВА 4 ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДИАМИДОМ
ЭРИТРОЦИТОВ К ГИПЕРТОНИЧЕСКОМУ СТРЕССУ.................................70
Выводы.........................................................................................................74
ГЛАВА 5 МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И БАРЬЕРНЫЕ
СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ В ПРИСУТСТВИИ
АМФИФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ............................................................................75
Выводы.........................................................................................................82
ГЛАВА 6 ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА
ДИНАМИЧЕСКУЮ СТРУКТУРУ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ....................83
Выводы.........................................................................................................87
ГЛАВА 7 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................89
ВЫВОДЫ.............................................................................................................108
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................110
 3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

C10 - децилсульфат натрия

С12 - додецилсульфат натрия
ДM - додецил-β,D-мальтозид
ХП - хлорпромазин гидрохлорид
Z10 - 3-децилдиметиламмоний-1-пропансульфонат натрия
Z16 - 3-цетилдиметиламмоний-1-пропансульфонат натрия
АПК - амид пальмитиновой кислоты
5-ДС - 5-доксилстеариновая кислота
16-ДС - 16-доксилстеариновая кислота
 4
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.
В настоящее время одной из актуальных проблем криобиологии
является исследование механизмов повреждения и защиты клеток при их
охлаждении и замораживании. Полагают, что основными факторами,
определяющими повреждение клеток, являются изменения температуры и
действие высококонцентрированных растворов солей, образующихся во
внеклеточной среде в результате вымораживания воды [2, 133].
Изменение физико-химических условий внешней среды первой
воспринимает плазматическая мембрана, которая обладает наиболее высокой
чувствительностью к действию криоповреждающих факторов [115, 119].
Отделяя цитоплазму от внешней среды и осуществляя транспорт веществ,
плазматическая мембрана активно участвует в поддержании клеточного
гомеостаза. Повреждение плазматической мембраны под действием
стрессовых факторов приводит к нарушению гомеостаза и гибели клетки.
Основой современных знаний о механизме повреждения мембран при
изменении осмотических и температурных условий среды является
представление о возникновении и формировании мембранных пор, через
которые происходит утечка ионов и биомолекул клетки [5]. На начальном
этапе осмотического и температурного повреждения клеток происходит
нарушение барьерной функции мембраны для катионов, которое частично
или полностью обратимо [73]. Необратимое повреждение эритроцитов
происходит при появлении мембранных макроскопических пор,
проницаемых для крупных молекул.
Молекулярный механизм формирования мембранных пор еще во
многом не ясен. В частности, вопрос об инициации и эволюции мембранных
пор, а также насколько одинакова их природа в условиях различных
осмотических стрессов (гипертонического, постгипертонического,
гипотонического) и стресса, вызванного снижением температуры.
 5
К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том,
что изменение исходного состояния клеток может приводить к повышению
их устойчивости к последующему резкому изменению осмотических и
температурных условий среды. Так, например, предварительная частичная
дегидратация эритроцитов [25, 26], а также дозированное добавлении к
эритромассе раствора криопротектора ПЭО-1500 при температуре 0 0С [1]
позволяет существенно повысить устойчивость клеток к действию
высококонцентрированных растворов солей и замораживанию. Насыщение
клеток глюкозой также способствует повышению их устойчивости к
гипертоническому стрессу [21].
В то же время устойчивость эритроцитов к изменению осмотических и
температурных условий среды может повышаться непосредственно в момент
стресса при наличии в литической среде веществ, оказывающих влияние на
процессы замыкания мембранных пор, в частности, некоторых
фармакологических препаратов [13].
Из вышесказанного следует, что уровень повреждения клеток может
определяться как их состоянием перед действием стрессовых факторов, так и
состоянием непосредственно в момент действия стрессовых факторов.
При изучении гипотонического лизиса эритроцитов Hagerstrand с
соавторами [77] показали, что достаточно разнообразные по химическому
строению амфифильные соединения снижают уровень гипотонического
повреждения клеток. Указанный эффект авторы связывают со способностью
амфифилов влиять на состояние плазматической мембраны.
Известно, что отдельные представители амфифильных соединений
повышают устойчивость клеток к гемолизу, индуцированному
мелиттином [140], а также к постгипертоническому гемолизу [23].
Некоторые катионные амфифильные вещества, в частности,
производные фенотиазинового ряда, способны снижать уровень повреждения
эритроцитов в условиях гипертонического стресса и постгипертонического
 6
криогемолиза [12]. Однако, данные об антигемолитической активности
амфифильных веществ в этих условиях единичны, разрознены и часто
касаются представителей одного класса.
Целесообразно было исследовать влияние амфифильных соединений,
которые являются представителями разных классов поверхностно-активных
веществ (катионных, анионных, неионных, цвиттерионных), на
чувствительность эритроцитов к гипертоническому стрессу и
постгипертоническому криогемолизу. Изучение действия веществ,
относящихся к различным классам, на плазматическую мембрану клеток
позволило бы расширить представления о механизмах повреждения и защиты
клеточных мембран при резком изменении осмотических и температурных
условий среды.

Связь работы с научными программами, планами, темами.

Работа выполнена в соответствии с научным направлением работы
отдела криофизиологии клетки ИПКиК НАН Украины по темам:
"Клеточные механизмы контроля холодовой и осмотической
чувствительности" (шифр темы 2.2.6.53);
"Факторы и механизмы регуляции стойкости клетки к изменениям
температурного и осмотического параметров среды" (шифр темы 2.2.6.86);
где автор выполняла самостоятельные разделы.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования - коррекция чувствительности эритроцитов к
изменению температурных и осмотических условий среды с помощью
представителей различных классов амфифильных соединений, а также роль
исходного состояния эритроцитов в реализации антигемолитической
активности амфифилов при гипертоническом стрессе.
 7
Задачи исследования.
1. Влияние веществ, относящихся к различным классам амфифильных
соединений, на чувствительность эритроцитов к гипертоническому стрессу в
среде, содержащей 4,0 Моль/л NaCl, при температуре 37 и 0 0С.

2. Влияние амфифильных соединений на устойчивость к гипертоническому

стрессу эритроцитов, предварительно проинкубированных в растворах,
содержащих 0,45 Моль/л и 0,7 Моль/л NaCl, при температуре 37 и 0 0С;

3. Влияние амфифильных веществ на чувствительность эритроцитов,

модифицированных диамидом, к гипертоническому стрессу.

4. Действие амфифильных соединений на устойчивость эритроцитов к

постгипертоническому криогемолизу (охлаждение от 37 до 0 0С в растворе
1,2 Моль/л NaCl).

5. Влияние амфифильных соединений на динамическую структуру

эритроцитарной мембраны, ее барьерные свойства (проницаемость
мембраны для ионов калия) и морфологические особенности клеток.

Объект исследования - гипертонический стресс эритроцитов;

постгипертонический криогемолиз эритроцитов.
Предмет исследования - осмотическая и температурная
чувствительность эритроцитов в присутствии амфифильных соединений;
антигемолитическая активность амфифильных соединений при различном
исходном состоянии эритроцитов (частичная дегидратация; обработка
диамидом); состояние эритроцитарной мембраны в присутствии
амфифильных соединений (проницаемость мембраны для ионов калия,
микровязкость мембраны).
Для решения поставленных задач были использованы следующие
методы:
- спектрофотометрический метод для определения содержания вышедшего
в супернатант гемоглобина из эритроцитов после постгипертонического
криогемолиза и гипертонического стресса при варьировании осмотических и
 8
температурных условий как среды предварительной инкубации клеток, так и
литической среды в присутствии амфифильных соединений;
- обработка эритроцитов диамидом для модификации состояния
эритроцитарной мембраны;
- метод световой микроскопии для регистрации изменения формы
эритроцитов в присутствии амфифильных веществ;
- метод атомно-абсобционной спектрофотометрии для определения
содержания калия, вышедшего из эритроцитов;
- метод ЭПР спектрометрии для исследования изменения динамического
состояния эритроцитарной мембраны в присутствии амфифильных веществ;
- дисперсионный анализ для статистической обработки полученных
результатов;
- регрессионный и корреляционноный анализ для получения
математических моделей исследуемых процессов.

Научная новизна полученных результатов.

Данные о влиянии амфифильных соединений на чувствительность

эритроцитов к различным типам стресса были существенно дополнены
представленными в нашей работе результатами о проявлении
антигемолитической активности амфифильных веществ в условиях
гипертонического стресса и постгипертонического криогемолиза
эритроцитов.

Впервые показано, что исследуемые вещества, относящиеся к

различным классам амфифильных соединений, снижают уровень гемолиза
эритроцитов при перенесении в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl, при
температуре 37 и 0 0С, и величины максимальной антигемолитической
активности амфифилов зависят от температурных условий проведения
гипертонического стресса.
 9
Впервые обнаружено, что проявление антигемолитического эффекта
всех амфифильных соединений при перенесении эритроцитов в среду,
содержащую 4,0 Моль/л NaCl, определяется состоянием клеток перед
гипертоническим стрессом.

На основании результатов проведенных нами исследований показана

однонаправленность изменения величины антигемолитической активности
амфифильных соединений в условиях гипертонического стресса при
варьировании как температурных условий проведения гипертонического
стресса, так и осмотических условий дегидратации клеток, предшествующей
гипертоническому лизису.

Получены новые данные о влиянии исследуемых соединений на

чувствительность эритроцитов к постгипертоническому криогемолизу.
Представители катионных и анионных амфифильных соединений
протектируют эритроциты от повреждения в условиях постгипертонического
криогемолиза, а представители неионных и цвиттерионных амфифильных
соединений не обладают такой способностью.

Впервые показано, что все исследуемые амфифильные вещества

проявляют антигемолитическую активность при перенесении эритроцитов,
модифицированных диамидом, в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl.
Значения антигемолитической активности исследуемых веществ при
гипертоническом гемолизе модифицированных диамидом эритроцитов ниже
чем значения антигемолитической активности веществ для не
модифицированных диамидом клеток.

Выявлено, что антигемолитическая активность исследуемых веществ

не зависит от их способности изменять форму клетки по типу
дискоцит → эхиноцит или дискоцит → стоматоцит.

Показано, что в условиях гипертонического стресса эритроцитов

амфифильные соединения не влияют на выход катионов калия из клеток.
 10
На основании результатов собственных исследований обнаружена
общая способность представителей различных классов амфифильных
веществ увеличивать микровязкость эритроцитарной мембраны.
Трансмембранная локализация указанного эффекта отличается для веществ,
относящихся к различным классам.

Практическая значимость работы.

Полученные в работе результаты могут быть использованы как основа
для дальнейших разработок по применению этих веществ в составе
криозащитных сред. Результаты работы могут быть рекомендованы для
научного использования в обучающем процессе, направленном на подготовку
специалистов в различных областях биологии, в частности, криобиологии,
мембранологии, фармакологии.

Личный вклад соискателя.

Диссертация является самостоятельным исследованием соискателя.
Автором самостоятельно сформулирована цель и определены задачи работы,
проведены эксперименты, статистически обработаны результаты,
осуществлен анализ экспериментальных данных, получены выводы,
основанные на экспериментальных данных. В совместных публикациях
соавторы проводили морфологические исследования (методика,
фотографирование), исследования методом ЭПР спектрометрии (методика),
определяли содержание калия в супернатанте (методика).

Апробация результатов диссертации.

Результаты работы были представлены на II-ом съезде Украинского
биофизического общества (Харьков, 1998), Конференции молодых ученых
ИПКиК НАН Украины (Харьков, 1999), рабочем заседании ЮНЕСКО
"Cryolability and Cryostability of Biological Objects" (Харьков, 1999).
 11
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них в
специализированных научных журналах - 5 , в сборниках
материалов конференций - 3.
 12
ГЛАВА 1
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Динамическая структура мембраны эритроцита

Эритроцитарная мембрана состоит из липидного бислоя со

встроенными в него интегральными белками и периферической
цитоскелетной белковой сети [6]. Липидная часть мембраны сформирована
двумя фосфолипидными монослоями, где полярные головки липидных
молекул направлены во вне- и внутриклеточную среду, а гидрофобные
гидрокарбонатные цепи находятся внутри мембранного бислоя [6].
Различные фосфолипиды распределены между двумя монослоями бислоя
асимметрично. Нейтральные молекулы фосфатидилхолина и сфингомиелина
локализованы преимущественно во внешнем монослое, тогда как
отрицательно заряженные молекулы фосфатидилсерина, а также
фосфатидилэтаноламин и минорный фосфолипид фосфатидилинозитол - во
внутреннем монослое [107, 130]. Оба монослоя содержат холестерин.
Известно, что общее молярное соотношение холестерина к фосфолипидам в
эритроцитарной мембране составляет примерно 0,8 [34].
Интегральные белки являются гликопротеинами, углеводные части
которых формируют гликокаликс с наружной поверхности мембраны.
Наличие отрицательного заряда гликокаликса обусловлено присутствием в
его составе сиаловых кислот [19]. Белок полосы 3, формирующий канал
анионного транспорта, является главным интегральным белком, т.к. он
занимает примерно половину от общего содержания интегральных белков в
эритроцитарной мембране [66, 94]. Остальные интегральные белки
представлены, в основном, гликофоринами [43].
Эритроцитарный цитоскелет представляет собой двумерную белковую
сеть, которая состоит из соединенных через актин молекул спектрина.
Цитоскелет локализован с цитоплазматической стороны мембранного бислоя.
 13
Цитоскелетные белки взаимодействуют с внутренними доменами
эритроцитарной мембраны [75]. Спектриновые молекулы взаимодействуют с
интегральными мембранными белками. Через анкирин они прикреплены к
цитоплазматической стороне белка полосы 3 и через белок полосы 4.1 - к
белку полосы 3 и различным гликофоринам. Цитоскелетные белки также
взаимодействуют с мембранными липидами, например, белок полосы 4.1
связан с фосфатидилсерином.
Интегральные белки эритроцитарных мембран обладают вращательной
подвижностью, в то время как латеральная подвижность их резко ограничена.
Ограничение латерального движения интегральных белков объясняют
взаимодействием их с белками цитоплазматического мембранного
скелета [43, 134, 154].
Липидные молекулы вращаются и движутся в плоскости их монослоев.
Молекулы липидов могут переходить из одного монослоя в другой
("флип-флоп"). Флип-флоп мембранных липидов происходит чрезвычайно
медленно, что объясняется большой величиной энергетического барьера для
переноса полярной группы головки молекулы липида через гидрофобную
часть бислоя [34].
Конформация и упаковка липидов в бислое может изменяться, что
обусловлено способностью липидов проявлять температурный и лиотропный
мезоморфизм. В первом случае с уменьшением температуры происходят
структурные переходы липидов, при которых углеводородные цепи липидных
молекул переходят от неупорядоченного (жидкокристаллического) в более
упорядоченное (гелевое) состояние [6, 34].
Лиотропный мезоморфизм - это способность липидов образовывать
различные структуры (ламеллярную или гексагональную) в зависимости от
относительного содержания воды [6, 34].
В одинаковых условиях различные липиды отличаются по способности
образовывать ламеллярные или гексагональные структуры, что зависит от
формы липидной молекулы. Липидные молекулы, имеющие форму "конуса"
 14
(большая площадь поверхности полярной головки и маленький
гидрофобный объем), характеризуются тенденцией к образованию мицелл.
Другие липидные молекулы, имеющие форму "перевернутого конуса"
(маленькая площадь поверхности полярной головки и большой
гидрофобный объем), имеют тенденцию к образованию инвертированных
мицелл или гексагональных (HII) фаз [93, 100, 138].
Образование бислоя такими липидами, как фосфатидилхолин, связано с
тем, что большая площадь поверхности головки липидов по отношению к
углеводородному объему, приводит к образованию усеченного конуса. Более
маленькая площадь поверхности полярной головки фосфатидилэтаноламина
по отношению к углеводородному объему, приводит к образованию
инвертированного конуса. Таким образом, энергетически более
предпочтительно для фосфатидилэтаноламина образовывать
инвертированные мицеллы или HII фазу [149].
Эритроцитарная мембрана имеет разнообразный липидный состав
(примерно 200 видов липидов) [63]. Некоторые мембранные липиды
обладают способностью образовывать небислойные липидные фазы, в то
время как другие мембранные липиды формируют или стабилизируют
бислойные фазы [56, 102]. Так как образование гексагональных фаз в
мембране влияет на степень упорядоченности жирнокислотных цепей
липидов, авторы работы [57] предположили, что разнообразие липидов
необходимо для определенной степени упорядоченности мембраны.
Фосфатидилэтаноламин, содержащий ненасыщенные жирные кислоты,
предпочтительно образует гексагональную (HII) фазу в модельных
системах [149]. Образование такой фазы чувствительно к степени
ненасыщенности и температуре. Дисперсии ненасыщенного
фосфатидилэтаноламина формируют гексагональные фазы только при
высокой температуре и высокой концентрации NaCl.
Взаимодействие катионов кальция с фосфатидилсерином позволяет
фосфатидилэтаноламину латерально сегрегировать для образования H II фаз в
 15
модельных мембранах, соответствующих по составу внутреннему монослою
эритроцитарной мембраны [149]. Другие фосфолипиды также могут
образовывать небислойные фазы в определенных условиях гидратации,
температуры и рН среды [56, 87].
Некоторые белки стабилизируют мембранные липиды в бислойной
фазе [60], в то время как другие содействуют образованию небислойных
фаз [155]. Диацилглицерол - вторичный мессенджер биологических мембран
также способен преобразовывать мультибислои в гексагональную
(HII) фазу [101].
Как рассматривалось выше, в модельных экспериментах показано
присутствие в мембранах небислойных липидных фаз, в то же время наличие
таких фаз в биологических мембранах еще точно не обнаружено. С другой
стороны, гексагональные (HII) фазы липидов в биологических мембранах
постоянно не могут присутствовать, т.к. тогда мембрана не выполняла бы
своей барьерной функции.
Однако, есть многочисленные данные [118, 82, 149],
свидетельствующие о том, что временное существование небислойных фаз
возможно и в биологических мембранах. Авторы работы [58] предположили,
что возникновение гексагональных фаз в результате взаимодействия
кардиолипина и ионов кальция, могло бы облегчить транспорт катионов
кальция через поры, которые формируются. В этом случае белки не
требовались бы, и транспорт веществ был бы специфичным [58].
Полагают [56, 131, 148, 149, 150], что процесс слияния мембран можно
объяснить с помощью существования в мембранах временных небислойных
липидных фаз. Доказательством важной роли небислойных фаз в
мембранном слиянии может служить тот факт, что химические фузогены
(вещества, которые могут индуцировать слияние эритроцитов) индуцируют
образование в мембранах гексагональных фаз [56, 149].
Слияние как биологических мембран, так и фосфолипидных бислоев
можно модулировать, изменяя их липидный состав [85, 118]. Так, липиды,
 16
поддерживающие бислойную структуру, ингибируют мембранное слияние, а
липиды, способные образовывать гексагональную фазу, стимулируют
мембранное слияние. В работе [85] показано, что чем больше в
эритроцитарной мембране образуется HII фаз под влиянием липидных
фузогенов, тем выше мембранное слияние.
Считают, что трансбислойное движение (флип - флоп) липидов также
осуществляется с помощью небислойных фаз [149]. В поддержку роли
небислойных фаз в трансбислойном движении липидов свидетельствует тот
факт, что трансформация липидной дисперсии, содержащей 50 %
фосфатидилэтаноламина, из бислойной фазы в небислойную сопровождается
троекратным увеличением трансбислойного движения
фосфатидилхолина [129]. В работе [82] представлены данные об изменении
движения холестерина в течение перехода липидов от ламеллярной к
гексагональной структуре. Движение холестерина становится более
энергичным в смеси ламеллярной и гексагональной фаз по сравнению с
движением холестерина в липосомах, представленных только ламеллярной
или гексагональной фазой.
Небислойные структуры, представленные гексагональными (HII) фазами
или инвертированными мицеллами, вовлекаются также в процессы экзо- и
эндоцитоза [52].
Как рассматривалось выше, форма молекулы определяет склонность
липида к образованию ламеллярной или гексагональной структуры.
Полагают, что форма мембранных липидных молекул важна в регуляции
формы эритроцитов. Так, при увеличении в мембране доли молекул,
имеющих форму конусов или инвертированных конусов, изменяется
мембранная кривизна и, следовательно, форма эритроцита [52, 56].
В нормальных физиологических условиях эритроцит имеет форму
двояковогнутого диска (дискоцит) [69]. Эта форма поддерживается за счет
механических свойств мембраны и контролируется клеточным
метаболизмом [40]. Эритроциты изменяют форму в ответ на различные
 17
воздействия: изменение рН среды [62, 157], присутствие амфифильных
агентов во внеклеточной среде [62, 79], обогащение клеток ионами
кальция [64] и истощение по АТФ [47, 145]. В рассмотренных выше случаях,
дискоциты принимают либо шиповидную, кренированную форму
(эхиноциты), либо форму односторонне вогнутых дисков (стоматоциты).
Для объяснения трансформации эритроцитов под действием
амфифильных веществ, Sheets и Singer сформулировали гипотезу
"сопряженного бислоя" [146, 147]. Согласно этой гипотезе, монослои
липидного бислоя мембраны представляют собой "закрытые" и сопряженные
структуры, а изменение формы клетки происходит в результате различного
поглощения амфифильных веществ двумя монослоями бислоя и,
соответственно, различного расширения монослоев относительно друг друга.
Эхиноциты образуются при расширении внешнего монослоя относительно
внутреннего, а стоматоциты - при расширении внутреннего монослоя
относительно внешнего.
Авторы работ [67, 98] гипотезу сопряженного бислоя подтвердили
экспериментально, а положение о роли различного расширения монослоев в
процессе трансформации считают наиболее предпочтительным для
объяснения изменений формы эритроцитов.
Другие исследователи предположили, что кренирование эритроцитов
вследствие АТФ истощения связано с дефосфорилированием спектрина, что
приводит к изменениям в цитоскелетном белковом комплексе и сокращению
внутреннего монослоя липидного бислоя мембраны [47, 145]. Однако,
существует мнение, что кренирование эритроцитов при их истощении по
АТФ и обогащении ионами кальция можно объяснить в контексте гипотезы
сопряженного бислоя без вовлечения изменений в мембранном
цитоскелете [67, 68]. Полагают, что появление эхиноцитарной формы, в
данном случае, происходит из-за нарушения баланса между двумя
монослоями бислоя вследствие деградации
фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата и фосфатидилинозитол-4-фосфата во
 18
внутреннем монослое, что приводит к уменьшению его площади.
Авторы работ [127, 128] считают, что стоматоцитоз, вызванный
некоторыми амфифильными лекарствами обусловлен ингибированием
кальмодулин-зависимой киназы, которая фосфорилирует спектрин. Однако,
существуют данные, свидетельствующие о том, что кальмодулин не вовлечен
в процесс трансформации эритроцитов, вызванный амфифильными
соединениями [90]. Многие исследователи считают, что мембранный
цитоскелет в процессе трансформации эритроцитов играет пассивную
роль [40, 68, 99, 105].
Несмотря на приведенные выше факты, некоторые исследователи
поддерживают мнение об активном участии цитоскелета в процессе
трансформации эритроцитов. Их убеждения основаны на предположении о
том, что модификация цитоскелета может оказывать влияние на кривизну
внутренних участков мембраны и, следовательно, форму клетки [65], а также
данных, свидетельствующих о том, что хлорпромазин не вызывает изменения
формы теней эритроцитов, в которых цитоскелет диссоциирован от
мембраны вследствие селективного отщепления анкирина [95].
В работе [142] изучали стоматоцитоз, вызванный некоторыми
амфифильными веществами. При этом методом ЭПР спектрометрии
контролировали движение спин-меченых фосфатидилхолина и
сфингомиелина из внешнего во внутренний монослой эритроцитарной
мембраны. Ванадат, который ингибировал стоматоцитоз, не блокировал
движение фосфатидилхолина и сфингомиелина из внешнего во внутренний
монослой мембраны, что позволило авторам указанной работы предположить
участие аминотранслоказы в изменении формы эритроцитов амфифилами.
Однако, здесь же указано, что эффект ванадата может быть преодолен
увеличением концентрации амфифила. При этом хлорпромазин, при
достижении определенной концентрации, вероятно, пассивно расширяет
внутренний монослой.
В работах [62, 146] показано, что анионные амфифильные соединения
 19
являются, в основном, эхиноцитогенными веществами, а катионные -
стоматоцитогенными. Согласно гипотезе сопряженного бислоя,
эхиноцитогенные вещества встраиваются во внешний монослой липидного
бислоя и расширяют его относительно внутреннего монослоя, а
стоматоцитогенные вещества встраиваются во внутренний монослой
липидного бислоя и расширяют его относительно внешнего монослоя.
Различную локализацию анионных и катионных амфифильных веществ
внутри бислоя объясняют энергетически предпочтительным
взаимодействием катионных соединений с отрицательно заряженными
фосфолипидами внутреннего монослоя эритроцитарной мембраны [146].
Однако, в многочисленных работах [79, 91, 81] показано, что связь
между молекулярной структурой амфифилов и их трансформирующей
способностью более сложная. В частности, нельзя на основании заряда
полярной части молекулы амфифильного соединения предсказать
трансформацию эритроцита, поскольку среди катионных амфифилов
встречаются эхиноцитогенные вещества, а среди неионных - как
эхиноцитогенные, так и стоматоцитогенные соединения.
Трансформация плазматической мембраны под действием амфифилов
приводит к изменению ее способности к деформации. Как трансформация по
типу дискоцит - эхиноцит, так и трансформация по типу дискоцит -
стоматоцит приводит к увеличению сопротивления мембраны к деформации
при втягивании эритроцита в микропипетку [51]. Интересен тот факт, что
эхиноциты возвращаются к нормальной морфологии и нормальной
мембранной реологии добавлением стоматоцитогенного вещества [39, 51].
Использование амфифильных соединений в предлитических
концентрациях может приводить к освобождению микровезикул из
мембраны [76, 78]. В работе [67], изучая взаимосвязь трансформации и
везикуляции, авторы пришли к выводу, что существует "предельная" форма
клетки, а везикуляция - это свойственная мембране реструктуризация в ответ
на критическое изменение поверхности. При этом показано, что
 20
эхиноцитогенные вещества вызывают формирование экзовезикул, а
стоматогенные - эндовезикул. Интересен тот факт, что хлорпромазин,
который вызывает эндовезикуляцию в эритроцитах [114], ингибирует
экзовезикуляцию, вызванную различным воздействием на клетки [151].
Отщепление везикул от мембран "родительских" клеток возникает в
различных условиях: метаболическое истощение клеток [151], увеличение
внутриклеточного уровня ионов кальция [38], изменение рН среды [48, 156],
температуры [151], в присутствии мочевины [151]. Везикулы имеют сходный
липидный и белковый состав с родительскими клетками, но в них
отсутствуют цитоскелетные белки [106].
 21
1.2. Гипертонический стресс и холодовой шок клеток

При охлаждении и замораживании клетки попадают в неблагоприятные

условия среды. Если повреждение клеток при охлаждении до 0 0С
обусловлено изменением температуры, то при замораживании (ниже 0 0С)
факторы, вызывающие повреждение клеток, связаны с образованием льда. К
факторам, действующим на клетки при замораживании, относятся
гиперконцентрированные растворы солей, образующиеся во внеклеточной
среде за счет кристаллизации части растворителя, изменение рН среды,
механические и гипербарические факторы, возникающие при захвате клеток
в ледяные ячейки [2, 4].
Исследуя причину повреждения эритроцитов при замораживании,
Lovelock обнаружил, что уровень гемолиза клеток в среде, содержащей
0,8 Моль/л NaCl, сопоставим с уровнем гемолиза эритроцитов,
замороженных до температуры -3 0С в физиологическом растворе и затем
оттаянных. При этом в замороженном образце концентрация NaCl достигала
0,8 Моль/л. На основании выше изложенных данных, Lovelock сделал вывод,
что причиной повреждения клеток являлось увеличение концентрации
электролитов во внеклеточной среде до критического значения [108, 109, 116,
117].
Экспонируя эритроциты в растворе сахарозы, Meryman показал, что
клетки повреждались не только в гипертонических солевых растворах, но и в
неэлектролитных средах, осмотическое давление которых было эквивалентно
осмотическому давлению среды, содержащей 0,8 Моль/л NaCl [123]. Так как
гемолиз эритроцитов в различных растворах начинался при одной и той же
осмолярности среды (1300 мОсмоль/кг), Meryman предположил, что в
результате дегидратации эритроциты достигали критического минимального
объема, при котором начинался лизис клетки [120, 121].
Это предположение подтвердилось данными, полученными в
экспериментах с эритроцитами, истощенными по калию. Так, лишенные
 22
ионов калия эритроциты в сравнении с контрольными клетками, начинали
лизировать при меньших значениях осмолярности среды, но почти при том
же объеме, что и нормальные эритроциты [121]. Гипертоническое
повреждение эритроцитов автор гипотезы "минимального клеточного
объема" связывает с обезвоживанием и сжатием клетки до критического
уровня.
В работе [163] показано, что превышение осмотичности среды
инкубации выше 1,3 Осмоль/кг приводит к нарушению барьерных свойств
плазматической мембраны эритроцитов, о чем свидетельствует выход
внутриклеточных катионов калия.
Существует связь между реакцией клеток на замораживание и
свойствами их мембран [115]. Полагают, что механизм повреждения
плазматической мембраны при охлаждении и замораживании клеток связан с
образованием мембранных пор различных размеров [5].
В работе [104] показано, что пора, образующаяся в эритроцитарной
мембране в результате осмотического гемолиза, способна увеличиваться или
уменьшаться в зависимости от экспериментальных условий, т.е. представляет
собой динамическую структуру. Механизм формирования мембранных пор
при осмотической деформации клеток еще во многом не ясен.
В работе [10] рассматривается возможная деформация плазматической
мембраны при частичном обезвоживании клетки. Так как энергия чистого
изгиба мембраны мала по сравнению с энергией ее растяжения, полагают, что
при обезвоживании клетки мембране энергетически более выгодно
деформироваться по типу изгиба, чем по типу сжатия. При этом знак
кривизны в разных частях мембраны становится разным, а площадь
поверхности мембранного бислоя остается такой же, как в
недеформированном состоянии. В условиях осмотического сжатия клетки
изгибание плазматической мембраны приводит к тому, что в области участков
с положительной кривизной происходит растяжение внешнего монослоя и
сжатие внутреннего, а в области участков с отрицательной кривизной -
 23
сжатие внешнего и растяжение внутреннего монослоев. При определенных
значениях тоничности среды и времени инкубации клеток изгибание
плазматической мембраны может явиться причиной латерального
перераспределения мембранных компонентов и не приводить к лизису
клетки. Показано [5], что при осмотической деформации клеток происходит
изменение их формы и объема, а на мембране появляются участки сильного
растяжения (плазматические спикулы) и сжатия (инвагинаций). При этом
возникают неравномерные напряжения на мембране, особенно в местах ее
изгибов и растяжений, которые, по-видимому, могут служить причиной
повреждения мембраны при гипертоническом стрессе клеток.
Повреждение клеток может быть обусловлено не только действием
гипертонических растворов, но и быстрым снижением температуры. Лизис
клеток после быстрого снижения температуры до 0 0С называют холодовым
шоком (температурным шоком) [3].
Полагают, что формирование мембранных макроскопических пор при
холодовом шоке клеток связано с термотропными структурными переходами
мембранных липидов и их фазовым разделением [5]. Фазовое разделение -
это процесс, при котором молекулы липидов в одинаковом структурном
состоянии (гелевом или жидкокристаллическом) в результате латеральной
диффузии сегрегируют в отдельные области (домены) бислоя [34].
Существуют два вида реакции клеток на быстрый сдвиг температуры.
Во-первых, клетки с низким содержанием холестерина в мембране,
повреждаются при охлаждении до 0 0С в изотонических условиях, т.к.
фазовые переходы мембранных липидов и их фазовое разделение происходит
при температурах выше 0 0С [5]. Во-вторых, в клетках, обогащенных
холестерином (эритроциты), холодовой шок возникает только при
комбинированном воздействии быстрого сдвига температуры и
гипертонического раствора электролита или неэлектролита [123]. Полагают,
что в первом случае охлаждение клеток сопровождается изменением
фазового состояния основной массы липидов, а во втором - снижение
 24
температуры в первую очередь влияет на липидные микродомены,
окружающие белки (аннулярные липиды) [5].
Охлаждение до 0 0С эритроцитов в изоосмотических условиях не
приводит к их лизису, т.к. при этих температурах в клетках, обогащенных
холестерином, фазовые переходы мембранных липидов не фиксируются [34].
Выдерживание эритроцитов в гипертонической среде влияет на
распределение холестерина в плазматической мембране [152], в результате
чего при положительных температурах фазовые переходы липидов
происходят в мембранных зонах, лишенных холестерина. Таким образом,
повреждение эритроцитов при охлаждении до околонулевых температур
наступает только после их предварительной экспозиции в гипертонической
среде до начала охлаждения. Это явление часто называют "холодовым
шоком" эритроцитов. Однако, правильнее было бы называть рассматриваемое
явление "постгипертоническим криогемолизом" эритроцитов согласно
терминологии, представленной в работе Morris [125]. Термин
"постгипертонический криогемолиз" подчёркивает отличительную
особенность явления гемолиза эритроцитов при охлаждении до
околонулевых температур - необходимость предварительной экспозиции
эритроцитов в гипертонических растворах.
В работе [10] показано, что контакт эритроцита с гипертонической
средой приводит к деформации плазматической мембраны и последующему
перераспределению мембранных компонентов. В частности, на мембране
появляются места с повышенным содержанием того или иного компонента.
Вследствие этого явления может облегчаться фазовое превращение в
мембране, если вслед за экспозицией в гипертонической среде суспензия
клеток охлаждается. Указанный эффект зависит от времени экспозиции
клеток в гипертонической среде до начала охлаждения, т.к. для
перераспределения мембранных компонентов под влиянием осмотической
деформации необходимо сравнительно большое время (около 10 мин.).
Существует определенный критический уровень тоничности среды,
 25
достаточный для сенсибилизации эритроцитов к последующему
охлаждению, но недостаточный для того, чтобы вызвать сильные изменения
проницаемости мембран для катионов. Так, эритроциты становятся
чувствительными к охлаждению при перенесении их в гипертонические
среды с концентрацией выше 0,7 Моль/л NaCl [108]. Известно, что при
инкубации эритроцитов в средах, содержащих 0,7 Моль/л NaCl и выше,
наблюдается выход ионов калия из клетки. По-видимому, нарушение
барьерной функции мембраны для катионов является показателем
сенсибилизации эритроцитов к последующему охлаждению в области
положительных температур.
В работе [124] показано, что для проявления постгипертонического
криогемолиза эритроцитов важен сдвиг температуры от значения выше 20 0С
0
и до значения ниже 8 С, При этом в области указанных значений
температуры фиксируются структурные переходы в эритроцитарной
мембране. Структурный переход в эритроцитарной мембране при 8 0С связан
с изменениями в структуре белка 4.1, посредством которого происходит
ассоциация мембраны с белковым цитоскелетом [70]. Из сказанного выше
следует, что в проявлении постгипертонического криогемолиза эритроцитов
важную роль играет изменение взаимодействия между цитоскелетом и
мембраной.
 26
1.3. Действие амфифильных соединений на структуру клеточных
мембран

Еще в 1974 году Seeman показал, что анестетики не являются

специальными ядами для нервной системы, а действуют и на
эритроциты [144]. Так, целый ряд анестетиков при концентрациях,
блокирующих проведение нервного импульса, оказывает антигемолитическое
действие на эритроциты, находящиеся в гипотонических условиях.
Анестетиками называют широкий круг липофильных веществ различной
химической природы, которые способны предотвращать проведение нервного
импульса, блокируя потенциал действия, но, не изменяя существенно
потенциала покоя. К ним относятся транквилизаторы, антиконвульсанты,
антигистамины, стероиды, детергенты, антиаритмики, наркотики и другие
физиологически активные соединения.
Позднее было показано, что анестетики способны влиять на состояние
других видов клеток: тромбоцитов [80], бактериальных клеток [31] и др. [88],
а также внутриклеточных органелл (микротрубочки, митохондрии) [49].
Известно [144], что главной мишенью действия анестетиков являются
плазматические мембраны. Авторы работы [34] полагают, что эффект
анестетиков связан со способностью этих соединений встраиваться в
мембрану и изменять структурное состояние мембранных липидов.
Растворимые в воде и способные встраиваться в клеточные мембраны
вещества амфифильны, т.е. в их молекулах присутствуют гидрофильные
(полярные) и гидрофобные (неполярные) группы.
Амфифильное строение определяет способность веществ
накапливаться (адсорбироваться) на поверхности раздела (гидрофильно-
гидрофобной границе), поэтому их называют поверхностно-активными
веществами или ПАВ [15].
Амфифилы, имеющие углеводородную цепь с не менее чем семью
атомами углерода и хорошо выраженную гидрофильную полярную группу,
 27
характеризуются способностью к мицеллообразованию. Так, эти соединения
могут образовывать как истинные, так и коллоидные растворы. В виде
истинных растворов амфифилы существуют до критической концентрации
мицеллообразования (ККМ), по достижении которой происходит
качественное изменение состояния вещества в растворе: образуются агрегаты
молекул (мицеллы) [15].
Авторы работы [83] указывают на существование связи величины ККМ
амфифила и его коэффициента распределения в системе мембрана-вода.
Величина ККМ зависит от строения амфифила [32]. Она снижается при
увеличении длины углеводородного радикала. Наличие двойных связей или
разветвлений в углеводородной цепи способствуют возрастанию ККМ.
Электростатическое отталкивание между полярными группами заряженных
амфифилов увеличивает их ККМ приблизительно в 100 раз по сравнению с
соответствующими незаряженными аналогами. Величина ККМ вещества
зависит от условий внешней среды [32]. Увеличение ионной силы раствора
приводит к снижению ККМ, особенно в случае ионных амфифилов.
Повышение температуры слабо влияет на ионные амфифилы, но приводит к
заметному снижению ККМ неионных соединений.
Способность к мицеллообразованию обусловливает применение
амфифильных веществ с целью солюбилизации биологических мембран [15].
При добавлении к биологической мембране амфифилы встраиваются в нее до
достижения точки насыщения, после чего мембрана начинает распадаться на
смешанные (амфифил-липид-белок) мицеллы.
Многие амфифилы обладают антимикробными свойствами [31].
Антимикробное действие зависит от типа соединения. Наиболее высокое
бактерицидное действие проявляют катионные вещества, неионные - слабое,
анионные занимают промежуточное положение. Авторы работы [31]
описывают антимикробное действие амфифилов так: на первом этапе
происходит адсорбция молекул ПАВ в мембрану бактериальной клетки, затем
отмечается нарушение проницаемости её мембраны. Конечным результатом
 28
действия ПАВ является деструкция мембраны и лизис бактериальной клетки.
Наряду с литическим действием амфифилы способны протектировать
клетки от повреждения при различных стрессовых воздействиях [92, 126,
140, 161]. При этом протектирующие концентрации веществ значительно
ниже литических концентраций.
Авторы работы [92] изучали влияние различных амфифильных
соединений (алкилтриметиламмоний бромиды, алкилсульфаты,
алкилдиметиламмоний пропансульфонаты, глюкопиранозиды) как на
чувствительность эритроцитов к гипотоническому стрессу, так и на
барьерные свойства эритроцитарных мембран в физиологическом растворе с
32
использованием РО43- и 43
К+. Было показано, что при использовании в
антигемолитических концентрациях все амфифилы увеличивали пассивный
поток ионов калия (из клетки и в клетку), ингибировали активный транспорт
ионов калия в клетку и выход фосфата из эритроцитов. На основании
полученных данных авторы указанной работы предположили механизм
антигемолитического действия амфифилов на клетки в условиях
гипотонического стресса. Так, амфифилы, встраиваясь в мембрану
эритроцита, инициируют быстрый выход ионов калия в гипотоническую
среду. При этом уменьшаются различия в осмотическом давлении между
внутриклеточной средой и гипотоническим буфером, и клетки не лизируют.
Существует другой предполагаемый механизм антигемолитического
действия амфифилов в условиях гипотонического стресса эритроцитов [144].
Считают, что гипотоническое повреждение клетки обусловлено ее
набуханием до критического гемолитического объема, при котором
происходит разрушение плазматической мембраны. Встраивание амфифилов
в мембрану приводит к увеличению ее поверхности и сдвигу значения
критического гемолитического объема в сторону больших величин, что
способствовует предотвращению гипотонического лизиса клеток.
Авторы работы [162] утверждают, что гипотонический гемолиз
эритроцитов возникает, как только объем сфероцита достигает определённого
 29
критического значения. Однако современные представления противоречат
этому предположению. Авторы работы [24] на основании построенной ими
физико-математической теории гипотонического гемолиза эритроцитов
показали, что время 50 %-ного гемолиза непосредственно не связано со
временем достижения клетками объема, при котором начинается гемолиз.
При этом процесс выхода гемоглобина из эритроцитов происходит в течение
достаточно длительного промежутка времени, а не мгновенно. Таким
образом, процесс гипотонического гемолиза эритроцитов состоит из двух
периодов: периода достижения клетками критического объема и периода
образования макроскопической поры в клеточной мембране (так называемого
"сферического периода"). Существование сферического периода обусловлено,
во-первых, необходимостью растяжения мембраны до определённого уровня,
когда в процессе осмотического гемолиза эритроцит достигает сферической
формы и дальнейшее увеличение клеточного объема приводит к изотропному
растяжению мембраны и, во-вторых, необходимостью преодоления
энергетического барьера между состояниями с нулевым и отличным от нуля
радиусом поры. В связи с вышеизложенными представлениями,
описывающими явления гипотонического гемолиза эритроцитов, можно
заключить, что механизм антигемолитического действия амфифильных
веществ в условиях гипотонического стресса клеток её во многом не ясен.
Известно, что амфифильные соединения (хлорпромазин) протектируют
эритроциты от повреждения при действии мелиттина [140]. Компонент
пчелиного яда - мелиттин способен образовывать макроскопические поры в
мембранах [105].
Различные амфифильные соединения (хлорпромазин, тетракаин,
индометацин и др.) снижают уровень повреждения эритроцитов при
повышении гидростатического давления [161].
Интересен тот факт, что одно амфифильное соединение (лецитин)
способно предотвращать разрушение клеточных мембран, вызванное
другими амфифильными соединениями (солями жирных кислот) [126].
 30
Молекуляный механизм протектирующего действия амфифилов на
клетки в условиях различных стрессов еще во многом не ясен. Эти
соединения оказывают модифицирующее действие как на липиды, так и на
белки клеточных мембран [34]. Считают [34], что при низких
(анестетических) концентрациях амфифилы взаимодействуют с липидами, а
для взаимодействия с белками требуются высокие (предлитические)
концентрации веществ. При использовании амфифилов в низких
концентрациях их влияние на функциональное состояние белков может быть
опосредовано структурными изменениями в липидной фазе мембраны [34].
Так, авторы работы [92] описывают предполагаемые молекулярные явления,
лежащие в основе ингибирующего действия амфифильных веществ на
транспорт фосфата из клетки. Амфифилы увеличивают "жидкостность"
бислоя, в результате этого изменяется конформация и функциональная
активность анион-транспортного белка полосы 3 и происходит
ингибирование транспорта фосфата.
Результаты работ [71, 96] свидетельствуют, что под воздействием
амфифилов увеличивается "текучесть" липидов в модельных мембранах. В
работе [71] исследовали действие амфифильных веществ (хлорпромазин,
дитазин) на температуру фазового перехода липидов
дипальмитоилфосфатидилхолиновых липосом. Используя три различных
метода (калориметрия, ядерно-магнитный резонанс с использованием
С13 и Р31), авторы указанной работы показали, что оба вещества понижали
температуру фазового перехода липидов, увеличивали "жидкостность" в
области жирнокислотных цепей фосфатидилхолиновых молекул.
В работе [96] методом сканирующей дифференциальной калориметрии
исследовали влияние катионных амфифилов (16 веществ) на температуру
фазового перехода фосфатидилхолиновых липосом. Было показано, что
вещества с различной эффективностью понижали температуру фазового
перехода липидов.
Результаты работы [34] также свидетельствуют о том, что амфифилы
 31
разупорядочивают липидную фазу мембран. Так, хлорпромазин при
использовании в концентрации, протектирующей эритроциты от
гипотонического повреждения, увеличивает проницаемость к АНС
(1-анилино-8-нафталинсульфонат) как мембран нативных клеток, так и
липосом, сформированных из суммарной фракции эритроцитарных липидов.
В работе [164] изменения формы и мембранных свойств эритроцитов в
присутствии свободных жирных кислот и их производных изучали с
помощью методов светорассеяния при малых и больших углах, световой
микроскопии и флуоресцентной анизотропии. Показано, что пальмитиновая
кислота уменьшала ротационную диффузию флуоресцентного зонда,
встроенного в мембрану, в то время как метиловый эфир пальмитиновой
кислоты и лауриловый альдегид увеличивали подвижность зонда.
В ряде работ показано [55, 72, 86, 159], что одинаковый эффект
амфифилов наблюдался, когда концентрация веществ в мембране была
сходной. Seeman, исследуя действие большого количества
липидорастворимых и амфифильных соединений на эритроциты в условиях
гипотонического стресса, показал, что при 50 %-й антигемолитической
активности концентрация вещества в мембранной фазе была примерно
одинаковая, несмотря на то, что коэффициент распределения в системе
масло-вода отличался в несколько раз для исследуемых веществ [144].
В работе [86] отмечено, что хотя концентрации, вызывающие 50 %-й
гемолиз клеток, отличались для различных катионных амфифилов,
количество молекул вещества в мембране было примерно одинаковое.
Одинаковое изменение формы клеток наблюдалось при сходных
значениях связывания с мембраной гомологов лизофосфатидилхолина с
длиной алкильной цепи от 8 до 22 углеродных атомов [72, 159].
0
Однако, понижение на 2 С температуры фазового перехода
фосфатидилхолина в присутствии катионных амфифилов происходило при
различном молярном отношении вещество-липид [96].
Заключение.
 32
Плазматическая мембрана отделяет внутриклеточное содержимое от
внешней среды и играет главную роль в поддержании стационарного
состояния клетки. Именно поэтому предотвращение разрушения
плазматической мембраны под действием стрессовых факторов является
необходимым условием сохранения жизнеспособности клетки.
Благодаря динамической структуре плазматическая мембрана реагирует
на внешние воздействия изменением своего структурного состояния.
Структурные перестройки в мембране могут быть направлены как на ее
разрушение, так и на повышение устойчивости к стрессовым воздействиям.
Так, под действием факторов, сопровождающих криоконсервацию
эритроцитов, в плазматической мембране происходят структурные
изменения, приводящие к формированию макроскопических пор и лизису
клеток. Амфифильные соединения способны модифицировать структуру
мембраны и повысить ее адаптивные свойства в различных стрессовых
условиях. Поэтому использование различных амфифильных веществ в
условиях резкого изменения осмотических и температурных параметров
среды могло бы повысить устойчивость клеток к действию повреждающих
факторов, а также позволить приблизиться к пониманию процессов,
ответственных за криоповреждение и криозащиту биологических мембран.
 33
ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для исследования использовали эритроциты, полученные из донорской

крови, заготовленной на глюгицировом консерванте. Кровь мужчин II-ой
группы была предоставлена областной станцией переливания крови
г Харькова. После удаления плазмы эритромассу дважды отмывали путем
центрифугирования при 1500 g в течение 3 мин в 10-кратном объеме
физиологического раствора (0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный
буфер, pH 7,4) и хранили в виде плотного осадка не более двух часов при
температуре 0 0С. Лейкоцитарную пленку удаляли аспирацией. Все
использованные в работе среды готовили на 0,01 Моль/л фосфатном
буфере, рН 7,4.

Гипертонический стресс эритроцитов.

Гипертонический стресс эритроцитов осуществляли следующим
образом. По 50 мкл. осадка эритроцитов переносили с помощью поршневого
дозатора "Gilson" в 0,5 мл раствора NaCl (0,15; 0,45; 0,7 Моль/л) при заданной
температуре (0 или 37 0С) и инкубировали две минуты (этап предварительной
инкубации). Затем из каждой пробы по 50 мкл суспензии эритроцитов
переносили в 1,0 мл раствора, содержащего 4,0 Моль/л NaCl (контроль), или
в 1,0 мл 4,0 Моль/л раствора NaCl, содержащего амфифильное вещество, при
той же температуре на пять минут (этап гипертонического стресса).

Постгипертонический криогемолиз эритроцитов.

Для проведения постгипертонического криогемолиза 50 мкл осадка
эритроцитов переносили в 0,5 мл раствора NaCl (1,2 Моль/л) на 10 мин при
температуре 37 0С. Затем из этой пробы 50 мкл суспензии эритроцитов
переносили в 1,0 мл раствора NaCl той же тоничности, находящегося при
температуре 0 0С и содержащего амфифильное вещество, на 10 мин.
 34
В экспериментах по гипертоническому стрессу и
постгипертоническому криогемолизу конечный гематокрит суспензии
составил 0,4 %. Исследуемое вещество добавляли в литическую среду перед
внесением клеток. При использовании двухвалентных катионов (Са 2+, Zn2+),
для приготовления сред вместо фосфатного буфера применяли буфер
трис-HCl в концентрации 10 мМоль/л.

Определение уровня гемолиза эритроцитов, подвергнутых стрессовому

воздействию.
Клетки осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 1500 g.
Содержание вышедшего в супернатант гемоглобина определяли
спектрофотометрическим способом на СФ-4А с проточной кюветой на длине
волны 543 нм. За 100 % принимали поглощение пробы, в которую добавляли
детергент тритон Х-100 в концентрации 0,1 %. Каждый эксперимент
повторяли не менее 6 раз в двух параллельных пробах. В дальнейшем
вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное
отклонение гемолиза эритроцитов для каждой концентрации амфифильного
вещества. Для каждого приведенного в работе графика представлено
значение максимального среднеквадратичного отклонения величины
гемолиза эритроцитов из серий опытов одного эксперимента в виде точки с
разбросом значений, имеющих соответствующую маркировку и цвет.
За эффективную концентрацию амфифильного вещества в серии
опытов одного эксперимента было принято среднее арифметическое
концентраций данного вещества, соответствующих минимальному значению
гемолиза эритроцитов. Значение максимальной антигемолитической
активности (АГmax) амфифильного соединения в серии опытов одного
эксперимента представляет собой среднюю арифметическую величину из
значений максимальной антигемолитической активности данного
соединения, рассчитанных по формуле:
 35
ка
АГ max   100 % (2.1), где
к

к - величина гемолиза эритроцитов в данных экспериментальных

условиях в отсутствие амфифильного вещества.
а - минимальная величина гемолиза эритроцитов в присутствии
амфифильного вещества;

Обработка эритроцитов диамидом [74].

4 % - ную суспензию эритроцитов инкубировали в физиологическом
растворе, приготовленном на 0,01 Моль/л фосфатном буфере, рН 8,0, с
диамидом и без него при температуре 37 0С в течение 45 мин в условиях
постоянного перемешивания. По окончанию времени инкубации клетки
трижды отмывали от диамида раствором, содержащим 0,15 Моль/л NaCl, 0,01
Моль/л фосфатный буфер, рН 7,4, и подвергали гипертоническому стрессу в
среде, содержащей 4,0 Моль/л NaCl.

Исследование морфологии эритроцитов.

Морфологический анализ эритроцитов проводили методом световой
микроскопии на микроскопе МБИ-15У с фотографической регистрацией
формы клеток (увеличение при съемке в 200 раз). Реакцию клеток на
введение амфифильных соединений оценивали в капле, которую помещали
между двумя силиконизированными стеклами и равномерно распределяли
тонким слоем. При этом эритроциты находились во взвешенном состоянии,
что позволяло всесторонне наблюдать за формой клетки, начиная с 30 сек.
реакции. В морфологической оценке особенностей формы и поверхностной
архитектоники эритроцитов использовали общепринятую классификацию,
приведенную в работе Bessis М. [45].

Исследование барьерных свойств эритроцитарной мембраны.

 36
Количество ионов калия, вышедших из эритроцитов в присутствии
амфифильных соединений, определяли методом атомно-абсорбционной
спектрофотометрии [27]. Измерения проводили на спектрофотометре
С-115-М1 в режиме эмиссии при длине волны 766,5 нм, пламя пропан-
воздух, с использованием шкалы концентраций. Предел обнаружения
0,0008 мг/л. Для получения градуировочных растворов использовали соли
NaCl и KCl квалификации "осч", высушенные в сушильном шкафу при
120 0С. Градуировку перед измерением проводили с использованием
градуировочных растворов, содержащих 0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 10,0; 15,0; 20,0 мг/л
калия. Для подавления ионизации калия все градуировочные растворы
содержали 50 мг/л натрия. Разбавление исследуемых проб проводили таким
образом, чтобы концентрации разбавленных растворов соответствовали
диапазону калибровки, затем эти разбавления учитывали в пересчете.
Содержание калия определяли в супернатанте образцов, подвергнутых
гипертоническому воздействию (температура 37 0С) в присутствии
амфифильных веществ в эффективных концентрациях.

Исследование динамической структуры эритроцитарной мембраны.

Динамическую структуру мембраны эритроцита изучали методом
электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спиновых зондов [20]. В
работе были использованы зонды - производные жирных кислот, содержащих
нитроксильный радикал: амид пальмитиновой кислоты (АПК) , 5-
доксилстеариновая кислота (5-ДС), 16-доксилстеариновая кислота (16-ДС).
Эти спин-меченые производные жирных кислот отличаются положением
нитроксильного радикала вдоль гидрофобной цепи. Меченый в первом
положении углеродного атома жирнокислотной цепи зонд АПК является
удобным инструментом для изучения состояния полярной поверхности
мембраны. Зонд 5-ДС с нитроксильным радикалом, присоединенным к
пятому атому углерода в углеводородной цепи, дает информацию о структуре
гидрофобной зоны мембраны (на расстоянии примерно 5 углеродных атомов
 37
вглубь бислоя, около 8 Ǻ от поверхности). В молекуле 16-ДС нитроксильный
фрагмент присоединен к 16-му атому углеводородной цепи, что позволяет
использовать зонд 16-ДС для изучения структурного состояния гидрофобной
зоны мембраны на расстоянии примерно 16 углеродных атомов вглубь
бислоя. Использование таких зондов позволяет оценить микровязкость (в
микроокружении радикала зонда) липидов эритроцитарной мембраны в
трансмембранном направлении.
Нативная мембрана характеризуется определенным распределением
свободных и аннулярных (иммобилизованных) липидов в планарном и
трансмембранном направлениях, при этом спин-меченые жирные кислоты
распределяются прежде всего в наиболее текучие липид-липидные
микрообласти [20].
Микровязкость локального окружения нитроксильного фрагмента
зондов АПК и 16-ДС в мембране оценивали по частоте вращения радикала ν +1
(с-1). Выбор данного параметра обусловлен тем, что как на водно-липидной
поверхности, так и в гидрофобной зоне мембраны на расстоянии примерно
16 углеродных атомов вглубь бислоя наблюдается быстрое хаотичное
вращение нитроксильного радикала зонда, что позволяет использовать для
расчета частоты вращения радикала формулу 2.2.
Нитроксильный фрагмент зонда 5-ДС характеризуется более
упорядоченным (преимущественно вокруг гидрофобной цепи молекулы
зонда) вращением на расстоянии около 8 Ǻ от поверхности, поэтому
подвижность радикала оценивали по эмпирическому параметру ΔН + (Тл)
(расстояние между первым максимумом и предпоследним минимумом
спектра ЭПР зонда). Увеличение значения параметра ΔН + (Тл) соответствует
снижению величины ν+ (с-1) [20].
Спин-меченая суспензия клеток содержала 100 мкМоль/л спиртового
раствора жирнокислотного зонда (не более 1 % спирта). Указанные
концентрации зондов считают магнитно-разбавленными (присутствуют
единичные зонды, не взаимодействующие друг с другом) и не
 38
пертурбирующими клеточную мембрану [20].
Контрольные, а также обработанные диамидом или амфифильными
веществами клетки инкубировали с зондами в течение 20 мин, т.к. показано,
что за это время завершается встраивание молекул спиновых зондов в
бислой [20].
Спектры ЭПР зондов регистрировали на спектрометре ЭПР ЕR-100-D
"Bruker" (Германия), снабженном стандартной термоприставкой. Выбор
температуры регистрации спектров (15-17 0С) был обусловлен
необходимостью свести к минимуму изменение интенсивности компонент
спектра вследствие потери парамагнетизма спиновыми зондами при реакции
восстановления нитроксилов, скорость которой резко снижается при
температурах ниже 20 0С, как было показано в работе [20]. По спектрам
измеряли расстояние между первым максимумом и предпоследним
минимумом (ΔH+), а также интенсивности индивидуальных линий (h 0, h+) и
ширину центральной компоненты (∆Η0), которые использовали для расчета
частоты вращения радикала зонда, по формуле, приведенной в работе [20]:

2  108
ν  с 1
 h0  (2.2), где
  1   ΔH 0
 h
 

∆Η0 - ширина центральной компоненты;

h0, h+ - интенсивности компонент спектра;
ν+ - частота вращения радикала

Перед введением в мембрану зондов, эритроциты инкубировали с

амфифильными веществами в течение 5-ти мин при температуре 37 0С.

В работе были использованы вещества:

 39
децилсульфат натрия, додецилсульфат натрия (СинтезПАВ);
3-децилдиметиламмоний-1-пропансульфонат натрия,
3-цетилдиметиламмоний-1-пропансульфонат натрия;
додецил-β,D-мальтозид; хлорпромазин гидрохлорид (Calbiochem);
амид пальмитиновой кислоты (Reanal);
5-доксилстеариновая кислота, 16-доксилстеариновая кислота,
диамид (Sigma).
В работе использованы реактивы отечественного производства
квалификации "хч" и "чда".
Статистическую обработку результатов проводили с помощью
дисперсионного, регрессионного и корреляционного анализа [17, 30, 35].
 40
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 3
ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ К ГИПЕРТОНИЧЕСКОМУ
СТРЕССУ И ПОСТГИПЕРТОНИЧЕСКОМУ КРИОГЕМОЛИЗУ

В процессе охлаждения и замораживания условия среды, окружающей

клетку, изменяются. Так, изменяется температура, рН среды, увеличивается
концентрация солей в жидкой фазе при кристаллизации части растворителя,
растущие кристаллы льда могут оказывать механическое давление на
клетки [4]. Полагают, что основными факторами повреждения эритроцитов
при замораживании является действие гиперконцентрированных растворов
солей и быстрое снижение температуры [2, 133].
Для того, чтобы выделить из комплекса повреждающих факторов и
оценить влияние на эритроциты высококонцентрированных растворов солей
и сдвига температуры используют модельные эксперименты:
гипертонический стресс и постгипертонический криогемолиз [3].
Гипертоническим холодовым шоком или постгипертоническим
криогемолизом называют явление повреждения эритроцитов человека,
которое возникает в результате их экспозиции в гипертоническом растворе не
проникающего в клетки вещества при постоянной температуре в диапазоне
от 45 до 20 0С и последующего охлаждения до температуры ниже +13 0С, но
выше температуры, при которой в клеточной суспензии образуются
кристаллы льда [18, 125].
Гипертонический стресс эритроцитов представляет собой повреждение
клеток, перенесенных в гипертоническую среду при постоянных
положительных значениях температуры [25].
В работе [77] показано, что разнообразные по химическому строению
амфифильные соединения защищают эритроциты от повреждения в условиях
 41
гипотонического стресса. Вышеизложенное, а также тот факт, что
амфифильные вещества способны проявлять антигемолитическое действие
на клетки в других стрессовых условиях [23, 140], позволяют предположить,
что представители различных классов амфифильных соединений могли бы
снижать уровень гемолиза эритроцитов в условиях гипертонического стресса
и постгипертонического криогемолиза.
Исследуемые в нашей работе вещества являются растворимыми в воде
амфифильными соединениями, относящимися к разным классам
поверхностно-активных веществ [14, 31]. Амфифильность обусловлена
наличием в молекуле гидрофильной и гидрофобной частей.
Неионные амфифилы представлены додецил-β,D-мальтозидом (ДМ):

C H 2O H C H 2O H
O O
O - ( C H 2) 11- C H 3
HO O
OH OH
OH OH

Катионные - хлорпромазином, производным фенотиазина (ХП):

N
CH3
CH3
 42
Анионные амфифилы представлены гомологами алкилсульфата натрия
с длиной алкильной цепи 10 и 12 углеродных атомов (С10, С12):

R-SO4Na, где R=C10, C12

Цвиттерионные соединения представлены гомологами

алкилдиметиламмоний пропансульфоната натрия с длиной алкильной цепи
10 и 16 углеродных атомов (Z10, Z16):

R-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3Na, где R=C10, C16

 43
3.1. Гипертонический стресс эритроцитов в присутствии
амфифильных веществ

Для проведения гипертонического стресса мы переносили клетки из

физиологического раствора в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl. Выбор
раствора, содержащего 4,0 Моль/л NaCl, обусловлен тем, что в этой среде
наблюдается достаточно высокий (80 - 90 %) уровень гемолиза эритроцитов,
что показано в ряде работ [12, 25].
Для всех исследуемых амфифильных веществ были сняты
концентрационные зависимости гемолиза эритроцитов в среде, содержащей
4,0 Моль/л NaCl, при температуре 37 0С (рис. 3.1.1). Из представленных на
рисунке 3.1.1 данных видно, что повреждение эритроцитов в растворе
4,0 Моль/л NaCl при физиологической температуре составляет примерно
80-90 %. Все амфифильные соединения при использовании в определенных
концентрациях снижают уровень гипертонического повреждения
эритроцитов.
В представленных кривых концентрационной зависимости гемолиза
эритроцитов можно выделить две фазы. По мере увеличения концентрации
амфифила происходит постепенное снижение уровня повреждения клеток
(фаза 1). Затем отмечается повышение уровня повреждения клеток до
контрольного значения и выше (фаза 2). Таким образом, все исследуемые
соединения характеризуются двойственным влиянием на чувствительность
эритроцитов к гипертоническому стрессу: в низких концентрациях
амфифильные вещества протектируют эритроциты от повреждения в
гипертонической среде, в то время как в высоких - оказывают литическое
действие на клетки.
О двойственном характере влияния амфифильных веществ на клетки
указывалось в ряде работ. Так, в низких концентрациях амфифильные
соединения протектировали эритроциты от гипотонического [77] и
постгипертонического гемолиза [23], а также лизиса клеток, вызванного
 44
Рис. 3.1.1
 45
действием порообразующих агентов [140], тогда как в высоких
концентрациях амфифильные соединения приводили к лизису клеток даже в
изотонических условиях. Действие амфифильных веществ в высоких
концентрациях связаны с детергентными свойствами этих соединений,
именно поэтому они широко применяются для солюбилизации
биологических мембран [32, 83].
Для того, чтобы сравнить протектирующее действие исследуемых
соединений и устранить влияние индивидуальных различий донорской
крови, мы использовали понятие антигемолитической активности вещества.
Антигемолитическую активность амфифильного соединения выражали как
процент снижения гипертонического гемолиза клеток в присутствии
вещества по отношению к гемолизу в пробе, не содержащей амфифил
(формула 2.1).
В табл. 3.1.1 представлены значения максимальной антигемолитической
активности и эффективные концентрации исследуемых веществ.
Эффективными названы концентрации веществ, при которых гемолиз
эритроцитов минимальный и, соответственно, антигемолитическое действие
вещества максимальное.
Как видно из представленных данных, величины эффективных
концентраций для исследуемых соединений находятся в диапазоне
6-778 мкМоль/л, т.е. различаются на два порядка. Так, наименьшие
эффективные концентрации веществ в условиях гипертонического стресса
(температура 37 0С) отмечены для длинноцепочечного цвиттерионного
соединения Z16 и неионного ДM, а наибольшие - для катионного амфифила
ХП и короткоцепочечного цвиттерионного соединения Z10.
Если расположить исследуемые вещества в ряду по мере возрастания
значений эффективных концентраций (см. табл.. 3.1.1), можно увидеть
определенную закономерность. Амфифильные соединения с длиной
гидрофобной алкильной цепи больше десяти атомов углерода
характеризуются меньшими значениями эффективных концентраций по
 46
сравнению с амфифилами, имеющими более короткую гидрофобную цепь.
Исключением является ХП, в молекуле которого гидрофобная часть
представлена циклической структурой.
Таблица 3.1.1
Значения эффективных концентраций и максимальной
антигемолитической активности амфифильных соединений в условиях
гипертонического стресса эритроцитов при температуре 37 0С

Вещество Эффективная конц., мкМоль/л Макс.антигем. активность, %

Z16 8 ±2 65 ±4
ДМ 6 ±3 68 ±6
С12 21 ±7 73 ±7
С10 40 ±16 84 ±7
ХП 124 ±8 94 ±2
Z10 778 ±219 79 ±3

Как видно из данных, представленных в табл. 3.1.1, значения

максимальной антигемолитической активности амфифильных веществ в
условиях гипертонического стресса эритроцитов при температуре 37 0С
находятся в диапазоне 65-94 %.
Для сравнения значений максимальной антигемолитической активности
исследуемых веществ, необходимо убедиться, что указанные величины
относятся к различным совокупностям. С помощью критерия Стьюдента
была проведена проверка гипотезы о равенстве средних значений
максимальной антигемолитической активности различных веществ для
парных случаев (табл. 3.1.2) [35].

Таблица 3.1.2
Величина критерия Стьюдента (t), полученная при проверке гипотезы о
 47
равенстве средних значений максимальной антигемолитической активности
веществ в условиях гипертонического стресса эритроцитов
(температура 37 0С).

Веще С10- С10- С10- С10- C10- С12- С12- C12- C12- ДМ- ДМ- ДМ- ХП- ХП- Z10-
ства С12 ДМ ХП Z10 Z16 ДМ ХП Z10 Z16 ХП `Z10 Z16 Z10 Z16 Z16

t 4,4 7,0 7,3 3,3 11,7 1,9 9,8 2,5 3,7 13,5 5,2 1,6 15,5 26,9 10,7

Гипотеза с вероятностью 94 % не подтвердилась для всех исследуемых

веществ. Исключением являются значения максимальной антигемолитичской
активности Z16 и ДМ. Таким образом, величины максимальной
антигемолитической активности амфифильных веществ относятся к
различным совокупностям, что позволяет сравнивать протектирующий
эффект исследуемых соединений в условиях гипертонического стресса
эритроцитов при температуре 37 0С.
Из данных, представленных в табл. 3.1.1, видно, что минимальным
протектирующим действием обладает цвиттерионный амфифил Z16, а
максимальным - катионный амфифил ХП. При сравнении значений
эффективных концентраций и величин антигемолитической активности
исследуемых амфифилов наблюдается следующая закономерность: чем
меньше значение эффективной концентрации амфифила, тем ниже его
антигемолитическое действие (исключением является Z10).
Это хорошо видно при сравнении как гомологов алкилсульфата натрия,
так и производных алкилдиметиламмоний пропансульфоната натрия. Так,
короткоцепочечные гомологи (С10, Z10) характеризуются большими
величинами антигемолитической активности и эффективных концентраций
по сравнению с длинноцепочечными (С12, Z16) (см. табл.. 3.1.1). Эта
особенность лучше прослеживаются у цвиттерионных гомологов,
отличающихся на большее количество -СН2 групп, чем у анионных, у
которых разница в длине алкильной цепи составляет всего два углеродных
 48
атома.
На рис. 3.1.2 представлены зависимости гемолиза эритроцитов в
растворе, содержащем 4,0 Моль/л NaCl, от концентрации амфифила при
температуре 0 0С (кривая 2) в сравнении с аналогичными зависимости при
температуре 37 0С, используемыми в качестве контроля (кривая 1). Все
исследуемые амфифилы протектируют эритроциты от гипертонического
повреждения при температуре 0 0С (рис.3.1.2, кривая 2), и форма кривых
гемолиза при 0 0С имеет сходный с контрольной кривой двухфазный
характер.
Однако, концентрационные зависимости гипертонического гемолиза
при температуре 0 0С и при температуре 37 0С различны. Во-первых, при 0 0С
область концентраций амфифила, при которых гемолиз минимален,
сдвигается в сторону меньших значений. Во-вторых, диапазон концентраций
вещества, при которых наблюдается максимальное защитное действие,
гораздо уже при температуре 0 0С, чем при 37 0С. В-третьих, при
использовании амфифилов в эффективных концентрациях уровень
минимального гемолиза выше при температуре 0 0С, чем при 37 0С, т.е.
защитное действие веществ при температуре 0 0С в условиях
гипертонического стресса эритроцитов менее выражено.
Отмеченные особенности концентрационных кривых характерны для
всех исследуемых амфифилов. Исключением является цвиттерионное
соединение Z16, для которого наблюдается незначительное протектирующее
действие на клетки в условиях гипертонического стресса при температуре
0 0С (10 %), поэтому в дальнейшем мы не рассматриваем антигемолитическое
действие Z16 в данных условиях. В ряде работ [145, 171] показано, что
действие на клетки амфифильных веществ, имеющих длину алкильной цепи
больше 14 атомов углерода, отличается от действия более короткоцепочечных
гомологов. Причина этого явления не ясна.
Рис 3.1.2
 49
Величины максимальной антигемолитической активности и
эффективные концентрации амфифилов при гипертоническом стрессе
(температура 0 0С) приведены в табл. 3.1.3. Видно, что значения
максимальной антигемолитической активности амфифилов при
температуре 0 0С находятся в диапазоне 30-63 %.
Таблица 3.1.3
Значения эффективных концентраций и максимальной
антигемолитической активности (АГmax) амфифильных соединений в
условиях гипертонического стресса эритроцитов при температуре 0 0С

Вещество Эфф.конц., мкМоль/л АГmax, % АГ37-АГ0, %

Z16 1,67 ±0,75 15 ±1 50
ДМ 3,00 ±0,01 30 ±3 38
С12 6,00 ±0,01 39 ±3 34
С10 10,00 ±0,01 48 ±4 36
ХП 20,00 ±0,01 63 ±6 31
Z10 500,00 ±0,01 63 ±6 16

Следует отметить, что величины максимальной антигемолитической

активности всех амфифильных соединений в условиях гипертонического
стресса эритроцитов ниже при температуре 0 0С (см. табл.. 3.1.3), чем при
температуре 37 0С (см. табл.. 3.1.1).
В табл. 3.1.3 вещества расположены в ряду по мере возрастания
значений эффективных концентраций при гипертоническом стрессе
эритроцитов (0 0С). Обращает на себя внимание тот факт, что
последовательность веществ аналогична таковой при температуре 37 0С
(см. табл. 3.1.1). Видно, что с увеличением значений эффективных
концентраций исследуемых амфифилов возрастает и величина их
антигемолитического действия.
 50
Таким образом, при температуре 0 0С зависимость между значениями
эффективных концентраций и величинами антигемолитической активности
амфифилов сохраняется такой же, как при температуре 37 0С.
В табл. 3.1.3 представлена разность между величинами максимальной
антигемолитической активности амфифилов в условиях гипертонического
стресса клеток при температуре 37 0С и при 0 0С (АГ37-АГ0). В основном,
разность в эффективности действия амфифилов в условиях гипертонического
стресса при разных температурах составляет - 30-40 %.
Исключением являются цвиттерионные соединения.
Антигемолитическая активность короткоцепочечного цвиттерионного
соединения Z10 достаточно высока как при физиологической, так и при
низкой температуре, поэтому разность составляет 16 %. Для
длинноцепочечного гомолога Z16 значительной величины
антигемолитической активности при температуре 0 0С не наблюдается в
условиях гипертонического стресса клеток. Таким образом, различие в длине
гидрофобной алкильной цепи гомологов алкилдиметиламмоний
пропансульфоната натрия является существенным моментом для проявления
этими соединениями антигемолитического действия на клетки в условиях
гипертонического стресса при температуре 0 0С.
 51
3.2. Влияние амфифильных соединений на чувствительность исходно
дегидратированных эритроцитов к гипертоническому стрессу

В работах Позднякова В.В. [22, 23] показано, что инкубирование

эритроцитов в растворах с различной тоничностью изменяет
чувствительность клеток к последующему перенесению в среду, содержащую
4,0 Моль/л NaCl. Эритроциты, предварительно проинкубированные в средах,
содержащих 0,4-0,5 Моль/л NaCl, приобретают максимальную устойчивость
к гипертоническому стрессу (4,0 Моль/л NaCl). Дальнейшее повышение
концентрации соли в среде исходной инкубации клеток приводит к
последующему увеличению гипертонического гемолиза эритроцитов. Так,
клетки, предварительно проинкубированные в растворе 0,7 Моль/л NaCl, при
перенесении в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl, повреждаются на уровне
контроля.
Нами изучено действие амфифильных веществ на клетки,
перенесенные из сред предварительной инкубации в литическую среду
(4,0 Моль/л NaCl). Средами предварительной инкубации были выбраны:
раствор 0,15 Моль/л NaCl - в качестве контроля; раствор 0,45 Моль/л NaCl -
зона оптимальной устойчивости; раствор 0,7 Mоль/л NaCl - зона
неустойчивости клеток к последующему перенесению в среду, содержащую
4,0 Моль/л NaCl.
На рис. 3.2.1 представлены уровни гемолиза эритроцитов,
перенесенных из сред, содержащих 0,15 Моль/л (кривая 1), 0,45 Моль/л
(кривая 2), 0,7 Моль/л NaCl (кривая 3), в раствор 4,0 Моль/л NaCl от
концентрации амфифила в литической среде (температура 37 0С). Исходный
уровень повреждения эритроцитов, перенесенных из среды, содержащей
0,45 Моль/л NaCl, в 4,0 Моль/л NaCl, значительно ниже (38-54 %), чем
гипертоническое повреждение клеток, предварительно находившихся в
физиологическом растворе или в среде, содержащей 0,7 Моль/л NaCl.
 52
Рис 3.2.1
 53
Из представленных на рис. 3.2.1 данных видно, что амфифильные
соединения снижают уровень гипертонического гемолиза эритроцитов,
предварительно проинкубированных в средах, содержащих не только
0,45 Моль/л, но и 0,7 Моль/л NaCl, при температуре 37 0С.
Наименьший уровень гипертонического гемолиза наблюдается при
совместном влиянии на клетки среды предварительной инкубации
(0,45 Моль/л NaCl) и амфифильного вещества. Такая закономерность
отмечена для всех исследуемых соединений. Исключение составил
катионный ХП. Он снижает гипертонический гемолиз как контрольных, так и
прединкубированных в растворе 0,45 Моль/л NaCl эритроцитов до
одинаковых значений.
Эритроциты, исходно проинкубированные в среде, содержащей
0,7 Моль/л NaCl, наиболее чувствительны к повреждающему действию
раствора 4,0 Моль/л NaCl в присутствии амфифильных веществ по
сравнению как с контрольными, так и с клетками, исходно
проинкубированными в среде, содержащей 0,45 Моль/л NaCl.
Из данных, представленных на рис 3.2.2, видно, что исходный уровень
гипертонического повреждения контрольных и перенесенных из среды,
содержащей 0,7 Моль/л NaCl, эритроцитов имеет примерно одинаковые
значения. Однако, амфифильные вещества снижают гипертонический
гемолиз контрольных клеток в большей степени, чем эритроцитов,
прединкубированных в растворе 0,7 Моль/л NaCl.
Таким образом, при температуре 37 0С все исследуемые амфифильные
вещества снижают гемолиз эритроцитов в условиях гипертонического
стресса с увеличивающейся интенсивностью при использовании сред
предварительной инкубации клеток в ряду: 0,7 Моль/л; 0,15 Моль/л;
0,45 Моль/л NaCl.
Выше приведенные данные отражают совместное влияние сред
исходной нкубации и амфифильных веществ на уровень гемолиза
эритроцитов при гипертоническом стрессе. Для того, чтобы оценить
 54
эффективность протектирующего действия амфифильных соединений в
данных условиях, на рис. 3.2.2 представлены значения максимальной
антигемолитической активности амфифильных веществ при использовании
их в эффективных концентрациях.

100

90

80
антигемолитическая активность, %

70

60

50

40

30

20

10

0
8 9 5 6 5 4 21 20 8 40 32 54 124 133 120 778 667 1000
Z16 ДМ С12 С10 ХП Z10

концентрация, мкМоль/л

Рис. 3.2.2 Значение максимальной антигемолитической активности

амфифильных соединений при перенесении эритроцитов в 4,0 Моль/л NaCl
из сред предварительной инкубации:
- 0,15 Моль/л NaCl
- 0,45 Моль/л NaCl
- 0,7 Моль/л NaCl

Контролем являются величины максимальной антигемолитической

активности амфифильных соединений при гипертоническом стрессе
эритроцитов, предварительно проинкубированных в физиологической среде.
 55
Из представленных на рисунке данных видно, что антигемолитическая
активность всех исследуемых соединений достаточно высока, несмотря на
условия, в которых находились клетки перед перенесением в среду,
содержащую 4,0 Моль/л NaCl. Характерно, что для всех веществ уровень
антигемолитической активности немного ниже (примерно на 10-20 %) в
случае использования дегидратированных в растворе 0,7 Моль/л NaCl
эритроцитов по сравнению с контрольными.
Проверка гипотезы о равенстве средних показала, что значения
максимальной антигемолитической активности вещества в указанных
условиях относятся к различным совокупностям (табл. 3.2.1)

Таблица 3.2.1
Величина критерия Стьюдента (t), полученная при проверке гипотезы о
равенстве средних значений максимальной антигемолитической активности
вещества при перенесении эритроцитов из 0,15 Моль/л в 4,0 Моль/л NaCl и
при перенесении эритроцитов из 0,7 Моль/л в 4,0 Моль/л NaCl
(температура 37 0С)
Вещество C10 C12 ДМ ХП Z10 Z16
t 3,92 4,41 3,00 4,71 4,03 4,54

Как было показано выше (см. рис. 3.1.2), величины максимальной

антигемолитической активности амфифилов в условиях гипертонического
стресса зависят от температуры. Нами изучено влияние температуры на
проявление антигемолитической активности исследуемыми соединениями
при гипертоническом стрессе эритроцитов, предварительно
проинкубированных в растворах 0,45 Моль/л или 0,7 Моль/л NaCl.
На рис. 3.2.3 представлены кривые гемолиза эритроцитов, исходно
проинкубированных в средах, содержащих 0,15 Моль/л (1), 0,45 Моль/л (2),
0,7 Моль/л (3) NaCl, и перенесенных в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl и
амфифильные вещества, при температуре 0 0С.
 56
Рис 3.2.3
 57
Обращает на себя внимание тот факт, что характер кривых
гипертонического гемолиза при температуре 0 0С отличается от аналогичных
кривых при 37 0С. При более низкой температуре исходное гипертоническое
повреждение клеток, предварительно проинкубированных в среде,
содержащей 0,45 Моль/л NaCl, незначительно, что не дает возможности
оценить антигемолитический эффект амфифильных соединений. Можно
отметить лишь то, что прирост гемолиза клеток в этих условиях наступает
при достижении тех концентраций амфифилов (крив. 2), при которых
отмечено увеличение гемолиза и в контроле (крив. 1).
Для клеток, перенесенных из 0,7 Моль/л в 4,0 Моль/л NaCl в
гипотермических условиях, антигемолитическая активность не наблюдается
для неионного, катионного и длинноцепочечного цвиттерионного
соединений. В случае использования анионных амфифилов и
короткоцепочечного цвиттерионного соединения отмечено незначительное
(примерно 10 %) снижение гипертонического гемолиза эритроцитов, исходно
дегидратированных в растворе 0,7 Моль/л NaCl.
Таким образом, температура 0 0С практически не позволяет
исследуемым амфифилам проявить антигемолитическую активность в
условиях гипертонического стресса эритроцитов, исходно
проинкубированных в среде, содержащей 0,7 Моль/л NaCl.
В указанных выше экспериментальных условиях и предварительную
инкубацию, и собственно гипертонический лизис эритроцитов осуществляли
при одной и той же температуре - 37 0 или 0 0С.
Для того, чтобы оценить влияние температуры литической среды на
проявление антигемолитической активности амфифильных соединений при
перенесении эритроцитов из 0,7 Моль/л в 4,0 Моль/л NaCl, мы изменили
температурный режим эксперимента. Так, исходную инкубацию клеток в
растворе 0,7 Моль/л NaCl осуществляли при температуре 0 0С, затем
переносили эритроциты в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl и какое-либо
амфифильное вещество, при температуре 37 0С.
 58
На рис. 3.2.4 представлены кривые гемолиза эритроцитов,
перенесенных из раствора 0,7 Моль/л NaCl (0 0С) в раствор 4,0 Моль/л NaCl
(37 0С) в присутсвии амфифильных соединений. При выбранном
температурном режиме исходный уровень гемолиза дегидратированных
клеток составляет примерно 45 %. Как видно из представленных на рисунке
данных, все исследуемые соединения снижают уровень гипертонического
повреждения дегидратированных клеток. При использовании ХП и С10
величина повреждения эритроцитов в рассматриваемых условиях составляет
примерно 5 %, а при использовании Z16 - 20 %.
В табл. 3.2.2 представлены значения эффективных концентраций и
максимальной антигемолитической активности амфифильных соединений в
условиях гипертонического стресса (температура 37 0С) при использовании
предварительно проинкубированных в растворе 0,7 Моль/л NaCl эритроцитов
(температура 0 0С).

Таблица 3.2.2
Значения эффективных концентраций и максимальной
антигемолитической активности амфифильных соединений при перенесении
эритроцитов из 0,7 Моль/л NaCl (0 0С) в 4,0 Моль/л NaCl (37 0С).

Вещество Эффективная конц., мкМоль/л Макс.антигем. активность, %

Z16 5 ±1 52 ±5
ДМ 6 ±1 82 ±8
С12 24 ±5 65 ±6
С10 47 ±15 87 ±8
ХП 89 ±40 97 ±8

Рис 3.2.4
 59
Как видно из представленных данных, величины максимальной
антигемолитической активности исследуемых веществ довольно высокие и
находятся в диапазоне 52-96 %.
Таким образом, в одинаковых условиях исходной гипотермической
дегидратации клеток эффект амфифильных соединений определяется
температурой литической среды.
Представляло интерес проверить, зависит ли величина максимальной
антигемолитической активности амфифильных соединений от температуры
литической среды при использовании клеток, исходно инкубированных в
физиологическом растворе (температуре 0 0С).
На рис. 3.2.5 представлены значения максимальной
антигемолитической активности амфифильных соединений, используемых в
эффективных концентрациях, при перенесении эритроцитов из
0,15 Моль/л NaCl (0 0С) в 4,0 Моль/л NaCl при температуре 37 0С или 0 0С
(контроль).
Из представленных на рисунке данных видно, что при физиологической
температуре литической среды, в отличие от гипотермических условий,
антигемолитическая активность всех исследуемых амфифильных веществ
выше примерно на 20 - 30 %.
Таким образом, температура литической среды оказывает существенное
влияние на проявление антигемолитической активности исследуемых
амфифильных соединений в условиях гипертонического стресса
эритроцитов.
 60

100
антигемолитическая активность, %

80

60

40

20

0
1,7 6 3 6 6 27 10 61 20 130
Z16 ДМ С12 С10 ХП

концентрация, мкМоль/л

Рис. 3.2.5 Значение максимальной антигемолитической активности

амфифильных соединений при перенесении эритроцитов из раствора
0,15 Моль/л NaCl (температура 0 0С) в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl,
при температуре:
- 0 0С
- 37 0С
 61
3.3. Постгипертонический криогемолиз эритроцитов в присутствии
амфифильных веществ

Если в условиях гипертонического стресса эритроциты повреждаются в

результате действия гиперконцентрированного раствора соли, то в условиях
постгипертонического криогемолиза сдвиг температуры является фактором,
ответственным за гибель клеток. И в первом, и во втором случае повреждение
клеток связывают с формированием в их плазматических мембранах
макроскопических пор [4].
Амфифильные соединения оказывают модифицирующее действие на
структуру плазматической мембраны и, как показано выше, способны
протектировать клетки от гипертонического повреждения. Ранее было
показано, что катионный ХП повышает устойчивость эритроцитов к
охлаждению [34]. Следовательно, можно предположить, что амфифильные
соединения, относящиеся к различным классам, могли бы проявлять
антигемолитическую активность и в условиях постгипертонического
криогемолиза эритроцитов.
На рис. 3.3.1 представлены данные о влиянии амфифильных веществ на
гемолиз эритроцитов, охлажденных от 37 до 0 0С в растворе, содержащем
1,2 Моль/л NaCl. Как видно, анионные С10,С12 и катионный ХП проявляют
ярко выраженный протектирующий эффект на клетки при охлаждении, тогда
как цвиттерионные Z10, Z16 и неионный ДM не влияют на гемолиз
эритроцитов.
В табл. 3.3.1 представлены значения эффективных концентраций и
максимальной антигемолитической активности анионных и катионного
амфифилов. Так, уровень антигемолитической активности указанных
амфифилов составляет 43-74 %. Обращает на себя внимание тот факт, что как
и в случае гипертонического стресса эритроцитов, при постгипертоническом
криогемолизе эритроцитов наблюдается следующая закономерность: с
увеличением значений эффективных концентраций в ряду
 62
Рис 3.3.1
 63
веществ С12, С10, ХП растут и величины их антигемолитической
активности.
Следует отметить, что эффективные концентрации указанных
амфифильных соединений при постгипертоническом криогемолизе
эритроцитов имеют сходные значения с эффективными концентрациями,
полученными в условиях гипертонического стресса клеток при температуре
37 0С (см. табл. 3.1.1).

Таблица 3.3.1
Значения эффективных концентраций и максимальной
антигемолитической активности амфифильных соединений при охлаждении
эритроцитов от 37 0 до 0 0С в 1,2 Моль/л NaCl (постгипертонический
криогемолиз)

Вещество Эффективная конц., мкМоль/л Макс.антигем. активность, %

С12 25 ±5 43 ±3
С10 47 ±8 60 ±4
ХП 120 ±20 74 ±7

Тот факт, что в условиях постгипертонического криогемолиза

эритроцитов только заряженные амфифилы способны протектировать клетки
от повреждения, позволяет предположить, что заряд вещества определяет
проявление его антигемолитической активности в указанных условиях.
Следовательно, двухвалентные катионы могли бы защищать клетки от
повреждения при охлаждении. Двухвалентные катионы отличаются широким
спектром действия на мембраны [9]. В зависимости от концентрации они
могут оказывать множественное влияние на различные структурные
элементы клетки [9].
Ранее полученные данные о способности двухвалентных катионов, в
 64
частности ионов Са2+ и Zn2+, повышать устойчивость эритроцитов к
постгипертоническому лизису [29] и действию порообразующих агентов [42]
также позволяют предположить, что эти катионы могли бы оказывать
антигемолитическое действие на эритроциты в условиях
постгипертонического криогемолиза.
На рис. 3.3.2 представлены данные о влиянии двухвалентных катионов
(Са2+, Zn2+) на уровень гемолиза эритроцитов в условиях
постгипертонического криогемолиза. Видно, что ионы Zn2+ значительно
снижают гемолиз эритроцитов, тогда как ионы Са2+ не оказывают влияния на
клетки при охлаждении. Таким образом, наличие заряда не является
определяющим условием для проявления соединением антигемолитической
активности в условиях постгипертонического криогемолиза эритроцитов.

100 100

80 80
гемолиз, %

60
гемолиз,%

60

40 40

20 20

0 0
0 5 10 0 500 1000
Zn , мкМоль/л Ca, мкМоль/л

Рис. 3.3.2 Концентрационные зависимости уровня гемолиза

эритроцитов при охлаждении от 37 0 до 0 0С в среде, содержащей
1,2 Моль/л NaCl, в присутствии ионов Zn2+ и Са2+
 65
Выводы.

1. Амфифильные соединения, относящиеся к различным классам, повышают

устойчивость эритроцитов к гипертоническому стрессу (4,0 Моль/л NaCl).

2. Величины антигемолитической активности исследуемых веществ в

условиях гипертонического стресса эритроцитов зависят от температуры.
Так, при температуре 37 0С величины антигемолитической активности
амфифильных соединений выше, чем при температуре 0 0С.

3. Исследуемые вещества способны дополнительно снижать уровень

гемолиза эритроцитов, исходно проинкубированных в растворе
0,45 Моль/л NaCl и перенесенных в литическую среду (4,0 Моль/л NaCl) при
температуре 37 0С. При этом уровень гемолиза эритроцитов составляет
5-10 %.

4. Амфифильные соединения способны проявлять антигемолитическую

активность (50-80 %) в условиях гипертонического стресса эритроцитов,
исходно дегидратированных в среде, содержащей 0,7 Моль/л NaCl (37 0С).

5. Влияние исходной дегидратации эритроцитов на величину

антигемолитической активности амфифильных соединений в условиях
гипертонического стресса зависит от температуры. При физиологической
температуре наблюдается сходный уровень антигемолитической активности
амфифильных соединений для клеток, перенесенных в 4,0 Моль/л NaCl из
сред, содержащих 0,15 Моль/л; 0,45 Моль/л; 0,7 Моль/л NaCl. Однако, при
температуре 0 0С амфифильные вещества протектируют от гипертонического
повреждения эритроциты, перенесенные из физиологического раствора, но
не оказывают влияния на клетки, исходно дегидратированные в
0,7 Моль/л NaCl.

6. При одинаковых условиях исходной гипотермической дегидратации

эритроцитов эффект амфифильных соединений определяется
температурными условиями литической среды. Так, амфифильные
 66
соединения оказывают ярко выраженное антигемолитическое действие на
эритроциты, предварительно проинкубированные в 0,7 Моль/л растворе NaCl
(0 0С), а затем перенесенные в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl при 37 0C,
но не при 0 0С.

7. При варьировании условий проведения гипертонического стресса,

величины антигемолитической активности представителей различных
классов амфифильных соединений изменяются однонаправленно. Так,
изменение как температурных условий проведения гипертонического стресса
(37 или 0 0С), так и условий обработки клеток (инкубация в растворах 0,45
или 0,7 Моль/л NaCl), предшествующей гипертоническому лизису, приводят
либо к увеличению антигемолитической активности всех веществ, либо к
снижению этих величин тоже для всех исследуемых соединений.

8. Различия в действии амфифильных соединений на клетки проявляются в

условиях постгипертонического криогемолиза. Так, катионные (ХП) и
анионные (С10, С12) амфифилы протектируют эритроциты от повреждения
при охлаждении, тогда как цвиттерионные (Z10, Z16) и неионные (ДМ)
исследуемые вещества не обладают такой способностью.

По материалам главы 3 опубликованы работы:

Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Действие двухвалентных катионов на

чувствительность эритроцитов к гиперосмотическому стрессу и холодовому
шоку// Пробл. криобиологии. - 1998. - №1.- С.30-35.
Орлова Н.В. Действие двухвалентных катионов и гемина на
чувствительность эритроцитов к гиперосмотическому стрессу// Пробл.
криобиологии.- 1999.-№2.- С.17-21.
 67
Шпакова Н.М., Панталер Е.Р., Орлова Н.В. Влияние додецил-β,D-
мальтозида на устойчивость предварительно дегидратированных эритроцитов
к гиперосмотическому и холодовому шоку// Пробл. криобиологии.- 1999.-
№3.-С.10-16.
Shpakova N.M.,Koba L.V., Bondarenko V.A., Kozlov A.S., Orlova N.V.,
Pantaler E.R. Amphiphilic substances increase the stability of erytrocytes to the
action of cold and hyperosmotic stress//34-th Annual Meeting of Society for
Cryobiology - Barselona, Spain, 1997.- P.160.
Шпакова Н.М., Панталер О.Р., Орлова Н.В. Ефекти катіонних і
неіонних амфіфільних сполук при холодовому та гіперосмотичному стресі
ерітроцитів// Тез.доп. II-ого з'їзду Українського біофізичного товариства.-
Харків, 1998.- С.198.
Орлова Н.В. Вплив двовалентних катіонів на стійкість ерітроцитів до
гіпертонічного та холодового стресу// Тез.доп.з'їзду Сучасні проблеми
гематології та транфузіології.- Київ, 1998.- С.58.
 68
ГЛАВА 4
ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДИАМИДОМ
ЭРИТРОЦИТОВ К ГИПЕРТОНИЧЕСКОМУ СТРЕССУ

Авторы работ [7, 36] полагают, что чувствительность эритроцитов к

гипертоническому стрессу и постгипертоническому криогемолизу
определяется состоянием цитоскелет - мембранного комплекса. Это
предположение основано на том, что обработка эритроцитов гемином,
изменяющим взаимодействие между цитоскелетом и мембраной,
существенно повышает устойчивость эритроцитов к гипертоническому
стрессу [28], а применение мембранного модификатора диамида снижает
уровень повреждения эритроцитов в условиях постгипертонического
криогемолиза [36].
Обработка клеток диамидом приводит к формированию межбелковых и
внутрибелковых дисульфидных мостиков в мембране [74]. Считают, что
действие диамида затрагивает, в основном, спектрин - актиновую систему.
Представляло интерес изучить влияние диамида на динамическую структуру
эритроцитарной мембраны.
В табл. 4.1 представлены значения параметров, характеризующих
микровязкость мембраны эритроцитов, обработанных диамидом в
концентрации 10 мМоль/л.
Таблица 4.1
Значения параметров вращательной подвижности зондов АПК, 16-ДС, 5-ДС в
мембране эритроцитов, обработанных диамидом.
n=6
Диамид, АПК, 5-ДС, 16-ДС,
мМоль/л 
+ 10 , с
-8 -1 +
H 10 , Тл
-4
+  10-8, с-1
0 (Контроль) 5,410 0,056 26,0 0,3 1,54 0,03
10 4,030 0,061 26,80,4 1,320,05
Примечание. Значения параметров вращательной подвижности зондов
по сравнению с контролем статистически отличаются при р < 0,05.
 69
Как видно из представленных данных, модификация клеток диамидом
оказывает влияние на вращательную подвижность всех зондов,
расположенных в трансмембранном направлении. Наблюдается значительное
увеличение микровязкости полярной области мембраны. Затормаживание
вращательной подвижности нитроксильного радикала зонда 16-ДС
свидетельствует о том, что изменение свойств мембраны под действием
диамида затрагивает и гидрофобную область.
Таким образом, выявленное возрастание микровязкости липидов после
обработки клеток диамидом говорит о том, что влияние сульфгидрильного
реагента не ограничивается локальными изменениями белковых компонентов
мембраны, а распространяется на состояние как водно-липидной
поверхности, так и гидрофобной области мембраны.
В таблице 4.2 представлены данные о влиянии диамида на уровень
гемолиза эритроцитов в среде, содержащей 4,0 Моль/л NaCl. Видно, что
обработка клеток диамидом в концентрации 5 и 10 мМоль/л практически не
изменяет чувствительность эритроцитов к гипертоническому стрессу.

Таблица 4.2
Влияние диамида на уровень гемолиза эритроцитов в растворе,
содержащем 4,0 Моль/л NaCl, при температуре 37 0С и 0 0С
n=6
Гемолиз, %
Диамид, мМоль/л 37 С 0
0 0С
0 (Контроль) 79 ±6 80 ±8
5 80 ±8 84 ±7
10 89 ±7 94 ±9
Примечание. Величины гемолиза эритроцитов по сравнению с
контролем статистически не отличаются при р < 0,05.

Таким образом, в отличие от постгипертонического криогемолиза, при

 70
котором модификация клеток диамидом приводит к повышению
устойчивости эритроцитов к охлаждению [33], в условиях гипертонического
стресса модифицированные клетки повреждаются на уровне
контроля (см. табл. 4.2).
В то же время диамид увеличивает микровязкость мембраны.
Интересно было изучить, как модификация мембраны диамидом отразится на
проявлении антигемолитической активности различных амфифильных
соединений в условиях гипертонического стресса эритроцитов.
На рис. 4.1 и 4.2 представлены значения максимальной
антигемолитической активности амфифильных соединений в условиях
гипертонического стресса как контрольных, так и обработанных диамидом
клеток (температура 37 0С и 0 0С, соответственно).

100

90

80

70
Антигемолитическая

60
активность, %

50

40

30

20

10

0
Z16, 6 мкМоль/л ДМ, 6 мк Моль/л C12, 20 мк Моль/л ХП, 120 мк Моль/л

Рис. 4.1 Влияние диамида на проявление антигемолитической активности

амфифильных веществ в условиях гипертонического стресса (4,0 Моль/л NaCl)
эритроцитов (температура 37 0С)

- контроль; - диамид, 5 мМоль/л; - диамид, 10 мМоль/л

Видно, что амфифильные соединения протектируют от повреждения в

 71
среде, содержащей 4,0 Моль/л NaCl, и эритроциты, модифицированные
диамидом. Однако, модификация эритроцитов диамидом приводит к
некоторому снижению значений антигемолитической активности
амфифильных соединений по сравнению с контрольными.
Если при использовании диамида в концентрации 5 мМоль/л это
отмечено в виде тенденции, то при увеличении концентрации диамида до
10 мМоль/л снижение антигемолитической активности веществ более
выражено и составляет для катионного ХП и анионного С12 - 20-30 %, а для
цвиттерионного Z16 и анионного ДМ - 10-15 %.
Следует отметить, что модификация клеток диамидом приводит к более
существенному снижению защитного эффекта тех амфифильных веществ,
которые характеризуются исходной более высокой антигемолитической
активностью в условиях гипертонического стресса эритроцитов. Указанный
эффект не зависит от температуры. Так, при температуре 0 0С (см. рис. 4.2)
снижение антигемолитической активности заряженных веществ (ХП и С12)
составляет 20-25 %, а для неионного ДМ - всего 7 %.
Цвиттерионное соединение Z16 мы не использовали в рассматриваемых
экспериментальных условиях, т.к. антигемолитическая активность Z16 при
гипертоническом стрессе эритроцитов в гипотермических условиях (0 0С)
практически не выявлена.
Данные, представленные в этой главе, позволяют предположить, что
падение антигемолитической активности исследуемых амфифильных
соединений при гипертоническом гемолизе эритроцитов, модифицированных
диамидом, может быть связано с увеличением микровязкости мембраны под
действием модификатора.
 72
100
Антигемолитическая активность, %

80

60

40

20

0
ДМ, 3 мкМоль/л C12, 6 мкМоль/л ХП, 20 мкМоль/л

Рис 4.2 Влияние диамида на проявление антигемолитической активности

амфифильных веществ в условиях гипертонического (4,0 Моль/л NaCl)
стресса эритроцитов (температура 0 0С)

- контроль; - диамид, 5 мМоль/л; - диамид, 10 мМоль/л;

Выводы.

1. Все исследуемые амфифильные вещества проявляют антигемолитическую

активность при перенесении эритроцитов, модифицированных диамидом, в
среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl.

2. Обработка эритроцитов диамидом не изменяет их чувствительность к

гипертоническому стрессу.

3. Обработка эритроцитов диамидом сопровождается увеличением

микровязкости мембраны и снижением антигемолитической активности
амфифильных веществ в условиях гипертонического стресса.
 73
ГЛАВА 5
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И БАРЬЕРНЫЕ СВОЙСТВА
ЭРИТРОЦИТОВ В ПРИСУТСТВИИ АМФИФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

Согласно гипотезе "сопряженного бислоя" [146, 147] и данным,

представленным в работе [81], трансформация эритроцитов под влиянием
амфифильных соединений может служить показателем встраивания вещества
в какой-либо монослой мембраны. При встраивании вещества в один из
монослоев мембраны происходит изменение площади этого монослоя по
отношению к другому, и в результате сопряжения монослоев, изменяется
форма клетки.
Так, изменение формы эритроцита по типу дискоцит → эхиноцит
свидетельствует о встраивании амфифильного вещества во внешний
монослой мембраны. При этом происходит расширение внешнего монослоя
относительно внутреннего. Напротив, изменение формы клетки по типу
дискоцит → стоматоцит характерно для преимущественной локализации
вещества во внутреннем монослое мембраны, что приводит к расширению
внутреннего монослоя относительно внешнего.
Мы изучили изменение формы эритроцитов под влиянием исследуемых
амфифильных соединений. Для морфологических исследований
использовали концентрации амфифилов, соответствующие
антигемолитическим концентрациям данных веществ в условиях
гипертонического стресса эритроцитов.
На рис. 5.1 представлены контрольные эритроциты, отмытые в
физиологическом растворе. Видно, что большинство клеток имеют слабо
выраженную эхиноцитарную форму. Кренированные эритроциты
представлены, главным образом, эхиноцитами I и II по классификации
Bessis [45]. Так как отмеченный эхиноцитоз отмытых клеток наблюдался и в
том случае, когда в работе использовали силиконизированные предметные и
покровные стекла, мы полагаем, что он не обусловлен "эффектом стекла".
 74
Рис 5.1
 75
Кренирование клеток, по-видимому, является результатом удаления
белков плазмы при отмывании эритроцитов.
Морфологический ответ эритроцитов на введение в физиологический
раствор различных амфифильных соединений представлен
микрофотографиями рис. 5.2. Видно, что в присутствии катионного ХП
подавляющее число эритроцитов в образце представлено стоматоцитами и
сферостоматоцитами. Иная картина наблюдается при использовании С12,
ДМ, Z16, которые являются анионным, неионным и цвиттерионным
веществами, соответственно. Реакция клеток на введение в среду данных
соединений сопровождается образованием сфероэхиноцитов.
Следует отметить, что при обработке эритроцитов цвиттерионным
соединением Z16 на микрофотографиях видно большое количество
сфероцитов. Это свидетельствует о том, что Z16 обладает более сильной
трансформирующей активностью по сравнению с другими исследуемыми
веществами.
Наблюдаемые морфологические особенности эритроцитов в
присутствии амфифильных соединений не зависят от времени инкубации
клеток (до 30 мин).
Так как вышеописанные результаты были получены на исходно
кренированных клетках, мы провели морфологический анализ эритроцитов,
находящихся в плазме. На рис. 5.1 видно, что эритроциты цельной крови
имеют дискоцитарную форму. В поле зрения хорошо видны монетные
столбики эритроцитов.
На микрофотографиях рис. 5.3 представлены эритроциты в плазме
крови в присутствии амфифильных соединений.
Видно, что в этом случае трансформация клеток наблюдается только
при использовании ХП и Z16. Катионный ХП вызывает появление в плазме
стоматоцитов, в то время как цвиттерионный Z16 - сфероэхиноцитов. В
случае добавления как С10, так и ДМ, существенных морфологических
изменений эритроцитов не выявлено. В образце отмечено незначительное

3 4
 76
Рис.5.2
77
 78
увеличение количества эхиноцитарных клеток по сравнению с контролем.
Трансформация клеток обусловлена встраиванием веществ в мембрану.
Так как в присутствии С10 и ДМ эритроциты, находящиеся в плазме,
оставались дискоцитами, можно предположить, что молекулы этих
соединений не достигали мембраны. Это может быть связано с тем, что
свободные белки плазмы сорбируют молекулы неионных и анионных
соединений, либо встраиванию в мембрану данных веществ препятствует
белковый слой, покрывающий эритроцит. Таким образом, ответ эритроцитов
на введение амфифильных соединений определяется средой, в которой
находятся клетки.
Характер морфологических изменений эритроцитов свидетельствует о
том, что исследуемые вещества, обладающие антигемолитической
активностью в условиях гипертонического стресса эритроцитов, могут
распределяться как во внешнем (С10, Z16, ДМ), так и во внутреннем
монослое мембраны (ХП). Так как для стоматоцитогенного ХП и
эхиноцитогенного С10 обнаружены сходные значения (разница 10 %)
максимальной антигемолитической активности в условиях гипертонического
стресса при 37 0С (см. табл. 3.1.1), можно сделать вывод, что характер
распределения амфифилов в мембране не влияет на величину их
антигемолитической активности. По-видимому, для инициации процессов в
мембране, ответственных за проявление антигемолитической активности
веществ, достаточно встраивания амфифильных молекул во внешний
монослой липидного бислоя.
Элемент сферолизации, присутствующий в трансформации
эритроцитов, обычно ассоциируется с изменениями в клеточном объеме и
барьерных свойствах плазматических мембран. Мы исследовали барьерные
свойства плазматических мембран эритроцитов по выходу ионов калия из
клеток в присутствии амфифильных веществ. Амфифилы были использованы
в концентрациях, соответствующих их эффективным концентрациям в
условиях гипертонического стресса эритроцитов при
 79
температуре 37 0С (см. табл. 3.1.1).
В таблице 5.1 представлены данные о содержании калия в супернатанте
после инкубации эритроцитов с амфифильными веществами в
физиологическом растворе и в среде, содержащей 4,0 Моль/л NaCl. Как видно
из представленных данных, исследуемые амфифильные вещества в
эффективных концентрациях существенно не влияют на выход ионов калия
из клеток как в физиологическом растворе, так и в среде, содержащей
4,0 Моль/л NaCl, т.е. барьерные свойства мембран для ионов калия остаются
на уровне контроля.

Таблица 5.1

Содержание калия в супернатанте, после инкубирования эритроцитов в

различных средах в присутствии амфифильных веществ.

n=6
Вещество Конц., Содержание калия, мг/л в средах
мкМоль/л 0,15 Моль/л N 4,0 Моль/л Na Дист. вода с 0,1 %
aCl Cl Тритон Х-100*
Контроль 0 0,24 0,03 10,97 1,06
Z16 6 0,27 0,04 10,99 0,93
ДМ 6 0,21 0,02 11,12 1,11
11,971,20
С12 20 0,20 0,02 10,73 0,91
С10 40 0,22 0,02 10,52 0,89
ХП 120 0,25 0,03 11,05 1,10
Примечания:
1. Для всех веществ содержание калия в супернатанте по сравнению с
контролем статистически не отличается при р < 0,05.
2. * - гемолиз эритроцитов в указанной среде в экспериментах по
гипертоническому стрессу был принят за 100 %.
 80
Выводы.

1. Направленность трансформирующей способности веществ

(дискоцит → эхиноцит или дискоцит → стоматоцит) не является
определяющей в проявлении их антигемолитической активности при
гипертоническом гемолизе эритроцитов.

2. Введение эритроцитов в литическую среду, содержащую амфифильное

вещество, предотвращает выход из клеток молекул гемоглобина, но
нарушение барьерной функции мембраны для катионов калия сохраняется на
уровне контроля.

По материалам главы 5 опубликована работа:

Кулешова Л.Г., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Антигемолитическая и

трансформирующая активность амфифильных соединений// Пробл.
криобиологии.-2001.- №1.- С.915.
 81
ГЛАВА 6
ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ДИНАМИЧЕСКУЮ
СТРУКТУРУ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ

Проявление амфифильными веществами антигемолитического действия

на клетки в стрессовых условиях происходит в результате взаимодействия
данных соединений с плазматическими мембранами. Выяснение природы
изменений структурно - динамических характеристик мембран в присутствии
амфифильных соединений могло бы способствовать развитию представлений
о механизме антигемолитической активности исследуемых веществ.
Динамическую структуру эритроцитарной мембраны, обработанной
амфифильными веществами, исследовали методом ЭПР спиновых зондов.
Концентрация амфифильного вещества выбрана такой, что при пересчёте
количества молекул вещества на одну клетку, она соответствует
антигемолитической концентрации в условиях гипертонического стресса
эритроцитов (табл. 6.1).
Таблица 6.1
Количество молекул амфифильных веществ, приходящееся на 1 клетку, в экспериментах по
исследованию динамической структуры мембраны методом ЭПР и при гипертоническом стрессе
эритроцитов.

Количество молекул вещества

Концентрация, мкМоль/л
Вещество приходящееся на 1 клетку
ЭПР Гипер. стресс ЭПР Гипер. стресс
Z16 20 6 6  10 7 9  10 7
ДМ 50 9 15  10 7 14  10 7
С12 70 14 21 10 7 21 10 7
С10 100 24 30  10 7 36  107
ХП 180 20 54  10 7 30  10 7

В работе были использованы зонды: амид пальмитиновой кислоты

(АПК), 5-доксилстеариновая кислота (5-ДС), 16-доксилстеариновая кислота
(16-ДС). Эти зонды позволяют исследовать динамическую структуру
мембраны в трансмембранном направлении: АПК - в полярной области
 82
мембраны, 5-ДС и 16-ДС - в гидрофобной области на различной глубине.
Подробная характеристика зондов представлена в главе 2.
В табл. 6.2 представлены значения частоты вращательной подвижности
нитроксильного радикала зонда АПК в мембране эритроцитов, обработанных
амфифильными веществами. Как видно из представленных данных, почти
все исследуемые амфифильные соединения (исключением является Z16)
значительно уменьшают частоту вращательной подвижности спинового зонда
АПК. Это свидетельствует о некоторой иммобилизации мембранных липидов
(увеличении микровязкости) вблизи их полярных головок под влиянием
амфифильных веществ.
Как видно, неионный ДМ по сравнению с другими исследуемыми
соединениями максимально увеличивает микровязкость липидов в полярной
области мембраны. Катионный ХП слабее иммобилизирует поверхность
клетки, чем ДМ, но сильнее, чем анионные амфифилы С10 и С12. В случае
цвиттерионного соединения Z16 не наблюдается значительного изменения
микровязкости липидов в полярной области мембраны.
Таблица 6.2
Значение частоты вращательной подвижности зонда АПК в мембране
эритроцитов, обработанных амфифильными веществами
n=6
8 -1
Вещество Конц., мкМоль/л ν   10 , с
Контроль 0 8,050  0,052
Z16 20 8,120  0,064*
ДМ 50 5,660  0,059
С12 70 6,760  0,069
С10 100 6,760  0,058
ХП 180 6,020  0,054
Примечание. * - Значение частоты вращательной подвижности зонда по
сравнению с контролем статистически не отличается при р < 0,05.
Данные, по которым можно судить о влиянии амфифильных веществ на
изменение динамического состояния мембраны в микроокружении зонда
5-ДС, представлены в табл. 6.3.
 83
Увеличение значения параметра ΔН+ (Тл) соответствует снижению
частоты вращения нитроксильного радикала зонда, в частности, 5-ДС.
Увеличение значения ΔН+ (Тл), по сравнению с контрольной величиной,
наблюдается только для клеток, проинкубированных с неионным (ДМ) и
цвиттерионным (Z16) амфифилами. Это свидетельствует об увеличении
микровязкости липидов в гидрофобной области мембраны на расстоянии
примерно 5 углеродных атомов вглубь бислоя.
Величины частоты вращательной подвижности нитроксильного
радикала зонда 16-ДС, характеризующие динамическое состояние
гидрофобной области мембраны на расстоянии примерно 16 углеродных
атомов вглубь бислоя, представлены в табл. 6.4.

Таблица 6.3
Значение параметра H+ (Тл) вращательной подвижности зонда 5-ДС в
мембране эритроцитов, обработанных амфифильными веществами
n=6
Конц.,
Вещество H+  10-4, Тл
мкМоль/л
Контроль 0 25,9 0,3
Z16 20 29,0 0,5
ДМ 50 27,0 0,4
С12 70 25,5 0,5*
С10 100 25,8 0,3*
ХП 180 25,90,3*
Примечание. * - Значения параметра вращательной подвижности зонда
по сравнению с контролем статистически не отличаются при р < 0,05.

Таблица 6.4
Значение частоты вращательной подвижности зонда 16-ДС в мембране
эритроцитов, обработанных амфифильными веществами
 84
n=6
Вещество Конц., мкМоль/л +  10 , с -8 -1

Контроль 0 5,211 0,060

Z16 20 5,276 0,051*
ДМ 50 4,179 0,053
С12 70 4,524 0,069
С10 100 4,271 0,082
ХП 180 5,283 0,074*
Примечание. * - Значения частоты вращательной подвижности зонда по
сравнению с контролем статистически не отличаются при р < 0,05.

Видно, что значения частоты вращения спинового зонда в мембранах

эритроцитов, обработанных неионным ДМ и, в меньшей степени, анионными
соединениями С10 и С12, снижаются. Катионный ХП и цвиттерионный Z16
практически не влияют на микровязкость липидов в микроокружении
зонда 16-ДС.
Таким образом, неионный ДМ обладает способностью
иммобилизировать липиды в трансмембранном направлении: в полярной
зоне и гидрофобной области мембраны на различной глубине. Анионные
вещества С10 и С12 увеличивают микровязкость мембранных липидов в
области полярных головок и гидрофобной зоне мембраны в микроокружении
зонда 16-ДС. Катионный ХП характеризуется влиянием на микровязкость
липидов только в полярной области мембраны, а цвиттерионный Z16 - лишь
в микроокружении зонда 5-ДС.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что исследуемые
вещества изменяют нативную структуру мембраны, увеличивая
микровязкость липидной матрицы. Это свойство присуще всем исследуемым
соединениям, хотя они имеют разнородную химическую структуру и
относятся к различным классам амфифильных веществ. Вероятно,
однонаправленное влияние катионных, анионных, неионных и
цвиттерионных амфифилов на структурно-динамическое состояние
мембраны лежит в основе их неспецифического действия на клетки в
 85
условиях гипертонического стресса.
С другой стороны, индивидуальное строение молекулы исследуемых
соединений (соотношение между размером гидрофильной и гидрофобной
частей молекулы, заряд), по-видимому, определяет области в мембране, где
наиболее проявляется действие конкретного вещества. Последнее может быть
связано с различиями в величинах антигемолитической активности
амфифильных соединений в условиях гипертонического стресса эритроцитов
и с различным проявлением действия амфифилов на клетки в условиях
постгипертонического криогемолиза.
Так, неионный ДМ и цвиттерионный Z16, в отличие от заряженных
соединений (С10, С12, ХП), характеризуются меньшими значениями
антигемолитической активности в условиях гипертонического стресса
эритроцитов и не способны защищать клетки в условиях
постгипертонического криогемолиза. При этом ДМ и Z16 отличаются от
других исследуемых веществ способностью влиять на микровязкость
мембраны в гидрофобной области на расстоянии примерно 5 углеродных
атомов вглубь бислоя.
Выводы.
1. Все исследуемые амфифильные соединения увеличивают микровязкость
мембраны, но трансмембранная локализация указанного эффекта отличается
для различных веществ. Так, неионные и цвиттерионные амфифилы
отличаются от катионных и анионных соединений своей способностью
увеличивать микровязкость мембраны в микроокружении зонда 5-ДС. При
этом неионный ДМ оказывает влияние на все исследуемые зоны мембраны.
Анионные вещества С10 и С12 увеличивают микровязкость мембраны в
полярной и гидрофобной области в микроокружении зонда 16-ДС, а
катионный ХП - только в полярной зоне мембраны.
По материалам главы 6 опубликована работа:
 86
Орлова Н.В., Цымбал Л.В., Шпакова Н.М. Действие хлорпромазина на
структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов// Биол.
вестник.-1999.- 3, №12.- С.71-75.
 87
ГЛАВА 7
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Действие высоких концентраций солей на клетки проявляется в

возникновении осмотического градиента между вне- и внутриклеточными
средами, что приводит к обезвоживанию клеток. Плазматическая мембрана
при этом деформируется (изгибается). Так, в области участков с
положительной кривизной происходит растяжение внешнего монослоя и
сжатие внутреннего, а в области участков с отрицательной кривизной -
сжатие внешнего и растяжение внутреннего монослоев [10].
При небольших гипертонических воздействиях (0,4-0,5 Моль/л NaCl)
частичное обезвоживание эритроцитов может играть положительную роль,
повышая устойчивость клеток к последующему замораживанию [25]. С
увеличением концентрации NaCl в среде, осмотическая деформация клетки
нарастает до тех пор, пока осмотическое давление не достигнет величины,
при которой нарушаются барьерные свойства мембраны для ионов (в
частности, происходит утечка из клетки ионов калия). Для эритроцитов
утечка ионов калия наблюдается, когда концентрация внеклеточного раствора
NaCl достигает 0,7 Моль/л и выше [25]. Нарушение барьерной функции
плазматической мембраны для катионов не сопровождается гемолизом
эритроцитов и является обратимым процессом, если клетка экспонируется в
среде с тоничностью ниже критической величины [73]. Если величина
тоничности среды превышает критическое значение, то дальнейшее
нарушение барьерной функции мембраны проявляется в утечке из клетки
средних и крупных молекул через мембранные макроскопические поры, в
результате чего клетка лизирует.
Молекулярный механизм возникновения мембранных
макроскопических пор при гипертоническом воздействии на клетку еще во
многом не ясен. Существует мнение [16], что изменение проницаемости
мембраны связано с уменьшением толщины углеводородной области бислоя.
 88
Это предположение возникло при изучении липидных бислоев. Так, при
уменьшении общей толщины углеводородной области до 15-17 Ǻ
происходило резкое возрастание проницаемости бислоя. Небольшой по
толщине бислой дилауроиллецитина не являлся эффективным барьером для
ионов, а еще более короткоцепочечный лецитин вообще не способен был
образовывать устойчивых бислоев [16].
Процесс "эволюции" мембранной поры также не ясен. Полагают, что
пора имеет динамическую структуру, т.е. под действием факторов изменяется
динамическая структура мембраны и, следовательно, размер поры [104].
Показано, что пора в тенях эритроцитов, полученная осмотическим
гемолизом, способна увеличиваться или уменьшаться в зависимости от
экспериментальных условий (осмотических условий, температуры,
химических соединений).
Исследуемые в данной работе химические соединения имеют ряд
общих свойств: амфифильность структуры, хорошая растворимость в воде,
поверхностная активность. Все исследуемые амфифильные вещества в
высоких концентрациях способны образовывать мицеллы и проявлять
детергентные свойства.
Исследуемые вещества относятся к различным классам амфифильных
соединений и значительно отличаются по своей химической структуре.
Децилсульфат натрия (С10) и додецилсульфат натрия (С12) диссоциируют в
воде с образованием длинноцепочечных анионов. Амфифильность данных
анионных соединений обусловлена наличием в их молекулах гидрофобной
части - предельной алифатической цепи (10 и 12 углеродных атомов,
соответственно) и гидрофильной части - сульфатной группы, несущей
отрицательный заряд.
Хлорпромазин (ХП) представляет собой положительно заряженное
производное фенотиазина. Гидрофильной является нециклическая структура
с положительным зарядом у атома азота, а гетероциклическая структура
представляет собой гидрофобную часть молекулы хлорпромазина.
 89
Гидрофильная часть молекулы додецил-β,D-мальтозида (ДМ)
представлена соединенными эфирной связью остатками молекул глюкозы, а
гидрофобная - предельной алифатической цепью с 12 атомами углерода. ДМ
не диссоциирует в воде, его растворимость обусловлена наличием в молекуле
гидроксильных групп.
Гидрофильная часть 3-(децилдиметиламмоний)-1-пропансульфоната
натрия (Z10) и 3-(цетилдиметиламмоний)-1-пропансульфоната натрия (Z16)
содержит катионную группу (аммониевую) и анионную группу
(сульфонатную). Гидрофобная часть Z10 и Z16 представлена алифатической
цепью с 10 и 16 углеродными атомами, соответственно. В зависимости от
значения рН данные вещества могут существовать в виде нейтральных
соединений (изоэлектрическая точка), а также проявлять свойства
катионактивных или анионактивных цвиттерионов.
Из перечисленных веществ наиболее изучено влияние на
эритроцитарную мембрану хлорпромазина [103, 104, 151]. Показано, что ХП
протектирует эритроциты от повреждения при различных стрессовых
воздействиях: при осмотических стрессах (гипотоническом [77],
гипертоническом [37], постгипертоническом [23]), холодовом шоке [37], а
также лизисе клеток, вызванном действием порообразующих агентов [140].
Так как эффекты ХП являются концентрационно-зависимыми, довольно
сложно привлекать данные, полученные другими исследователями при
различающихся экспериментальных условиях, для объяснения
антигемолитической активности вещества. Так, в работе [37] показано, что
ХП в концентрации 66 мкМоль/л протектирует эритроциты от повреждения в
среде, содержащей 4,0 Моль/л NaCl, и протектирующий эффект ХП в этой
концентрации не проявляется при использовании исходной инкубации клеток
в растворе 0,7 Моль/л NaCl при температуре 37 0С.
В нашей работе изучение концентрационной зависимости
гипертонического гемолиза эритроцитов в присутствии хлорпромазина
(эффективная концентрация 120 мкМоль/л) позволило обнаружить
 90
антигемолитическое действие данного вещества на клетки, перенесенные в
среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl после предварительной инкубации
эритроцитов в растворе 0,7 Моль/л NaCl при температуре 37 0С.
Молекулярный механизм антигемолитического действия ХП в условиях
гипертонического стресса не ясен. Действие этого соединения может носить
комплексный характер, вызывая изменение структурного состояния как
липидных, так и белковых компонентов мембраны [112, 151], модифицируя
белок - липидные взаимодействия [124]. Считают, что ХП может оказывать
антигемолитическое действие на клетки непосредственно, влияя на процесс
замыкания мембранных пор, или опосредованно, изменяя взаимодействие
цитоскелета с мембраной [37].
Существует предположение, что антигемолитический эффект ХП может
быть обусловлен его способностью распределяться на внутренней
поверхности мембраны, пространственно разделяя мембранные липиды и
белки цитоскелета, тем самым, уменьшая возможность стабилизации
мембранных макроскопических пор цитоскелетными белками [36]. Считают,
что, находясь на внутренней поверхности мембраны, ХП взаимодействует с
кальмодулином, и, что ингибирование кальмодулина, также может лежать в
основе антигемолитического действия ХП [44].
Данные, полученные в нашей работе, о влиянии катионнных, анионных,
неионных, цвиттерионных амфифильных веществ на чувствительность
эритроцитов к гипертоническому стрессу свидетельствуют о том, что
механизм антигемолитического действия данных веществ на эритроциты в
условиях гипертонического стресса носит неспецифический характер. Этот
вывод подтверждается следующими примерами, иллюстрирующими тот
факт, что величины антигемолитической активности представителей всех
классов амфифильных соединений, изменяются однонаправленно при
изменении как температурных условий проведения гипертонического
стресса, так и условий исходной инкубации клеток, предшествующей
гипертоническому лизису, а именно:
 91
- величины антигемолитической активности и значения эффективных
концентраций всех исследуемых амфифильных соединений в условиях
гипертонического стресса эритроцитов больше при температуре 37 0С, чем
при 0 0С;
- для всех веществ уровень антигемолитической активности в условиях
гипертонического стресса эритроцитов ниже в случае использования исходно
дегидратированных в растворе 0,7 Моль/л NaCl клеток по сравнению с
контрольными при температуре 37 0С;
- все амфифилы не оказывают протектирующего действия на клетки,
предварительно проинкубированные в растворе 0,7 Моль/л NaCl и
перенесенные в раствор 4,0 Моль/л NaCl при температуре 0 0С;
- при изменении температурных условий проведения гипертонического
стресса (исходная инкубация клеток в 0,7 Моль/л NaCl при температуре 0 0С,
гипертонический лизис при температуре 37 0С) все исследуемые вещества
проявляли ярко выраженное антигемолитическое действие на клетки.
- обработка эритроцитов диамидом снижает антигемолитическую
активность всех амфифильных соединений в условиях гипертонического
стресса как при температуре 37 0С, так и при 0 0С.
О неспецифическом влиянии исследуемых амфифилов на
эритроцитарную мембрану свидетельствуют также следующие данные,
полученные в нашей работе. Вещества, относящиеся к различным классам
амфифильных соединений, в эффективных концентрациях увеличивают
мембранную микровязкость и не влияют на барьерные свойства мембраны по
выходу катионов калия из клетки.
Используя собственные результаты и литературные данные,
рассмотрим, какие процессы в мембране могут лежать в основе
антигемолитического действия амфифильных соединений.
Амфифильные вещества способны встраиваться в модельные и
клеточные мембраны [46, 67, 84, 89, 110, 111, 113, 122, 135, 144, 160, 164].
При этом гидрофильная часть молекулы локализуется в гидрофильно -
 92
гидрофобной зоне мембраны, а гидрофобная часть амфифильной молекулы -
в гидрокарбоновой области бислоя. Например, амфифильные молекулы ХП,
состоящие из гидрофобной циклической структуры и короткой цепи с
протонированной аминогруппой, встраиваются катионной аминогруппой в
полярную область, а циклической структурой в неполярную область
мембраны [96]. Считают, что гидрофобная часть молекулы ответственна за
встраивание амфифильных соединений в клеточную мембрану [148].
Действительно, механизм встраивания амфифильных веществ в
мембрану можно объяснить появлением гидрофобных взаимодействий между
неполярными участками амфифильных молекул и гидрофобной областью
мембраны [15]. Гидрофобные взаимодействия возникают в водных растворах
в результате взаимодействия полярных молекул воды с неполярными
гидрофобными частицами или неполярными радикалами амфифильных
молекул. Энергия водородной связи между молекулами воды больше энергии
взаимодействия молекул воды с неполярными частицами. Энергия
водородной связи и увеличение числа этих связей (при растворении
неполярных частиц в воде) предопределяет притяжение гидрофобных частиц.
Возникновение гидрофобных взаимодействий можно также
рассмотреть с точки зрения термодинамики [15]. Процесс растворения в воде
неполярных или амфифильных веществ приводит к снижению энтропии
системы (водного раствора вещества). Снижение энтропии происходит за
счет изменения свойств воды в результате вкрапления в нее неполярных
частиц и формирования более упорядоченной по сравнению с чистой водой
структуры. Реакцией системы на понижение энтропии будет такая
перестройка, которая приведет к максимально возможному повышению
энтропии. В свою очередь повышение энтропии обусловливает уменьшение
числа контактов между неполярными радикалами амфифильных молекул и
молекулами воды, что достигается путем самопроизвольного выталкивания
амфифильных молекул из объема на поверхность мембраны и адсорбции.
Таким образом, гидрофобные взаимодействия определяют адсорбцию
 93
амфифильных молекул на границе раздела фаз (гидрофильно - гидрофобной
зоне мембраны). Или другими словами, самопроизвольный процесс
адсорбции обусловлен присутствием неполярного гидрофобного радикала в
молекулах амфифильных соединений.
Вопрос о местах встраивания различных амфифильных молекул в
плоскости мембраны не ясен. Насколько эти места специфичны для каждого
вещества? Гидрофобные участки в мембране могут быть представлены
неполярными границами между липидными, а также между липидными и
белковыми молекулами.
Нативная мембрана имеет динамическую структуру, т.е. постоянно
происходит изменение взаимного расположения мембранных компонентов -
молекул и молекулярных комплексов. При этом мембрана характеризуется
планарной неоднородностью, и граничные области между молекулярными
комплексами являются как бы динамическими дефектами, существующими
очень короткий промежуток времени. В работе [53] предположили, что
"локальные дефекты" структуры мембраны могут служить местом
встраивания амфифильных молекул.
Между двумя монослоями (внешним или внутренним) мембраны также
могут быть различия в локализации амфифильных соединений, о чем
свидетельствует изменение формы эритроцитов в присутствии
амфифилов [81, 146]. Считают [146, 147], что при встраивании амфифильных
веществ во внешний монослой мембраны появляются эхиноциты, а при
встраивании амфифильных веществ преимущественно во внутренний
монослой мембраны - стоматоциты.
В нашей работе сделана попытка установить связь между изменением
формы эритроцитов, а, следовательно, предположительной локализацией
амфифифильных соединений и величиной их антигемолитической
активности в условиях гипертонического стресса. Как видно из
представленных в главе 5 данных, и эхиноцитогенное вещество С10,
локализованное во внешнем монослое мембраны, и стоматоцитогенное
 94
вещество ХП, локализованное во внутреннем монослое мембраны,
проявляют сходные значения антигемолитической активности в условиях
гипертонического стресса эритроцитов. Следовательно, локализация
амфифильных веществ в каком-либо монослое мембраны не играет
существенной роли в проявлении амфифилами антигемолитической
активности.
Отметим, что максимальный антигемолитический эффект исследуемых
амфифильных соединений наблюдается в том случае, когда клетки
переносятся в раствор 4,0 Моль/л NaCl, уже содержащий эти вещества.
Предварительная обработка клеток данными соединениями не
сопровождается значительной протекцией эритроцитов от повреждения при
перенесении их в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl [37]. Такое явление
отмечено и при исследовании действия различных амфифильных соединений
в условиях другого вида стресса - гипотонического [77].
Следовательно, антигемолитическое действие амфифильных
соединений при разных видах стресса не связано с постоянной мембранной
модификацией. По-видимому, в момент внесения эритроцитов в литическую
среду амфифильные соединения способны встраиваться и инициировать в
мембране процессы, предотвращающие ее разрушение. При этом достаточно
встраивания вещества во внешний монослой мембраны.
Рядом авторов установлено, что мембрана эритроцита может
выдерживать без разрушения встраивание большого количества
амфифильных молекул при концентрации вещества, протектирующей клетки
от гипотонического стресса или изменяющей форму
эритроцитов [67, 89, 98, 110, 111, 113, 144]. При этом если в мембрану
встраивается эхиноцитогенное вещество, то внешний монослой должен был
бы расшириться на 7 % [89], тогда как расширение или сжатие одного
монослоя относительно другого только на 1 % вызывает заметное изменение
формы клетки [67, 98]. Учитывая существование определенного баланса
между двумя монослоями, который необходим для сохранения бислойной
 95
структуры мембраны, маловероятно, что один из монослоев может быть
загружен таким количеством амфифильных молекул без потери целостности
бислоя. Из вышесказанного можно предположить, что при встраивании
амфифильных соединений во внешний монослой мембраны должно
происходить перераспределение молекул амфифильных веществ и (или)
мембранных компонентов между внешним и внутренним монослоями
мембраны, чтобы сохранить баланс между монослоями и целостность
бислоя.
В ряде работ показано, что встраивание амфифильных веществ в
мембрану сопровождается трансбислойным перераспределением
мембранных липидов [98, 132, 141]. Так, быстрое проникновение
хлорпромазина в липидный бислой сопровождается реорганизацией
мембраны [139, 141]. При этом фракция аминофосфолипидов
перераспределяется из внутреннего во внешний слой мембраны, тогда как
фракция холинпроизводных липидов движется во внутренний монослой
мембраны. Авторы работы [92] предположили, что посредством временно
образующихся небислойных фаз в мембране встроенные амфифильные
молекулы и мембранные липиды могли бы быстро перераспределяться между
двумя монослоями бислоя, чтобы снизить "нагрузку" на внешний монослой
при встраивании амфифилов. В пользу этого предположения свидетельствует
тот факт, что гидрофобная область мембраны формирует барьер, который
трудно пересечь амфифильным и фосфолипидным молекулам, имеющим
гидрофильную головку, а энергетический барьер к переходу таких молекул
между бислойной и небислойной конфигурацией мембранных липидов
значительно ниже.
Существуют данные, что амфифильные соединения способны вызывать
образование временных небислойных фаз в мембране [91, 92, 139, 142].
Небислойные фазы, такие как гексагональные НII фазы, принимают
участие в экзо- и эндоцитозе и в процессах мембранного
слияния [50, 61, 143]. Полагают [92], что смешанные инвертированные
 96
мицеллы или гексагональные фазы, состоящие из некоторых встроенных
амфифилов и мембранных липидов, могли бы формироваться между двумя
монослоями, предотвращая накопление амфифильных молекул во внешнем
монослое мембраны. Межбислойные инвертированные мицеллы могли бы
затем быстро перераспределять встроенные амфифилы и липиды между
двумя монослоями, сохраняя целостность бислоя.
Наличие перераспределения мембранных компонентов при встраивании
амфифильных соединений можно предположить и анализируя эффекты
данных веществ на клеточные мембраны. Как уже указывалось,
амфифильные соединения характеризуются двойственным влиянием на
клеточные мембраны: в низких концентрациях они предотвращают
формирование мембранных макроскопических пор и лизис клеток в условиях
различных стрессов, а в высоких концентрациях способны нарушать
целостность мембраны, что связывают с проявлением детергентных свойств
этих соединений. Детергентные свойства амфифильных веществ используют
при солюбилизации клеточных мембран, при этом мембрана распадается на
смешанные (детергент-липид-белок) мицеллы [32], что свидетельствует о
высокой степени перераспределения мембранных компонентов.
Амфифильные соединения могут вызывать освобождение мембранных
компонентов (везикуляцию) без разрушения мембраны [76, 78], что
соответствует меньшей степени пертурбации мембраны. Вероятно,
небольшое перераспределение мембранных компонентов под влиянием
амфифильных соединений должно происходить и при встраивании веществ в
мембрану в момент гипертонического воздействия на клетки. Следует
отметить, что антигемолитическое действие амфифильных соединений в
условиях гипертонического стресса эритроцитов не может быть связано с
процессом везикуляции, т.к. стресс происходит в течение нескольких секунд,
а освобождение везикул начинается после одной минуты инкубации
эритроцитов с амфифилами [76].
Из вышесказанного можно предположить, что в зависимости от
 97
количественного накопления амфифильного вещества в мембране и,
следовательно, степени его пертурбирующего влияния на мембрану, может
наблюдаться различный эффект этих соединений на мембранные функции.
Действительно, показано [92], что в концентрации, протектирующей
эритроциты от гипотонического стресса, амфифилы увеличивают выход
ионов калия из клеток в физиологическом растворе. Однако, в нашей работе
не обнаружено значительного влияния амфифильных соединений в
концентрациях, протектирующих эритроциты от гипертонического стресса,
на выход ионов калия из клеток в физиологическом растворе. Также из
результатов ЭПР исследований, представленных в главе 6, видно, что
исследуемые амфифилы увеличивают микровязкость мембранных липидов,
но в то же время существуют данные о противоположном влиянии
амфифилов на динамическое состояние мембраны [34].
Если рассмотреть процесс встраивания амфифилов в мембраны с точки
зрения коллоидной химии [15], то адсорбция веществ на поверхности раздела
фаз также предполагает перегруппировку молекул в адсорбционной среде.
При адсорбции амфифильных молекул в мембрану гидрофобные
взаимодействия выполняют лишь ориентирующую функцию.
Удерживание амфифильных молекул в мембране может быть за счет
межмолекулярных (ван-дер-ваальсовых) и электростатических сил. В этих
взаимодействиях принимает участие и полярная часть амфифильной
молекулы. При встраивании амфифильных молекул в мембрану, молекулы
амфифилов и мембранных компонентов перегруппировываются и занимают
равновесное положение. В результате происходит образование новой
поверхности.
Таким образом, при встраивании амфифильных молекул в мембрану
происходит перераспределение мембранных компонентов, в котором
немаловажную роль играет природа полярной головки амфифильной
молекулы.
Изложенное выше подтверждается данными, полученными в нашей
 98
работе. Так, при сравнении антигемолитического действия как гомологов
алкилсульфата натрия, так и производных алкилдиметилпропансульфоната
показано, что длинноцепочечные гомологи (С12, Z16) имеют меньшие
значения эффективных концентраций и антигемолитической активности по
сравнению с короткоцепочечными гомологами (С10, Z10).
Таким образом, можно предположить, что соотношение между
размером гидрофобно-гидрофильных частей амфифильной молекулы, а
также их природа, определяет различия в эффективных концентрациях и
антигемолитической активности амфифильных соединений в условиях
гипертонического стресса эритроцитов.
В главе 5 показано, что при гипертоническом стрессе эритроцитов в
присутствии амфифильных соединений в эффективных концентрациях
уровень гемолиза эритроцитов значительно снижается, однако, сохраняется
нарушение барьерной функции мембраны для катионов калия.
Следовательно, можно предположить, что амфифилы, находясь в литической
среде при внесении клеток, встраиваются в мембрану на этапе нарушения её
барьерной функции для катионов и предотвращают формирование
мембранных макроскопических пор.
Известно, что изменения, возникающие в мембране на этапе нарушения
барьерной функции для катионов, частично или полностью обратимы [73].
При этом мембрана находится в метастабильном состоянии, т.е. в
зависимости от внешних условий такая мембрана в одном случае, может
сохранить свою структурную целостность и функциональные свойства, а в
другом - потерять барьерные свойства для средних и крупных биомолекул,
что приведет к лизису клетки.
По-видимому, амфифилы, встраиваясь в метастабильную мембрану,
способны инициировать процессы, которые препятствуют формированию
мембранных макроскопических пор. Наиболее вероятно, что
антигемолитическое действие амфифилов связано с временным
"разупорядочиванием" мембраны (флип-флоп липидов и (или) образование
 99
временных небислой