Вы находитесь на странице: 1из 150

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМЕДИЦИНЫ

НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК УКРАИНЫ

На правах рукописи

СЫНЧИКОВА ОЛЬГА ПЕТРОВНА

УДК: 57.043:612.111:352.462

ВЛИЯНИЕ АМФИФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ГИПЕРТОНИЧЕСКИЙ


ГЕМОЛИЗ ЭРИТРОЦИТОВ

03.00.19 – криобиология

Диссертация на соискание ученой степени


кандидата биологических наук

Научный руководитель
Бондаренко Валерий Антонович
доктор биологических наук, проф.

Харьков - 2003
2

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................3
ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................11
1.1. Структурная организация мембраны эритроцита.............................11
1.2. Гипертонический гемолиз эритроцитов.............................................19
1.3. Влияние амфифильных соединений на плазматическую мембрану
клетки..................................................................................................................27
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...............................37
ГЛАВА 3 ВЛИЯНИЕ ТРИФТОРПЕРАЗИНА НА РАЗВИТИЕ
ГИПЕРТОНИЧЕСКОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ В ЗАВИСИМОСТИ
ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И ИСХОДНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОК......................45
3.1. Морфологические изменения эритроцитов при гипертоническом
гемолизе..............................................................................................................45
3.2. Влияние предварительной дегидратации эритроцитов на уровень
гипертонического гемолиза в присутствии трифторперазина.......................52
3.3. Влияние протеолитической обработки клеток на проявление
антигемолитической активности трифторперазина при гипертоническом
гемолизе эритроцитов........................................................................................72
Выводы.........................................................................................................79
ГЛАВА 4 КОРРЕКЦИЯ ГИПЕРТОНИЧЕСКОГО ГЕМОЛИЗА
ЭРИТРОЦИТОВ АМФИФИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ. РОЛЬ
ЦИТОСКЕЛЕТА....................................................................................................82
4.1. Антигемолитическая активность алкил-,D-глюкопиранозидов при
гипертоническом гемолизе эритроцитов. Модификация мембраны
диамидом.............................................................................................................82
4.2. Влияние амфифильных соединений и температуры на
чувствительность модифицированных фенилгидразином эритроцитов к
гипертоническому воздействию.......................................................................95
Выводы.......................................................................................................112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................115
ВЫВОДЫ.............................................................................................................124
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ...........................................127
3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антигемолитическая активность
ГГП - гексил-,D-глюкопиранозид
ДГП - децил-,D-глюкопиранозид
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования
ОГП - октил-,D-глюкопиранозид
ПАВ – поверхностно-активные вещества
ТФП - трифторперазин
ФГ - фенилгидразин
4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.
При действии на клетки низких температур, их структура и функции
подвергаются существенным изменениям [3, 175]. Повреждение клеток при
замораживании возникает вследствие процессов кристаллизации и
рекристаллизации, сдвига температуры, изменения осмотического давления,
рН среды и т.д [5]. Так как при вымораживании свободной воды в каналах
между кристаллами льда концентрации растворов могут достигать
4-5 Моль/л [4], многие исследователи ведущими факторами криоповреждения
считают изменения температурных и осмотических условий среды.
Известно, что перенесение клеток в высококонцентрированные солевые
среды при положительных температурах сопровождается их обезвоживанием
и нарушением целостности плазматической мембраны [13]. В качестве
экспериментальной модели для изучения процесса гипертонического
повреждения клеток широко используются эритроциты человека [5].
Механизм гипертонического шока клеток до сих пор остается не до
конца изученным. Трудности в понимании этого явления связаны с
недостатком знаний о механизмах формирования трансмембранных пор в
участках, являющихся первичными зонами повреждения плазматической
мембраны клетки. Полагают, что образование и развитие трансмембранных
дефектов в мембранах эритроцитов, находящихся в высококонцентри-
рованных солевых средах, связано с нарушением упаковки и динамики
молекул липидного бислоя [125]. Предполагается, что причиной
формирования мембранных дефектов при гипертоническом воздействии
может быть нарушение ассоциации белков цитоскелета с мембраной и
сопутствующее изменение структуры липидного бислоя в участках
открепления цитоскелетных белков [8].
5

Существует два подхода к повышению сохранности эритроцитов при


гипертоническом и температурном воздействии. Первый подход связан с
модификацией состояния цитоскелет-мембранного комплекса на этапах,
предшествующих гипертоническому воздействию. Так, в работе [35]
показано, что предварительное частичное обезвоживание клеток
существенно повышает их устойчивость к последующему действию
высококонцентрированных сред. Полагают, что в основе указанного
защитного эффекта лежат процессы, связанные, в первую очередь, с
увеличением концентрации белков при обезвоживании клетки. Подобное
увеличение плотности взаимодействия белков цитоскелета с мембраной и
друг с другом стабилизирует плазматическую мембрану.
Второй подход предполагает влияние модифицирующих факторов на
процесс развития гемолиза непосредственно в момент действия
гипертонического стресса. В частности, показано, что присутствие в
литической среде амфифильных веществ различной структуры и природы
позволяет значительно снизить уровень гипертонического гемолиза
эритроцитов [27]. При этом многие амфифильные соединения обеспечивают
сохранение целостности клеток также при гипотоническом,
постгипертоническом и яд-индуцированном лизисе [100, 184].
Показано [102], что эффективность амфифильных веществ при
различных типах гемолиза эритроцитов в значительной степени обусловлена
их способностью оказывать влияние на липидный компонент мембраны. При
использовании в определенных концентрациях эти соединения вызывают
значительную реорганизацию мембраны, в частности, индуцируют
трансбислойное перераспределение фосфолипидов [173].
Если действие различных амфифильных соединений на липиды
достаточно хорошо изучено, то вопрос о влиянии этих соединений на белки
освещен недостаточно полно, хотя известно, что некоторые амфифильные
соединения, такие как хлорпромазин, трифторперазин являются
ингибиторами кальмодулина и подавляют активность ряда ферментов [15,
6

188]. Согласно современным представлениям, ведущая роль в формировании


устойчивости клеток к гипертоническому воздействию отводится именно
цитоскелет-мембранному комплексу [212], поэтому антигемолитическое
действие веществ амфифильной природы может опосредоваться и их
влиянием на интегральные белки и белки цитоскелета.
В связи с этим, актуальным является изучение влияния модификации
клеток амфифильными соединениями на уровень гипертонического гемолиза
как на предварительных этапах перед стрессовым воздействием, так и
непосредственно на этапах изменения осмотических и температурных
услових среды.

Связь с научными программами, планами, темами.


Работа выполнена в соответствии с научным направлением работы
отдела криофизиологии клетки ИПКиК НАН Украины по темам: «Клеточные
механизмы контроля холодовой и осмотической чувствительности» (шифр
темы 2.2.6.53), «Факторы и механизмы регуляции стойкости клетки к
изменениям температурного и осмотического параметров среды» (шифр
темы 2.2.6.86, № гос. регистрации 0101И003472), где автор выполняла
самостоятельные разделы.

Цель и задачи исследования.


Цель работы - изучить характер развития гипертонического гемолиза
эритроцитов в зависимости от исходного состояния клеток в изменяющихся
температурных и осмотических условиях среды, а также при действии на
клетки амфифильных соединений различной природы.

Задачи исследования.
1. Исследовать изменение формы и объема эритроцитов в процессе
гипертонического гемолиза с помощью оптико-электронной системы
телевизионного типа.
7

2. Изучить гипертонический гемолиз эритроцитов в присутствии


катионного производного группы фенотиазинов трифторперазина в
зависимости от исходного состояния клеток, изменяемого начальной
дегидратацией в средах с различной тоничностью, а также при
изменении температурных (0 и 37 С) и осмотических (2,0 – 4,0 Моль/л
NaCl) условий гипертонической среды, в которую после начальной
дегидратации переносились клетки.
3. Оценить влияние трифторперазина на устойчивость эритроцитов к
гипертоническому воздействию (4,0 Моль/л NaCl) после модификации
клеток путем обработки протеолитическими ферментами и
нейраминидазой.
4. Исследовать антигемолитическую активность представителей
гомологического ряда производных глюкопиранозида с различной
длиной алкильной цепи - гексил-,D-глюкопиранозида, октил-,D-
глюкопиранозида и децил-,D-глюкопиранозида при развитии
гипертонического гемолиза эритроцитов.
5. Изучить сочетанное влияние алкилглюкопиранозидов и модификации
цитоскелета эритроцитов с помощью фенилгидразина и диамида на
чувствительность клеток к гипертоническому гемолизу в 4,0 Моль/л
растворе NaCl.

Объект исследования – гипертонический гемолиз эритроцитов.


Предмет исследования – осмотическая и температурная
чувствительность эритроцитов в присутствии катионных амфифильных
соединений трифторперазина и лидокаина, неионных амфифильных
соединений алкилглюкопиранозидов; антигемолитическая активность
амфифильных соединений при различном исходном состоянии эритроцитов
(частичное обезвоживание, обработка диамидом, фенилгидразином,
протеолитическими ферментами, нейраминидазой).
8

Для решения поставленных задач были использованы следующие


методы:
- спектрофотометрический метод определения уровня гемолиза
эритроцитов по содержанию гемоглобина в супернатанте после
изменения условий среды предварительной инкубации и литической
среды в присутствии амфифильных соединений;
- спектрофотометрический метод регистрации динамических изменений
уровня гемолиза эритроцитов при рассеянии на целых клетках при
варьировании температурных и осмотических условий среды;
- метод регистрации морфологических изменений эритроцитов с помощью
оптико-электронной системы телевизионного типа;
- модификация мембраны и цитоскелета эритроцитов с помощью диамида,
фенилгидразина, ферментов (трипсина, папаина, проназы,
нейраминидазы);
- метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии для определения уровня
калия, вышедшего из эритроцитов.

Научная новизна полученных результатов.


Впервые с использованием оптико-электронной системы
телевизионного типа получены данные о динамике изменений формы клеток,
а также о временных интервалах морфологических изменений эритроцитов в
процессе гипертонического гемолиза, позволяющая выделить два типа лизиса
клеток в гипертоническом растворе NaCl высокой тоничности – гемолиз без
изменения объема клетки (время гемолиза до 1 сек) и гемолиз,
опосредованный переходом эритроцита в сферу (время гемолиза 4 – 5 сек).
Обнаружено, что антигемолитический эффект трифторперазина (ТФП)
при гипертоническом гемолизе эритроцитов является температуро-
зависимым, он определяется исходным состоянием клеток и реализуется на
уровне клеточной мембраны в момент действия стрессового фактора.
9

В экспериментах с модификацией клеток нейраминидазой получены


новые данные о том, что состояние гликокаликса эритроцитов не оказывает
влияния на способность ТФП снижать уровень лизиса эритроцитов в
гипертоническом растворе NaCl. Указанный эффект проявляется в меньшей
степени в случае эритроцитов, предварительно подвергшихся инкубации в
0,7 Моль/л растворе NaCl.
Впервые с использованием протеолитических ферментов показано, что
эффективность трифторперазина при перенесении эритроцитов в 4,0 Моль/л
раствор NaCl практически не изменяется при модификации белков, а зависит
от исходных осмотических и температурных условий, в которых находяться
эритроциты. Предварительная инкубация эритроцитов в 0,7 Моль/л растворе
NaCl, когда достигается максимальная исходная дегидратация клеток,
сопровождается снижением способности амфифильных соединений
уменьшать уровень гипертонического гемолиза эритроцитов при температуре
37 С.
Выявлено, что эффективность представителей гомологического ряда
производных глюкопиранозида определяется длиной алкильной цепи: с
увеличением ее длины протектирующее действие этих соединений
возрастает, а эффективная концентрация снижается. Обнаружено явление
индукции температурной зависимости антигемолитической активности
алкилглюкопиранозидов при гипертоническом гемолизе эритроцитов с
модифицированным фенилгидразином цитоскелетом, не проявляющейся у
немодифицированных клеток.
Впервые на примере лидокаина продемонстрировано отсутствие связи
между способностью амфифильных соединений изменять форму клеток и
проявлением их антигемолитической активности.

Практическая значимость работы.


Результаты, полученные в работе, могут быть использованы при
разработке новых подходов коррекции осмотической и температурной
10

чувствительности эритроцитов с использованием амфифильных соединений.


Данные, представленные в диссертации, могут быть использованы также в
учебном процессе по специальностям биологического направления.

Личный вклад соискателя.


Диссертация является самостоятельным исследованием соискателя.
Автором сформулирована цель и определены задачи работы, проведены и
проанализированы эксперименты, статистически обработаны результаты,
сформулированы выводы работы. Работы, опубликованные в соавторстве с
к.б.н. Шпаковой Н.М., Дунаевской О.Н. и к.т.н. Стрелковой Т.А. отражают
результаты совместного планирования, проведения экспериментов и
обсуждения результатов.

Апробация результатов диссертации.


Результаты проведенных исследований были представлены на II съезде
Украинского биофизического общества (Харьков, 1998), конференции
молодых ученых ИПКиК (Харьков, 1999, 2002), II съезде трансплантологов
Украины (Киев, 2000), конференции молодых ученых (Киев, 2001), IV съезде
гематологов и трансфузиологов Украины (Киев, 2001), III съезде Украинского
биофизического общества (Львов, 2002).

Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 12 работ, из них
в специализированных научных журналах – 7, в сборниках материалов
конференций – 5.
11

ГЛАВА 1
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурная организация мембраны эритроцита

Эритроцитарная мембрана представляет собой сложную структуру, обра-


зованную несколькими взаимосвязанными комплексами: непрерывный ли-
пидный бислой, составляющий основу мембраны, гликокаликс, обращенный во
внеклеточную среду и цитоскелет, расположенный на внутренней стороне
мембраны. Все слои плотно связаны в направлении, перпендикулярном
плоскости плазматической мембраны, но липидные монослои и белковый
цитоскелет могут скользить относительно друг друга в плоскости мембраны [82].
Анализируя химический состав мембраны, следует выделить липиды,
белки, углеводы и воду. Липиды составляют порядка 40 % сухого веса мембран, и
представлены тремя основными классами: гликолипиды, фосфолипиды и стеро-
иды. В эритроцитах человека большая часть гликолипидов представлена
глюкозилцерамидом, галактозилглюкозилцерамидом, дигалактозилглюкозилце-
рамидом [7]. В мембранах эритроцитов человека липиды характеризуются нерав-
номерным распределением как в плоскости мембраны, так и между монослоями
бислоя. Так, холинсодержащие фосфолипиды фосфатидилхолин и сфингомиелин
локализованы преимущественно в наружном монослое (фосфатидилхолин - 70%,
сфингомиелин – 80 % от общего числа каждого липида в мембране) [169], в то
время как аминофосфолипиды, такие как фосфатидилсерин, несущий отрица-
тельный заряд, и фосфатидилэтаноламин - во внутреннем
(фосфатидилсерин – 100 %, фосфатидилэтаноламин – 70 %) [131, 183].
Практически полностью локализован на внутреннем монослое минорный
фосфолопид фосфатидилинозитол [144]. Стероиды в мембранах представлены
холестерином, составляющим почти половину общего количества липидов
мембраны эритроцитов. Было показано неравномерное распределение
холестерина между монослоями и в плоскости мембраны, с более высоким
12

содержанием в наружном монослое [73, 204]. Холестерин участвует в обмене


веществ и выполняет роль пластификатора бислоя, регулируя упаковку и
контролируя динамичность липидных молекул. Кроме того, монослои мембраны
различаются по жирнокислотному составу и степени насыщенности ацильных
цепей. Внешний слой является более ригидным, чем внутренний [200].
Движущей силой при формировании липидного бислоя является
гидрофобный эффект. Поверхностное натяжение нейтрализуется стерическим
отталкиванием между головными группами липидов и ацильными цепями [125].
Это стерическое отталкивание зависит от эффективной формы липидов,
определяемой зарядом и гидратационной оболочной их головных групп и
интенсивностью теплового движения их ацильных цепей [125]. Результат
совместного действия сил отталкивания и поверхностного натяжения образует
так называемое равновесное латеральное давление. Величина равновесного
латерального давления связана с конформацией мембранных белков [64, 65].
Молекулы мембранных фосфолипидов характеризуются высокой сте-
пенью упорядоченности, в то же время они способны осуществлять различного
рода перемещения. В зависимости от вектора движения различают несколько
форм подвижности молекул. Перемещение фосфолипидов в плоскости бислоя –
латеральная диффузия, сегментальная подвижность; ротационная подвижность -
вращение молекул вокруг своей оси, а также переходы молекул липидов из
одного монослоя в другой – «флип-флоп» переходы [7, 56].
Ассиметричное распределение мембранных фосфолипидов поддерживает-
ся за счет работы АТФ-зависимой аминофосфолипидтранслоказы, нивелирую-
щей перераспределение их в результате пассивной диффузии [93, 229]. Важную
роль в поддержании асиммертии липидных молекул играют взаимодействия фос-
фатидилэтанотамина и фосфатидилсерина с основным цитоскелетным белком
спектрином [80, 155, 171]. Указанное распределение молекул липидов в бислое
является одним из основных свойств клеточной мембраны, оно сохраняется и
после гемолиза эритроцитов [74, 149].
13

Для липидов мембранного бислоя характерен температурный и лиотроп-


ный мезоморфизм. Проявлением температурного мезоморфизма является моди-
фикация упаковки липидных молекул, сопровождающее изменение температуры.
Понижение температуры вызывает переход липидной фазы мембраны от жидко-
кристаллического в гель-состояние, которое характеризуется более упорядоченой
упаковкой углеводородных цепей липидных молекул [7, 45, 125]. При изменении
степени гидратации бислоя, липидные молекулы могут образовывать различные
структуры – ламеллярные, гексагональные и кубические фазы. Эта способность
носит название лиотропного полиморфизма [7].
Свойство липидов образовывать те или иные упорядоченные структуры
определяется рядом факторов, среди которых определяющим является геометрия
молекулы. Большая площадь полярной головки при относительно небольшой
гидрофобной части способствует образованию мицеллярных структур, обратные
пропорции в соотношении площадей сопровождаются тенденцией в обра-
зованию инвертированных мицелл или гексагональных фаз [195]. Ламеллярные
структуры характерны для молекул, площади полярной и неполярной частей ко-
торых примерно сопоставимы [136]. Определенное распределение молекул фос-
фолипидов в бислое необходимо для поддержания бислойной организации этой
структуры. Структурные перестройки, вызванные действием различных факторов
внешней среды, будут проявляться в образовании неламеллярных структур при
изменении температуры, рН и условий гидратации липидного бислоя [74, 110].
Мембранные белки представлены тремя основными классами: интеграль-
ные, пронизывающие толщу мембраны, периферические, локализованные на
внешней или внутренней цитоплазматической поверхности, и промежуточные,
т.е. белки, погруженные в один из монослоев. Интегральные белки мембран
эритроцитов являются гликопротеинами. Их углеводные цепи формируют
гликокаликс, а сиаловые кислоты, выступающие наружу с внешней стороны
мембраны, определяют отрицательный заряд поверхности эритроцита при
физиологических значениях рН.
14

Взаимодействие углеводных цепей в гликокаликсе определяется, в


основном, электростатическими силами [25], хотя не исключены и стерические
взаимодействия типа зацеплений, характерные для разветвленных биополимеров
[23]. Гликокаликс выполняет функцию стерического стабилизатора, препятствуя
слиянию эритроцитов в русле крови, а также контролирует электростатические
взаимодействия клеток. Многие углеводные участки гликолипидов и
гликопротеинов выполняют также рецепторную функцию при взаимодействии
клеток с вирусами, антителами и химическими соединениями [34, 90].
Деление мембранных белков на периферические и интегральные
определяется свойствами, которые обеспечивают взаимодействие белка с
бислоем, т.е. их структурой, количеством гидрофобных аминокислот и
расположением в первичной структуре. Интегральные белки мозаично встроены
в бислой, их взаимодействия с компонентами мембраны могут быть нарушены
лишь разрушением липидного матрикса в результате солюбилизирующего
действия детергентов [133, 188]. Многие интегральные белки мембран окружены
аннулярными (связанными, иммобилизированными) липидами [60], которые
влияют на конформационное состояние и пространственную конфигурацию
белка. Аннулярные липиды, непосредственно премыкающие к интегральным
белкам, отличаются очень низкой подвижностью, т.к. содержат большое
количество насыщенных жирнокислотных цепей [5, 7, 228].
Периферические белки мембран отличаются от интегральных меньшей
глубиной проникновения в бислой и более слабыми белок-липидными
взаимодействиями. Они могут быть экстрагированы из мембраны при
добавлении хелатирующего агента или при изменении ионного состава среды.
Основным интегральным белком эритроцитарной мембраны является бе-
лок полосы 3 по стандартной классификации Фейервенкса, с молекулярной мас-
сой 95 кДа [83]. Присутствуя в мембране в количестве примерно 1 млн. молекул
на 1 клетку, он составляет около половины всех интегральных белков [54, 72].
Ди- или тетрамерные ассоциаты белка полосы 3 формируют канал анионного
транспорта в мембране эритроцита [117]. Методами электронной микроскопии
15

была выявлена U-подобная структура этого мембранного обменника с размерами


60 на 110 А, и толщиной 80 А. Гликопротеин, образованный 911 аминокислота-
ми, включает 52 кДа гидрофобный домен (С-терминал), осуществляющий анион-
ный транспорт и N-терминал цитозольного домена (43 кДа). Белок полосы 3 осу-
ществляет перенос анионов через эритроцитарную мембрану. Показано, что он
не только опосредует потоки небольших гидрофильных анионов (хлорид, окса-
лат), но также и флип-флоп длинноцепочечных амфифильные анионов (додецил-
сульфат) [214]. Авторы работ [170, 191] показали, что при ингибировании работы
анионного обменника наблюдается ингибирование флипа (перехода молекулы
фосфолипида из внешнего монослоя во внутренний) на 55 – 85 %. Обратные пе-
реходы (флоп), из внутреннего во внешний монослой, моно- и дианионных фос-
фолипидов осуществляются очень быстро. Они АТФ-зависимы и ингибируются
ванадатом, фторидом , SH-реагентами или истощением клеток по магнию. Все
это, по мнению авторов [191], свидетельствует в пользу того, что флоп опосреду-
ется белком полосы 3, работающим как «флоппаза». Асимметричное распреде-
ление меченных анионных фосфолипидов в мембране отражает скорости их
флип-флопа, блокирование «флоппазопосредованных» переходов приводит к
нарушению указанной ассимметрии. Гидрофильный N-терминал белка полосы 3
ассоциирован с гликолитическими ферментами [216], он является одним из
основных организующих центров эритроцитарной мембраны. С цитозольным
доменом белка полосы 3 связаны такие периферические белковые лиданды, как
анкирин (главный мост спектрин-актинового скелета), белок полосы 4.1, белок
полосы 4.2, альдолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа,
фосфофруктокиназа, диоксигемоглобин и гемихромы [197, 211, 233].
Остальные интегральные белки представлены, в основном, гликофорина-
ми А ( 2 х 105 молекул/кл) и С ( 3,5 х 10 4 молекул/кл) [54]. Интегральные белки
осуществляют основные функции мембраны: ферментативную, транспортную и
регуляторно-акцепторную [67]. Подвижность интегральных белков ограничена
вращательной подвижностью, поскольку взаимодействие этих структур с компо-
нентами цитоскелета исключает существенное латеральное перемещение [54,
16

176, 212]. Диссоциация цитоскелета сопровождается увеличением латеральной


подвижности [54], а образование сшивок между молекулами спектрина – ее
уменьшением [199].
Периферические белки в эритроцитарных мембранах представляют собой
либо маркерные ферменты мембран, либо формируют белковый цитоскелет, кото-
рый регулирует форму и объем клеток, их динамику и метаболизм [2, 5, 6, 227].
Цитоскелет состоит, прежде всего, из спектрина, актина и белка полосы
4.1, а также минорных компонентов аддуцина, белка полосы 4.2, белка полосы
4.9, тропомиозина и миозина. Главной составляющей мембранного цитоскелета
является спектрин, составляющий около 25 % всех мембранных белков эритро-
цитов [82]. Гетеродимер спектрина включает молекулы в  и  конфигурациях,
которые дают на электрофореграмме полосы 1.1 и 1.2 по стандартной
классификации [83]. Этот белок состоит из 20 относительно жестких доменов
объединенных между собой в удлиненную молекулу 2 х 100 нм [153].  и 
мономеры обычно существуют в виде димера или тетрамера, причем молекулы
имеют высокое сродство друг к другу, взаимодействуют по всей длине и
связываются антипараллельно. При снижении температуры более энергетически
выгодной становится тетра- и олигомерная форма ассоциации спектрина [154,
161]. При физиологических рН одна молекула спектрина несет на себе около 20
элементарных отрицательных зарядов [202] и является «энтропийной
пружиной». Особенностью такой молекулы является ее сокращение при
повышении температуры и ионной силы раствора или при снижении рН [201].
Второй компонент цитоскелетного комплекса – актин (белок полосы 5 по
стандартной классификации ) в эритроцитарной мембране представлен в виде
олигомеров со степенью полимеризации 12-17 [179]. Олигомеры актина, белка
полосы 4.1 и тетрамеры спектрина образуют тройной комплекс и узлы
спектриновой сети мембранного цитоскелета [52, 167, 208]. Тройной комплекс в
присутствии Mg2+ и АТФ способен собираться в трехмерную сеть, обладающую
ярко выраженными тиксотропными свойствами [70, 84]. Цитоскелет связан с
мембраной посредством по крайней мере двух белков: анкирин связывает
17

-спектрин с белком полосы 3 мембраны [93], второй связывающий белок –


белок полосы 4.1. Установлено, что местами связывания белка полосы 4.1 на
мембране являются белок полосы 3 и гликофорин [107, 224]. Основное место
присоединения белка полосы 4.1 это гликофорин C/D. Очищенный белок полосы
4.1 связывается с гликофорином в двух различных точках – одно взаимодействие
прямое, вовлекающее 82 - 98 остатки гликофорина С( 61-77 гликофорина D),
другое опосредуется р55. Получены доказательства того, что белок полосы 3 –
это дополнительное, неосновное место связывания белка полосы 4.1. Все места
связывания для белка полосы 3, гликофорина и р55 расположены на 30 кДа
участке белка полосы 4.1. Относительный вклад этих трех мест связывания в
нормальных эритроцитах составляет 40 % для р55, 40 % для гликофорина С и
20 % для белка полосы. Взаимодействие белка полосы 4.1 с р55 и р55 с
гликофорином характеризуется высокой аффинностью (нМоль/л), а непосред-
ственно с гликофорином и с белком полосы 3 – на 2 порядка ниже (мкМоль/л)
[107]. Белок полосы 4.1 участвует в регуляции свойств клеточной мембраны при
ее деформации в ответ на механическое или осмотическое воздействие [89].
В целом, структура цитоскелет-мембранного комплекса эритроцитов
характеризуется специфическим характером интеграции его компонентов, что
обусловлено условиями, в которых реализуется функция этих клеток. В
зависимости от интенсивности сдвигового воздействия эритроцит может вести
себя, с одной стороны, как жидкая капля, а с другой, как твердая частица.
Подобное поведение обусловлено тиксотропными свойствами ионного геля,
образуемого белками цитоскелета, для которого характерны структурно-фазовые
переходы в зависимости от условий, в которых находятся клетки [202].
В криобиологическом плане это означает, что все факторы, играющие
важную роль в условиях охлаждения и замораживания, такие как повышение
ионной силы, увеличение осмолярности среды, сдвиг рН и изменение
температуры, оказывают влияние на состояние эритроцита. В частности, для
липидной фазы мембраны эритроцитов важную роль может играть процесс
образования небислойных структур [195]. Наличие отрицательно заряженных
18

групп на молекулах спектрина и фосфатидилсерина делает цитоскелет-


мембранный комплекс эритроцитов чувствительным к изменению ионной силы и
рН среды. Указанные факторы могут играть важную роль в механизмах
формирования локальной нестабильности мембраны и нарушения ее барьерной
функции при изменении осмотических и температурных условий среды. При
всем разнообразии структуры и организации цитоскелетных белков, цитоскелет
представляет собой ионный гель, способный претерпевать фазовые переходы,
резко изменяющие однородность распределения его компонентов в различных
участках мембраны [202]. Это можно рассматривать как фактор нестабильности,
сопутствующий обезвоживанию клеток в условиях, когда повышается
осмолярность внеклеточного раствора. Не менее важным механизмом
нестабильности является разделение липидных фаз в плоскости мембраны, что, в
первую очередь, касается липидного окружения мембранных белков и общей
липидной фазы. В любом случае, критическим фактором, обусловливающим
нестабильность мембраны, могут стать пограничные области, разделяющие
липидные участки в различном фазовом состоянии, и области, резко
отличающиеся по плотности распределения белков в цитоскелетном геле. В
первом случае дефекты могут образовываться вследствии неидеальности
упаковки липидных молекул в пограничных участках, а во втором – с изменени-
ем стабилизирующего влияния цитоскелета на бислой в участках как с повышен-
ной, так и с пониженной плотностью распределения периферических белков.
Именно специфика подобных механизмов нестабильности клеточной
мембраны позволяет говорить о высокой потенциальной эффективности
амфифильных молекул различной природы на липидный бислой в условиях
осмотического и температурного воздействия на эритроциты.
19

1.2. Гипертонический гемолиз эритроцитов

При замораживании эритроциты разрушаются под действием ряда


факторов, среди которых можно выделить влияние высококонцентрированных
солевых растворов. Повышение концентрации внеклеточного раствора
сопровождается рядом изменений структуры и функций клеток, и при
достижении определенных значений концентраций происходит их лизис.
Исследуя процессы, сопровождающие замораживание эритроцитов,
Lovelock обнаружил, что их гемолиз начинает развиваться при достижении
температуры, при которой осмолярность внеклеточного раствора NaCl достигает
0,8 Моль/л. При использовании растворов NaCl с осмолярностью,
соответствующей определенной температуре замораживания, был получен такой
же уровень гемолиза клеток, как при их замораживании эритроцитов [175]. Для
объяснения причины лизиса автором была высказана гипотеза, в соответствии с
которой повреждение эритроцитов происходит вследствие проявления лиотроп-
ного и денатурирующего действия высококонцентрированных растворов солей
на липиды и белки клеточных мембран [146, 147, 148]. Из анализа полученных
данных был сделан вывод, что повреждение клеток наступает при достижении
критической величины концентрации внеклеточного солевого раствора [145].
Идентичность структуры теней, полученных при замораживании клеток и
в модельных экспериментах по перенесению эритроцитов в гипертонические
растворы [147], позволила в дальнейшем исследовать механизм повреждения
эритроцитов при замораживании путем перенесения клеток в гипертонические
растворы солей.
В экспериментах по изучению осмотического поведения эритроцитов как в
электролитных средах, так и в растворах сорбитола Meryman выяснил, что
минимальный объем клеток в среде с осмолярностью 1300 мОсмоль/кг
составляет примерно 57 % от объема эритроцитов в изотонической среде и не за-
висит от ионной силы внеклеточного раствора [156]. Авторы работы [230] пока-
зали, что в средах, осмотическое давление которых превышает 1300 мОсмоль/кг,
20

мембраны эритроцитов теряют свойство полупроницаемости и наблюдается


утечка ионов из клеток. На основании полученных данных, Meryman предложил
гипотезу минимального объема, состоящую в том, что при достижении эритро-
цитом минимального объема происходит нарушение барьерной функции его
мембраны и последующий лизис клетки [156, 157]. Следовательно, повреждение
эритроцитов в гипертонической среде, по мнению Meryman, связано с крити-
ческим обезвоживанием клеток, а не с концентрацией электролитов во внекле-
точной среде, как утверждалось в работах Lovelock. Авторы работы [222]
получили аналогичные результаты.
Чувствительность клеток к изменению осмотических условий среды, в
первую очередь, обеспечивает основной структурный элемент всех
биологических мембран – липидный бислой. В условиях высокой тоничности
внеклеточного раствора изменяются физическое состояние и молекулярные
взаимодействия в бислое, изменяется упаковка липидных молекул и их динамика
[108, 109, 125]. Наблюдается значительное усиление взаимодействий между
цепями молекул липидного бислоя, что на мембранном уровне приводит к
появлению отдельных композиционно выделеных доменов, что в целом
уменьшает свободную энергию системы [135].
В модельных экспериментах показано, что разделение липидов зависит от
степени ненасыщенности жирнокислотных цепей, причем процесс доменообра-
зования усиливается по мере уменьшения количества двойных связей в жирно-
кислотных остатках. Следует отметить, что сегрегация липидных молекул может
быть предотвращена холестерином [135]. Поскольку для каждого фосфолипида
существует своя температура, при которой аффинность его головных групп
существенно возрастает, ответ бислоя на осмотический стресс является
температурозависимым [135].
Обнаружено, что в гипертонических солевых растворах гемолизу
дегидратированных клеток предшествует увеличение объема первоначально
обезвоженных эритроцитов и трансформация их в сферические формы. Авторы
работы [24, 40] предполагают, что в этом случае гемолизу клеток предшествует
21

нарушение барьерной функции для ионов натрия, проницаемость которых через


нативные мембраны пренебрежимо мала. Поток в клетку внеклеточных веществ
и сопутствующий поток воды, поддерживающий равновесие ее химических
потенциалов на мембране, приводит к увеличению объема эритроцитов. При
определенных значениях гидростатического давления это приводит к
образованию пор и разрывов клеточной мембраны [40].
В средах, содержащих растворы повышенной осмолярности, наблюдается
обезвоживание эритроцитов. При уменьшении объема клеток в гипертоническом
растворе повышается ионная сила цитозоля, что приводит к нарушению
ассоциации белка полосы 4.1 с мембраной [164]. Повышение концентрации
основного цитоскелетного белка спектрина в дегидратированных клетках
сопровождается его олигомеризацией, что способствует повышению
устойчивости цитоскелета к механическому сдвигу [42, 140, 141, 181].
Кроме того, уменьшение количества внутриклеточной воды приводит к
повышению концентрации внутриклеточного кальция, что может активировать
протеолиз [83, 124], способствовать повышению АТФазной активности [206],
изменять характер ассоциации цитоскелетных белков с липидным бислоем [126].
Изменение ионной силы внутриклеточной среды в сочетании со
сближением в норме удаленных участков белковых молекул может быть
причиной образования аномальных внутри- и межмолекулярных связей
белковых молекул эритроцитов [86, 141].
В ряде работ указывается на кренирование клеток в средах умеренной
тоничности [175], при повышении тоничности внеклеточного раствора
появляются плоские диски различной формы [223]. Авторы работ [139, 205]
полагают, что кренирование эритроцитов может сопровождаться частичным
откреплением цитоскелета от мембраны, что приводит к формированию
потенциальных зон нестабильности. В областях, в которых произошло
открепление цитоскелета от мембраны, возможно нарушение барьерной функции
мембраны. В ряде работ показано, что чувствительностью к гипертоническому
криогемолизу характеризуются эритроциты уплощенной формы [175, 207].
22

Полагают, что гемолиз клеток при замораживании может происходить в


результате образования и развития трансмембранных пор различных размеров
[3]. Формирующаяся в клеточной мембране пора представляет собой
динамическую структуру, развитие которой определяется факторами внешней
среды, в частности температурой и осмолярностью внеклеточного раствора [18,
138]. Появление пор при изменении температуры и осмотического давления
внеклеточного раствора зависит от уровня дефектности клеточной мембраны и
исходного объема клеток [3]. В работе [33] показана роль продолжительности
экспозиции эритроцитов в гипертонической среде на этапе, предшествующем
охлаждению. Предварительная экспозиция эритроцитов в 0,95 Моль/л растворе
NaCl при 0ºС приводит к исчезновению температурной и осмотической компо-
нент в реакции клеток на осмотический стресс при их последующем перене-
сении в 3 Моль/л раствор NaCl при 37 ºС. Состояние эритроцитов, сформирован-
ное в условиях предварительной инкубации, оценивается автором как стабильное
[10].
Анализ клеточной реакции на осмотическое и температурное воздействие
позволил авторам работ [8, 9] заключить, что особенности поведения клеток
могут быть объяснены на основе представлений гелевой природы мембранного
цитоскелета. Цитоскелет представляет собой периодическую коллоидную
структуру, адсорбированную на доменах мембраны с цитоплазматической
стороны [202, 143]. Именно гелевая природа цитоскелета определяет факторы,
ключевые для криобиологических систем, такие как осмотическое давление,
ионная сила, рН и температура. Повышение устойчивости клеток в результате
предварительного обезвоживания [10, 36] можно связать с увеличением
количества связей между составляющими геля при его концентрировании и
переходом геля в стабильное состояние. При более высоких значениях
осмолярности среды предварительной дегидратации эритроцитов
примембранный гель переходит в метастабильное состояние, обусловленное
сопряжением между приложенным осмотическим стрессом и упругим давлением
деформирующихся белковых филаментов в условиях, когда существенно
23

ограничен отток воды их клетки [115]. Таким образом, осмолярность среды


является ведущим фактором, контролирующим устойчивость клеток [13].
Влияние низких температур на стабильность цитоскелетных гелей по-
видимому связано с реорганизацией взаимодействий различными типами цито-
зольных белков. Показано, что скорость процессов ассоциации-диссоциации в
системе, состоящей из актина и -актинина является функцией
температуры [186]. Как повышение температуры, так и уменьшение
концентрации ионов кальция в цитоплазме приводит к сборке микротрубочек, в
противном случае наблюдается их распад.
Значение стабильности белкового цитоскелета в чувствительности эритро-
цитов к действию высококонцентрированных солевых растворов подчеркивается
и авторами работ [8, 11, 12]. Указывается, что сохранность клеток в условиях
действия как осмотического, так и температурного фактора внешней среды
определяется состоянием цитоскелета эритроцита, что в свою очередь, зависит от
концентрации белка в единице объема внутриклеточного растворителя.
Обнаружено, что связывание периферических белков с клеточной
мембраной определяется липидным составом, организацией и физическим
состоянием липидной фазы [126]. Следовательно, факторы, оказывающие
влияние на фазовое состояние бислоя, а именно, температура, латеральная
упаковка липидных молекул, присутствие ионов, будут контролировать характер
ассоциации цитоплазматических белков с липидами клеточной мембраны [126].
Для функционирования многих интегральных белков необходимым усло-
вием является возможность конформационных переходов, что зависит от состава
и состояния прилегающих липидных молекул [66]. Изменение латерального рас-
пределения липидных молекул в мембранах клеток, обезвоженных в условиях
повышенной тоничности среды, приводит к изменению функционирования
многих интегральных белков эритроцитов. Согласно данным [30], уменьшение
объема эритроцитов крысы в гипертонических средах сопровождается
увеличением скорости Na+,K+,2Cl- - котранспорта и Na+/H+ обмена.
24

Обнаружено, что при осмотическом сжатии эритроцитов на их мембране


появляются участки существенного сжатия – инвагинации, и растяжения – спи-
кулы мембраны [5]. Это связано с локальным скоплением в этих местах цитоске-
летных белков, подвергшихся биохимической модификации, в частности, окисле-
нию SH-групп в актине с образованием высокомолекулярных агрегатов [198].
Неравномерное напряжение на мембране, в частности в областях изгибов, может
приводить к нарушению целостности мембраны при гипертоническом
воздействии на эритроциты.
Физико-математический анализ процессов, протекающих при деформации
клеточных мембран представлен в работах [18, 17, 134, 177]. В работах [18, 17]
показано, что деформация мембраны, как и изменение температуры, является фи-
зической причиной сепарации мембранных компонентов. Так как энергия изгиба
мембраны по сравнению с энергией ее растяжения мала, следовательно мембране
энергетически более выгодно деформироваться по типу изгиба. При сжатии
клетки в гипертонической среде происходит локальное растяжение внешнего
монослоя при сжатии внутреннего и наоборот, в зависимости от знака кривизны
мембраны. В условиях определенной тоничности внеклеточного раствора, а
также значения времени инкубации эритроцитов в гипертонической среде, изгиб
клеточной мембраны может приводить к латеральному перераспределению
мембранных компонентов в соответствии с минимумом свободной энергии
бислоя. Это, в свою очередь, может привести к нарушению барьерной функции
клеточной мембраны и гемолизу эритроцита. Следует отметить, что для перерас-
пределения мембранных компонентов под влиянием деформации необходимо
время порядка 10 минут. Если сепарация мембранных компонентов при дефор-
мации клеточной мембраны и при охлаждении эритроцитов имеет одинаковую
направленность, то, возможно, в мембране облегчаются фазовые переходы. Ав-
торы работы [18] предполагают, что подобное явление лежит в основе сенси-
билизации к охлаждению клеток, помещенных в гиперосмотический раствор.
Чувствительность эритроцитов к гипертоническому воздействию может
контролироваться двумя группами процессов, связанными как с осмотическим
25

обезвоживанием клетки, так и с процессами, обусловленными нарушением


свойства полупроницаемости мембраны. Нарушение барьерной функции
мембраны приводит к дополнительному по отношению к осмоиндуцированному
изменению клеточного объема [32].
Для объяснения механизма регуляции клеточного объема в неизотоничес-
ких растворах авторами ряда работ привлекалась теория макромолекулярного
кроудинга, предложенная [160, 231, 232]. Согласно этой теории, незначительные
концентрационные изменения внутриклеточных белков могут оказывать сущест-
венное влияние на их функцию. В частности, симпорт KCL, работа Na +/H+ – пе-
реносчика определяется макромолекулярным кроудингом [132]. Увеличение кон-
центрации белков при обезвоживании эритроцитов в гипертонических условиях
сопровождается изменением коэффициента активности и конформационной под-
вижности эритроцитарных протеинов [63, 132, 174]. Изменение кинетики ряда
биохимических реакций в условиях повышаюшейся концентрации других белков
также может являться проявлением макромолекулярного кроудинга. Как указы-
вается в работах [232, 63, 132], эффект макромолекулярного кроудинга является
следствием не столько изменения в концентрации ферментов, субстратов и
продуктов биохимических реакций, сколько изменениями в их активности.
В целом, анализ данных литературы, посвященных изучению механизмов
осмотической и температурной чувствительности эритроцитов, позволяет гово-
рить о наличии важного фактора, каковым являются исходные параметры внекле-
точной среды, определяющие состояние клеток. В частности, определенное значе-
ние осмолярности среды при повышении концентрации солей и неэлектролитов
может стать порогом, при переходе через который происходит сенсибилизация
клеток, то есть повышение чувствительности к последующим изменениям усло-
вий среды. Именно это обусловливает “шоковую” реакцию обезвоженных эритро-
цитов на быстрое изменение температуры или осмолярности среды, проявляющу-
юся в лизисе этих клеток. Фактор сенсибилизации может быть связан с нарушени-
ем интеграции структурных изменений цитоскелета и мембраны на этапе после-
дующих изменений условий среды. Состояние повышенной чувствительности
26

можно сязать как с критической осмолярностью, так и с критическим (минималь-


ным) объемом клетки при ее обезвоживании. Однако, центральным звеном меха-
низма сенсибилизации, очевидно, является локальная нестабильность клеточной
мембраны, возникающая вследствии нарушения плотности упаковки как компо-
нентов липидного бислоя, так и белков цитоскелета. Предполагается, что процес-
сы, вызывающие подобные нарушения, близки к процессам, сопровождающим
фазовые переходы в жидкокристаллических и гелевых структурах, а нестабиль-
ность соответствует зонам с максимально нарушенной упаковкой молекул. В ус-
ловиях обезвоживания эритроцитов в гипертонических солевых растворах такими
зонами могут быть участки интенсивной деформации мембраны. Соответственно,
большое значение приобретает проблема динамического поведения зон неста-
бильности при последующих изменениях условий среды, то есть проблема эволю-
ции дефектов от предлитической до литической фазы, когда дефекты трансформи-
руются в трансмембранные поры критического размера, нарушается барьерная
функция мембраны и включается механизм лизиса клеток. Последнее ставит воп-
рос о том, на каком этапе осмотического воздействия на клетки использовать хи-
мические агенты, способные модифицировать структуру мембраны и цитоскелета,
предотвращающие лизис клеток. Существующие данные показывают, что наибо-
лее высокая устойчивость эритроцитов соответствует не исходным физиологичес-
ким условиям осмолярности внеклеточного раствора, а условиям умеренной ги-
пертонии, обеспечивающим частичное обезвоживание клеток. Это означает, что в
механизмы, контролирующие устойчивость клеток к осмотическому воздействию,
могут быть вовлечены эффекты макромолекулярного кроудинга. Иными словами,
осмотический компонент стабилизации клеток на ранних этапах
гипертонического воздействия на эритроциты может быть более эффективным,
чем компонент, связанный с направленной химической модификацией клеток. Это
относится и к использованию амфифильных соединений. Если учитывать, что
эволюция дефектов мембраны при переходе от предлитической к литической фазе
включает латеральное разделение липидов, тогда использование веществ,
27

обладающих высокой поверхностной активностью, может быть наиболее


целесообразным.
1.3.Влияние амфифильных соединений на плазматическую мембрану клетки

Биологические мембраны представляют собой бислои с гидрофобным яд-


ром и гидрофильным окружением. Амфифильные соединения, т.е. вещества, мо-
лекулы которых объединяют в своем составе как гидрофильную, так и гидрофоб-
ную части, способны взаимодействовать с подобного рода структурами. Многие
лекарства, такие как анестетики и транквилизаторы, активность которых зависит
от взаимодействия с мембранами, являются амфифильными соединениями.
Анестетики – вещества, предотвращающие проведение нервного импульса –
оказывают существенное влияние и на чувствительность эритроцитов в условиях
стрессового воздействия, снижая, в частности, уровень гипотонического лизиса
[115]. Эти вещества способны изменять структурно-функциональное состояние
различных видов клеток, в том числе эритроцитов [188], тромбоцитов [98], бакте-
риальных клеток [41], клеток эндотелия [112], а также клеточных органелл [57].
В основе механизма взаимодейстия анестетиков с клеточными мембрана-
ми лежит свойство амфифильности их молекул. В водных системах полярная
часть молекулы (головка) гидрофильна, а неполярная (хвост) гидрофобна. Извес-
тен широкий набор амфифильных (амфипатических, дифильных) соединений.
Обычная классификация поверхностно-активных веществ основана на свойствах
гидрофильной части молекулы. В настоящее время выделяют неионные,
катионные, анионные и цвиттерионные поверхностно-активные вещества (ПАВ).
Гидрофобная часть молекулы может состоять из углеводородной цепи различной
длины, иногда она содержит ненасыщенные или ароматические фрагменты,
может быть частично или полностью галогенизирована, может иметь
разветвленную структуру, состоять из двух или более цепей. Многие молекулы
ПАВ, например, такие, как молекулы солей желчных кислот, имеют жесткую
структуру, в то время как углеводородные цепи характеризуются гибкостью.
28

Амфифильные молекулы имеют тенденцию собираться на границе раздела


двух фаз, где гидрофобные участки частично или полностью изолируются от во-
ды, а гидрофильные группы остаются погруженными в воду. Этой общей тенден-
цией объясняется их поверхностная активность, т.е. способность адсорбировать-
ся на границе раздела вода-воздух или вода-масло, или связываться с
макромолекулами. Та же двойственная тенденция, основанная на ассиметричном
строении молекул, обеспечивает образование различных структур, в частности,
бимолекулярных слоев. При образовании липидных мембран участвуют те же
силы и структурные особенности молекул. Дуализм молекул обусловливает
процессы самоассоциации в растворе, приводящие к образованию агрегатов, в
которых молекулы ориентированы таким образом, чтобы общая площадь
контакта гидрофобных групп с растворителем была минимальна.
При достижении определенных значений концентрации амфифильных со-
единений в растворе, их молекулы образуют коллоидные ассоциаты - мицеллы –
агрегаты из длинноцепочечных дифильных молекул. Значение этой концентра-
ции называется критической концентрацией мицеллообразования (ККМ) [29].
ККМ определяется как концентрация ПАВ, при которой возникает большое чис-
ло мицелл, находящихся в термодинамическом равновесии с молекулами в раст-
воре [29]. Показана связь между значением этой концентрации и коэффициентом
распределения вещества в системе мембрана-вода [105]. ККМ – это достаточно
определенная величина, однако в виду специфики веществ, в ряде случаев учи-
тывается узкая концентрационная область, в пределах которой определяется
ККМ. Этот концентрационный разброс обусловлен кооперативностью процесса
самоассоциации, в который вовлечены амфифильные молекулы. Считается, что
ниже ККМ мицеллы отсутствуют, а выше - изменения в концентрации свобод-
ных молекул пренебрежимо малы [29]. Так как мицеллы не обладают поверх-
ностной активностью, взаимодействие амфифильных веществ с клеточными
мембранами изучаются при докритических концентрациях этих соединений.
Величина ККМ зависит как от природы полярной части, так и от длины це-
пи молекулы [29, 44]. Следует отметить, что критическая концентрация мицелло-
29

образования катионных и анионных амфифильных соединений значительно вы-


ше их незаряженных аналогов, что является проявлением сил электростатическо-
го отталкивания между заряженными головными группами молекул. При неиз-
менной полярной области молекулы увеличение длины углеводородных цепей
сопровождается уменьшением ККМ амфифильных веществ [44, 215]. Разветв-
ленная структура гидрофобного участка молекулы, а также наличие в углево-
дородной цепи двойных связей обуславливает более высокие значения ККМ [44].
При агрегировании амфифильные молекулы образуют структуры, характер
которых определяется балансом ван-дер-ваальсовых сил и водородных связей, с
одной стороны, и электростатического отталкивания между молекулами и стери-
ческих ограничений, с другой [215]. Амфифильные соединения в водной среде
способны организовываться в мицеллы, бислои, монослои, гексагональные или
кубические фазы. Тенденция к формированию различных структур определяется
как различиями в геометрии молекул амфифильных соединений (отношение
площади поперечного сечения к объему), так и соотношением гидрофильности и
гидрофобности в пределах одной молекулы [188, 136]. Основными физическими
характеристиками мицеллярных образований служат ККМ, число агрегации
(количество включенных в мицеллы молекул), размер частиц, гидрофильно-
гидрофобный баланс. Даже для типичных мицелл-образующих систем описыва-
ется примицеллярная агрегация [188]. Мицеллы полидисперсны, поэтому число
агрегации представляет собой наиболее вероятное число. Динамическая природа
этих агрегатов отражена в свойствах мономеров внутри мицеллы. Мономеры в
пределах мицеллы способны вращаться вокруг собственной молекулярной оси и
латерально диффундировать вдоль мицеллярной поверхности. В случае форми-
рования мицелл сурфактантами, гидрофобная часть которых представлена
алкильными цепями, отмечается также сегментальная подвижность [188].
Следует отметить, что мицеллы менее стабильны по сравнению с другими
агрегатами, в частности, бислоями.
Критическая концентрация мицеллообразования определяется условиями
внешней среды. ККМ неионных амфифильных веществ практически не зависит
30

от ионной силы раствора [178], в то время как для катионных и анионных амфи-
фильных соединений показано снижение ККМ с увеличением ионной силы
среды [44].
Взаимодействие детергентов с биологическими мембранами было
предметом исследования многих ученых. Результаты, полученные на чистых
липидных мембранах, позволяют выделить несколько последовательных этапов
такого взаимодействия вплоть до солюбилизации. Солюбилизация – это
способность растворов ПАВ, концентрация которых превышает ККМ,
растворять вещества мало- или совсем не растворимые в чистом растворителе.
Результат взаимодействия молекул амфифильного соединения с липидными
бислоями является функцией количества молекул указанного вещества [105, 136].
При повышении концентрации амфифильного соединения в растворе
взаимодействие детергент – бислой последовательно проходит несколько фаз.
На начальной стадии взаимодействия молекулы амфифила, стремясь
уменьшить поверхность контакта гидрофобного участка с водным раствором,
встраивается в фосфолипидный бислой. При этом полярная часть молекулы рас-
полагается на границе мембраны либо с внеклеточным раствором, либо с внутри-
клеточной средой, хвост оказывается обращенным в гидрофобную область би-
слоя. При определенных значениях количества молекул включенного в бислой
амфифильного соединения возникает кооперативный эффект. Следствием детер-
гент-детергентного взаимодействия является возникновение локальной дестаби-
лизация бислойной структуры в некоторых точках мембраны и ее фрагментация.
Дальнейшее добавление детергента приводит к формированию смешанных ли-
пид-детергентных мицелл, которые сосуществуют в термодинамическом равно-
весии с фосфолипидным бислоем, насыщенным детергентом. На последней ста-
дии фосфолипиды полностью солюбилизированы включением в мицеллярный
детергент [133]. Способность детергентов к эстракции интегральных мембран-
ных белков из биологических мембран в общем случае проистекает из их способ-
ности солюбилизировать мембранные липиды. Одновременно с удалением де-
31

тергентом существенной части липидов мембраны, гидрофобный сектор мемб-


ранных белков становится заключенным в слой защитной оболочки детергента.
Многие амфифильные соединения демонстрируют двоякий характер влия-
ния на эритроциты. В условиях гипотонического воздействия многие вещества в
низких концентрациях повышают сохранность клеток, в то время как в высоких
индуцируют гемолиз [190]. Такое двоякое поведение было также замечено у
классических сурфактантов [101, 188]. Указанный характер взаимодействия с
эритроцитами отмечается также для местных анестетиков, транквилизаторов, ан-
тигистаминных, противовоспалительных, наркотических веществ, полиеновых
антибиотиков, витамина А [190]. В начале литической фазы увеличивается про-
ницаемость мембраны для небольших веществ и ионов, подобных калию. Далее
гемолиз происходит по коллоидно-осмотическому механизму, размеры гемо-
литической поры увеличиваются и клетка теряет внутриклеточные белки [188].
Встраивание экзогенных амфифильных молекул в эритроцитарную мемб-
рану сопровождается изменением ряда ее характеристик. В частности, показано
изменение текучести мембраны [62, 130]. При концентрациях амфифильных ве-
ществ ниже ККМ наблюдается изменение формы клеток. Эритроциты, в
результате обработки амфифильными агентами, могут трансформироваться как в
шиповидные сферы – эхиноциты, так и в инвагинированную чашкообразную
форму – стоматоциты. Автор работы [78] обнаружил, что большинство веществ,
приводящих к кренированию эритроцитов, были анионными соединениями
(жирные кислоты, барбитураты), в то время как стоматоцитогенность была
свойственна катионным веществам (фенотиазинам, местным анестетикам).
Для объяснения индуцированной амфифильными молекулами транс-
формации эритроцитов, авторы работ [192, 194] сформулировали так называе-
мую гипотезу сопряженного бислоя. В ее основе лежит представление о бислое,
состоящем из близко расположенных и сопряженных монослоев, способных раз-
личным образом перестраиваться, оставаясь при этом связанными друг с другом.
Они предполагают, что возможно расширение одного монослоя в плоскости
мембраны по отношению к другому без нарушения Ван-дер-Ваальсовых взаимо-
32

действий между монослоями. Преимущественное включение молекул амфи-


фильного соединения в один из монослоев приводит к его расширению по отно-
шению к другому. Полагают, что расширение внутреннего монослоя при включе-
нии в него амфифильных молекул приводит к появлению стоматоцитов, а увели-
чение площади наружного монослоя по отношению к внутреннему – к образова-
нию эхиноцитарных форм. Как правило, анионные амфифильные соединения яв-
ляются эхиноцитогенными, а катионные – стоматоцитогенными [192]. При более
высоких концентрациях оба вида соединений приводят эритроциты к
сферификации и лизису.
Различия в локализации экзогенных анионных и катионных амфифильных
молекул в бислое обусловлены энергетически предпочтительным взаимо-
действием катионных молекул с отрицательно заряженными фосфолипидами во
внутреннем монослое [106, 133]. Существует мнение, что амфифильные молеку-
лы проникают во внутренний монослой путем пассивной диффузии [59, 209].
Способные к протонированию катионные молекулы, например, молекулы хлор-
промазина, в нейтральной форме быстро диффундируют через наружный и
встраиваются во внутренний монослой липидного бислоя. Наблюдаемое при
этом изменение формы дискоцит – стоматоцит происходит практически мгновен-
но. В случае медленного распределения молекул амфифильного вещества во
внутренний монослой (например, четвертичные амины), трансформация проис-
ходит по схеме дискоцит – эхиноцит – стоматоцит, отражая преимущественную
локализацию амфифильных молекул в данный момент времени в монослоях би-
слоя [192]. Амфифильные молекулы, которые не могут диффундировать во внут-
ренний монослой, являются эхиноцитогенными. Однако в ряде работ показано,
что заряд полярной части амфифильной молекулы не всегда определяет преиму-
щественную локализацию молекул в мембране, и катионные амфифильные со-
единения могут инициировать образований эхиноцитов, а анионные вызывать
стоматоцитоз [97, 113]. Встраивание молекул амфифильной природы в липидные
мембраны определяется температурой, с ее повышением встраивание
амфифильных молекул облегчается [210].
33

При исследовании коэффициентов распределения 15 неионных и


цвиттерионных амфифильных веществ на границе мембрана/вода в системе с
фосфолипидными везикулами, авторы работы [105] показали следующие
зависимости между коэффициентом распределения молекул амфифильного
соединения и величиной его ККМ. Разрушение мембраны классическими
детергентами происходило при значениях указанных параметров,
соответствующих равенству КхККМ=1. «Сильные» детергенты
характеризовались неравенством КхККМ<1, и разрушение бислоя происходило
при накоплении молекул амфифильного вещества в мембране в соотношении
детергента к липидам бислоя <1 (алкилмальтозиды, тритоны). Соотношение
между коэффициентом распределения мембрана-вода и величинами ККМ для
«мягких» детергентов было КхККМ>1, и для разрушения бислоя этими
соединениями необходимо большее количество молекул детергента по
отношению к липидам (алкилглюкозиды).
Хотя кооперативное связывание - это отличительная черта солюбилизации
детергентами, следует заметить, что эти два события не точно совмещены,
поскольку начало кооперативного связывания, в большинстве случаев, опережает
солюбилизацию белков и липидов. Неионные детергенты обычно не
взаимодействуют с цитоскелетными белками, но при встраивании их молекул в
клеточные мембраны может модифицироваться солюбилизация интегральных
мембранных белков [133].
Инкубирование эритроцитов в средах, содержащих предлитические
концентрации амфифильных соединений может сопровождаться отщеплением
микровезикул от клеточной мембраны [101, 102]. Эхиноцитогенные вещества
индуцируют образование экзовезикул, стоматоцитогенные вызывают
эндовезикуляцию. Авторы работы [85] полагают, что образование везикул
является реакцией клетки на критическое изменение площади ее поверхности
при встраивании предельного количества молекул амфифильного вещества.
Исследование встраивания амфифильных молекул в бислойные мембраны
в настоящее время эффективно производится с использованием
34

высокочувствительного метода изотермической титрационной калориметрии


[106, 220, 221]. Этот метод позволяет выявить многие параметры связывания,
например, коэффициент распределения вещества в мембране, свободную
энергию и энтропию перехода, вычислить ККМ соединений, возможно получить
информацию об ассимметричном распределении вещества между монослоями
бислоя мембраны [106].
Авторами работ [133, 173, 187] показано, что при встраивании
амфифильных молекул в клеточную мембрану происходит трансбислойное
перераспределение липидов бислоя. Быстрое проникновение молекул катионного
амфифильного соединения хлорпромазина в мембрану сопровождается
перераспределением аминофосфолипидов из внутреннего во внешний монослой
мембраны и противоположно направленным движением холинпроизводных
липидов [182, 187]. По мнению авторов [114], подобное бысрое
перераспределение как мембранных липидов, так и амфифильных молекул
экзогенного происхождения возможно посредством образования небислойных
фаз. Энергия перехода от бислойной к небислойной конфигурации амфифильных
молекул ниже энергетического барьера гидрофобной области мембраны, что
свидетельствует в пользу подобного механизма распределения амфифильных
молекул в мембране. Образование временных небислойных фаз амфифильными
соединениями отмечается и в работах [182, 189]. Вероятно, возможность
формирования небислойных, в частности, гексагональных фаз предотвращает
перегрузку внешнего монослоя липидного бислоя при встраивании молекул
амфифильных соединений, и способствует быстрой реорганизации липидного
бислоя без нарушения целостности мембраны [114].
Повреждение клеток в результате различных стрессовых воздействий
может быть существенно снижено под влияние процессов, сопровождающих
встраивание амфифильных молекул в плазматическую мембрану. Показано, что
производные фенотиазина встраиваются в эритроцитарную мембрану с
достаточно высоким коэффициентов распределения [137, 151], и способствуют
снижению уровня гипотонического, холодового и вирус-индуцированного
35

гемолиза [48, 100, 151]. Для объяснения механизма гипертонического гемолиза


эритроцитов ряд авторов привлекают представления о формировании
трансмембранных дефектов вследствие определенной упорядоченности
компонентов клеточной мембраны в условиях высокой тоничности внеклеточной
среды [18, 135]. Следовательно, факторы, способствующие реорганизации
липидного бислоя, будут оказывать влияние на ход процессов, сопровождающих
гипертоническое повреждение эритроцитов. Положительно заряженные
амфифильные соединения вызывают изменение организации мембранных
фосфолипидов [189], причем, как для любого амфифильного соединения,
наблюдается их действие на эритроциты является концентрационно зависимым.
Центральным вопросом, относящимся к снижению амфифильными
соединениями уровня лизиса эритроцитов при изменении осмотических условий
среды, является вопрос о механизме антигемолитического действия. Первичным
звеном этого механизма может явиться собственно процесс распределения
молекул амфифильного вещества в липидных бислой [162]. При высоком
коэффициенте распределения концентрация молекул амфифильного соединения
в клеточной мембране может достигнуть уровня, при котором начинает расти
латеральное давление в пределах бислоя, что, в частности, может стать фактором,
накладывающим ограничения на увеличение периметра трансмембранных пор.
Соответственно, лишь эффекта изотропного «сдавливания» может быть
достаточно для предотвращения лизиса клеток. Дополнительным фактором
может являться влияние молекул амфифильного соединения на процесс
разделения фаз в плоскости бислоя, так как при их встраивании в мембрану
динамика фазовых изменений становится более комплексной, в том числе за счет
способности амфифильньных молекул формировать собственные фазы. Следует
учитывать также эффекты, связанные с наличием заряженных групп – фактором,
в значительной степени контролирующим взаимодействия как в пределах
цитоскелетной сети, так и между цитоскелетом и мембраной. Способность
молекул амфифильных соединений создавать высокую локальную концентрацию
агента, в случае катионных и анионных соединений, может оказывать
36

существенное влияние на взаимодействие белков и липидов, молекулы которых


включают группы, несущие заряд. Например хлорпромазин, являющийся
катионным производным фенотиазина, может способствовать усилению
взаимодействий молекул, несущих отрицательный заряд, вследствие его
нейтрализации. Последнее может относиться, в частности, к взаимодействиям
спектрина с цитоплазматической поверхностью мембраны, опосредуемым
кислым фосфолипидом фосфатидилсерином. Способность амфифильных
молекул распределяться на границе разделения фаз предполагает специфическое
взаимодействие гидрофобных сегментов молекулы экзогенного амфифильного
соединения с липидами, характер которого в той или иной степени должен
проявляться в изменении упаковки липидных молекул [150]. Такое изменение
может противостоять изменениям, вызванным осмотическим обезвоживанием
клеток в гипертонической среде.
В то же время следует отметить, что при значительном количестве
экспериментальных данных, относящихся к эффектам амфифильных соединений
при действии на клетки стрессовых факторов, остается ряд нерешенных
вопросов. Не определена связь между направленностью и глубиной
модифицирующего влияния амфифильного соединения и структурой его
молекулы. Требует изучения влияние параметров среды (ионная сила,
осмолярность, температура) на эффективность влияния амфифильных
соединений при действии на эритроциты осмотического и температурного
стресса. Не известно, в какой степени эффекты амфифильных соединений могут
изменяться при сочетанном действии на клетки этих соединений и других
химических модификаторов, способных оказать влияние на структуру мембраны
и ее белкового скелета. Эти вопросы требуют своего решения, и эритроцит
является удобным экспериментальным объектом для исследований, проводимых
в этом направлении.
37

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение эритроцитов

Объектом исследования служили эритроциты, полученные из свежей


или свежеконсервированной донорской крови, предоставленной
Харьковской областной станцией переливания крови. Для консервации
крови применялся консервант Глюгицир. С целью унификации объекта, в
работе использовали кровь II группы, полученную от доноров-мужчин.
Сроки хранения крови – не более 5 дней. После удаления плазмы
эритромассу трижды отмывали путем центрифугирования при 1500 g в
течение 3 мин в 10-кратном объеме физиологического раствора
(0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный буфер, pH 7,4). Супернатант и
лейкоцитарную пленку удаляли методом аспирации. Эритроциты в виде
плотного осадка хранили при 4 С и использовали в течение 4 часов.

Гипертонический стресс эритроцитов

Гипертоническое воздействие осуществляли перенесением равных


аликвот суспензии контрольных клеток и клеток, подвергшихся
предварительной дегидратации в умеренно гипертонических растворах, в
1 мл высококонцентрированного раствора NaCl (2,0, 3,0 или 4,0 Моль/л),
гематокрит 0,4 %. Перенесение и экспозицию эритроцитов в
гипертонической среде в течение 5 мин осуществляли при заданной
температуре (0 или 37С). Далее целые клетки осаждали
центрифугированием при 1500 g в течение 3 минут. Количество
гемоглобина в супернатанте определяли спектрофотометрически.
38

Предварительную дегидратацию эритроцитов производили


перенесением 50 мкл суспензии эритроцитов в растворы с различными
концентрациями NaCl (0,15 – 1,00 Моль/л) при заданной температуре
(0 или 37 С), и инкубировали в течение 2 мин.

Определение уровня гипертонического гемолиза эритроцитов

Уровень лизиса клеток, подвергнувшихся воздействию


высококонцентрированных солевых сред, определяли по светорассеянию
гемоглобина в супернатанте на спектрофотометре СФ-4А с проточной
кюветой при длине волны 543 нм. Выход гемоглобина из клеток
рассчитывали в процентах по отношению к 100 % - му гемолизу
эритроцитов в присутствии 0,1 % раствора тритона Х-100. Количество
повторений в серии эксперимента - не менее 6 в двух параллельных
пробах. Для всех образцов производили вычисление среднего
арифметического значения и значения среднеквадратичного отклонения
значения гемолиза. Каждый из представленных в работе графиков отражает
результаты из серии опытов одного эксперимента, выраженные в среднем
арифметическом значении уровня гемолиза эритроцитов с
соответствующим разбросом значений этой величины.

Вычисление антигемолитической активности амфифильного


соединения.

Для выражения эффективности амфифильного соединения


использовали понятие антигемолитической активности. Значение
максимальной антигемолитической активности (АГ max) амфифильного
соединения в серии опытов одного эксперимента представляет собой
среднюю арифметическую величину из значений максимальной
39

антигемолитической активности данного соединения, рассчитанных по


формуле:
Г  Гамф.
АГ 
Г
 100% , где Г - величина гемолиза эритроцитов в данных

экспериментальных условиях в отсутствие амфифильного вещества; Г амф -


минимальная величина гемолиза эритроцитов в присутствии
амфифильного вещества.

Динамика гемолиза эритроцитов и ее зависимость от температуры

Для регистрации динамики гипертонического гемолиза эритроцитов


в работе была использована установка для измерения малоуглового
светорассеяния (расходимость светового пучка 3) клеточных суспензий,
созданная на базе монохроматора СФ-4А. Описание метода анализа клеток,
основанном на измерении рассеяния света, представлено в работах [14, 16,
163].
Уровень гемолиза эритроцитов как функцию времени определяли
путем регистрирации изменения во времени оптической плотности
суспензии эритроцитов (длина волны 720 нм). Концентрация суспензии
эритроцитов в кювете составляла (1,7 - 3,5) х 10 6 кл./мл. В
рассматриваемом концентрационном диапазоне оптическая плотность
клеточной суспензии прямо пропорциональна количеству интактных
клеток. Светорассеяние теней, образующихся в процессе лизиса
эритроцитов, и поглощение света гемоглобином при указанной длине
волны пренебрежимо малы [28, 43].
Скорость гемолиза эритроцитов определяли как тангенс угла наклона
касательной, проведенной к кинетической кривой изменения оптической
плотности суспензии эритроцитов, помещенных в
высококонцентрированные солевые среды [19].
40

Морфологические изменения эритроцитов в процессе


гипертонического гемолиза

Для решения задачи регистрации и анализа морфологических


изменений клеток в процессе гемолиза была выбрана оптико-электронная
система, описанная в [42].
Полученные по описанной методике эритроциты помещали в
4,0 Моль/л раствор NaCl при комнатной температуре. После
перемешивания суспензии пробу в виде капли переносили на предметное
стекло микроскопа, наблюдения проводили на световом микроскопе
БИОЛАМ в проходящем свете. Регистрация морфологических изменений
клеток начиналась через 12-15 секунд после внесения клеток в
гипертоническую среду. Для регистрации динамических изменений клеток
видеопоток с передающей телевизионной камеры на основе ПЗС подавался
на вход платы видеозахвата компьютера. Частота кадров записи потока
составляла 25 кадров/сек (дискретность 40 мсек). Выбранные параметры
увеличения телевизионного микроскопа позволяли фиксировать
межкадровое изменение объектов в пределах характерных изменений их
размеров. Оригинальное программное обеспечение позволяло формировать
запись изображения с задаваемыми параметрами (длительность
видеофрагмента, частота кадров в нем, яркость и контрастность
изображения), просматривать видеозапись в реальном и задаваемом
масштабах времени.

Модификация эритроцитов трифторперазином

Модификацию клеток трифторперазином осуществляли в


оптимальной для температуры эксперимента концентрации – 3х10 -5 Моль/л
при 37 С. На этапе предварительной инкубации клеток в физиологической
среде эритроциты вносили в раствор, содержащий ТФП при температуре
41

37 С и инкубировали в течение 10 мин [47]. Супернатант удаляли, клетки


использовали в дальнейших экспериментах. На этапе предварительной
дегидратации и на этапе собственно гипертонического шока амфифильное
соединение присутствовало в солевой среде в указанной концентрации.

Модификация эритроцитов диамидом

Обработку эритроцитов диамидом проводили по методу,


предложенному авторами работы [94]. Суспензию эритроцитов (гематокрит
4 %) инкубировали в физиологическом растворе (0,150 Моль/л NaCl, 0,010
Моль/л фосфатный буфер, pH 8,0) с диамидом
(2,5; 5,0 и 10,0 мМоль/л) при температуре 37 С в течение 45 мин в
условиях постоянного перемешивания. По окончании времени инкубации
клетки трижды отмывали от диамида раствором, содержащим
0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный буфер, рН 7,4, и использовали в
дальнейшем в экспериментальной работе. Контролем служили эритроциты,
подвергшиеся аналогичным воздействиям в отсутствие сульфгидрильного
реагента.

Модификация эритроцитов фенилгидразином

Модификацию цитоскелета эритроцитов фенилгидразином


осуществляли в соответствии с методом [51]. Клетки в условиях
постоянного перемешивания (гематокрит 5 %) инкубировали в
физиологическом растворе (0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный
буфер, pH 7,4), содержащем фенилгидразин в концентрации 1 мМоль/л,
при температуре 37 С в течение 10 мин. В конце периода инкубации
эритроциты дважды отмывали физиологическим раствором и использовали
в последующей работе.
42

Ферментативная обработка эритроцитов

1. папаин
Модификацию клеток (гематокрит 20 %) папаином проводили по
методу [118]. Эритроциты инкубировали с папаином (1мг/мл) в
физиологическом растворе растворе (0,150 Моль/л NaCl, 0,010 Моль/л
фосфатный буфер, pH 7,4) при 37 С в течение 60 мин. Затем клетки
отмывали однократно средой, содержащей 0,15 Mоль/л NaCl, 0,1 %
сывороточный альбумин человека, 30 мг/мл фенилметилсульфонил фторид,
0,01 Моль/л фосфатный буфер, рН 7,4, далее - дважды холодным
физиологическим раствором (0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный
буфер, рН 7,4).

2. трипсин
При обработке эритроцитов трипсином (0,1 мг/мл) клетки
(гематокрит 20 %) инкубировали в среде, содержащей 75 мМоль/л KCl,
50 мМоль/л Na2SO4, 40 мМоль/л сахарозу, 10 мМоль/л HEPES, рН 7,4, в
течение 60 мин при 37 С. Клетки после обработки отмывали
физиологическим раствором (0,150 Моль/л NaCl, 0,010 Моль/л фосфатный
буфер, pH 7,4), содержащим 0,1 мг/мл соевого ингибитора трипсина, и
дважды - холодным физиологическим раствором [111].

3. проназа
Клетки (гематокрит 20 %) инкубировали с проназой (0,1 мг/мл) в
среде, содержащей 75 мМоль/л KCl, 50 мМоль/л Na 2SO4, 40 мМоль/л
сахарозу, 10 мМоль/л HEPES, рН 7,4, в течение 60 мин при 37 С.
Эритроциты отмывали физиологическим раствором, содержащим 1 мМ
фенилметилсульфонил фторид, и дважды - холодным физиологическим
раствором [111].
43

4. нейраминидаза
Обработку клеток (40 % гематокрит) нейраминидазой проводили по
методу [152]. Эритроциты инкубировали с ферментом в среде,
содержащей 0,15 Моль/л NaCl, 1 мг/мл глюкозу, в течение 60 мин при
37 С в условиях постоянного перемешивания. По завершении времени
инкубирования эритроциты трижды отмывали холодным физиологическим
раствором.
Модифицированные ферментами эритроциты хранили при
температуре 4 С не более 30 мин.

Исследование барьерных свойств эритроцитарной мембраны.

Количество ионов калия, вышедших из эритроцитов в присутствии


амфифильных соединений, определяли методом атомно-абсорбционной
спектрофотометрии [38]. Измерения проводили на спектрофотометре
С-115-М1 в режиме эмиссии при длине волны 766,5 нм, пламя пропан-
воздух, с использованием шкалы концентраций. Предел обнаружения
0,0008 мг/л. Для получения градуировочных растворов использовали соли
NaCl и KCl квалификации "осч", после испарения воды при 120 С.
Градуировку перед измерением проводили с использованием
градуировочных растворов, содержащих 0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 10,0; 15,0;
20,0 мг/л калия. Разбавление исследуемых проб проводили таким образом,
чтобы концентрации разбавленных растворов соответствовали диапазону
калибровки, затем эти разбавления учитывали в пересчете.
Содержание калия определяли в супернатанте образцов,
подвергнутых гипертоническому воздействию (температура 37 С) в
присутствии амфифильных веществ в эффективных концентрациях.
44

В работе были использованы следующие реактивы:


гексил-,D-глюкопиранозид (ГГП), октил-,D-глюкопиранозид (ОГП),
децил-,D-глюкопиранозид (ДГП) фирмы Calbiochem-Behring Corp.(USA),
тритон Х-100 (Merсk), диамид (Sigma), фенилгидразин (Sigma),
нейраминидаза (Serva), папаин (Merсk), проназа (Calbiochem-Behring
Corp.), трипсин (Calbiochem-Behring Corp.), HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)
piperasine-1-ethane-2-sulfonic acid) (Serva), и реактивы отечественного
производства квалификации “хч” и “чда”.

Статистическая обработка результатов


Полученные результаты обрабатывали по методу Стьюдента-Фишера.
45

ГЛАВА 3
ВЛИЯНИЕ ТРИФТОРПЕРАЗИНА НА РАЗВИТИЕ
ГИПЕРТОНИЧЕСКОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ В
ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И ИСХОДНОГО СОСТОЯНИЯ
КЛЕТОК

3.1. Морфологические изменения эритроцитов при гипертоническом


гемолизе

Известно, что в физиологических условиях эритроциты имеют


форму двояковогнутого симметричного диска. Перенесение клеток в
среды повышенной осмолярности сопровождается изменением ряда
клеточных характеристик, что находит свое проявление в изменении
формы эритроцитов. Обнаружено, что при перенесении клеток в среды
умеренной тоничности происходит кренирование эритроцитов [175], при
повышении тоничности внеклеточного раствора появляются плоские
диски различной формы [223]. По мнению авторов работ [139, 205],
кренирование клеток может сопровождаться локальной диссоциацией
цитоскелета от плазматической мембраны и образованию участков,
являющихся первичными зонами повреждения плазматической мембраны
клетки. В указанных зонах возможно нарушение барьерной функции
мембраны.
Ряд исследователей полагают, что эритроциты уплощенной формы
характеризуются наибольшую чувствительностью к действию сред
высокой тоничности и последующему снижению температуры
(гипертоническому криогемолизу) [175, 207].
При изучении морфологических изменений эритроцитов в процессе
гипертонического гемолиза было обнаружено, что гемолизу обезвоженных
в среде высокой тоничности клеток предшествует увеличение их объема и
46

переход в сферу [24, 40]. Авторы указанных работ предполагают, что


трансформация в этом случае связана с нарушением проницаемости
клеточной мембраны для ионов натрия, в норме не проникающих через
плазматическую мембрану. Увеличение объема эритроцита, следующее за
сопутствующим потоку ионов поступлением воды в клетку, при
определенных значениях гидростатического давления приводит к
образованию пор и разрывов мембраны эритроцитов [40].
С целью получения информации о морфологических изменениях
эритроцитов, перенесенных в 4,0 Моль/л раствор NaCl, мы использовали
оптико-электронную систему, описанную в [42]. Применение оптико-
электронной системы позволило с высокой точностью оценить временные
интервалы, в пределах которых происходят морфологические изменения
клеток. Частота кадров видеозаписи гемолиза клеток составляла
25 кадров/сек.
Регистрацию клеточной морфологии начинали через 12 - 15 сек
после внесения клеток в гипертоническую среду, наблюдение за
поведением эритроцитов в гипертоническом солевом растворе проводили
в течение 5 минут.
В начале регистрации все эритроциты были значительно
обезвожены и представляли собой уплощенные кренированные клетки и
сфероциты, сморщенные по всей поверхности. Лизис эритроцитов
происходил с различной скоростью, и анализ наблюдаемых изменений
позволяет говорить о том, что гемолиз в высококонцентрированном
солевом растворе происходил двумя различными способами. На рис. 3.1.1
и 3.1.2 показаны снимки примеров ответа клетки на перенесение в
высококонцентрированную солевую среду.
В первом случае (рис. 3.1.1) клетка, представляющая собой
обезвоженный сфероцит, за короткий промежуток времени (0,04 сек)
претерпевает ряд изменений, приводящих к утрате целостности мембраны
и выходу гемоглобина. В последующем наблюдается снижение
47

А Б В

Г Д Е

Ж З И

Рис. 3.1.1 Развитие гипертонического гемолиза эритроцитов после


перенесения в 4,0 Моль/л NaCl (промежутки времени, сек):
А – 5,36 Б – 5,40 В – 5,44
Г - 5,48 Д – 5,56 Е - 5,64
Ж – 5,72 З – 5,80 И- 5,88.

контрастности изображения клетки и формирование тени. Следует


отметить, что изменение площади видимой поверхности клетки в этом
случае не предшествует и не сопровождает процесс гемолиза. Лизис и
48

А Б В Г

Д Е Ж З

И К Л М

Рис. 3.1.2 Развитие гипертонического гемолиза эритроцитов после


перенесения в 4,0 Моль/л NaCl (промежутки времени, сек):
А – 33,80 Б – 34,12 В – 34,20 Г – 34,60
Д – 35,00 Е – 35,40 Ж – 35,80 З – 36,20
И – 37,00 К – 37,40 Л – 38,20 М – 38,92

образование тени в этом случае завершаются в течение 0,44 сек.


Проведенные наблюдения за обезвоженными сфероцитами
свидетельствуют о том, что время лизиса клеток по указанному
механизму не превышает 1 сек, т.е. процесс лизиса можно назвать
быстротекущим.
В случае уплощенного кренированного эритроцита,
представленного на рис. 3.1.2, наблюдается сглаживание поверхности его
49

мембраны с постепенным увеличением площади изображения. Клетка


такого типа трансформируется в сферу, и ее изображение впоследствии
теряет контрастность. Наблюдаемые морфологические изменения
позволяют предположить, что гемолизу эритроцитов в гипертонической
среде может предшествовать переход в сферу, и гемолиз клеток этого типа
имеет признаки коллоидно-осмотического. Наблюдение за клетками,
имеющими форму уплощенного диска, показывает, что процесс лизиса
завершается в течение 4-5 сек.
Таким образом, повреждение клеток в высококонцентрированном
солевом растворе, по-видимому, происходит по двум различным типам:
быстрый лизис связан с разрывом мембраны обезвоженной клетки,
медленный – с нарушением барьерных свойств эритроцитарной мембраны
при перенесении клеток в высококонцентрированный солевой раствор.
Полученные нами результаты согласуются с данными, полученными в
работе [40].
Авторы работы [120] показали, что контроль формы эритроцитов
происходит при непосредственном взаимодействии цитоскелета с
липидным бислоем мембраны. Гетерогенность клеточной популяции
проявляется в различной динамике дегидратации клеток.
Можно предположить, что при нарушении свойств
полупроницаемости эритроцитарной мембраны из клетки происходит
выход ионов К +, в клетку из внеклеточного раствора поступают ионы Na+,
которые в норме можно считать непроникающими. Перепад концентраций
ионов натрия на мембране исчезает, и вход молекул воды, обусловленный
нескомпенсированным онкотическим давлением внутриклеточных белков,
приводит к увеличению объема обезвоженной клетки и наблюдаемой нами
сферификации.
Ряд исследователей полагают, что следует говорить не о нарушении
барьерных свойств мембраны, а об изменении ее транспортных
характеристик. Исследователями [55] выявлено наличие “остаточного”
50

потока калия при ингибировании с помощью оубаина, буметанида и ЭГТА


сравнительно хорошо изученных транспортных путей для данного иона
(Na +/K+ насоса, Na+/K+/2Cl- котранспорта, Ca2+-активируемых
K+ каналов). Изучение этого потока привело к открытию
K+(Na+)/H+ переносчика, работа которого зависит от ионной силы
внеклеточного раствора [129].
Мы не исключаем, что сравнительно медленное изменение объема
дегидратированного эритроцита, предшествующее гемолизу клетки по
второму механизму, может быть обусловлено и работой переносчика. В
этом случае вход ионов натрия и сопутствующий ему поток воды
приводят к увеличению объема клетки и последующему ее лизису.
Быстрый гемолиз клеток в этой модели может рассматриваться как
пример отсутствия в клеточной мембране указанного переносчика, либо
его неактивного состояния. В таком случае в мембране клетки,
обезвоженной в 4 Моль/л растворе, возникает вероятностно
обусловленный разрыв, через который и происходит выход молекул
гемоглобина.
По нашему мнению, описанная модель изменений транспортных
характеристик клеточной мембраны, связанных с работой пререносчика в
условиях гипертонического воздействия на эритроциты, может быть
применима к небольшому числу клеток. Следует обратить внимание, что
регистрацию морфологических изменений клеток в гипертонической
среде начинали на 12–15 сек после перенесения эритроцитов в
высококонцентрированный солевой раствор. К этому времени по нашим
данным, полученным методом малоуглового светорассеяния,
прогемолизировало уже более 30 % эритроцитов от числа клеток,
лизировавших в образце.
Эритроциты представляют собой достаточно гетерогенную
популяцию, изучению свойств которой в последнее время уделяется
достаточно много внимания. Выявленные нами два типа
51

гипертонического гемолиза эритроцитов и полученные временные


характеристики этого процесса, по всей видимости, являются отражением
гетерогенности клеточной популяции.
52

3.2. Влияние предварительной дегидратации эритроцитов на уровень


гипертонического гемолиза в присутствии трифторперазина

Моделирование условий замораживания в экспериментах по


осмотическому воздействию на клетки в зоне положительных температур
позволило установить, что чувствительность эритроцитов к высоким
концентрациям солей можно направленным образом изменять [35]. Одним
из возможных подходов можно назвать частичное обезвоживание клеток.
Предварительная дозированная дегидратация эритроцитов может
способствовать повышению их устойчивости к последующему действию
высококонцентрированных солевых сред [37]. Известна также
способность веществ амфифильной природы снижать показатели
повреждения клеток в условиях пониженной осмотичности внеклеточной
среды [100, 114, 158]. Способность фенотиазинов протектировать клетки
от повреждений в условиях холодового и гипотонического шока, а также
снижать вирус-индуцированный гемолиз [48, 100, 151] дает основания
предполагать, что и в условиях гипертонического воздействия эти
соединения, обладающие поверхностной активностью, будут снижать
уровень гемолиза эритроцитов.
Структурно-функциональное состояние клеточной мембраны в
условиях варьирования ряда параметров внешней среды, таких как
тоничность, ионная сила, рН и температура раствора, претерпевает
существенные изменения. Встраивание экзогенных амфифильных
молекул в плазматическую мембрану эритроцитов сопровождается
изменением ее организации, в связи с этим мы рассматриваем эффект
амфифильного вещества в условиях изменения температуры как фактора,
обусловливающего изменение клеточной реакции на стрессовое
воздействие в случае гипертонического гемолиза эритроцитов при их
перенесении в высококонцентрированные солевые среды.
53

Трифторперазин является положительно заряженным производным


фенотиазина.

CF3
N

CH 2 -CH 2 – N N +- CH 3

Зависимости гипертонического гемолиза от концентрации ТФП в


литической среде и от температуры эксперимента, приведены на рис.
3.2.1. Уровень лизиса эритроцитов в средах, содержащих 4,0 Моль/л
раствор NaCl в отсутствие ТФП, составляет 60 - 80 % в зависимости от
температуры литической среды.
Данные, представленные на этом рисунке, демонстрируют двоякий
характер действия амфифила на гипертонический гемолиз эритроцитов.
При определенных концентрациях ТФП снижает уровень гемолиза
эритроцитов при всех температурных режимах эксперимента.
Концентрации вещества, при которых наблюдается максимально
выраженная защита эритроцитов, являются эффективными (далее -
эффективные или оптимальные). Повышение содержания указанного
соединения в лизирующей среде свыше оптимальных значений
сопровождается увеличением степени повреждения эритроцитов в
гипертоническом растворе NaCl. Более того, значительное превышение
эффективных концентраций может приводить к возрастанию уровня
54

гемолиза по сравнению с клетками, лизирующими в отсутствие


амфифила.
Степень защитного действия, а также значение концентрационного
оптимума вещества определяется, как это видно из данных,
представленных на рис 3.2.1, температурой лизирующей среды.
Максимальной сохранности эритроцитов, помещенных в 4,0 Моль/л
раствор NaCl при 0 С, соответствует уровень гемолиза 40 %, при 37 С –
10 %. С повышением температуры от 0 до 37 С смещается и значение
эффективной концентрации ТФП от 1 х 10-5 при 0 С до 2 х 10-5 и 3 х 10-5
при 22 С и 37 С, соответственно. Таким образом, максимальное

90

80
3

70 2
1
60
Гемолиз,%

50

40

30

20

10

0
10-6 10-5 10-4
Концентрация ТФП,Моль/л

Рис. 3.2.1 Влияние ТФП на гипертонический гемолиз эритроцитов


в 4,0 Моль/л NaCl при температурах 0, 22 и 37 С
(1, 2, 3, соответственно).

снижение чувствительности эритроцитов к действию гипертонического


55

стресса наблюдается при температуре 37 С и составляет 70 %, т.е. ТФП


выявляет наибольшую эффективность при физиологической температуре.
Аналогичные зависимости были получены авторами в работе [20].
При охлаждении и повышении осмолярности среды в мембране
происходит фазовое разделение липидов и формируются микродомены с
различной текучестью [75, 180]. Известно, что производные фенотиазина
распределяются в мембрану с достаточно высоким коэффициентом
распределения [137, 151], причем их сродство к липидам в жидко-
кристаллическом состоянии значительно выше, чем к липидам,
находящимся в состоянии геля [103]. Поэтому встраивание ТФП в
клеточную мембрану при низкой температуре может приводить к его
преимущественному включению в жидко-кристаллические домены в
высоких локальных концентрациях, приводя к увеличению уровня
гипертонического гемолиза.
При увеличении концентрации амфифильных соединений до
значений, ниже критической концентрации мицеллообразования,
происходят существенные перестойки на мембранном уровне, в результате
которых возможно проявление этими соединениями детергентных свойств.
Этим объясняется применение поверхностно-активных веществ, в
частности, амфифильных соединений, для солюбилизации мембранных
компонентов эритроцитов [133, 188].
Уменьшение эффективных концентраций указанного соединения при
понижении температуры свидетельствует, на наш взгляд, о сокращении
площади жидко-кристалических областей мембраны, в которые может
происходить встраивание молекул ТФП при данной низкой температуре.
Это согласуется с данными работы [151], в которой показано, что
коэффициент распределения трифторперазина между мембраной
эритроцита и буфером при 4 С ниже, чем при 37 С.
56

Как уже отмечалось, предварительная дозированная дегидратация


клеток может приводить к повышению сохранности эритроцитов при их
последующем перенесении в высококонцентрированные солевые среды.
Авторы [37] полагают, что предварительная частичная дегидратация
эритроцитов в средах, содержащих 0,4 – 0,5 Моль/л NaCl, приводит к
формированию некоторого стабильного состояния клеток. Особая роль в
формировании устойчивости эритроцитов к перенесению в среды с
высоким содержанием электролита отводится состоянию комплекса
цитоскелет-мембрана. В частности, авторы работ [37] указывают на
важность характера ассоциации – диссоциации белка полосы 3 с
периферическими белками мембраны.
Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение
комбинированного действия трифторперазина, присутствующего в
литической среде (4,0 Моль/л раствор NaCl) в эффективной концентрации,
и частичной дегидратации эритроцитов. Результаты совместного действия
дозированной дегидратации и амфифила на уровень гипертонического
повреждения эритроцитов представлены на рис 3.2.2. Максимальная
сохранность эритроцитов в 4,0 Моль/л растворе NaCl в присутствии ТФП
отмечается для клеток, которые были предварительно проинкубированы в
средах, содержащих 0,15 – 0,6 Моль/л NaCl (уровень гемолиза
примерно 10 %). Повреждение клеток в тех же условиях, но без ТФП,
составляет 50 – 80 %.
Дальнейшее повышение концентрации среды прединкубации
приводит к резкому увеличению гемолиза эритроцитов в 4,0 Моль/л
растворе NaCl, однако защитное действие амфифила наблюдается и в
диапазоне концентраций дегидратирующей среды, который авторами [20]
определется как зона неустойчивости – 0,7 – 0,8 Моль/л NaCl. Таким
образом, изменения, вызванные инкубацией эритроцитов в умеренно
гипертонических растворах, детерминируют степень последующего
защитного действия амфифила.
100
57
90
80
1
70
60
Гемолиз,%

50
40
30
20
2
10
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Концентрация NaCl, Моль/л

Рис. 3.2.2 Влияние предварительной инкубации эритроцитов в средах,


содержащих 0,15 – 1,0 Моль/л растворы NaCl, на уровень
гипертонического гемолиза эритроцитов при перенесении в 4,0 Моль/л
раствор NaCl), в присутствии ТФП ( 3х10-5 Моль/л ) – кривая 2, и в его
отсутствие – кривая 1. Температура лизирующей среды 37 С.

Ряд исследователей полагают, что защитное действие производных


фенотиазина при гипотоническом [53] и гипертоническом [47] воздействиях
связано с его влиянием на цитоплазматический белок кальмодулин. ТФП
является ингибитором кальмодулина [15]. Этот белок, связываясь в
присутствии ионов кальция с основным белком цитоскелета спектрином,
способен оказывать влияние на состояние эритроцитарного цитоскелета. [15].
Кальмодулиновая сигнальная система, взаимодействуя с другими
сигнальными системами клетки, участвует в формировании клеточного ответа
на внешние воздействия [15, 26]. ТФП как ингибитор кальмодулина может
модифицировать кальмодулинзависимые системы клетки, изменяя либо
взаимодействие кальмодулина с компонентами белковой решетки, либо
активность кальмодулин-зависимых киназ, в частности, спектринкиназы.
58

Блокирование кальмодулина приводит к изменению уровня


фосфорилирования белков цитоскелета, их ионного окружения и уровня АТФ
в клетке [15].
59

Для того чтобы выяснить, связано ли защитное действие


трифторперазина с его способностью оказывать влияние на активность
кальмодулина, мы использовали подход, позволяющий выявить этап
реализации протектирующих потенций вещества. Трифторперазин в
оптимальной для температуры эксперимента концентрации включали в состав
сред на разных этапах эксперимента. I этап представляет собой инкубацию
клеток в физиологическом растворе в течение 10 мин при температуре 37 С
[47]. II этап заключается в предварительной дегидратации эритроцитов в
течение 2 минут, III этап – этап собственно гипертонического лизиса в
4,0 Моль/л растворе NaCl. ТФП вносится в среды на различных этапах
эксперимента (схема к рис. 3.2.3, где “+” соответствует присутствию вещества
в среде).
В качестве сред предварительного обезвоживания клеток (этап II)
были выбраны растворы 0,45 и 0,7 Моль/л NaCl, инкубация в которых
определяла, соответственно, формирование стабильного и
метастабильного состояния клеток. Результаты влияния трифторперазина
на уровень гипертонического гемолиза эритроцитов после
предварительной инкубации в дегидратирующих средах представлены на
рис. 3.2.3. Видно, что присутствие амфифила на I и II этапах не снижает
уровень гемолиза эритроцитов при их последующем перенесении в
4,0 Моль/л раствор NaCl. Степень повреждения клеток в этом случае
определяется лишь состоянием эритроцитов, обусловленном их
предварительной дегидратацией.
60

100
90
80
70
Гемолиз, %

60
50
40
30
20
10
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
0
0,15 0,45 0,7
Концентрация NaCl, Моль/л

Рис. 3.2.3 Влияние ТФП ( 3х10-5 Моль/л ) на уровень гипертонического


гемолиза эритроцитов (4,0 Моль/л NaCl) после их предварительной
инкубации в растворах, содержащих NaCl в концентрациях 0,15, 0,45 и 0,7
Моль/л (температура 37 С). ТФП присутствовал в солевых средах в
соответствии со следующей схемой:
№ столбца диаграммыФиз. растворСреда прединкубации (0,15, 0,45 и 0,7
Моль/л NaCl)Гипертонический раствор NaCl (4 Моль/л)1
2
3
4
5
6
7
8-
+
-
+
+
+
-
--
-
+
+
+
-
+
--
-
-
+ 61
+
Относительно невысокие значения гемолиза отмечены в случае
+
прединкубации клеток в 0,45 Моль/л растворе NaCl. При увеличении
+
концентрации среды предварительной дегидратации до 0,7 Моль/л уровень
гемолиза эритроцитов в 4,0 Моль/л растворе NaCl существенно возрастает.
Введение амфифила в среду на этапе собственно гипертонического
гемолиза приводит к резкому снижению гипертонического повреждения
эритроцитов, причем присутствие ТФП на стадиях прединкубации и
предварительной дегидратации не оказывает существенного влияния на
уровень гипертонического гемолиза в этом случае.
Выраженное протектирующее действие ТФП, наблюдаемое в
случаях, когда амфифил присутствует в лизирующей среде только в
момент действия 4,0 Моль/л раствора NaCl, является показателем того, что
именно эта стадия является решающей в последовательности изменений
клетки, приводящих ее к лизису. Введение ТФП в лизирующую среду на
этом этапе позволяет увеличить сохранность клеток, причем защитный
эффект амфифила определяется степенью дегидратации эритроцитов на
этапе прединкубации.
Авторы работы [100] обнаружили способность ТФП уменьшать
125
связывание I- меченного кальмодулина с эритроцитарной мембраной.
Тот факт, что в результате предварительной обработки клеток ТФП не
изменяется их чувствительность к гипертоническому воздействию,
говорит в пользу того, что защитный эффект вещества реализуется не
через кальмодулин. Антигемолитический эффект, проявляемый
веществом в момент гипертонического воздействия на клетки,
предполагает участие ТФП в гемолитическом процессе, непосредственно
связанном с формированием и ростом мембранных дефектов.
Аналогичные данные были получены авторами [48] для менее активного
производного фенотиазина хлорпромазина.
Трифторперазин вызывает изменение формы эритроцитов по типу
дискоцит – стоматоцит. Для объяснения изменений формы под действием
62

различных амфифильные соединений Sheetz и Singer [192, 193]


сформулировали так называемую гипотезу сопряженного бислоя.
Согласно этой гипотезе, монослои мембранного бислоя представляют
собой близко расположенные и сопряженные структуры, относительное
изменение площади которых проявляется на макроскопическом уровне в
трансформации клетки. Полагают, что эхиноциты образуются при
расширении внешнего монослоя по отношению к внутреннему, а
стоматоциты – при расширении внутреннего по отношению к внешнему.
Как правило, анионные амфифилы являются эхиноцитогенными, в то
время как катионные – стоматоцитогенными. Т.е. в равновесии анионные
амфифилы находятся преимущественно во внешнем монослое, а
катионные расположены во внутреннем.
Локализация трифторперазина в бислое обусловлена энергетически
выгодным взаимодействием его положительно заряженных молекул с
отрицательно заряженными фосфолипидами внутреннего монослоя [193].
Полагают, что катионные амфифилы, которые могут протонироваться,
быстро диффундируют через бислой в нейтральной форме, и
захватываются внутренним монослоем в своей обычной заряженной
форме [46], вызывая при этом переход по типу дискоцит – стоматоцит.
Непротонируемые катионные молекулы распределяются изначально во
внешний монослой, и со временем диффундируют во внутренний. Схема
изменения формы клетки при этом следующая: дискоцит – эхиноцит –
стоматоцит. Встраивание молекул ТФП происходит по первой из
описанных схем, что проявляется в практически мгновенной
трансформации эритроцитов в присутствии амфифила. В течение
продолжительного времени авторы [113] не наблюдали дальнейшей
трансформации клеток, что позволило им утверждать, что
перераспределения молекул положительно заряженных фенотиазинов в
мембране не происходит.
63

Мы предположили, что степень протекции эритроцитов катионным


фенотиазином может определяется скоростью его встраивания в
клеточную мембрану, что, в свою очередь, по-видимому зависит от
величины поверхностного заряда эритроцита. Сиаловые кислоты,
входящие в состав гликопротеинов и гликолипидов, обусловливают
отрицательный заряд гликокаликса эритроцитов, препятствуя
образованию клеточных агрегатов в кровеносном русле. Для выявления
роли поверхностного заряда мембраны эритроцита в проявлении
антигемолитической активности положительно заряженного ТФП, мы
удаляли гликокаликс с помощью нейраминидазы. Затем клетки
инкубировали в 0,15 и 0,7 Моль/л растворах NaCl, после чего переносили
их в 4,0 Моль/л раствор NaCl. Полученные данные (рис. 3.2.4)
показывают, что90 обработка клеток нейраминидазой не влияет на
Антигемолитическая активность,% .

чувствительность эритроцитов к гипертоническому воздействию. Не


70
наблюдается изменений в проявлении антигемолитической активности
ТФП в случае контрольных клеток (0,15 Моль/л NaCl). Однако, для
50
метастабильных эритроцитов (0,7 Моль/л NaCl) отмечается существенное
снижение протективного
30 эффекта вещества.
Следовательно, уменьшение поверхностного заряда эритроцитов в
10
результате обработки клеток нейраминидазой не оказывает влияния на
1 2 3 1 2 3
проявление антигемолитической активности положительно заряженного
-10 А Б
ТФП (рис. 3.2.4). Авторы работы [165] показали, что способность
эритроцитов трансформироваться под действием как катионных, так и
Рис. 3.2.4 Влияние обработки клеток нейраминидазой на проявление
анионных амфифильных соединений не зависит -5 от состояния
антигемолитической активности трифторперазина (3 х 10 Моль/л ) при
гликокаликса. Исходя из вышеизложенного, можно полагать, что
перенесении эритроцитов в 4,0 Моль/л NaCl после предварительной
гликокаликс не вовлекается в механизм, ответственный за встраивание
инкубации в 0,15 Моль/л (А) и 0,7 Моль/л (Б) NaCl (температура 37 С).
амфифила в клеточную мембрану и не влияет на проявление
1 - ТФП, 2 - нейраминидаза, 3 - нейраминидаза + ТФП.
антигемолитической активности ТФП в условиях гипертонического
стресса эритроцитов. Хотя в условиях гипотонического воздействия на
эритроциты исследователи [57] обнаружили зависимость
64

антигемолитической активности катионного производного фенотиазина от


состояния гликокаликса клеточной мембраны. Это проявлялось в
снижении защитного эффекта вещества в результате ферментативной
обработки клеток.
В работе [31] показано, что амфифильные соединения, проявляя
антигемолитическую активность, в то же время не предотвращают выход
ионов калия из клеток в гипертонических условиях. Следовательно,
встраиваясь в эритроцитарную мембрану, молекулы трифторперазина
лишь препятствуют развитию трансмембранного дефекта до размера
гемолитической поры, и снижение уровня гипертонического гемолиза
эритроцитов в присутствии трифторперазина нельзя рассматривать как
повышение сохранности клеток в его присутствии.

Образование гипертонических трансмембранных дефектов при


перенесении эритроцитов в высококонцентрированные солевые среды
связано с осмолярностью лизирующей среды. Существует мнение, что
осмолярность контролирует процессы, связанные с формированием
трансмембранной поры, в то время как температура определяет ее
дальнейший рост. С учетом изложенного, представляло интерес
выявление действия ТФП в условиях гипертонического воздействия на
эритроциты солевого раствора различной силы.
Концентрация среды прединкубации также определяет характер
ответа эритроцитов на гиперосмотический стресс, в связи с чем для
дальнейших исследований мы обозначили две концентрации среды
дегидратации, детерминирующие состояние высокой гиперосмотической
устойчивости – 0,45 Моль/л NaCl, и состояние гиперосмотической
чувствительности – 0,7 Моль/л NaCl.
Данные, представленные на рис. 3.2.5 – 3.2.7, демонстрируют
влияние ТФП на уровень гипертонического гемолиза эритроцитов,
подвергшихся предварительной дегидратации в солевых растворах
65

указанных концентраций и перенесенных в 4,0 Моль/л раствор NaCl.


Температуру эксперимента и время гипертонического воздействия
варьировали. Видно, что степень повреждения эритроцитов определяется
выбранным температурным режимом: при 37 С (ближний ряд) уровень
лизиса клеток превышает соответствующие показатели, отмеченные при
0 С. С повышением концентрации лизирующего раствора NaCl от 2,0 до
4,0 Моль/л, уровень гипертонического гемолиза эритроцитов при
температуре 37 С возрастает. Однако, степень повреждения эритроцитов
при их перенесении в 4,0 Моль/л раствор NaCl зависит от того, в какой
среде предварительной дегидратации находились клетки (рис. 3.2.5 –
3.2.7).
66

Из данных рис. 3.2.5 видно, что повышение концентрации


лизирующей среды до 3,0 Моль/л и выше сопровождается увеличением
уровня гемолиза эритроцитов, прединкубированных в физиологических
условиях (40 % и более 80 % при 3,0 и 4,0 Моль/л, соответственно).
Изменение времени гипертонического воздействия до 30 мин не приводит
к росту показателей уровня гипертонического гемолиза при температуре

100

80

60
,%

40
е
Гмл
оиз

20

0
1 2 3 4
А 1 2 0C
3 4
Б 1 2 3 4 37 C
В
К о н ц е н т р а ц и я N a C l, М о л ь /л

Рис. 3 .2 .5 У ровень ги п ертони ческого гем о ли за эритроцитов,


п р е д и н к у б и р о в а н н ы х в 0 ,1 5 М о л ь /л N a C l в з а в и с и м о с т и о т к о н ц е н т р а ц и и
N a C l в л и т и ч е с к о й с р е д е ( А – 2 ,0 М о л ь /л , Б – 3 ,0 М о л ь /л , В – 4 ,0 М о л ь /л
N a C l), т е м п е р а т у р ы (3 7  С – б л и ж н и й р я д , 0  С – д а л ь н и й р я д ) и в р е м е н и
-5
и н к у б а ц и и ( 1 ,3 – 5 м и н у т , 2 ,4 – 3 0 м и н у т ) . К о н ц е н т р а ц и я Т Ф П : 1 х 1 0
М о л ь / л и 3 х 1 0 -5 М о л ь / л п р и 0 и 3 7  С , с о о т в е т с т в е н н о .
1 ,2 – к о н т р о л ь , 3 ,4 – Т Ф П .
П огреш ность п ри веден н ы х результатов н е п ревы ш ает 7 % .

37 С. При низкой температуре эксперимента в этом случае (30 мин)


67

наблюдается усиление гемолиза клеток, перенесенных в 3,0 Моль/л


раствор NaCl. Введение в лизирующую среду ТФП снижает
гипертонический гемолиз эритроцитов при перенесении их в среды всех
указанных концентраций. Следует отметить, что выраженность защитного
действия амфифила определяется температурным режимом: при 0 С

100

80

60
Гемолиз, %

40

20

0
1 2 3 4
А
1 2 0 C
3 4
Б 1 2 3 4 3 7 C
К о н ц е н тр а ц и я N aC l, М о л ь /л В

Р и с. 3 .2 .6 У р о в ен ь ги п ер то н и ч еск о го ге м о л и за эр и тр о ц и то в ,
п р ед и н к у б и р о в а н н ы х в 0 ,4 5 М о л ь /л N aC l в зав и си м о с ти о т к о н ц ен тр ац и и
N aC l в л и ти че ско й ср ед е (А – 2 ,0 М о л ь/л , Б – 3 ,0 М о л ь/л, В – 4 ,0 М о л ь/л
N aC l), т ем п е р ат ур ы (3 7 С – б л и ж н и й р я д , 0 С – д ал ьн и й р я д ) и в р ем ен и
и н к уб ац и и (1 ,3 – 5 м и н ут, 2 ,4 – 3 0 м и н у т). К о н ц ен тр ац и я Т Ф П : 1 х 1 0 -5
М о л ь/л и 3 х 1 0 -5 М о л ь/л п р и 0 и 3 7 С , со о тв ет ствен н о .
1 ,2 – к о н тр о л ь, 3 ,4 – Т Ф П .
П о гр еш н о сть п р и ве д ен н ы х р езу л ьта то в н е п р е вы ш ае т 7 % .
68

(дальний ряд) уровень гемолиза эритроцитов в присутствии ТФП


превышает соответствующие показатели, отмеченные для 37 С.

Изменение состояния эритроцитов их предварительной


дегидратацией в 0,45 Моль/л NaCl (рис. 3.2.6) и 0,7 Моль/л NaCl

100

80

60
лиз,%

40
ем
Г о

20

0
1 2 3 4
А 1 2 0C
3 4
Б 1 2 3 4 37C
В
К о н ц е н т р а ц и я N a C l, М о л ь /л

Рис. 3 .2 .7 У ровень ги п ер то н и ческо го гем о ли за эритроци тов,


п р е д и н к у б и р о в а н н ы х в 0 ,7 М о л ь /л N a C l в з а в и с и м о с т и о т к о н ц е н т р а ц и и
N a C l в л и т и ч е с к о й с р е д е ( А – 2 ,0 М о л ь / л , Б – 3 ,0 М о л ь / л , В – 4 ,0
М о л ь /л N a C l), т е м п е р а т у р ы (3 7  С – б л и ж н и й р я д , 0  С – д а л ь н и й р я д ) и
в р е м е н и и н к у б а ц и и ( 1 ,3 – 5 м и н у т , 2 ,4 – 3 0 м и н у т ) . К о н ц е н т р а ц и я Т Ф П :
-5 -5
1х 1 0 М о л ь /л и 3 х 1 0 М о л ь /л п р и 0 и 3 7  С , с о о т в е т с т в е н н о .
1 ,2 – к о н т р о л ь , 3 ,4 – Т Ф П .
П огреш н ость п ри вед ен н ы х результатов н е п ревы ш ает 7 % .

(рис. 3.2.7) показывает, что наиболее устойчивыми к гипертоническому


воздействию являются эритроциты, предварительно проинкубированные в
69

0,45 Моль/л NaCl. Гемолиз этих клеток развивается при перенесении


лишь в высококонцентрированный (4,0 Моль/л) раствор NaCl, менее
концентрированные среды не вызывают значительных повреждений
(рис. 3.2.6). Эритроциты, дегидратированные в 0,7 Моль/л растворе NaCl
(рис. 3.2.7), лизируют при перенесении уже в 2,0 Моль/л раствор NaCl.
Увеличение времени экспонирования эритроцитов в
гипертонических растворах от 5 до 30 мин приводит к повышению уровня
гемолиза эритроцитов при температуре 0 С на 10 – 30 %.
Амфифильное соединение оказывает выраженное протектирующее
действие на эритроциты при их перенесении во все используемые
гипертонические среды при 37 С, но, как видно из рис. 3.2.5 – 3.2.7,
степень защиты определяется условиями прединкубации. Гемолиз
эритроцитов, которые предварительно находились в 0,15 или 0,45 Моль/л
растворе NaCl, практически полностью подавляется трифторперазином
при всех величинах гиперосмотического стресса. Действие амфифила на
дегидратированные в 0,7 Моль/л растворе NaCl и перенесенные в
гиперосмотическую среду клетки зависит от величины стресса в конечной
среде: при перенесении в 2,0 Моль/л раствор NaCl уровень гемолиза
снижается примерно на 75 %, в 4,0 Моль/л растворе NaCl - примерно 50
%.
При температуре 0 С зависимость степени повреждения клеток в
присутствии амфифила от величины приложенного осмотического стресса
характерна для эритроцитов, предварительно инкубированных как в 0,7
Моль/л, так и в 0,15 Моль/л растворе NaCl. Степень защиты
трифторперазином эритроцитов при 0 С значительно ниже, чем при
37 С (рис. 3.2.5, 3.2.7). При 0 С, в отличие от физиологической
температуры, при увеличении времени инкубации эритроцитов в
лизирующей среде от 5 до 30 мин наблюдается увеличение уровня
гемолиза. Вероятно, повреждение клеток при низких температурах
70

развивается медленнее измерения в пределах 5 минут, но соразмерно


времени эксперимента.
Клетки, обезвоженные в 0,45 Моль/л растворе NaCl (рис. 3.2.6), в
присутствии ТФП демонстрируют минимальный уровень гемолиза при
всех величинах приложенного гипертонического стресса в любых
вариантах температуры. Изменение времени инкубации в лизирующей
среде в этом случае не приводит к изменению показателей гемолиза.
Гипертонический гемолиз эритроцитов является результатом
формирования и развития трансмембранных дефектов. Характер их
развития обусловливается как свойствами собственно мембраны клетки,
так и параметрами внешней среды. Динамика развития дефекта
определяется балансом сил, направленных, с одной стороны, на
увеличение размера поры, и, с другой стороны, на затекание дефекта в
липидном бислое.
Увеличение тоничности лизирующей среды, как видно из
представленных выше данных (рис. 3.2.5 – 3.2.7), по всей вероятности,
приводит к доминированию роста мембранной поры над процессами ее
репарации, о чем свидетельствует увеличение уровня лизиса эритроцитов.
Включение амфифила в состав гипертонической среды на этом этапе
гемолитического процесса приводит к мгновенному распределению его в
клеточную мембрану и интегральному изменению ее свойств [162].
Следствием перераспределения мембранных компонентов при включении
экзогенных амфифильных молекул в мембрану может являться изменение
баланса действующих на пору сил, в результате чего предсуществующие
мембранные дефекты не разовьются до размеров, соизмеримых с
размерами молекулы гемоглобина.

Кроме того, как показано в модельных экспериментах, катионные


фенотиазины способны оказывать влияние и на скорость замыкания
мембранных дефектов [26, 87].
71

Температура среды оказывает влияние на этот процесс, изменяя


энергию взаимодействия компонентов мембраны эритроцитов, и,
следовательно, условия развития трансмембранной поры. При низкой
температуре для формирования поры необходимы большие
энергетические затраты, а при 37 С процессы, сопровождающие лизис,
облегчаются. Этим объясняется тот факт, что при 37 С гипертонический
гемолиз клеток отмечается при меньших значениях тоничности
лизирующей среды, по сравнению с аналогичными величинами при 0 С,
и достигает больших величин.
Выраженность антигемолитической активности ТФП определяется
исходным состоянием эритроцитов. Защитный эффект ТФП был наименее
выражен в случае метастабильных клеток, барьерные функции которых
были модифицированы на этапе прединкубации. В частности в работе
[46] показано, что выход ионов калия из клетки наблюдается в средах,
содержащих 0,75 Моль/л NaCl и выше.
При встраивании ТФП во внутренний монослой происходит
пространственное разобщение компонентов клеточной мембраны и белков
цитоскелета [20, 21]. Это согласуется с данными авторов [159], которые
показали, что ТФП и хлорпромазин увеличивают подвижность спин-
меченой стеариновой кислоты в эритроцитах и их тенях, в то время как в
везикулах, истощенных по спектрину и актину, подобного эффекта не
наблюдается.
Кроме того, было установлено, что данные соединения способны
устранять температурные переходы, обусловленные белком полосы 4.1.
На основании полученных результатов авторы рассматривают спектрин-
актиновую сеть и белки, которые связывают цитоскелетную сеть с
мембраной, в качестве возможных мембранных мишений для
биологически активных фенотиазинов.
72

3.3. Влияние протеолитической обработки клеток на проявление


антигемолитической активности трифторперазина при гипертоническом
гемолизе эритроцитов

Как уже упоминалось, катионные амфифильные соединения


характеризуются двояким характером влияния на клетки. В небольших
концентрациях они обладают антигемолитической активностью, в
частности, при гипотоническом стрессе эритроцитов, а при
использовании в высоких концентрациях оказывают сенсибилизирующее
действие на клетки в изотонической среде и индуцируют их лизис [48].
Полагают, что в процесс гемолиза, индуцированного фенотиазинами,
вовлечены липидные места связывания, в то время как тип мест
связывания, представленный белками, участвует в формировании
антигемолитической активности вещества [21]. Для выявления участия
белков клеточной мембраны в проявлении защитного действия ТФП в
условиях гипертонического воздействия мы использовали
протеолитические ферменты.
На рис. 3.3.1 представлены данные о влиянии ТФП и
протеолитических ферментов (проназы, трипсина и папаина) на клетки,
перенесенные в 4,0 Моль/л NaCl при 37 С. Вычисление значений
антигемолитической активности производилось по представленной в
разделе «Материалы и методы» формуле. Как видно, в результате
обработки эритроцитов протеолитическими ферментами, их устойчивость
к действию гипертонического стресса незначительно повышается, а
предварительное обезвоживание клеток нивелирует указанный эффект
ферментативной обработки эритроцитов. Степень антигемолитической
активности ТФП при действии гипертонического шока на контрольные
эритроциты (0,15 Моль/л NaCl) не зависит от состояния белковой
компоненты мембраны. Однако если клетки после протеолитической
обработки находились в 0,7 Моль/л NaCl, а затем подвергались действию
73

100
90
Антигемолитическая 80
активность, % 70
60
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 2 3 4
4,0 Mоль/л NaCl 4,0 Mоль/л NaCl + ТФП

Рис. 3.3.1 Уровень антигемолитической активности трифторперазина


(3х10-5 Моль/л) при температуре 37 С для модифицированных
протеолитическими ферментами эритроцитов, перенесенных в
4,0 Моль/л NaCl после предварительной инкубации в 0,7 Моль/л
(ближний ряд) и 0,15 Моль/л NaCl (дальний ряд).
1 - контроль, 2 - проназа, 3 - трипсин, 4 - папаин

гипертонического стресса, то наблюдается падение антигемолитической


активности ТФП на 25 - 45 %. Таким образом, в последнем случае
состояние мембранных белков значимо для проявления защитного
эффекта амфифильного соединения при действии на клетки
осмотического стресса.
При изменении температурного режима (рис. 3.3.2, 0 С),
наблюдается значительное возрастание устойчивости клеток в результате
ферментативной обработки к повреждающему действию 4,0 Моль/л
74

80
70
60
Антигемолитическая

50
активность, %

40
30
20
10
0
-10
-20
1 2 3 4 2 3 4
4,0 Mоль/л NaCl 4,0 Mоль/л NaCl + ТФП

Рис. 3.3.2 Уровень антигемолитической активности трифторперазина


(3х10-5 Моль/л) при температуре 0 С для модифицированных
протеолитическими ферментами эритроцитов, перенесенных в 4,0 Моль/л
NaCl после предварительной инкубации в 0,7 Моль/л (ближний ряд) и
0,15 Моль/л NaCl (дальний ряд).
1 - контроль, 2 - проназа, 3 - трипсин, 4 - папаин

раствора NaCl, причем оно более выражено в случае клеток,


находившихся предварительно в изотонических условиях (0,15 Моль/л
NaCl), и составляет примерно 60 %. Эффективность ТФП в этом случае
существенно снижается, и при температуре 0 С присутствие ТФП в
лизирующей среде приводит к незначительному активированию гемолиза
эритроцитов, дегидратированных в 0,7 Моль/л растворе NaCl.
Из представленных результатов видно, что в результате обработки
клеток протеолитическими ферментами устойчивость эритроцитов к
действию 4,0 Моль/л NaCl при 0 С существенно возрастает, и
75

фактически не изменяется при 37 С (рис. 3.3.1, 3.3.2). Т.е. в случае, когда


текучесть липидного бислоя достаточно высока (37 С), модификация
мембранных гликопротеинов не оказывает влияния на процессы,
связанные со стабилизацией трансмембранных пор в условиях
гипертонического шока.
Следует отметить, что применяемые ферменты различаются по
характеру своего действия на эритроцитарные белки [71, 152]. Папаин
известен как ингибитор транспортной функции анионов белка полосы 3
эритроцитов человека. По мнению авторов [119], это является результатом
отщепления папаином 5-10 кДа участков от 35 кДа хемотрипсинового
пептида белка полосы 3. Кроме того показано, что это соединение удаляет
С-терминальный пептид 60 кДа хемотрипсинового пептида белка полосы
3 [118]. Папаин и проназа разделяют гидрофобный и гидрофильный
домены амфифильного протеина эритроцитарной мембраны
ацетилхолинэстеразы [81]. Методом флуоресцентной спектроскопии был
выявлен еще один аспект действия папаина. В работах [170, 214] по
исследованию трансбислойной реориентации (флип-флоп)
длинноцепочечного амфифильного аниона DENSA (5-(N-
decyl)aminonaphthalene-2-sulfonic acid) в эритроцитарной мембране
показано, что обработка клеток папаином приводит не только к
ингибированию «традиционного» обмена анионов, но и усиливает как
флип, так и флоп исследуемых амфифильных молекул DENSA. Проназа
также ингибирует транспорт анионов, посредством расщепления белка
полосы 3 на 60 кДа и 38 кДа фрагменты [111]. В отличие от проназы и
папаина, трипсин не гидролизует белок полосы 3, его действие
реализуется на уровне освобождения цитоскелетных компонентов [111].
Обращает на себя внимание тот факт, что после обработки клеток
различными по характеру воздействия на клеточную мембрану
протеолитическими ферментами (трипсин, проназа, папаин) реакция
эритроцитов на перенесение в гипертоническую среду, а также на
76

действие ТФП весьма схожа (рис. 3.3.1, 3.3.2). Следовательно, есть


основания полагать, что особенности гипертонической чувствительности
эритроцитов с модифицированными белковыми компонентами
обусловлены неспецифическим действием протеолитических ферментов
на клетки.
Авторами работы [226] было продемонстрировано влияние
ферментативной обработки эритроцитов на гемолиз, который развивается
под действием высокого давления. Обнаружено, что чувствительность
эритроцитов к гипербарическому воздействию повышается в результате
действия на клетки трипсина и нейраминидазы [226], в то время как при
гипотоническом шоке [57] и гипертоническом воздействии
ферментативная обработка клеток не сопровождается повышением уровня
лизиса эритроцитов. Таким образом можно сделать вывод, что процесс
формирования трансмембранных дефектов, приводящий к лизису клеток,
в меньшей степени зависит от состояния мембранных белков эритроцитов
при резком изменении осмолярности среды, чем в случае
гипербарического стресса.
Мы полагаем, что антигемолитическая активность ТФП связана со
способностью катионных амфипатических соединений оказывать влияние
на мембранные поры. Фосфолипиды, составляющие основу клеточных
мембран, относятся к жидким кристаллам. Как в любом реальном
кристалле, в пленке из фосфолипидов есть дефекты, в месте которых
могут развиваются структурные перестройки при стрессовых
воздействиях внешних сил [1].
Вероятность формирования пор, проницаемых для молекул
гемоглобина, определяется структурно-функциональным состоянием
мембраны эритроцитов. Показано, что при встраивании производных
фенотиазина в эритроцитарную мембрану наблюдается значительное
снижение (на 10 - 12 ºС) температуры фазовых переходов липидов [103,
122], что, по мнению авторов, может свидетельствовать о нарушении
77

водородых связей между соседними головными группами липидов.


Следовательно, ТФП может ограничивать фазовое разделение липидов,
снижая таким образом вероятность возникновения трансмембранных
дефектов.
Действие ТФП на процессы, сопровождающие лизис эритроцитов в
гипертоническом растворе не ограничивается, по нашему мнению,
влиянием на образование мембранных дефектов. ТФП, сочетая в себе как
гидрофильную, так и гидрофобную области, распределяется а границе
раздела мембрана – внемембранный раствор. В случае, когда в клеточной
мембране существуют дефекты в виде сквозной гидрофильной поры,
наиболее естественные для липидного бислоя [1], молекулы амфифила
могут распределяться и в область периметра поры. Формирующаяся пора
в любом случае представляет собой структуру с гидрофильной
центральной частью, характеризующееся определенным распределением
заряда. Электростатическое взаимодействие катионного производного
фенотиазина с заряженными группами молекул поры может
способствовать прекращению ее роста до размеров гемолитической.
Действие вещества на пору может реализоваться как в результате
непосредственного влияния на нее, так и опосредованно через изменение
состояния липидов и белков, погруженных в липидный матрикс [185].
Исходя из того, что в результате протеолиза мембранных гликопротеинов
антигемолитическая активность ТФП при гипертоническом шоке
эритроцитов при 37 С не изменяется (либо несколько снижается в случае
предварительно дегидратированных клеток) мы полагаем, что механизмы,
лежащие в основе защитного действия ТФП связаны, в первую очередь, с
его влиянием на липидный бислой.
Показано, что катионные амфипатические соединения вызывают
изменение организации мембранных фосфолипидов [189], а также их
освобождение из мембран эритроцитов человека [58]. Известно, что
распределение амфифильных молекул в клеточной мембране
78

сопровождается образованием небислойных структур [188, 189].


Трансбислойное движение мембранных фосфолипидов (флип – флоп)
может осуществляться с помощью небислойных фаз [195].
Облегчение реорганизации молекул липидного бислоя при
включении в него экзогенных амфифильных молекул может быть
фактором, оказывающим существенное влияние на способность
эритроцитов противостоять осмотическому воздейстию
гиперконцентрированного солевого раствора.
79

Выводы

1. Существует два возможных типа гемолиза эритроцитов в


высококонцентрированных солевых средах – лизис клеток без изменения
их объема и лизис, опосредованный сферификацией.
2. Время лизиса клеток без изменения объема не превышает 1 сек, а гемолиз
эритроцитов, опосредованный сферификацией, завершается в течение
4 – 5 сек.
3. Эффект снижения уровня гипертонического гемолиза эритроцитов в
присутствии ТФП является температурозависимым, концентрационный
оптимум ТФП с увеличением температуры от 0 до 37 С смещается от 1
х 10-5 до 3 х 10-5 Моль/л. Кроме того, степень антигемолитической
активности также температурозависима, максимальная сохранность
эритроцитов в присутствии амфифила наблюдается при 37 С.
4. Способность ТФП снижать гемолиз эритроцитов, перенесенных в
4,0 Моль/л NaCl, зависит от исходного состояния клеток. Максимальная
сохранность в присутствии ТФП отмечена для клеток,
прединкубированных в средах, содержащих 0,15 – 0,6 Моль/л NaCl,
минимальная защита – в 0,7 – 0,8 Моль/л NaCl.
5. Стадией, определяющей защиту эритроцитов трифторперазином при
гипертоническом воздействии, является собственно момент перенесения
эритроцитов в гипертонический раствор NaCl. Присутствие
амфифильного соединения на более ранних этапах не оказывает
существенного влияния на уровень гемолиза клеток. Следовательно,
протектирующее действие ТФП не опосредуется кальмодулином, а
реализуется на уровне клеточной мембраны.
6. Уровень гипертонического гемолиза эритроцитов определяется условиями
предварительной инкубации, температурой эксперимента и тоничностью
лизирующего раствора. Наибольшей устойчивостью характеризуются
эритроциты, обезвоженные в 0,45 Моль/л NaCl (их гемолиз начинается
80

лишь в 4,0 Моль/л растворе NaCl). Клетки, прединкубированные в


0,7 Моль/л NaCl, являются метастабильными и существенно
повреждаются уже при перенесении в 2,0 Моль/л NaCl. Уровень гемолиза
эритроцитов при 37 С превышает аналогичные показатели при 0 С.
7. Обработка клеток протеолитическими ферментами показала, что
эффективность ТФП при гипертоническом гемолизе эритроцитов не
зависит от состояния белковой компоненты контрольных клеток и
снижается в случае метастабильных эритроцитов при температуре 37 С.
При 0 С наблюдается повышение уровня гипертонического лизиса клеток
в присутствии ТФП. Состояние гликокаликса, модифицированного
нейраминидазой, не оказывает влияния на степень протектирования ТФП.
В случае метастабильных клеток отмечается снижение
антигемолитической активности ТФП при гипертоническом гемолизе
эритроцитов.

По материалам главы 3 опубликованы следующие работы:


Сынчикова О.П., Шпакова Н.М., Стрелкова Т.А., Бондаренко В.А.
Физическая модель гипертонического гемолиза // Биофизический вестник.-
2002.- №1.- С.78-81.
Сынчикова О.П., Шпакова Н.М., Стрелкова Т.А., Бондаренко В.А.
Динамический анализ морфологических изменений эритроцитов в процессе
гипертонического гемолиза // Проблемы криобиологии.- 2002.- № 2.- С. 62-
63.
Шпакова Н.М., Дунаевская О.Н., Сынчикова О.П., Бондаренко В.А.
Гиперосмотический гемолиз эритроцитов. Влияние трифторперазина //
Проблемы криобиологии.- 2002.- № 3.- С. 7-15.
Бондаренко В.А., Шпакова Н.М., Орлова Н.В., Дунаєвська О.М.,
Синчикова О.П. До питання про механізми захисної дії катіонних та неіонних
81

сполук в умовах гіпертонічного стресу еритроцитів // Трансплантологія.-


2000.- 1, №1.- С. 298-299.
Шпакова Н.М., Дунаевская О.Н., Сынчикова О.П. Антигемолитическая
активность трифторперазина при гипертоническом шоке эритроцитов //
Материалы конференции молодых ученых - Киев, 2001.- С. 170.
Синчикова О.П., Олейник О.О., Сиромятникова О.А., Алмазова О.Б.,
Бондаренко В.А. Обгрунтування принципів застосування амфіпатичних
сполук для захисту клітин крові в умовах осмотичного та температурного
стресу // ІV з`їзд гематологів та трансфузіологів України –Київ, 2001.- С.200.
Synchykova O.P., Orlova N.V., Tsymbal L.V., Shpakova N.M., Kophanova
O.A. Structural and functional state of erythrocyte membranes under the effect of
amphiphilic compounds // Тези доповідей ІІІ з їзду Українського біофізичного
товариства.- Львів, 2002.- С. 92.
82

ГЛАВА 4
КОРРЕКЦИЯ ГИПЕРТОНИЧЕСКОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ
АМФИФИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ. РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА

4.1. Антигемолитическая активность алкил-,D-глюкопиранозидов при


гипертоническом гемолизе эритроцитов. Модификация мембраны диамидом.

Бимолекулярный слой фосфолипидов составляет основу любой


клеточной мембраны. Его организация определяет барьерные свойства
плазматической мембраны, которые ответственны за поддержание
гомеостаза клетки. Известно, что амфифильные соединения, встраиваясь
в мембрану эритроцитов, существенно изменяют ее структурно-
функциональные свойства. [91, 188] Авторы работ [102] показали, что
присутствие в среде веществ амфифильной природы в момент стрессовых
воздействий на эритроциты позволяет модулировать клеточную реакцию
на уровне плазматической мембраны. В частности, введение в среду
глюкопиранозидов позволяет снизить уровень гипотонического
повреждения эритроцитов [100].
Благодаря сочетанию гидрофобности и гидрофильности в пределах
одной молекулы, эти соединения обладают способностью накапливаться в
клеточной мембране, изменяя ряд ее физико-химических свойств.
Вызывая пертурбации в организации липидов, они приводят к
формированию адаптивных механизмов, позволяющих снизить
повреждение эритроцитов при резком изменении условий внешней среды.
Встраивание амфифильных молекул в клеточную мембрану в момент
действия на них высококонцентрированных солевых растворов позволяет
представить процесс гипертонического гемолиза в разрезе изменения
организации плазматической мембраны в момент действия стрессового
фактора.
83

Характер встраивания амфифилов в липидный бислой определяется


свойствами соединения, в том числе способностью к
мицеллообразованию. Известно, что критическая концентрация
мицеллообразования амфифильных веществ может изменяться при
варьировании условий среды, поэтому для оценки способности
амфифильных соединений влиять на устойчивость эритроцитов в
высококонцентрированных солевых растворах нами были выбраны
неионные амфифильные соединения, ККМ которых не зависит от ионной
силы раствора [178]. Применение этих соединений в изучении
взаимодействий детергентов с биологическими мембранами обусловлено,
в частности, высокими значениями их ККМ [76].
Мы исследовали действие представителей гомологического ряда
производных глюкопиранозида с длиной алкильной цепи 6, 8 и 10
углеродных атома: гексил-, октил- и децил-,D-глюкопиранозидов (далее
ГГП, ОГП и ДГП, соответственно) на эритроциты человека в условиях
гипертонического воздействия. Изменение длины алкильной цепи этих
неионных соединений при неизменной полярной головке, по нашему
мнению, позволяет оценить роль гидрофобности в реализации защитных
способностей амфифилов.

CH2OH O

O (CH2)5 CH3
OH
OH 5 3

OH
Гексил-,D-глюкопиранозид
84

CH2OH O

O (CH2)7 CH3

OH
OH 5 3

OH
Октил-,D-глюкопиранозид

CH2OH O

O (CH2)9 CH3

OH
OH 3

OH
Децил-,D-глюкопиранозид

Для указанных алкилглюкопиранозидов были получены


концентрационные зависимости их влияния на гипертонический гемолиз
эритроцитов. Как и в случае положительно заряженного ТФП,
зависимости этих амфифильных соединений характеризуются
бифазностью. При определенных концентрациях отмечается защита
клеток веществами от повреждения, при более высоком содержании
амфифилов в среде выявляется эффект сенсибилизации клеток к
гипертоническому воздействию. Для всех производных глюкопиранозида
были определены оптимальные концентрации и значения максимальной
антигемолитической активности (табл.4.1.1). Видно, что с увеличением
длины алкильной цепи алкилглюкопиранозида на две –СН 2 группы,
значение концентрации, при которой наблюдается максимальное для этого
вещества блокирование гемолиза, уменьшается на порядок.
Короткоцепочечный ГГП характеризуется достаточно высокой
85

Таблица 4.1.1
Значения эффективных концентраций и максимальной антигемолитической
активности алкил-,D-глюкопиранозидов при гипертоническом гемолизе
эритроцитов (4,0 Моль/л NaCl, температура 20 С)

Эффективная
Антигемолитическая
Вещество концентрация,
активность, %
мМоль/л
гексил-,D-
2,8 76
глюкопиранозид
октил-,D-
0,45 86
глюкопиранозид
децил-,D-
0,03 90
глюкопиранозид

эффективной концентрацией и сравнительно низкой антигемолитической


активностью по сравнению с длинноцепочечными. Если для ГГП
защитная активность составляет 76% при концентрации 2,8 мМоль/л, то
для ДГП – 90 % при эффективной концентрации 0,05 мМоль/л.
Полученные данные позволяют заключить, что с увеличением длины
алкильной цепи алкилглюкопиранозидов их эффективность возрастает,
т.е. антигемолитическая активность увеличивается при снижении
значений эффективных концентраций в ряду ДГП  ОГП  ГГП .
Ранее нами и авторами работы [48] было показано, что степень
защиты клеток амфифильными веществами не зависит от предобработки
клеток этими соединениями (хлорпромазин, ТФП). Было обнаружено
86

также, что наибольшая эффективность достигается при одновременном


действии на клетки стрессового фактора и молекул амфифильных
соединений. Поскольку отмеченный феномен наблюдался и в случае
гипотонического гемолиза эритроцитов, есть основания предполагать, что
механизм защиты амфифильными соединениями при осмотических
воздействиях на клетки имеет универсальный характер.
Таким образом было выявлено, что стадией, определяющей уровень
гемолиза эритроцитов в присутствии амфифильного соединения, является
собственно перенесение клеток в гипертоничесий раствор, а не
предшествующие ему этапы. Представляло интерес проследить за
способностью амфифильных веществ защищать эритроциты от
повреждения после начала литического процесса.
На рис. 4.1.1 представлена зависимость антигемолитической
активности производных глюкопиранозида от времени внесения их в
лизирующую среду. Видно, что максимальный защитный эффект
алкилглюкопиранозидов наблюдается в том случае, когда эти соединения
присутствуют в гипертонической среде в момент внесения в нее
эритроцитов. Этот факт согласуется с полученным ранее эффектом
снижения повреждения эритроцитов в присутствии катионных
амфифильных соединений [21, 48]. В случае, когда добавление вещества в
гипертоническую среду производится после начала лизиса эритроцитов,
защитный эффект амфифилов снижается. Так, добавление вещества уже
через 10 сек после начала процесса гемолиза, приводит примерно к 50 %
уменьшению его антигемолитической активности. С увеличением
времени, прошедшего после запуска процессов, приводящих к лизису
клетки, эффект добавления вещества градуально снижается. Через 50
секунд отмечается полное отсутствие блокирования гемолиза. В виду
гетерогенности популяции эритроцитов, а также из-за вероятностного
характера зарождения мембранных дефектов, клетки лизируют
неодномоментно. За 5, 10, 25 сек с момента перенесения эритроцитов в
87

гипертонический раствор лизирует все возрастающее количество клеток.

100
90
80
70
60
Антигемолитическая активность,%

50
40
30 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
20
10
0
Г Г П1 О Г 2П Д Г 3П

Р и с . 4 .1 .1 Д и н а м и к а п р о ц е с с а с н и ж е н и я у р о в н я г и п е р т о н и ч е с к о г о
г е м о л и з а э р и т р о ц и т о в а л к и л -  ,D -г л ю к о п и р а н о з и д а м и в растворе,
с о д е р ж а щ е м 4 ,0 М о л ь / л N a C l п р и т е м п е р а т у р е 2 2  С .
1 -5 - вр ем я д о б а в л е н и я в ещ е ств в б л о к и р у ю щ и х к о н ц е н тр ац и ях ч ер е з
0, 5, 10, 25, 50 секунд после начала лизиса, соответственно. Зн ачения
ан ти гем о л и ти ч еск о й ак ти вн о сти н о р м ал и зо ван ы н а ур о вен ь гем о л и за
эри троцитов в 4 ,0 М о л ь /л растворе N aC l без учета врем ени
добавлен ия ам ф иф ильн ого вещ ества.

Встраивание амфифильных молекул в мембраны эритроцитов, доля


которых сокращается по мере увеличения временного интервала с
момента внесения клеток в гипертонический раствор, по всей
вероятности, приводит к прекращению роста дефектов до размеров,
соизмеримых с величиной молекулы гемоглобина. Количество клеток в
88

суспензии, встраивание амфифилов в мембраны которых предотвратило


их лизис, определяет антигемолитическую активность вещества.
В основе лизиса эритроцитов лежат процессы, связанные с
формированием и развитием трансмембранных дефектов [3]. Липидные
поры, возникающие в эритроцитарной мембране, характеризуются
достаточно коротким временем жизни. Макроскопическая пора
представляет собой динамический липидно-белковый ансамбль, и его
стабильность определяется как факторами внешней среды, так и
структурно-функциональным состоянием образующих его компонентов.
Изменения взаимодействий между составляющими поры должно
проявиться в клеточном ответе на стрессовое воздействие. Поэтому далее
мы модифицировали белковые компоненты мембраны с помощью
сульфгидрильного реагента диамида, действие которого, в первую
очередь, реализуется на периферических белках клеточной мембраны
[92]. Для того, чтобы выявить взаимосвязь между химической
модификацией цитоскелета эритроцитов и их чувствительностью к
гипертоническим солевым средам, были проведены эксперименты, в
которых эритроциты, обработаные диамидом (2,5, 5 и 10 мМоль/л)
переносили в раствор, содержащий 4,0 мМоль/л NaCl (рис. 4.1.2).
Видно, что при повышении концентрации диамида
чувствительность эритроцитов к гипертоническому воздействию
возрастает, что коррелирует с образованием межмолекулярных сшивок в
белковом скелете эритроцитов [92]. Уровень гипертонического гемолиза в
этом случае зависит от концентрации SH-реагента, и после обработки
эритроцитов диамидом, в максимальной в пределах эксперимента
концентрации, наблюдается наибольшее значение лизиса эритроцитов.
Ранее были получены данные о том, что клетки, обработанные диамидом,
повреждаются в меньшей степени при их охлаждении в гипертонических
средах [31]. Разный характер ответа модифицированных диамидом клеток
89

100

80
Антигемолитическая активность,%

60

40

20

0
1 2 3 4
-20

-40

-60

Рис. 4.1.2 Уровень антигемолитической активности алкил-,D-


глюкопиранозидов при перенесении модифицированных диамидом
эритроцитов в раствор, содержащий 4,0 Моль/л NaCl при температуре
22С.
1 – контроль, 2 – ГГП, 3 – ОГП, 4 – ДГП.
Концентрация диамида:
2,5 мМоль/л 5 мМоль/л 10 мМоль/л

на гипертоническое воздействие и холодовой шок свидетельствует о


различиях в процессах, происходящих в эритроцитах в этих условиях.
Как видно из представленных данных (рис. 4.1.2), ОГП и ДГП
обладают достаточно выраженной антигемолитической активностью и в
случае клеток, обработанных диамидом, причем величины
антигемолитической активности длинноцепочечных алкил-,D-
90

глюкопиранозинов не зависят от концентрации модификатора.


Способность глюкопиранозидов снижать гиперосмотический гемолиз
эритроцитов, модифицированных высокими концентрациями диамида,
снижается по мере уменьшения длины алкильной цепи представителей
гомологического ряда. Так, антигемолитическая активность ГГП
выражена в меньшей степени и определяется используемой
концентрацией диамида. Таким образом, с уменьшением гидрофобности
молекулы способность гомолога протектировать модифицированные
диамидом эритроциты в условиях гиперконцентрированного солевого
раствора снижается.
Диамид, являясь сульфгидрильным реагентом, способствует
образованию внутри- и межбелковых дисульфидных связей. В результате
обработки эритроцитов этим агентом, модификации подвергаются как
трансмембранные белки, так и белки цитоскелета. Диамид резко изменяет
электрофоретический спектр белков эритроцитарных мембран, вызывая
уменьшение интенсивности спектриновых полос с одновременным
формированием белковых агрегатов, не входящих в гель [46]. В
модельных экспериментах с использованием цитоскелетных белков
эритроцитов было показано, что под действием диамида образуются
сшивки между молекулами спектрина, актина и белка полосы 4.1 [88].
Авторы работы [128] показали, что действие этого соединения на уровне
цитоскелета не ограничивается межмолекулярными сшивками, он
инициирует также сшивки внутри тетра- и димеров основного
цитоскелетного белка спектрина. Известно, что спектрин может
стабилизировать ассиметричное распределение фосфолипидов в бислое
эритроцитарных мембран [96]. В результате обработки диамидом
наблюдается уменьшение степени асимметрии, что, по мнению авторов,
связано с модификацией цитоскелета.
Обработка эритроцитов окисляющими агентами сопровождается
усилением трансбислойной реорганизации фосфолипидов, асимметрия
91

распределения фосфатидилэтаноламина и фосфатидилэтанолсерина при


окислении диамидом понижается [95]. С использованием диамида была
показана важная роль внутримолекулярных и/или межмолекулярных
дисульфидных связей для осуществления транслокации фосфолипидов
клеточных мембран. Авторы работы [123] предполагают наличие
аллостерической связи SH-групп некоторых белков в механизме
транслокации. Исследования [88] показали, что сегментальная
подвижность сохраняется даже в присутствие интенсивных сшивок. С
образованием дисульфидных сшивок связывают изменение мембранной
вязкости и деформируемости эритроцитов [217]. В результате воздействия
диамидом деформируемость эритроцитов снижается
[68, 217].
Модификация эритроцитов диамидом приводит к формированию
водных пор [79], а по мере истощения клеток по АТФ – интенсификации
везикуляции [127]. Обработка эритроцитов диамидом сопровождается
уменьшением транспорта фосфата, что свидетельтвует о важной роли
сульфгидрильных групп цитоплазматического домена белка полосы 3 в
регуляции анионного транспорта [225].
92

Представленные данные свидетельстуют о значительной роли


межбелковых взаимодействий в механизме гипертонического гемолиза. С
увеличением концентрации сульфгидрильного реагента, индуцирующего
– S – S – сшивки, степень повреждения эритроцитов повышается.
Стабилизация указанным агентом внутри- и межбелковых
взаимодействий, по-видимому, приводит к закреплению
93

Таблица 4.1.2
Содержание калия в супернатанте после инкубации эритроцитов в различных
средах в присутствии глюкопиранозидов
n=6

Вещество Конц., Содержание калия в средах, мг/л


мМоль/л
0,15 Моль/л NaCl 4,0 Моль/л Дист. вода
NaCl + 0,1%
10мин. 60мин.
Тритон Х-
100*
Контроль 0 0,24+0,03 0,26+0,03 10,97+1,06
ГГП 2,8 0,22+0,03 0,23+0,03 11,01+1,03
ОГП 0,45 0,26+0,02 0,25+0,02 10,68+0,95
ДГП 0,03 0,26+0,03 0,28+0,03 10,82+0,97 11,97+1,20

Примечания:
1. Для всех веществ содержание калия в супернатанте по сравнению с
контролем статистически не отличается при р < 0,05.
2. * - уровень гемолиза в указанной среде в экспериментах по
гипертоническому гемолизу был принят за 100 %.

предсуществующих дефектов в мембранной структуре, и в условиях


гипертонического воздействия они получают свое развитие. Способность
мембраны закрывать дефекты связывают с липидной составляющей
мембраны [159, 203], преимущественное влияние на которую происходит
при включении молекул неионных амфифилов [133]. Встраивание в
модифицированную диамидом клеточную мембрану на этапе
94

гипертонического воздействия неионных амфифильных молекул


способствует снижению уровня гемолиза клеток, отражая при этом
участие липидной составляющей мембраны в динамике формирования
литических пор. В условиях стабилизированных диамидом меж – и
внутрибелковых связей, различия в протектирующем действии
представителей гомологического ряда производных глюкопиранозида
демонстрируют роль гидрофильности молекулы в снижении лизиса
клеток. С увеличением длины алкильной цепи алкил-,D-
глюкопиранозида его способность протектировать эритроциты в условиях
высококонцентрированного солевого раствора повышается, что
проявляется в отсутствии зависимости антигемолитической активности
соединения от количества дисульфидных связей, продуцируемых
различными концентрациями диамида (Рис. 4.1.2). Реорганизация
клеточной мембраны менее гидрофобным ГГП, по всей вероятности,
недостаточна, по сравнению с ОГП и ДГП, для реализации процессов,
способствующих повышению гипертонической устойчивости
эритроцитов.
Амфифильные соединения обладают выраженным
пертурбирующим действием на клеточную мембрану, поэтому
представляло интерес изучить барьерные свойства эритроцитарной
мембраны по выходу ионов калия в присутствии алкилглюкопиранозидов.
Глюкопиранозиды использовали в концентрациях, соответствующих
оптимальным концентрациям при гипертоническом воздействии. В
таблице 4.1.2 представлены данные о содержании калия в супернатанте
после инкубирования клеток с амфифильными веществами в
физиологическом растворе и в растворе, содержащем 4,0 Мол/л NaCl. Как
видно из представленных данных, исследуемые алкилглюкопиранозиды в
используемых концентрациях не влияют на выход ионов калия из клеток в
физиологической среде (10 мин) Увеличение продолжительности
инкубирования эритроцитов с амфифильными соединениями в
95

физиологическом растворе до 1 ч не влияет на выход ионов калия из


клеток. Таким образом можно говорить о том, что в присутствии
алкилглюкопиранозидов в изотонических условиях барьерные свойства
эритроцитарных мембран не изменяются. Присутствие глюкопиранозидов
в литической среде, как видно из таблицы 4.1.2, существенно не изменяет
утечку ионов калия из клеток в 4,0 Моль/л NaCl. Аналогичные результаты
были получены в работе [27] для амфифильных веществ, являющихся
представителями различных классов.
Таким образом, выявленное снижение гипертонического гемолиза
эритроцитов и, в то же время, сохранение нарушения барьерной функции
мембраны для ионов калия в присутствии алкилглюкопиранозидов
свидетельствует о том, что амфифильные вещества не оказывают влияния
на формирование микродефектов, а предотвращают их развитие до
размера пор, проницаемых для молекул гемоглобина.
96

4.2. Влияние амфифильных соединений и температуры на


чувствительность модифицированных фенилгидразином эритроцитов к
гипертоническому воздействию.

Защитный эффект амфифильных соединений является функцией


температуры [48], в связи с чем представляло интерес изучить
температурную зависимость гипертонического гемолиза эритроцитов в
присутствии глюкопиранозидов. Так как максимальный защитный эффект
амфифилов наблюдается при одновременном действии на клетки
высококонцентрированных солевых сред и производных глюкопиранозида
(рис. 4.1.1), эритроциты вносили в литическую среду (4,0 Моль/л NaCl),
уже содержащую амфифильное соединение. Данные, представленные на
рис. 4.2.1 свидетельствуют, что все исследованные вещества в заданном
диапазоне температур (5 - 20 С) снижают уровень гипертонического
гемолиза. Для представителей гомологического ряда с относительно
длинной алкильной цепью (ОГП и ДГП) уровень гипертонического
гемолиза эритроцитов снижается в 5 - 6 раз и не зависит от температуры,
в то время как для ГГП защитное действие определяется температурой.
Антигемолитическое действие этого соединения выражено в большей
степени при высокой температуре. Это проявляется в снижении уровня
повреждения клеток примерно в 3 раза при изменении температуры от 5
до 20 С. Таким образом, зависимость способности влиять на
гипертоническое повреждение клеток от температуры выявляется лишь
для короткоцепечечного ГГП в отличие от длинноцепочечных, в
присутствии которых уровень гемолиза эритроцитов в 4,0 Моль/л NaCl
составляет примерно 10 % вне зависимости от температуры лизирующей
среды.
Температура и осмолярность играют определяющую роль в
развитии повреждения эритроцитов. При постоянной температуре
97

увеличение тоничности лизирующей среды сопровождается повышением


степени повреждения эриитроцитов [22]. При постоянном значении
тоничности среды 4,0 Моль/л NaCl, снижение температуры до 5 С
приводит к некоторому снижению уровня гемолиза (1, рис. 4.2.2).
Изменение температуры гипертонической среды в пределах 10 - 20 С не
сопровождается изменением гипертонического повреждения эритроцитов.
Состояние эритроцитарной мембраны обусловливает характер
ответа клетки на стрессовое воздействие. Модификация эритроцитарного
цитоскелета фенилгидразином (0,2 мг/мл) вызывает 35-40 % деградацию
спектрина [51, 166]. Морфологически это проявляется в переходе клеток в

100

80

60
Гемолиз, %

1
40

2
20 3
4

0
0 5 10 15 20 25
о
Температура, С

Рис. 4.2.1 Температурная зависимость гипертонического гемолиза


эритроцитов (4,0 Моль/л NaCl) в присутствии глюкопиранозидов:
1 – контроль, 2 – ГГП (2,8 мМоль/л), 3 – ОГП (0,45 мМоль/л), 4 – ДГП
(0,03 мМоль/л)

эхиноцитарную форму [166]. Фенилгидразин разрушает - и -цепи


спектрина без образования высокомолекулярных продуктов [51]; он
98

индуцирует значительное снижение свободных сульфгидрильных групп


как спектрина, так и большинства других полипептидов [104].
Использование этого модификатора цитоскелета позволяет
исследовать особенности поведения клеток с измененным цитоскелетом в
условиях высококонцентрированной солевой среды. Уровень
гипертонического гемолиза клеток, модифицированных фенилгидразином
(1мМоль/л), превышает гемолиз контрольных эритроцитов и не зависит от
температуры литической среды при 10-20 С (2, рис. 4.2.2). При
температуре 5 С отмечается повышение уровня повреждения
модифицированных клеток.Несмотря на неизменный уровень
гипертонического гемолиза как контрольных, так и модифицированных

100

80 2
1
60
Гемолиз, %

40

20

0
5 10 15 20
o
Температура, С

Рис. 4.4.2 Уровень гипертонического гемолиза модифицированных


фенилгидразином эритроцитов в 4,0 Моль/л NaCl:
1 – контроль; 2 – фенилгидразин, 1 мМоль/л.

фенилгидразином эритроцитов в условиях варьирования температуры


99

(10 – 20 С), скорость гемолиза в этом температурном диапазоне


изменяется. Как видно из данных, представленных на рис. 4.2.3, при
снижении температуры от 20 до 10 С скорость лизиса клеток
уменьшается, причем модифицированные эритроциты лизируют с более
высокой скоростью. Дальнейшее снижение температуры лизирующей
среды приводит к резкому возрастанию скорости гемолиза
модифицированных эритроцитов, в отличие от контрольных.
На рис. 4.2.4 представлены типичные кривые изменения оптической
плотности суспензии эритроцитов, отражающие динамику

3,5

3
Скорость гемолиза

2,5
2
2

1,5

1 1
0,5

0
0 5 10 15 20 25
о
Температура, С

Рис. 4.2.3 Температурная зависимость скорости гипертонического


(4,0 Моль/л NaCl) гемолиза эритроцитов, модифицированных
фенилгидразином: 1 – контроль; 2 – фенилгидразин, 1 мМоль/л
100

гипертонического лизиса клеток при 5 С. Эти температурные условия


выбраны исходя из того, что при указанной температуре наиболее
выражены различия как в уровне, так и в скорости гемолиза контрольных
и модифицированных фенилгидразином клеток. Видно, что при низкой
температуре процесс лизиса модифицированных эритроцитов
завершается к концу первой минуты, в отличие от нативных клеток, для
завершения лизиса которых необходимо около 6 мин. Таким образом,
сочетанное действие таких трех факторов, как фенилгидразин, низкая
температура и высокая осмолярность среды, значительно снижает
устойчивость эритроцитов, что проявляется как в увеличении скорости
гемолиза, так и в повышении его уровня.
Изменения структурного состояния эритроцитарной мембраны под
действием фенилгидразина обуславливают более высокий уровень ее
повреждения во всем температурном интервале по сравнению с

1
0,1 ед. экст.

50 сек

Рис. 4.2.4 Изменения оптической плотности суспензии эритроцитов в


4,0 Моль/л растворе NaCl при температуре 5 С:
1, 3 – контрольные эритроциты, 2, 4 – эритроциты, модифицированные
фенилгидразином (1 мМоль/л); 3, 4 – ДГП (0,03 мМоль/л).

контрольными клетками (рис. 4.2.2). Можно предположить, что действие


101

фенилгидразина приводит к формированию нестабильной


предлитической фракции клеток, и последующее гипертоническое
воздействие приводит к быстрому развитию гемолиза. При этом высокая
скорость гипертонического лизиса модифицированных эритроцитов
особенно выражена при низкой температуре (рис. 4.2.3), что отражает
высокую синхронность процесса повреждения нестабильной фракции.
Имеющиеся к настоящему моменту литературные данные
позволяют считать, что действие этого вещества реализуется на уровне
как белкового, так и липидного компонентов мембраны.
Экспозиция эритроцитов человека в растворе фенилгидразина
приводит к деградации мембранных белков и, в первую очередь,
основного цитоскелетного белка спектрина. При инкубации эритроцитов
(гематокрит 5 %) с фенилгидразином (1 мМоль/л) в течение 10 минут,
что соответствует нашим экспериментальным условиям, наблюдается
разрушение - и  -цепей спектрина (62,3 % и 48,5 %, соответственно)
[51]. Отмеченный процесс характеризуется потерей спектрина без
сопутствующего формирования высокомолекулярных продуктов [51].
Авторы работы [51] показали, что необходимым условием деградации
спектрина фенилгидразином является присутствие молекул гемоглобина в
реакционной среде. Это позволяет исследователям сделать вывод о том,
что деградация спектрина инициируется реакционноспособными
интермедиатами, возникающими в процессе окисления фенилгидразина
при участии гемоглобина. В то же время в экспериментах с
использованием белых теней эритроцитов показано существенное
уменьшение как свободных сульфгидрильных групп, так и многих
мембранных полипептидов [104]. Вызванные фенилгидразином
повреждения клеток сопровождаются освобождением тирозина из белков,
как это было показано на электрофореграммах в работе [69].
Мнения авторов относительно механизма действия фенилгидразина
на эритроциты весьма противоречивы. Согласно работе [69] экспозиция
102

эритроцитов в растворе фенилгидразина приводит к деградации


цитоскелетных белков протеолитическим, АТФ-независимым путем. Для
деградации цитоскелетных белков в экспериментах, проведенных
авторами этой работы, требовалось присутствие цитозольной фракции
эритроцитов, что, по их мнению, было обусловлено наличием
протеолитических ферментов в цитозоле.
В то же время участие протеолитической системы полностью
исключается в экспериментах на очищенных тетрамерах спектрина,
чистом гемоглобине и фенилгидразине [51]. Процент деградации - и 
-мономеров спектрина в этой постановке эксперимента был сопоставим с
показателями экспериментов на эритроцитах и их тенях. Участие
протеолитической системы может выражаться в уничтожении продуктов
деградации спектрина, возникших в результате вызванного
фенилгидразином окислительного стресса.
В пользу механизма окислительного повреждения клеток в
присутствии фенилгидразина говорят данные о том, что нейтрализация
эритропоэтином гидроксильных радикалов, образующихся в присутствии
модификатора, приводит к значительному уменьшению повреждающего
действия фенилгидразина [69].
Влияние фенилгидразина на липидную конпоненту мембраны
проявляется в снижении ее текучести [166], уменьшении содержания
фосфатидилэтаноламина [50]. Показано [69], что деградация
цитоскелетных белков, вызванная фенилгидразином, сопровождается
усилением трансбислойного движения мембранных фосфолипидов. В то
же время, авторы работы [68, 77] не обнаружили экспонирование
фосфатидилсерина на поверхности мембраны, но выявили нарушение
аминофосфолипидтранслоказной активности в клетках, обработанных
фенилгидразином.
На макроскопическом уровне изменения компонентов мембраны
фенилгидразином проявляются в формировании эхиноцитов [166].
103

Таким образом, имеющиеся в научной литературе данные [51, 69,


77] позволяют говорить, что фенилгидразин является модификатором не
только цитоскелета, но и цитоскелет-мембранного комплекса в целом.
Инкубация эритроцитов с таким высокореакционноспособным веществом
приводит к тому, что плазматическая мембрана претерпевает изменения,
которые значительно снижают способность клеток противостоять
действию неблагоприятных факторов среды. Это особенно наглядно
проявляется при сочетанном действии высококонцентрированной солевой
среды и низкой температуры.
Введение производных глюкопиранозида в литическую среду
позволяет снизить уровень гемолиза и эритроцитов, модифицированных
фенилгидразином (рис. 4.2.5). В случае модифицированных
фенилгидразином клеток действие всех гомологов глюкопиранозида
определяется температурой. ГГП снижает уровень повреждения
модифицированных эритроцитов во всем температурном диапазоне
(кривая 2), однако по мере снижения температуры литической среды
защитный эффект данного соединения уменьшается. Зависимости 2 на
рис. 4.2.1 и 4.2.5 показывают, что степень повреждения
модифицированных клеток в присутствии ГГП превышает уровень
гемолиза контрольных эритроцитов при всех температурах эксперимента.
Характер кривой, отражающей действие ОГП на
модифицированные фенилгидразином клетки, в целом, подобен
температурной зависимости гемолиза в присутствии ГГП. Однако с
понижением температуры до 5 С уровень гипертонического гемолиза
модифицированных эритроцитов в присутствии ОГП превышает
соответствующие показатели для ГГП (рис. 4.2.5, кривая 3). В данном
гомологическом ряду наиболее выраженную температурную зависимость
имеет ДГП, в присутствии которого уровень гемолиза клеток,
модифицированных фенилгидразином, при 20 С составляет 13 % , в то
время как при 5 С - 74 % .
104

Таким образом, при низкой температуре различия в способности


снижать уровень гипертонического гемолиза модифицированных клеток у
разных представителей гомологического ряда наиболее выражены. В
отличие от высокой температуры (20 С), при 5 С гемолиз
модифицированных эритроцитов снижается по мере уменьшения длины
алкильной цепи вещества. В этом случае (при низкой температуре)
длинноцепочечный аналог наименее эффективен. Кроме того, введение
его (ДГП) в литическую среду при 5 С дополнительно ускоряет процесс
лизиса обработанных фенилгидразином эритроцитов (рис. 4.2.4,

100

80
1
4
Гемоли з, %

60
3
2
40

20

0
0 5 10 15 20 25
о
Температура, С

Рис. 4.2.5 Температурная зависимость гипертонического гемолиза


модифицированных фенилгидразином эритроцитов (4,0 Моль/л NaCl) в
присутствии глюкопиранозидов:
1 – контроль, 2 – ГГП (2,8 мМоль/л), 3 – ОГП (0,45 мМоль/л), 4 – ДГП
(0,03 мМоль/л)
105

кривая 4). Следовательно, реакция модифицированных фенилгидразином


эритроцитов на гиперконцентрированные солевые среды, содержащие
амфифильные вещества, характеризуется температурной зависимостью,
причем ее выраженность определяется степенью гидрофобности
используемого алкилглюкопиранозида.
Для сравнения эффективности алкилглюкопиранозидов мы
анализировали температурные зависимости антигемолитической
активности веществ при перенесении в гипертонические среды нативных
и модифицированных фенилгидразином клеток. Из данных,
представленных на рис. 4.2.6 видно, что в отношении нативных клеток
антигемолитическая активность ОГП и ДГП не является

А Б В

1
1 1

2 2

Рис. 4.2.6 Температурная зависимость антигемолитической


активности алкилглюкопиранозидов при перенесении в 4,0 Моль/л
NaCl нативных (1) и модифицированных фенилгидразином (2)
эритроцитов:
А – ГГП (2,8 мМоль/л), Б – ОГП (0,45 мМоль/л), В – ДГП
(0,03 мМоль/л).
106

температурозависимой в отличие от ГГП, снижение эффективности


которого было отмечено при температуре 5 С. При высокой температуре
длинноцепочечные гомологи (рис. 4.2.6, Б, В) были более эффективны по
сравнению с ГГП ( рис. 4.2.6, А).
В случае клеток, модифицированных фенилгидразином, (рис. 4.2.6,
кривые 2) наблюдалется довольно выраженная температурная
зависимость антигемолитической активности для всех гомологов. Если
при 20 С антигемолитическая способность ОГП и ДГП выражена в
большей степени, чем ГГП, то при низкой температуре по
эффективности защитного действия вещества можно расположить в
следующем ряду: ГГП > ОГП > ДГП.
Данные, представленные на рис. 4.2.6, свидетельствуют о том, что
антигемолитическая активность амфифильных веществ при
гипертоническом гемолизе зависит от исходного состояния клеток и
температуры литической среды. Если в случае ГГП снижение
эффективности по отношению к клеткам, модифицированным
фенилгидразином, было примерно одинаково во всем температурном
диапазоне, то для длинноцепочечных гомологов наблюдается иная
картина. В этом случае при высоких температурах различий в
антигемолитической активности практически нет, а по мере снижения
температуры они проявляются (ОГП) и наиболее выражены при 5 С
(ОГП и ДГП).
Алкил-,D-глюкопиранозиды являются неионными амфифильными
соединениями. Они характеризуются высокой антигемолитической
активностью при различных типах стрессов: протектирует клетки при
гипотоническом лизисе [100], их эффективность выявлена при
перенесении клеток в высококонцентрированные солевые среды. При
встраивании в эритроцитарную мембрану алкилглюкопиранозиды, как
107

все амфифильные соединения, взаимодействуют с липидной


компонентой мембраны [61, 133].
Встраивание молекул производных глюкопиранозида в липидный
бислой сопровождается изменением его текучести и проницаемости [49,
116, 168]. Имеются данные, свидетельствующие о том, что неионные
амфифильные соединения способствуют экспонированию (флопу)
липидного компонента внутреннего монослоя мембраны эритроцитов -
фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны, т.е. они
облегчают трансбислойное движение липидных молекул [99, 188].
Молекулы этих веществ могут вызывать пертурбацию липидного
бислоя как в целом, так и определенных его зон [172, 213]. С
использованием искусственных бислоев методами ITC (isothermal titration
calorimetry) и 2Н-ЯМР-спектроскопии было показано, что связывание
октил-,D-глюкопиранозида является гидрофобным и коэффициент его
распределения зависит от состава мембраны [219]. Добавление октил-
,D-глюкопиранозида практически не оказывает влияния на состояние
полярной области (липидных головных групп) даже при концентрациях
вещества, при которых наблюдается разрушение бислоя. Его действие
выражается в некоторой переориентации холиновых головных групп по
отношению к водной фазе. Постояноство полярной области бислоя резко
контрастирует с пертурбацией гидрокарбонатной зоны в присутствие
ОГП: с увеличением концентрации амфифила наблюдается существенное
повышение флуктуации липидных жирнокислотных цепей,
локализованных во внутренней части бислоя. Т.о. можно говорить о
специфичности действия октил-,D-глюкопиранозида на гидрофобную
зону липидного бислоя. В основе действия алкилглюкопиранозидов на
гидрофобную зону лежат особенности геометрии их молекул: большая
площадь головных групп в сочетании с короткими углеводородными
цепями вызывают дефекты упаковки центральной части липидного
108

бислоя, что выражается в существенном повышении сегментальных


флуктуаций [219].
Такая пертурбирующия способность представленных амфифильных
веществ является, по-видимому, важным фактором в условиях, когда
клетка попадает в гипертонические солевые растворы. Под действием
гипертонии в клеточной мембране инициируются процессы, приводящие
как к зарождению мембранного дефекта, так и к его активации в случае,
когда дефектное образование в мембране предсуществует. Введение в
литическую среду амфифильных молекул производных глюкопиранозида
способствует реорганизации мембраны, что, по-видимому, препятствует
дальнейшему росту и стабилизации мембранных дефектов.
Известно, что при околонулевых температурах для многих
амфифильных соединений наблюдается либо резкое снижение, либо даже
потеря способности защищать клетки при действии на них
неблагоприятных условий среды [22, 48]. Для алкилглюкопиранозидов
отмеченая особенность, т.е. уменьшение антигемолитической активности
при снижении температуры литической среды, выявлена только для
короткоцепочечного ГГП. Этот гомолог характеризуется более низкими
значениями антигемолитической активности и сравнительно высокой
эффективной концентрацией. Соответственно, как более слабый
антигемолитик, он реагирует снижением своей эффективности при
действии на модифицированную низкой температурой и
фенилгидразином мембрану. Более сильные гомологи (ОГП и ДГП)
характеризуются отсутствием чувствительности к температурозависимым
изменениям мембраны. Наблюдаемое снижение антигемолитической
активности ОГП и ДГП при гипертоническом гемолизе
модифицированных эритроцитов при 5 С (рис. 4.2.6), по-видимому,
обусловлено достаточно сильными изменениями мембраны при
совместном действии на нее трех факторов среды (фенилгидразин,
гипертония, низкая температура). В работе [166] методом ЭПР
109

спектроскопии показано снижение текучести мембраны под действием


высоких концентраций фенилгидразина, причем изменения затрагивали
гидрофобную часть мембраны. Кроме того, понижение температуры
также приводит к уменьшению текучести мембраны [218].
Амфифильные молекулы распределяются преимущественно в
жидкие области эритроцитарной мембраны, количество которых может
резко изменяться в мембранах, модифицированных. при действии на них
фенилгидразина и низкой температуры. На наш взгляд,
антигемолитические эффекты могут определяться особенностями
насыщения модифицированной в указаных условиях мембраны
молекулами амфифильных соединений. Их локальные концентрации в
мембране могут превышать оптимальные и приближаться к литическому
уровню в зависимости от физико-химических свойств молекул гомологов
и состояния эритроцитарной мембраны.
Следствием встраивания и накопления молекул амфифильных
соединений в мембране эритроцитов является изменение формы клеток.
Тот факт, что в присутствии алкилглюкопиранозидов в среде преобладают
эхиноциты, говорит о том, что молекулы веществ встраиваются во
внешний монослой мембраны. В случае ТФП, когда трансформация
клеток происходит по типу дискоцит-стоматоцит, молекулам этого
соединения энергетически выгодно накапливаться во внутреннем
монослое мембраны. В обоих случаях, по-видимому, включение
амфифильных молекул в бислой способствует активизации процессов,
позволяющих клетке противостоять воздействию стрессовых факторов
среды.
Установлено, что вещества, проявляющие антигемолитическую
активность при различных воздействиях (гипотонический гемолиз,
постгипертонический криогемолиз эрироцитов) вызывают изменения
формы клеток. Представляло интерес изучить влияние положительно
заряженного амфифильного соединения лидокаина, которое в
110

используемой нами концентрации (1 мМоль/л) не вызывает изменения


формы эритроцитов даже при длительной инкубации [100].

CH3
C2H5
NH C CH2 N
C2H5
CH3 O

Введение в раствор, содержащий 4,0 Моль/л NaCl, лидокаина приводит


к некоторому снижению повреждения эритроцитов (рис. 4.2.7). Следует
отметить, что защитное действие местного анестетика реализуется по мере

90 4
3
80 1
2
70

60
Гемолиз, %

50
40
30
20
10

0
5 10 20
о
Температура, С

Рис. 4.2.7 Влияние температуры на гипертонический гемолиз


эритроцитов в 4,0 Моль/л в присутствии лидокаина:
1- контроль, 2 - лидокаин (1 мМоль/л), 3 - фенилгидразин (1 мМоль/л),
4 - лидокаин (1 мМоль/л), фенилгидразин (1 мМоль/л).
111
о
снижения температуры эксперимента. При температуре 5 С уровень
гемолиза в присутствии лидокаина снижается примерно на 25 %, в то время
как при 20 оС антигемолитический эффект амфифила выявлен не был. В
случае гипертонического гемолиза эритроцитов, модифицированных
фенилгидразином, снижение повреждения эритроцитов отмечается лишь при
температуре 20 С, причем до уровня контрольных клеток Скорость
гипертонического гемолиза эритроцитов увеличивается с ростом
температуры (рис. 4.2.3). В присутствии лидокаина отмеченная зависимость
сохраняется, но величины скорости лизиса клеток снижаются (рис. 4.2.8).

3,5 3

3
4
Скорость гемолиза

2,5

1,5

0,5 1

2
0
0 5 10 15 20 25
о
Температура, С

Рис. 4.2.8 Влияние лидокаина и фенилгидразина на скорость


гипертонического гемолиза эритроцитов в 4,0 Моль/л NaCl при
различных температурах:
1 – контроль, 2 – лидокаин (1 мМоль/л), 3 - фенилгидразин (1 мМоль/л),
4 - лидокаин (1 мМоль/л), фенилгидразин (1 мМоль/л).
112

Выявленное замедление гипертонического лизиса клеток при 5 и 20 С в


присутствии лидокаина, в целом, не изменяет температурную зависимость
скорости гипертонического гемолиза, характерную для эритроцитов,
обработанных фенилгидразином (рис. 4.2.8). Полученные нами результаты на
примере лидокаина свидетельствуют, что амфифильное соединение может
проявлять антигемолитическую активность при гипертоническом гемолизе
эритроцитов и в случае, когда оно не вызывает изменения формы клеток.
Таким образом, нельзя говорить о существовании прямой связи между
снижением уровня гипертонического гемолиза эритроцитов и их
трансформацией под действием амфифильных веществ.
113

Выводы

1. Все представители гомологического ряда производных


алкилглюкопиранозида снижают уровень гипертонического гемолиза
эритроцитов, однако, их эффективность определяется длиной алкильной
цепи. По эффективности их можно расположить в следующем ряду
ДГП  ОГП  ГГП. С увеличением длины алкильной цепи их
протектирующее действие возрастает, а величины оптимальных
концентраций уменьшаются на порядок при увеличении длины алкильной
цепи на каждые две метильные группы.
2. Антигемолитическая активность алкилглюкопиранозидов падает по мере
увеличения времени, прошедшего от момента начала гипертонического
гемолиза эритроцитов до внесения их в литическую среду.
3. Для длинноцепочечных гомологов гюкопиранозида отсутствует
температурная зависимость, в то время как для ГГП отмечена выраженная
температурная зависимость антигемолитической активности при
гипертоническом гемолизе эритроцитов.
4. Уровень и скорость гипертонического гемолиза эритроцитов,
обработанных фенилгидразином, превышает соответствующие показатели
для контрольных клеток в температурном диапазоне 5 – 20 С. При 5 С
наблюдается резкое возрастание скорости гемолиза модифицированных
фенилгидразином эритроцитов, в отличие от контрольных.
5. Введение глюкопиранозидов в литическую среду позволяет снизить
уровень гемолиза модифицированных фенилгидразином клеток, однако в
этом случае, в отличие от нативных эритроцитов, их эффективность
является температурозависимой для всех представителей гомологического
ряда. При низких температурах наиболее эффективным оказывается
короткоцепочечный ГГП.
6. Антигемолитическая активность амфифильных веществ при
гипертоническом гемолизе зависит от исходного состояния клеток и
114

температуры литической среды. Для короткоцепочечного ГГП отмечается


снижение эффективности в случае модифицированных фенилгидразином
эритроцитов во всем температурном диапазоне, с увеличением длины
алкильной цепи глюкопиранозида область различий антигемолитических
активностей сдвигается в сторону высоких значений температуры.
7. В отличие от стоматоцитогенного ТФП и эхиноцитогенных
алкилглюкопиранозидов, лидокаин в используемой концентрации не
приводит к изменению формы клеток, проявляя при этом
антигемолитическую активность при гипертоническом гемолизе
эритроцитов. Таким образом, в целом, не существует прямой связи между
снижением уровня гипертонического гемолиза эритроцитов и их
трансформацией под действием амфифильных веществ.
8. Несмотря на эффект блокирования гипертонического гемолиза
эритроцитов алкилглюкопиранозидами, они не оказывают влияния на
выход ионов калия из клеток при гипертоническом воздействии.

По материалам главы 4 опубликованы следующие работы:


Сынчикова О.П. Влияние глюкопиранозидов на устойчивость
эритроцитов человека к гиперосмотическому стрессу // Проблемы
криобиологии.- 1999.- № 3.- С. 77-79.
Бондаренко В.А., Шпакова Н.М., Орлова Н.В., Дунаєвська О.М.,
Синчикова О.П. До питання про механізми захисної дії катіонних та неіонних
сполук в умовах гіпертонічного стресу еритроцитів // Трансплантологія.-
2000.- т.1.- №1.- С. 298-299.
Сынчикова О.П., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А. Влияние алкил-,D-
глюкопиранозидов на температурозависимый гипертонический гемолиз
эритроцитов, модифицированных фенилгидразином // Биологический
вестник.- 2001.- 5, № 1-2, С. 81-86.
115

Ніпот О.Є., Синчикова О.П. Вплив температурного режиму дегідратації


на гіпертонічний та постгіпертонічний гемоліз ерітроцитів // Тези доповідей
ІІ з`їзду Українського біофізичного товариства, Харків.- 1998.- С. 203.
Парченко Т.О., Синчикова О.П. Значення деяких білків цитоскелету для
стиснення мембрани еритроцитів, спричиненого бджолиною отрутою // Тези
доповідей ІІ з`їзду Українського біофізичного товариства, Харків.- 1998.-
С.126.
Сынчикова О.П., Шпакова Н.М. Действие лидокаина на развитие
гипертонического гемолиза эритроцитов при различных температурах
// Проблемы криобиологии.- 2002.- №1.- С. 124-127.
Синчикова О.П., Олейник О.О., Сиромятникова О.А., Алмазова О.Б.,
Бондаренко В.А. Обгрунтування принципів застосування амфіпатичних
сполук для захисту клітин крові в умовах осмотичного та температурного
стресу // ІV з`їзд гематологів та трансфузіологів України, Київ.- 2001.- С.200.
116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами эксперименты показывают, что амфифильные


соединения в низких концентрациях существенно снижают лизис
эритроцитов при перенесении клеток в гипертонические среды. В то же
время, как показывают данные исследования антигемолитического
действия трифторперазина при развитии гипертонического гемолиза
эритроцитов, защитная эффективность этого агента в значительной мере
зависит от условий среды. Подобная зависимость может быть связана с
амфифильной природой модифицирующего клетки агента и, прежде
всего, с теми свойствами, которые определяют его включение в липидную
фазу мембраны и его распределение в ней. В этой связи важным
фактором, определяющим характер влияния амфифильного соединения на
клетку, является температура. Действительно, для липидов,
формирующих мембрану большинства клеток, характерным является
распределение критических температурных зон, при которых происходят
фазовые переходы типа «гель – жидкий кристалл» в относительно узкой
температурной области [45]. Верхняя граница этой области локализуется
в зоне положительных температур, что и объясняет, в частности, такое
явление, как гипертонический криогемолиз эритроцитов, развивающийся
при охлаждении клеток в гипертонических средах от 37 до 0 С. В
отличие от везикул с контролируемым липидным составом, для
плазматической мембраны клеток, в том числе эритроцитов, характерна
фазово-структурная гетерогенность. Такая гетерогенность связана с
доменной структурой мембраны, то есть с определенными
ограничениями, накладываемыми на смешивание липидов, а также с
локальной модификацией бислоя при взаимодействии с ним интегральных
и периферических белков [196]. В случае эритроцитов фазово-
структурная гетерогенность проявляется в наличие нескольких фазовых
117

переходов, из которых основными являются переходы при +8 и +15 С


[159].
Термотропные свойства мембраны определяет такой важный
параметр, как соотношение липидов, находящихся в
жидкокристаллической и гелевой фазе. При снижении температуры это
соотношение уменьшается вследствие перехода части липидов в гелевую
фазу. Если учитывать, что амфифильные соединения предпочтительно
включаются в жидкокристаллические области мембраны [103], то
понятно, что снижение температуры оказывает существенное влияние на
их включение в мембрану вследствие уменьшения общей площади,
занимаемой жидкокристаллическими доменами. Тот факт, что
максимальный защитный эффект трифторперазина при 0 С наблюдается
при более низкой концентрации амфифильного соединения, можно
объяснить формированием в мембране участков с более высокой
локальной концентрацией этого вещества. Такие зоны соответствуют
доменам в жидкокристаллическом состоянии, куда преимущественно
распределяется трифторперазин. Соответственно, в сторону более низких
концентраций сдвигается область, при переходе через которую начинает
проявлять себя антигемолитическое действие трифторперазина. Более
того, в этих условиях могут формироваться обособленные фазы,
обогащенные этим веществом. Если учитывать тот факт, что разделение
липидных фаз является неблагоприятным фактором вследствие появления
участков с неидеальной упаковкой липидных молекул на границе раздела
фаз, тогда более высокий уровень гипертонического гемолиза при 0 С в
присутствии трифторперазина может быть объяснен нарушением
непрерывности липидного бислоя вследствие термотропного разделения
липидных фаз. При 37 С, когда липиды мембраны эритроцитов находятся
преимущественно в жидкокристаллическом состоянии, увеличивается
эффективная концентрация трифторперазина и уменьшается уровень
118

гипертонического гемолиза клеток. На этой основе можно предположить,


что концентрация трифторперазина, обеспечивающая максимальный
эффект снижения уровня гипертонического гемолиза, тем выше, чем
больше площадь участков, находящихся в жидкокристаллическом
состоянии.
Как показывают наши эксперименты, эффективность действия
трифторперазина при развитии гипертонического гемолиза эритроцитов
зависит помимо температуры, и от исходных условий, в которых
находились клетки перед перенесением в гипертоническую среду. Как и в
случае с температурной зависимостью действия трифторперазина,
обнаружена зависимость эффективности этого амфифильного соединения
от осмолярности среды исходной инкубации. Если в случае
температурной зависимости гипертонического гемолиза клеток
эффективность действия трифторперазина уменьшается по мере снижения
температуры, то в случае осмотической зависимости лизиса эритроцитов
его эффективность снижается по мере увеличения осмолярности среды, в
которой исходно инкубировались клетки (выше 0,45 Моль/л NaCl) перед
перенесением в гипертонический (4,0 Моль/л NaCl) раствор. В этой связи
возникает вопрос, могут ли факторы, влияющие на эффективность
трифторперазина, быть общими в случае температурной и осмотической
зависимости действия этого амфифильного соединения в условиях
гипертонического гемолиза на эритроциты? В наших экспериментах
минимальный эффект трифторперазина наблюдается в случае
эритроцитов, которые исходно инкубировались в 0,7 Моль/л NaCl .
Известно, что в условиях осмотической дегидратации минимальный
объем эритроцитов достигается при концентрации NaCl, равной 0,5 – 0,6
Моль/л [156]. Соответственно, при более высокой концентрации
электролита клетка уже не может отвечать на приращение осмолярности
уменьшением своего объема, и в этом случае осмотический стресс в
значительной степени становится эквивалентен механическому или
119

сдвиговому. Действительно, 0,6 – 0,7 моль/л NaCl - это область, которой


соответствует переход клеток в нестабильное состояние. В случае, если
происходит дальнейшее повышение осмотичности внеклеточной среды,
можно говорить о сенсибилизации клеток к этим изменениям.
Проявлением этого состояния является выход ионов К + из клеток. Если
принимать во внимание этот критерий, можно выделить несколько
возможных причин увеличения проницаемости плазматической мембраны
для катионов. В гипертонических электролитных средах, когда
повышается осмолярность и ионная сила раствора, такими причинами
могут быть следующие: локальное растяжение мембраны, связанное с
деформацией клеток; изменение разности электрических потенциалов на
мембране; фазовые пререходы и фазовое разделение липидов в
отдельных участках мембраны. Последний фактор можно рассматривать в
качестве основной причины появления температурной зависимости
эффективности трифторперазина. Локальное растяжение мембраны
можно рассматривать в качестве одного из основных факторов появления
каналов утечки ионов К +. Нельзя исключить и роль фазовых изменений
липидов в качестве такого фактора. Согласно работе [159], разделение
липидных фаз в мембране эритроцитов не является процессом,
независимым от интегральных белков мембраны и белков цитоскелета.
Дефекты, образованные при разделении липидных фаз, могут
стабилизироваться периферическими белками [92]. В этом случае
механизм, повышающий устойчивость эритроцитов к последующему
гипертоническому воздействию, может рассматриваться по аналогии с
механизмами, контролирующими замыкание теней эритроцитов. При этом
условием замыкания является удаление периферических белков или
повышение температуры. Способность катионных амфифилов, к которым
относится трифторперазин, распределяться на границе раздела фаз [121],
отделяющей внутреннюю цитоплазматическую поверхность мембраны от
ближайшего водного окружения, позволяет предположить, что эта
120

особенность может являться фактором, накладывающим ограничение на


взаимодействие периферических белков с дефектными участками
мембраны.
Экспериментально показано [75], что при повышении осмолярности
среды текучесть мембраны эритроцитов снижается и достигает
устойчивой величины при 0,6 Моль/л NaCl, после чего текучесть
мембраны сохраняется на одинаковом уровне вплоть до 1,2 Моль/л NaCl,
после чего наблюдается следующая фаза изменений. Если процесс
формирования каналов утечки ионов К + рассматривать как фазу
инициации общего гемолитического процесса, а процесс формирования
гемолитической поры – как процесс его терминации, тогда важным
является вопрос о характере влияния амфифилов на состояние мембраны
в каждой из этих фаз.
Полученые нами экспериментальные данные показывают, что
амфифилы практически не влияют на фазу инициации и проявляют
антигемолитическое действие в терминальной фазе гемолитического
процесса. Если рассматривать антигемолитическую активность
амфифильных соединений как способность замыкать поры, тогда важным
звеном их действия может являться ослабление стабилизирующего
влияния белков на формирующуюся гемолитическую пору. Косвенно об
этом свидетельствуют полученные нами данные о максимальном
антигемолитическом действии исследуемых веществ в начальной фазе
после перенесения эритроцитов в гипертоническую среду. В целом же
можно сказать, что фазовое разделение липидов, при котором
формируются дефектные участки на границе раздела доменов в
различном фазовом состоянии, может являться общим фактором как в
механизме, определяющем температурную зависимость эффективности
трифторперазина, так и в механизме, определяющем осмотическую
зависимость на этапе, предшествующем перенесению эритроцитов в
гипертоническую среду. Это означает, что уровень гипертонического
121

гемолиза тем выше, а антигемолитическая активность амфифильноых


соединений тем ниже, чем больше уровень дефектности клеток в фазе
инициации. Если осмотическое воздействие в условиях, когда клетка не
может отвечать на него изменением объема, рассматривать по аналогии с
механическим (гидростатическим) или сдвиговым стрессом, тогда
разделение липидных фаз в мембране можно считать основным
процессом, обусловливающим появление дефектов в структуре липидного
бислоя. В пользу этого свидетельствуют также полученные нами данные о
сохранении температурной и осмотической зависимости эффективности
трифторперазина после такого сильного модифицирующего воздействия,
как обработка эритроцитов протеолитическими ферментами. В пользу
того, что защитное действие молекул амфифильного соединения
опосредуется их влиянием на липидную фазу мембраны, свидетельствуют
полученными нами данными о том, что эффективность
алкилглюкопиранозидов тем выше, чем больше длина гидрофобного
сегмента их молекулы. При этом снижается и концентрация амфифилов,
при которой проявляется их максимальное защитное действие.
В то же время важное значение имеет вопрос о соотношении вклада
белков и липидов в изменение структурного состояния плазматической
мембраны на этапе инициации и терминации общего процесса,
проявляющегося в гипертоническом гемолизе клеток. Использование в
наших экспериментах диамида, способствующего формированию сшивок
между молекулами белков, увеличивает гипертоническую
чувствительность эритроцитов, однако и в этом случае глюкопиранозиды
оказывают защитное действие на модифицированные диамидом клетки.
Это означает, что вклад белков в процессы, контролирующие
осмотическую чувствительность эритроцитов, преобладают в фазе
инициации. Диамид, увеличивающий число межбелковых сшивок и,
соответственно, степень их стабилизирующего влияния на дефектные
участки мембраны, увеличивает гипертоническую чувствительность
122

эритроцитов. В то же время вклад липидов преобладает в фазе


терминации, когда ключевую роль начинают играть процессы увеличения
размера трансмембранных пор. Именно поэтому сохраняется
антигемолитическое действие амфифильных соединений и в случае
модифицированных диамидом клеток. Полученные экспериментальные
данные показывают также, что после обработки эритроцитов диамидом не
проявляется зависимость антигемолитической активности
алкилглюкопиранозидов от длины алкильной цепи молекулы
амфифильного соединения. В случае немодифицированных клеток
вероятность замыкания поры тем выше, чем больше длина алкильной
цепи амфифильного соединения. После модификации эритроцитов
диамидом репарация мембранного дефекта уже может не зависить от
длины алкильной цепи.
В то же время нельзя говорить о том, что белки цитоскелета, в
первую очередь спектрин, оказывают стабилизирующее влияние только на
дефектные участки мембраны эритроцитов. Очевидно стабилизирующее
влияние цитоскелета на липидный бислой определенным образом
проявляется и в условиях, когда липиды претерпевают индуцированные
температурой структурно-фазовые переходы. Как показано в нашей
работе, модификация цитоскелета эритроцитов фенилгидразином,
вызывающим частичную деградацию спектрина, приводит к резкому
увеличению скорости гипертонического гемолиза эритроцитов. Однако
этот рост характеризуется ярко выраженным температурозависимым
характером и проявляется при снижении температуры инкубации клеток
до + 10 С и ниже. Именно эта зона соответствует области (+8 - +10 С)
фазового перехода липидов мембраны эритроцитов, контролируемого
периферическими белками цитоскелета [159]. Таким образом, увеличение
скорости гипертонического гемолиза эритроцитов при снижении
температуры ниже + 10 С можно связать с устранением
стабилизирующего влияния белков цитоскелета на бислой в условиях,
123

когда липиды претерпевают фазовые переходы. Возможно, стабилизация


бислоя белками цитоскелета исключает определенную долю липидов из
количества липидов, перешедших из жидкокристаллического состояния в
состояние геля, то есть доля этих молекул в жидкокристаллическом
состоянии при каждой данной температуре выше в случае клеток с
нормальной структурой белкового цитоскелета. Если принять, что
защитная эффективность амфифильных соединений при развитии
гипертонического гемолиза эритроцитов тем выше, чем выше доля
липидов, находящихся в жидкокристаллическом состоянии, тогда
эффективность их действия на эритроциты, обработанные
фенилгидразином должна уменьшаться по мере снижения температуры в
интервале 0 - +10 С. Именно это мы наблюдали в наших экспериментах в
случае октил-,D-глюкопиранозида и децил-,D-глюкопиранозида.
Прогрессирующее уменьшение объема клеток в гипертонических
растворах можно считать основным фактором в повышении
чувствительности эритроцитов к дальнейшим изменениям осмотических
и температурных условий среды. В случае, когда клетки достигают
минимального объема, действие гипертонического стресса является
причиной появления значительного отрицательного давления на
мембране, связанного с сопротивлением сжатию со стороны
цитоплазматических белков, концентрирующихся во внутреннем объеме
клеток в процессе обезвоживания. Гемолиз эритроцитов развивается и при
их перенесении в гипертонические среды из физиологических условий,
однако и этом случае обезвоживание клеток характеризуется наличием
критического порога уменьшения объема, ниже которого клетки уже не
могут реагировать его изменением на осмотический стресс. Именно за
этим порогом включаются механизмы, вызывающие быстрое изменение
структурного состояния цитоскелета и фазово-структурного состояния
липидного бислоя. Центральным звеном этих механизмов становится
дефектность или неидеальность упаковки липидных молекул в
124

пограничных участках, разделяющих домены в различном фазовом


состоянии, а также ограничение процессов замыкания мембранных
дефектов со стороны периферических белков. Амфифильные соединения,
в силу своей способности распределяться на границе раздела фаз, могут
оказывать влияние на каждое из этих звеньев, тем самым повышая
осмотическую устойчивость клеток.
125

ВЫВОДЫ

Снижение уровня гипертонического гемолиза эритроцитов является


важной задачей криобиологических исследований. Введение некоторых
амфифильных соединений в гипертонические среды позволяет в
значительной мере предотвратить развитие гипертонического гемолиза
эритроцитов. Если действие различных амфифильных соединений на липиды
изучено достаточно хорошо, то вопрос о влиянии этих соединений на клетки
в зависимости от их исходного состояния освещен недостаточно полно. В
связи с этим представлялось целесообразным изучить роль исходных
температурных и осмотический условий в реализации антигемолитической
активности амфифильных соединений при гипертоническом гемолизе
эритроцитов. Поставленные задачи решали с применением методов
малоуглового светорассеяния, атомно-абсорбционной спектрофотометрии и
регистрации морфологических изменений с помощью оптико-электронной
системы телевизионного типа.

1. Эффективность антигемолитического действия трифторперазина при


развитии гипертонического гемолиза эритроцитов зависит от температуры
и осмолярности среды, в которой исходно инкубируются клетки перед
перенесением в гипертонический раствор. При температуре 0ºС
максимальный антигемолитический эффект наблюдается при более низкой
концентрации трифторперазина по сравнению с температурным режимом
37ºС. Уровень лизиса клеток при 0ºС выше, чем аналогичный показатель
при 37ºС. Повышение температуры от 0ºС до 37ºС сдвигает эффективную
концентрацию трифторперазина, при которой наблюдается максимальный
антигемолитический эффект до более высоких значений, но при этом
уровень гипертонического лизиса эритроцитов существенно снижается по
сравнению с 0ºС.
126

2. В интервале исходной тоничности среды (0,15 - 0, 70 Моль/л NaCl), в


пределах которого эритроциты приобретают чувствительность к
последующему перенесению в гипертонические среды, максимальная
чувствительность клеток наблюдается в области 0,70 Моль/л NaCl, а
минимальная – в области 0,45 Моль/л NaCl. Соответствующая
зависимость обнаруживается и для антигемолитической активности
трифторперазина. Его антигемолитический эффект на эритроциты,
исходно инкубированные в 0,70 Моль/л NaCl, существенно снижается по
сравнению с действием на клетки, находившимися как в зоне
физиологической тоничности (0,15 Моль/л NaCl), так и в области,
обусловливающей повышенную устойчивость (0,45 Моль/л NaCl). Это
указывает на связь между защитным действием трифторперазина и
исходным состоянием клеток.
3. Устойчивость эритроцитов, модифицированных протеолитическими
ферментами, к перенесению в содержащие трифторперазин
гипертонические растворы электролитов, незначительно зависит от
природы протеолитического агента (трипсин, папаин, проназа,
нейраминидаза), а определяется температурой (0 и 37ºС) и осмолярностью
среды (0,15, 0,45 и 0,70 Моль/л NaCl) на начальных этапах инкубации.
4. Все исследованные в работе представители гомологического ряда
глюкопиранозида снижают уровень гипертонического гемолиза
эритроцитов, практически не оказывая влияния на осмотически
индуцированный выход из клеток ионов К +. В указанных условиях
эффективность алкилглюкопиранозидов повышается с увеличением длины
алкильной цепи молекул, причем эффективные концентрации этих
веществ снижаются.
5. Представители гомологического ряда глюкопиранозида снижают уровень
гипертонического лизиса модифицированных диамидом эритроцитов,
однако в этом случае не выявлена зависимость антигемолитической
активности алкилглюкопиранозидов от длины алкильной цепи их молекул.
127

6. В исследованной группе веществ, включающей гексил-,D-


глюкопиранозид, октил-,D-глюкопиранозид и децил-,D-
глюкопиранозид, только для гексил-,D-глюкопиранозида наблюдается
зависимость антигемолитической активности от температуры
гипертонической среды. Модификация эритроцитов фенилгидразином
приводит к появлению температурной зависимости антигемолитической
активности также для октил-,D-глюкопиранозида и децил-,D-
глюкопиранозида.
7. Анализ картины изменений формы эритроцитов при развитии
гипертонического гемолиза указывает на два возможных типа
гемолитического процесса. Наблюдаемые различия между этими типами
связаны с характером изменения объема клеток непосредственно на этапе
гемолитического процесса. К первому типу относится гемолиз
эритроцитов без изменения их объема (время гемолиза не более 1 сек), а
ко второму – лизис, опосредованный переходом клеток в сферу (время
гемолиза 4 – 5 сек).
128

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Антонов В.Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран


// Соросовский образовательный журнал.- 1998.- 10.- С. 10-17.
2. Белоус А.М. Роль регуляторных систем, модулирующих состояние белков
цитоскелета при температурно-осмотическом воздействии // Проблемы
криобиологии.- 1992.- № 4.- С. 3 – 14.
3. Белоус А.М., Бондаренко В.А., Бабийчук Л.А. и др. Единый механизм
повреждения клетки при термальном шоке, замораживании и
постгипертоническом лизисе // Криобиология.- 1985.- N 2.- С. 25-32.
4. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических
мембран при охлаждении Киев: Наук. думка, 1982.- 255 с.
5. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.- Киев: Наук. Думка, 1994.-
432 с.
6. Белоус А.М., Землянских Н.Г. Молекулярная динамика белков цитоскелета
в норме и при воздействии температурно-осмотических факторов //
Проблемы криобиологии.- 1994.- № 1.- С. 14-23.
7. Болдырев А.А., Котелевцев С.В., Ланио М. и др. Введение в
биомембранологию.- М.: МГУ, 1990.- 208 с.
8. Бондаренко В.А. Развитие и предупреждение температурного шока
эритроцитов: Дисс. ... д-ра биол. наук: 03.00.22.- Харьков, 1988.- 446 с.
9. Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П., Руденко С.В. Эффекты дегидратации в
контроле осмотической и температурной чувствительности клеток //
Проблемы криобиологии.- 1992.- № 4.- С. 14 – 26.
10.Бондаренко Т.П. Комбинированное действие температуры и осмолярности
среды на устойчивость эритроцитов к гипертоническому стрессу //
Проблемы криобиологии.- 1993.- № 2.- С.11-16.
11.Бондаренко Т.П. Роль липидов в повреждении мембраны митохондрий и
эритроцитов при охлаждении: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук:
03.00.22.- Харьков, 1981.- 15 с.
129

12.Бондаренко Т.П., Лупилова Н.А. Исходные условия и устойчивость


эритроцитов к осмотическому стрессу. 1. Флуоресцентные исследования //
Проблемы криобиологии.- 1998.- № 1.- С.43 – 48.
13.Бондаренко Т.П., Лупилова Н.А. Осмолярность и температура среды как
факторы, контролирующие поведение эритроцитов // Проблемы
криобиологии.- 1997.- № 4.- С. 24 - 27.
14.Борен К., Хофман Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. –
М.: Мир, 1986.- 860 с.
15.Бужурина И.М., Панов М.А. Механизмы клеточного ответа на внешние
воздействия // Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы физико-
химической биологии.- N 3.- М.: ВИНИТИ, 1986.- 214 с.
16.Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., Коваленко И.Ф., Розанов Л.Ф.
Экспериментальное изучение кинетики гипотонического и кислотного
гемолиза эритроцитов человека методом малоуглового рассеяния //
Проблемы криобиологии.- 1994.- № 1.- С. 32 – 39.
17.Гордиенко Е.А., Коваленко С.Е. Биофизическая модель явления
гипертонического криогемолиза // Проблемы криобиологии.- 1996.- № 4.-
С. 24 - 32.
18.Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного
консервирования клеточных суспензий.- Киев: Наук. думка, 1994.- 141 с.
19.Дегтярев А.В. Исследование особенностей холодового шока
фосфолипидных везикул и эритроцитов: Дисс ... канд. биол. наук:
03.00.22.- Харьков, 1988.- 106 с.
20.Дунаевская О.Н., Панталер Е.Р., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А.
Некоторые возможности повышения устойчивости эритроцитов к
холодовому и гиперосмотическому воздействию при использовании
катионных амфипатов // Проблемы криобиологии.- 1995.- № 1.- С. 21-27.
21.Дунаевская О.Н., Шпакова Н.М. Защитный эффект трифторперазина при
гипертоническом шоке эритроцитов // Укр. биохим. журн. – 1997.- 69,
№ 2.- С. 30-35.
130

22.Дунаевская О.Н., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А. Гипертонический


стресс эритроцитов и антигемолитическая активность трифторперазина //
Проблемы криобиологии.- 1997.- № 4.- С. 28-33.
23.Китайгородский А.И. Смешанные кристаллы.- М.: Наука, 1983.- 277 с.
24.Коваленко С.Ф., Панина Ю.Е., Розанов Л.Ф. Механизм и динамика
повреждения эритроцитов человека в гипертоническом растворе
проникающего в клетки криопротектора // Проблемы криобиологии.-
1998.- № 1.- С. 40 – 43.
25.Козлов М.М., Лерхе Д.С., Маркин В.С. Свободная энергия и спонтанная
кривизна заряженной мембраны с гликокаликсом // Биол. мембраны.-
1985.- 2, № 8.- С. 806-812.
26.Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности.- М.: Мир, 1986.- 144 с.
27.Кулешова Л.Г., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Антигемолитическая и
трансформирующая активность амфифильных соединений // Проблемы
криобиологии.- 2001.- № 1.- С. 9-15.
28.Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. – М: Мир, 1986.-
496 с.
29.Миттел К. Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии.- М.:
Мир, 1980.- 597с.
30.Орлов С.Н., Покудин Н.И., Ряжский Г.Г. и др. О механизме регуляции
транспорта ионов через плазматическую мембрану при уменьшении
объема клетки // Биол. мембраны.- 1988.- 5, № 10.- С. 1030 – 1041.
31.Орлова Н.В. Влияние амфифильных соединений на осмотическую и
температурную чувствительность эритроцитов: Дис… канд. биол. наук:
03.00.19.- Харьков, 2001.- 140 с.
32.Песина Н.И. Развитие чувствительности эритроцитов в охлаждению в
средах, содержащих неэлектролиты // Проблемы криобиологии.- 1993.-
№ 4.- С. 56-57.
33.Песина Н.И., Бондаренко В.А. Осмолярность среды и продолжительность
инкубации как два независимых фактора, контролирующих
131

чувствительность эритроцитов к охлаждению в средах, содержащих


неэлектролит // Сб. научн. тр. “Биохимические аспекты криоповреждения
и криозащиты клеточных систем” .- Харьков, 1989.- С. 26 - 33.
34.Петров Р.В. Иммунология.- М.: Медицина, 1987.- 415 с.
35.Поздняков В.В. Влияние состава и осмолярности среды на
устойчивость эритроцитов к осмотическому и температурному шоку:
Автореф. дис… канд. биол. наук: 03.00.22.- Харьков.- 1989.- С.16.
36.Поздняков В.В., Бондаренко В.А. “Объемный сдвиг” как фактор,
контролирующий осмотическую устойчивость эритроцитов в растворах
низкомолекулярных криопротекторов // Физико-химические свойства и
биологическое действие криопротекторов: Сб. научн. трудов ИПКиК АН
УССР.- Харьков, 1990.- С. 115 – 123.
37.Поздняков В.В., Бондаренко В.А. Взаимосвязь между исходными
осмотическими условиями среды и чувствительностью эритроцитов к
гиперосмотическому стрессу в 4,0 М NaCl // Криобиология.- 1989.- 1.-
С. 47-49.
38.Прайс В. Аналитическая атомно-абсорбционная спектроскопия.- М.: Мир,
1967.- 355 с.
39.Рамазанов В.В., Бондаренко В.А., Руденко С.В. Влияние модификаторов
цитоскелета на чувствительность эритроцитов к гипертоническому шоку
при повышении осмолярности среды прединкубации // Проблемы
криобиологии.- 1994.- № 2.- С. 11-16.
40.Розанов Л.Ф., Смольянинова Е.И., Гордиенко О.И. К вопросу о роли
мембраны и цитоматрикса в развитии криоповреждений клеток //
Проблемы криобиологии.- 1994.- № 3.- С. 12 - 18.
41.Ставская С.С. Биологическое разрушение анионных ПАВ.- Киев: Наукова
думка, 1981.- 114 с.
42.Стрелков А.И., Осташко Ф.И., Лытюга А.П., Стрелкова Т.А.
Компьютерный метод представления треков движения спермиев при
132

оценке качества эякулята // Медицинская техника. Москва. – 2001 .- № 1. –


С. 34-36.
43.Устройство для определения оптической плотности биологических
суспензий: А.с. 907436 СССР, МКИ4 601 N33/48. Дегтярев А.В.,
Руденко С.В., Бондаренко Т.П. (СССР).- опубл. 23.06.90, Бюл. № 40.
44.Финдлей Д.Б., Эванз У.Г. Биологические мембраны. Методы.- М.: Мир,
1990.- 426 с.
45.Черницкий Е.А., Воробей А.Б. Структура и функции эритроцитарных
мембран.- Минск: Наука и техника, 1981.- 213 с.
46.Шпакова Н.М. Действие криопротекторов и амфипатических соединений
на состояние эритроцитов, подвергнутых холодовому и осмотическому
шоку: Дис ... канд. биол. наук: 03.00.22.- Харьков, 1988.- 191 с.
47.Шпакова Н.М., Бондаренко В.А. Действие хлорпромазина на
температурную и осмотическую чувствительность эритроцитов //
Биохимия.- 1991.- 56, № 12.- С. 2125 - 2130.
48.Шпакова Н.М., Панталер Е.Р., Бондаренко В.А. Антигемолитический
эффект хлорпромазина при гиперосмотическом и холодовом шоке
эритроцитов // Биохимия.- 1995.- 60, № 10.- С. 1624-1631.
49.Almog S., Litman B. J., Wimley W., et. al. States of aggregation and phase
transformations in mixtures of phosphatidylcholine and octyl glucoside //
Biochemistry.- 1990.- 29.- P. 4582-4592.
50.Arduini A., Chen Z., Stern A. Phenylhydrazine-induced changes in erythrocyte
membrane surface lipid packing // Biochim. Biophys. Acta .- 1986.- 862, N 1.-
Р. 65-71.
51.Arduini A., Storto S., Belfigilo M. et. al. Mechanism of spectrin degradation
induced by phenylhydrazine in intact human erythrocytes // Biochim. Biophys.
Acta.- 1989.- 979, N 1.- P.1-6.
52.Beaven G. U., Jean-Baptiste L., Ungewickell E. et al. An examination of the
soluble oligomeric complexes from the red cell membrane and their relation to
the membrane cytoskeleton // Eur. J. Cell. Biol.- 1985.- 36, № 2.- Р. 299 - 307.
133

53.Bereza U., Brewer G., Mizukami I. Association of calmodulin ingibition,


erythrocyte membrane stabilization and pharmacological effects of drugs //
Biochem. Biophys. Acta.- 1982.- 692, N2.- P. 305 – 314.
54.Bennet V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications
for more complex cells // Ann. Rev. Biochem.- 1985.- 54.- P.273-304.
55.Bernhardt I., Hall A.C., Ellory J.C. Transport pathways for monovalent cations
through erythrocyte membranes // Stud. Biophys.- 1988.- 126.- P. 5 – 21.
56.Bittar E. E. Membrane structure and function // John Wileu & sons, New York
Chichester Brisbone Toronto, 1980.- Р. 389.
57.Born G.V.R., Housley G.M. Effects of modification of the membranes of intact
erythrocytes on the antihaemolytic action of chlorpromazine //
Brit. J. Pharmacol.- 1983.- 79, N 2.- P. 481-487.
58.Brito M.A., Malheiros S.V., Meirelles N.C., Brites D. Effect of bilirubin on
toxicity induced by trifluoperazine, dibucaine and praziquantel to
erythrocytes // Life Sci.- 2001.- 69, N 8.- P. 863-877.
59.Broring K., Haest C.W.M. and Deuticke B. Translocation of oleic acid across
the erythrocyte membrane // Biochem. Biophys. Acta.- 1989.- 986.- 321-331.
60.Brotherus I.R., Griffith O.H., Brotherus M.O. et. al. Lipid-protein multiple
binding equilibria in membranes // Biochemistry.- 1981.- 20, N 18.- P.5261-
5267.
61.Brown M.F., Thurmond R.L., Dodd S.W. et. al. Composite membrane
deformation on the mesoscopic length scale // Phys. Rev. E. Stat. Phys. Plasmas
Fluids Relat. Interdiscip. Topics.- 2001.- 64.- 010901.
62.Brown M.F., Thurmond R.L., Dodd S.W. et. al. Elastic deformation of
membrane bilayers probed by deuterium NMR relaxation // J. Am. Chem. Soc.-
2002.- 124, N 28.- P. 8471- 8484.
63.Burg M.B. Macromolecular crowding as a cell volume sensor // Cell. Physiol.
and Biochem.- 2000.- 10.- P. 251 – 256.
64.Cantor R. Lateral pressures in cell membranes: a mechanism for modulation of
protein function // J. Phys. Chem. B.- 1997.- 101.- P. 1723 – 1725.
134

65.Cantor R. The lateral pressure profile in membranes: a physical mechanism of


general anesthesia // Biochem.- 1997.- 36.- P. 2339 – 2344.
66.Cantor R.S. The influence of membrane lateral pressures on simple geometric
models of protein conformational equilibria // Chem. Phys. Lipids.- 1999.- 101,
N 1.- P. 45-56.
67.Capaldi R., Green D.E. Membrane proteins and membrane structure // FEBS
Lett.- 1972.- 25, N 2.- P.205-209.
68.Chasis J.A., Mohandas N. Erythrocyte membrane deformability and stability:
two distinct membrane properties that are independently regulated by skeletal
protein associations // J. Cell. Biol.- 1986 .- 103, N 2.- Р. 343-350.
69.Choudhury T.D., Das N., Chattopadhyay A., Datta A.G. Effect of oxidative
stress and erythropoietin on cytoskeletal protein and lipid organization in
human erythrocytes // Pol. J. Pharmacol. -1999.- 51, N 4.- P. 341-350.
70.Cohen K.N., Korsgen C. Band 4.1 causes spectrin-actin gels to become
thixiotropic // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1980.- 97, № 4.- P.1429-
1436.
71.Cousin J.-L., Motais R. Inhibition of anion transport in the red blood cell by
anionic amphiphilic compounds. I. Determination of the flufenamate-binding
site by proteolytic dissection of the band 3 protein // Biochim. Biophys. Acta.-
1982.- 687, N 2.- P. 147-155.
72.Croall D.E., Morrow J.S., De Martino G.N. Limited proteolysis of the
erythrocyte membrane skeleton by calcium-dependent proteases // Biochim.
Biophys. Acta.- 1986.- 882.- P. 287 – 292.
73.Cullis P.R. Hydrocarbon phase transitions, heterogeneous lipid distribution and
lipid-protein interactions in erythrocyte membranes // FEBS Lett.- 1976.- 68,
№ 2.- P.173-176.
74.Cullis P.R., Hope M.J., Tilcock C.P.S. Lipid polymorphism and the roles of
lipids in membranes // Chem. Phys. Lipids, 1986.- 40, N 2-4.- P. 127-145.
75.D Avila N.M. A spin label study of erythrocytes membranes during simulation
of freezing // J. Membrane Biol.- 1981.- 60, N 2.- P. 155-163.
135

76.De Grip W. J., and Bovee-Geurts P. H. M. Synthesis and properties of


alkylglucosides with mild detergent action // Chem. Phys. Lipids.- 1979.- 23.-
P. 321-335.
77.De Jong K., Geldwerth D., Kuypers F.A. Oxidative damage does not alter
membrane phospholipid asymmetry in human erythrocytes // Biochemistry.-
1997.- 36, N 22.- Р. 6768-6776.
78.Deuticke B. Transformation and restoration of biconcave shape of human
erythrocytes induced by amphiphilic agents and change of ionic environment //
Biochim. Biophys. Acta -1968.- 163.- P. 494-500.
79.Deuticke B., Poser B., Lutkemeier P., Haest C.W. Formation of aqueous pores
in the human erythrocyte membrane after oxidative cross-linking of spectrin by
diamide // Biochim. Biophys. Acta.- 1983.- 731, N 2.- Р. 196-210.
80.Dijck P. W. M., van Zoelen E. J. J., Seldenrijk R. et. al. Calorimetric behaviour
of individual phospholipid classes from human and bovine erythrocyte
membrane // Chem. Phys. Lipids, 1976.-17, N 2-3.- P. 336-343.
81.Dutta-Choudhury T.A., Rosenberry T.L. Human erythrocyte
acetylcholinesterase is an amphipathic protein whose short membrane-binding
domain is removed by papain digestion // J. Biol. Chem.- 1984.- 259, N 9.-
P. 5653-5660.
82.Elgsaeter A., Mikkelsen A. Shape and shape changes in vitro in normal red
blood cells // Biochim. Biophys. Acta.- 1991.- 1071.- P. 273 – 290.
83.Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analysis of the major
polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry.- 1971.- 10,
№ 12.- P. 2606-2617.
84.Fawler V., Taylor D.L. Spectrin plus band 4.1 cross-link actin. Regulation by
micromolar calcium // J. Cell. Biol.- 1980.- 85, № 5.- P. 361-376.
85.Ferrell J.E., Lee K.J., Huestis W.H. Membrane bilayer balance and erythrocyte
shape: a quantitative assessment// Biochemistry.- 1985.- 24, N 12.-
P. 2849-2857.
136

86.Fischer T.M. Cross bonding and stiffening of the red cell membrane // Biochim.
Biophys. Acta.- 1989.- 985, N 2.- P. 218 – 228.
87.Forte T., Leto T.L., Minetti М., Marchesi V. Protein 4.1 is involved in a
structural thermotropic transition of the red blood ceel membrane detected by a
spin-labeled stearic acid // Biochemistry.- 1985.- 24.- P. 7876 – 7880.
88.Fung L.W., Kalaw B.O., Hatfield R.M., Dias M.N. Erythrocyte spectrin
maintains its segmental motions on oxidation: a spin-label EPR study //
Biophys. J.- 1996.- 70, N 2.- Р. 841-51.
89.Gascard P., Lee G., Coulombel L. et. al. Characterization of multiple isoforms
of protein 4.1R expressed during erythroid terminal differentiation // Blood.-
1998.- 92, N 11.- P. 4404 – 4414.
90.Geyer G., Makovitzky J. Erythrocyte membrane topooptical staining reflects
glycoprotein conformation changes // J. of Microscopy.- 1980.- 119.- P. 407-
414.
91.Goñi F.M., Alonso A. Spectroscopic techniques in the study of membrane
solubilization, reconstitution and permeabilization by detergents // Biochim.
Biophys. Acta.- 2000.- 1508, N 1-2.- P. 51 - 68.
92.Green F.A., Jung C.Y., Cuppoletti J., Owens N. Hypertonic cryohemolysis and
the cytoskeletal system // Biochim. Biophys. Acta.- 1981.-648.- P. 225-230.
93.Haest C. Interaction between membrane skeleton proteins and the intrinsic
domain of the erythrocyte membrane. // Biochem Biophys Acta.- 1982.- 694.-
P. 331 – 352.
94.Haest C., Kamp D., Plasa G., Deuticke B. Intra- and intermolecular cross-
linking of membrane proteins in intact erythrocytes and ghosts by SH-oxidizing
agents // Biochim. Biophys. Acta.- 1977.- 469.- P. 226-230.
95.Haest C.W., Erusalimsky J., Dressler V. et. al. Transbilayer mobility of
phospholipids in the erythrocyte membrane. Influence of the membrane
skeleton // Biomed. Biochim. Acta.- 1983.- 42, N 11-12.- Р. 17-21.
137

96.Haest C.W.M., Plasa G., Kamp D., Deuticke B. Spectrin as a stabilizer of the
phospholipid asymmetry in human erythrocyte membrane // Biochim. Biophys.
Acta.- 1978.- 509, N 1.- P. 21-32.
97.Hagerstrand H., Agli A., Kralj-Igli V. Amphiphile induced echinocyte-
spheroechinocyte transformation of red blood cell shape// Eur. Biophys. J.-
1998.- 27, N 4.- P. 335-339.
98.Hagerstrand H., Bobrowska-Hagerstrand M., Lillsunde I., Isomaa B.
Vesiculation induced by amphiphiles and ionophore A23187 in porsine
platelets: a transmission electron microscopic study // Chem. Biol. Inter.- 1996.-
101, N 2.- P. 115-126.
99.Hagerstrand H., Holmstrom T.H., Bobrowska-Hagerstrand M. et. al.
Amphiphile-induced phosphatidylserine exposure in human erythrocytes //
Mol. Membr. Biol.- 1998. - 15, N 2.- P.89 - 95.
100. Hagerstrand H., Isomaa B. Amphiphile-induced antihaemolysis is not
causally related to shape changes and vesiculation // Chem.-Biol. Interactions.-
1991.- 79.- P. 335-347.
101. Hagerstrand H., Isomaa B. Morphological characterization of exovesicies
and endovesicles released from human erythrocytes following treatment with
amphiphiles // Biochim. Biophys. Acta.-1992.- 1109.- P. 117-126.
102. Hagerstrand H., Isomaa B. Lipid and protein composition of exovesicles
released from human erythrocytes following treatment with amphiphiles//
Biochim. Biophys. Acta.- 1994.- 1190 .- P. 409-415.
103. Hanpft R, Mohr K. Influence of cationic amphiphilic drugs on the phase-
transition temperature of phospholipids with different polar headgroups //
Biochim. Biophys. Acta.- 1985.- 814, N1.- P. 437–446.
104. Hashmi A.N., Saleemuddin M. Phenylhydrazine causes sulfhydyl oxidation
and protein aggregation in hemoglobin-free human erythrocyte membranes //
Biochem. Mol. Biol. Int.-1996.- 40, N 3.- P. 543-550.
138

105. Heerklotz H., Seelig J. Correlation of membrane/water partition coefficients


of detergents with the critical micelle concentration // Biophys. J.- 2000.- 78,
N 5.- P. 2435-2440.
106. Heerklotz H., Seelig J. Titration calorimetry of surfactant-membrane
partitioning and membrane solubilization // Biochim. Biophys. Acta.- 2000.-
1508, N 1-2.- P. 69-85.
107. Hemming N.J., Anstee D.J., Staricoff M.A. et. al. Identification of the
Membrane Attachment Sites for Protein 4.1 in the Human Erythrocyte //Am.
Society for Biochem. and Mol. Biol.- 1995.- 270, N 10.- P. 5360-5366.
108. Holopainen J., Angelova M., Kinnunen P.K.J. Vectorial budding of vesicles
by asymmetrical enzimatic formation of ceramide in giant liposomes //
Biophys. J.- 2000.- 78.- P. 830 – 838.
109. Holopainen J., Subramanian M., Kinnunen P.K.J. Sphingomyelinase induces
lipid microdomain formation in a fluid sphingomyelin/phosphatidylcholine
membrane // Biochem.- 1998.- 37.- P. 17562 – 17570.
110. Hsich C.H., Sue S.C., Lyu P.C., Wu W.G. Membrane packing geometry of
diphytanoylphosphatidylcholine is highly sensitive to hydration: phospholipid
polymorphism induced by molecular rearrangement in the heatgroup region //
Biophys. J.- 1997.- 73.- P. 870 – 877.
111. Hsu L., Morrison M. The interaction of human erythrocyte Band 3 with
cytoskeletal components // Arch. Biochem. Biophys.-1983.- 227, N 1.- P.31-38.
112. Hueck I.S., Hollweg H.G., Schmid-Schonbein G.W., Artmann G.M.
Chlorpromazine modulates the morphological macro- and microstructure of
endothelial cells // Biophys. J.- 2000.- 278, N 5.- P. 873-878.
113. Isomaa B., Hagerstrand H., Paatero G. Shape transformations induced by
amphiphiles in erythrocytes// Biochim. Biophys. Acta.- 1987.- 809.- P. 93-103.
114. Isomaa B., Hagerstrand H., Paatero G., Engblom A. Permeability
alterations and antihaemolysis induced by amphiphiles in human erythrocytes //
Biochim. Biophys. Acta.- 1986.- 860, № 3.- P. 510-524.
139

115. Ito T., Zaner K.S., Stossel T.P. Nonideality of volume flows and phase
transitions of F-actin solutions in response to osmotic strees // Biophys. J.-
1987.- 51, N 5.- P. 745 – 755.
116. Jackson M.L., Schmidt C.F., Lichtenberg D. et. al. Solubilization of
phosphatidylcholine bilayers by octyl glucoside // Biochemistry.- 1982.- 21.-
P. 4576-4582.
117. Jenning M.L. Structure and function of the red blood cell anion transport
protein // Ann. Rev. Biochem. Biophys. Chem.- 1989.- 18.- P. 397- 420.
118. Jennings M.L., Adams M.F. Modification by papain of the structure and
function of band 3, the erythrocyte anion transport protein // Biochemistry.-
1981.- 20, N 25.- P. 7118-7123.
119. Jennings M.L., Passow H. Anion transport across the erythrocyte membrane,
in situ proteolysis of band 3 protein, and cross-linking of proteolytic fragments
by 4,4'-diisothiocyano dihydrostilbene-2,2'-disulfonate // Biochim. Biophys.
Acta.- 1979.- 554, N 2.- P. 498-519.
120. Johnson R.M., Taylor G., Meyer D. Shape and volume changes in
erythrocyte ghosts and spectrin-actin networks // The J. Cell Biol.- 1980.- 86.-
P. 371 – 376.
121. Jorgensen K., Ipsen J.H., Mouritsen O.G. et. al. The effect of density
fluctuations on the partitioning of foreign molecules into lipid bilayers:
application to anesthetics and insecticides // Biochem. Biophys. Acta.- 1991.-
1067, N 2.- P. 241 – 253.
122. Jutila A., Saderlund T., Pakkanen A.L. et. al. Comparison of the effects of
clozapine, chlorpromazine, and haloperidol on membrane lateral
heterogeneity // Chem. Phys. Lipids.- 2001.- 112, N 2.- Р. 151-163.
123. Kamp D., Sieberg T., Haest C.W. Inhibition and stimulation of phospholipid
scrambling activity. Consequences for lipid asymmetry, echinocytosis, and
microvesiculation of erythrocytes // Biochemistry.- 2001.- 40, N 31.- Р. 9438-
9446.
140

124. Keiko S., Hayashi M., Kowashima S., Akanuma H. Calcium-induced


localization of calcium-activated neutral proteinase on plasma membranes //
Biochim. Biophys. Acta.- 1989.- 985, N 1.- P. 51-54.
125. Kinnunen P.K.J. Lipid bilayers as osmotic response elements // Cell.
Physiol. Biochem.- 2000.- 10.- P. 243 – 250.
126. Kinnunen P.K., Kõiv A., Lehtonen J.Y. et. al. Lipid dynamics and peripheral
interactions of proteins with membrane surfaces // Chem. Phys. Lipids.- 1994.-
73, N 1-2.- P. 181-207.
127. Kozlova N.M., Slobozhanina E.I., Chernitskii E.A. Oxidation of membrane
proteins and modification of erythrocyte surface characteristics // Biofizika.-
1998.- 43, N 3.- Р. 480-483.
128. Kumar J., Gupta C.M. Membrane skeletal protein structure and interactions
in human erythrocytes after their treatment with diamide and calcium // Indian
J. Biochem. Biophys.- 1992.- 29, N 2.- Р. 123-127.
129. Kummerow D., Hamann J., Browning J.A. et. al. Variation of intracellular
pH in human erythrocytes via K+(Na+)/H+ exchange under low ionic strength
conditions // J. Membrane Biol.- 2000.- 176.- P. 207 – 216.
130. Kursch B., Lulimann H., Mohr K. Influence of varions cationic amphiphilic
drugs on the phase-transition temperature of phosphatidylchoine liposomes//
Biochem. Pharmacol.- 1983.- 32, N 17.- P. 2589-2594.
131. Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M. et. al. Detection of altered membrane
phospholipid asymmetry in subpopulations of human red blood cells using
fluorescently labeled annexin V // Blood.- 1996.- 87, № 3.- P. 1179-1187.
132. Lang F., Busch G.L., Ritter M. et. al. Functional significance of cell volume
regulatory mechanisms // 1998.- Physiol. Reviews.- 78, N 1.- P. 247 – 306.
133. Le Maire M., Champeil P. and Møller J.V. Interaction of membrane proteins
and lipids with solubilizing detergents // Biochim. Biophys. Acta.- 2000.- 1508,
N 1-2.- P. 86-111.
141

134. Lee J.C-M., Discher D.E. Deformation-enhanced fluctuations in the red cell
skeleton with theoretical relations to elasticity, connectivity, and spectrin
unfolding // Biophys. J.- 2001.- 81.- P. 3178 – 3192.
135. Lehtonen J.Y.A., Kinnunen P.K.J. Poly(ethyleneglycol) induced and
temperature-dependent phase separation in fluid binary phospholipid
membranes // Biophys. J.- 1995.- 68.- P. 525 – 535.
136. Lichtenberg D., Opatowski E., Kozlov M.M. Phase boundaries in mixtures
of membrane-forming amphiphiles and micelle-forming amphiphiles //
Biochim. Biophys. Acta.- 2000.- 1508.- P. 1 – 19.
137. Lieber M.R., Lange Y., Weinstein R.S., Steck T.L. Interaction of
chlorpromazine with the human erythrocyte membrane // J. Biol. Chem.- 1984.-
259, N 14.- P. 9225-9234.
138. Lieber M.R., Steck T.L. Dynamics of the holes in human erythrocyte
membrane ghosts // J. Biol. Chem.- 1982.- 257, N 19.- P. 11660-11666.
139. Line S.C. Separation of the lipid bilayer from the membrane skeleton during
discocytoechinocyte transformation of human erythrocytes ghosts // Eur. J. Cell
Biol.- 1989.- 49.- P. 358-366.
140. Liu S.-C., Derick L.N., Palek J. Dependence of the permanent deformation
of red blood cell membranes on spectrin dimer-tetramer equilibrium:
Implication for permanent membrane deformation of irreversibly sickled cells //
Blood.- 1993.- 81.- P. 522 - 528.
141. Liu S.-C., Palek J. Hemoglobin enchances the self-association of spectrin
heterodimers in human erythrocytes // J. Biol. Chem.- 1984.- 259.- P. 11556-
11562.
142. Liu S.-C., Palek J. Spectrin tetramer-dimer equilibrium and the stability of
erythrocyte membrane skeletons // Nature.- 1980.- 285, N 5766.- P. 568 – 588.
143. Liu S.-C., Windisch P., Kim S., Palek J. Oligomeric states of spectrin in
normal erythrocyte membranes: biochemical and electron microscopic studies //
Cell.- 1984.- 37, N 2.- P. 587 – 594.
142

144. Loh R.K., Huestis W.H. Human erythrocyte membrane lipid asymmetry.
Transbilayer distribution of rapidly diffusing phosphatidylserines //
Biochemistry.- 1993.- 32, № 43.- P. 11722-11727.
145. Lovelock J.E. Haemolysis by thermal shock // Brit. J. Haematol.- 1955.- 1,
N 1.- P. 117-129.
146. Lovelock J.E. Physical instability and termal shock in red cells // Nature.-
1954.- 173.- P. 659-667.
147. Lovelock J.E. The haemolysis of human red blood cells by freezing and
thawing // Biochim. Biophys. Acta.- 1953.- 10.- P. 414 - 426.
148. Lovelock J.E. The mechanism of the protactive action of glycerole against
haemolysis by freezing and thawing // Biochim. Biophys. Acta.- 1953.- 11.-
P. 28-36.
149. Lovrien R., Tisel W., Pesheck P. Stoichiometry of compounds bound to
human erythrocytes in relation to morphology // J. Biol. Chem., 1975.- 250,
N 8.- P. 3136-3141.
150. Luxnat M., Galla H.-J. Partition of chlorpromazine into lipid bilayer
membranes: the effect of membrane structure and composition // Biochim.
Biophys. Acta.- 1996.- 856, N 2.- P. 274-283.
151. MacDonald R.I. Trifluoperazine inhibits Sendai virus-induced hemolysis //
Biochim. Biophys. Acta.- 1986.- 856, N 2.- P. 337-348.
152. Maeda N., Sieke M., Nakajima T. et. al. Contribution of glycoproteins to
fibrinogen-induced aggregation of erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta.-
1990.- 1022, N 1.- P. 72-78.
153. Marchesi V.T. Review: the red cell membrane sceleton: recent progress //
Blood.- 1983.- 61, N 1.- P. 1-12.
154. Marrov J.S., Marchesi V.T. Self-assembly of spectrin oligomers in vitro: a
basis for a dynemic cytosceleton // J. Cell. Biol.- 1981.- 88, N 2.- P. 463-468.
155. Marsymin R., Sui S.F., Gaub H., Sachmann E. Electrostatic coupling of
spectrin dimers to phosphotydilserine containing lipid lamellae // Biochemistry,
1987.- 26, N 11.- P. 2983-2991.
143

156. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury //


Cryobiology.- 1971.- 8, N 5.- P. 439-500.
157. Meryman H.T., Williams R.J., Douglas M.St.J. Freezing injury from
“solution effects” and its prevention by natural or artificial cryoprotection //
Cryobiology.- 1977.- 14, N 3.- P. 287-302.
158. Minetti M., Ceccarini M., Di Stasi A.M.M. Role of membrane thermotropic
properties on hypotonic hemolysis and hypertonic cryohemolysis ot human red
blood cells// J. Cell. Biochem.- 1984.- 25, N 2.- P. 61- 72.
159. Minetti M, Di Stasi A.M. Involvement of erythrocyte skeletal proteins in the
modulation of membrane fluidity by phenothiazines // Biochemistry.- 1987.- 26,
N 25.- P. 8133-8137.
160. Minton A.P. Confinement as a determinant of macromolecular structure and
reactivity // Biophys. J.- 1992.- 63.- P. 1090 – 1100.
161. Morrow J.S., Haigh W.B., Marchesi V.T. Spectrin oligomeres; a structure
feature of the erythrocyte cytosceleton // J. Supramol. Str. Cell. Biochem.-
1981.- 17, N 3.- P. 275-289.
162. Motais R., Baroin A., Motais A., Baldy S. Inhibition of anion and glucose
permeabilities by anestetics in erythrocytes. The mechanism of action of
positively and negatively charged drugs // Biochim. Biophys. Acta.- 1980.-
599, N 2.- P. 673 – 688.
163. Mullaney P.F., Dean P.N. The small angle light scattering of biological cells.
Theoretical consideration // Biophys. J. – 1970.- 10, N 3.- P. 764 – 772.
164. Nigg E.A., Bron C., Giradet M., Cherry R.J. Band 3 – glycophorin A
association in erythrocyte membranes demonstrated by combining protein
diffusion measurements with antibody-induced cross-linking // Biochemistry.-
1980.- 19, N 9.- P. 1887 – 1893.
165. Nwafor A., Coakley W.T. Drug-induced shape change in erythrocytes
correlates with membrane potential change and is independent of glycocalyx
charge//Biochem. Pharm.- 1985.- 34, N 18.- P. 3329-3336.
144

166. Ogiso T, Ito Y., Iwaki M. et. al. Effect of phenylhydrazine-induced structurel
alterations of human erythrocytes on basic drug penetration // Chem. Pharm.
Bull(Tokio).-1989.-37, N 2.- Р. 430-434.
167. Ohanian V., Volfe L.C., John K.M. et. al. Analysis of the ternery
interactions of the red cell membrane skeleton proteins spectrin, actin and 4.1 //
Biochemistry-USA.- 1984.- 23, № 119.- P. 4416-4420.
168. Ollivon M., Eidelmann O., Blumenthal R., Walter A. Micelle-vesicle
transition of egg phosphatidylcholine and octyl glucoside // Biochemistry.-
1988.- 27.- P. 1695-1703.
169. Op den Kamp J.A.F. Lipid asymmetry in membranes // Ann. Rev. Biochem.-
1979.- 48.- P. 47-71.
170. Ortwein R., Oslender-Kohen A., Deuticke B. Band 3, the anion exchanger of
the erythrocyte membrane, is also a flippase // Biochim. Biophys. Acta.- 1994.-
1191, N2.- P. 317-323.
171. O`Toole P.J., Wolfe C., Ladha S., Cherry R.J. Rapid diffusion of spectrin
bound to a lipid surface // Biochim. Biophys. Acta.- 1999.- 1419.- P. 64 – 70.
172. Otten D., Lobbecke L., Beyer K. Stages of the bilayer-micelle transition in
the system phosphatidylcholine-C12E8 as studied by deuterium- and
phosphorous-NMR, light scattering, and calorimetry // Biophys. J.- 1995.- 68.-
P. 584-597.
173. Pantaler E., Kamp D., Haest C.W. Acceleration of phospholipid flip-flop in
erythrocyte membrane by detergents differing in polar head group and alkyl
chain length // Biochim. Biophys. Acta.- 2000.- 1509, N 1-2.- P. 397 – 408.
174. Parsegian V.A., Pand R.P., Rau D.C. Osmotic stress, crowding, preferential
hydration, and binding: A comparison of perspectives // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.- 2000.- 97.- P. 3987 – 3992.
175. Pegg D.E., Diaper M.P. On the mechanism of injury to slowly frozen
erythrocytes // Biophys J.- 1998.- 54, N 3.- P. 471-488.
145

176. Peters R. Lateral mobility of proteins and lipids in the red cell membrane
and the activation of adenylate cyclase by adrenergic receptors // FEBS Lett.-
1988.- 234, N 1.- P.1 – 7.
177. Picart C., Dalhaimer P., Discher D.E. Actin protofilament orientation in
demormation of the erythrocyte membrane skeleton // Biophys. J.- 2000.- 79.-
P. 2987 – 3000.
178. Pierre Y., Breyton C., Kramer D., Popot J.-L. Purification and
characterization of the cytochrom b6 f complex from Chlamydomonas
reinhardtii // The J. of Biol. Chem.-1995.- 270, N 49.- P. 29342-29349.
179. Pinder J.C., Gratzer W.B. Structural and dynamic states of actin in the
erythrocyte // J. Cell. Biol.- 1983.- 96, N 3.- P. 768-776.
180. Quinn P.J. A lipid-phase separation model of lowtemperature damage to
biological membranes // Cryobiology.- 1985.- 22, N 2.- P. 128-147.
181. Ralston G.B. The self-association of human spectrin at high concentration //
Biophys. Chem.- 1992.- 44, N 2.- P. 175 – 187.
182. Rosso J., Zachowski A., Devaux P.F. Influence of chlorpromazine on the
transverse mobility of phospholipids in the human erythrocyte membrane:
relation to shape changes // Biochim. Biophys. Acta.- 1988.- 942.- P. 271 – 279.
183. Rothman J. E., Lenard J. Membrane assymetry // Science.- 1977.- 195,
№ 4280.- P. 743.- 753.
184. Rudenko S.V., Nipot E.E. Protection by chlorpromazine, albumin and
bivalent cations against haemolysis induced by melittin [Ala-14] melittin and
whole bee venon // Biochem. J.- 1996.- 317.- P. 747-754.
185. Ruggiero A.C., Meirelles N.C. Effects of trifluoperazine on the
conformation and dynamics of membrane proteins in human erythrocytes //
Mol.Genet.Metab.- 1998.- 64, N 2.- P. 148-151.
186. Sato M., Schwarz W.H., Pollard T.D. Dependence of mechanical properies
of actin /L-actin gels on deformation rate // Nature.- 1987.- 557, N 1.- P. 122 –
134.
146

187. Schneider E., Haest C.W.M., Plasa G., Deuticke B. Bacterial cytotoxins,
amphotericin B and local anesthetics enhance transbilayer mobility of
phospholipids in erythrocyte membrane. Consequences for phospholipid
asymmetry // Biochim. Biophys. Acta.- 1986.- 855.- P. 325 – 336.
188. Schreier S., Malheiros S.V.P., Paula E. Surface active drugs: self-association
and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and
biological aspects // Biochim. Biophys. Acta.- 2000.- 1508, N 1-2.- P. 210-234.
189. Schrier S.L., Zachowski A., Devaux P.F. Mechanisms of amphiphat-induced
stomatocytosis in human erythrocytes // Blood.- 1992.- 79, N 3.- P. 782-786.
190. Seeman P. The membrane action of anesthetics and tranquilizers //
Pharmacol. Rev.-1972.- 24.- P. 583-655.
191. Serra M.V., Kamp D., Haest C.W. Pathways for flip-flop of mono- and di-
anionic phospholipids in the erythrocyte membrane // Biochim Biophys Acta.-
1996.- 1282, N 2.- P. 263 – 273.
192. Sheetz M.P., Singer S.J. Equilibrium and kinetic effects of drugs on the
shapes of human erythrocytes // J. Cell. Biol. – 1976.- 70.- Р. 247 – 251.
193. Sheetz M.P., Singer S.J. Biological membranes as bilayer couples. A
molecular mechanism of drug-erythrocyte interactions // Proc. Natl. Acad. Sci.-
1974.- 71.- Р. 4457-4461.
194. Siegel D.P. The modified stalk mechanism of lamellar/inverted phase
transitions and its implications for membrane fusion // Biophys. J.- 1999.- 76,
N 1.- P. 291-313.
195. Siegel D.P., Epand R.M. The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal
phase transitions in phosphatidylethanolamine: implications for membrane
fusion mechanisms // Biophys. J.- 1997.- 73.- P. 3089-3111.
196. Sikorski A.F., Hanus-Lorenz B., Jezierski A., Dluzewski A.R. Interaction of
membrane skeletal proteins with membrane lipid domain // Acta Biochim. Pol.-
2000.- 45, N 3.- P. 565 – 578.
147

197. Sleep J., Wilson D., Simmons R., Gratzer W. Elasticity of the red cell
membrane and its relation to hemolytic disorders: an optical tweezers study //
Biophys. J.- 1999.- 77.- P. 3085 – 3095.
198. Small J.W., Draeger A., Rinnerthaler G. et al. Cytoskeleton reorganisation
and motility // Eur. J. Cell Biol.: Suppl.- 1990.- 51, N 30.- P.7.
199. Smith D.K., Palek J. Modulation of lateral mobility of band 3 in the red cell
membrane by oxidative cross-linking of spectrin // Nature.- 1982.- 297, N
5865.- P. 424 – 426.
200. Sniga T., Suda T., Maeda N. Spin label studies on the human erythrocyte
membrane. Two sites and two phases for fatti acid spin labels // Biochem.
Biophys. Acta.- 1977.- 466, N 2.- P. 231-234.
201. Stokke B.T., Mikkelsen A., Elgsaeter A. Human erythrocyte spectrin dimer
intrinsic viscosity: temperature dependence and implications for the molecular
basis of the erythrocyte membrane free energy // BBA.- 1985.- 816, N 1.-
P. 102-111.
202. Stokke B.T., Mikkelsen A., Elgsaeter A. Spectrin, human erythrocyte shapes
and mechanochemical properties // Biophys. J. – 1986.- 49, № 1.- P. 319-329.
203. Stubbs G. W., Smith H.G., Litman B.J. Alkyl glucosides as effective
solubilizing agents for bovine rhodopsin: a comparison with several commonly
used detergents // Biochim. Biophys. Acta.- 1976.- 426.- P. 46-56.
204. Suda T., Maeda N., Matsuoka K. et. al. Influences of membrane cholesterol
on the human red cell properties // Med. J. Osaka Univ.- 1978.- 29, № 1-2.-
P. 21-24.
205. Suzuki A., Yamazaki M., Ito T. Osmoelastic coupling in biological
structures: formation of crystalline-like structures changes by osmotic stress //
Biochemistry.- 1989.- 28.- P. 6543-6547.
206. Takahashi T., Williams R.J. Termal shock hemolysis in human red cells. 1.
The effect of temperature, time and osmotic stress // Cryobiology.- 1983.- 20,
N 5.- P. 507 – 520.
148

207. Takahashi T., Williams R.J. Termal shock in red cells // Cryobiology.- 1979.-
16.- P. 588-589.
208. Takeuchi M., Miyamoto H., Sako Y. et. al. Structure of the erythrocyte
membrane skeleton as observed by atomic force microscopy // Biophys. J.-
1998.- 74, N 5.- P. 2171 – 2183.
209. Tamura A., Sato T., Fujii T. Recovery of human erythrocytes from the
echinocytic shape induced by added choline-phospholipids is dependent on the
acyl chain length // Cell. Biochem. Funct.- 1987.- 5.- P. 167-173.
210. Tan A., Ziegler A., Steinbauer B., Seelig J. Thermodynamics of sodium
dodecyl sulfate partitioning into lipid membranes // Biophys. J.- 2002.- 83, N
3.- P. 1547-1556.
211. Tomishige M., Sako Y., Kusumi A. Regulation mechanism of the lateral
diffusion of band 3 in erythrocyte membranes by the membrane skeleton //
J. Cell Biol.- 1998.- 142, N 4.- P. 989 – 1000.
212. Tsuji A., Kawasaki K., Ohnishi L. et al. Regulation of band 3 mobilities in
erythrocyte ghost membranes by protein association and cytoskeleton
meshwork // Biochemistry.- 1998.- 27, N 19.- P. 7447-7453.
213. Thurmond R.L., Otten D., Brown M.F., Beyer K. Structure and packing of
phosphatidylcholines in lamellar and hexagonal liquid-crystalline mixtures with
a nonionic detergent: a wide-line deuterium and phosphorous-31 NMR study //
J. Phys. Chem.- 1994.- 98.- P. 972-983.
214. Voswinkel St., Haest C.W., Deuticke B. Complex effects of papain on
function and inhibitor sensitivity of the red cell anion exchanger AE1 suggest
the presence of different transport subsites // J. Membr. Biol.- 2001.- 179, N 3.-
P. 205 – 221.
215. Walter A., Kuehl G., Barnes K., VanderWaerdt G. The vesicle-to-micelle
transition of phosphatidylcholine vesicles induced by nonionic detergents:
effects of sodium chloride, sucrose and urea // Biophys. Acta.- 2000.- 1508.-
P. 20 – 33.
149

216. Wang D.N., Sarabia V.E., Reithmeier R.A., Kuhlbrandt W. Three-


dimensional map of the dimeric membrane domain of the human erythrocyte
anion exchanger, Band 3 // EMBO Journal.- 1995.- 14.- Р. 5158-5169.
217. Wang X., Wu Z., Song G. et. al. Effects of oxidative damage of membrane
protein thiol groups on erythrocyte membrane viscoelasticities // Clin.
Hemorheol. Microcirc.- 1999.- 21, N 2.- Р. 137-146.
218. Weltzien H., Arnold B., Reuther R. Quantitative studies on lysolecithin-
mediated hemolysis. Use of ether-deoxy lysolecithin analogs with varying
aliphatic chain-lengths // Biochim. Biophys. Acta.- 1977.- 466.- P. 411-421.
219. Wenk M. R., Alt T., Seelig A., Seelig J. Octyl--D-glucopyranoside
partitioning into lipid bilayers: thermodynamics of binding and structural
changes of the bilayer // Biophys. J.- 1997.- 72.- P. 1719-1731.
220. Wieprecht T., Apostolov O., Beyermann M., Seelig J. Thermodynamics of

the -helix-coil transition of amphipathic peptides in a


membrane environment: implications for the peptide-membrane binding
equilibrium // J. of Mol. Biol.- 1999.- 294, N 3.- P. 785-794.
221. Wieprecht T., Beyermann M., Seelig J. Thermodynamics of the coil-alpha-
helix transition of amphipathic peptides in a membrane environment: the role of
vesicle curvature // Biophys. Chem.- 2002.- 96, N 2-3.- P. 191-201.
222. Williams R.J., Show S.K. The relationship between cell injury and osmotic
volume reduction. 2. Red cell lysis correlates with cell volume rather than
intracellular salt concentration // Cryobiology.- 1980.- 17.- P. 530-539.
150

223. Williams R.J., Takahashi T. Erythrocyte metastability: Microscopic


observation of termal shock hemolysis // Cryo-Letters.- 1984.- 5, N 2.- P. 111-
116.
224. Workman R.F., Low P.S. Biochemical analysis of potential sites for protein
4.1-mediated anchoring of the spectrin-actin skeleton to the erythrocyte
membrane // J. Biol. Chem.- 1998.- 273.- P. 6171 - 6176.
225. Yamaguchi T., Kimoto E. Inhibition of phosphate transport across the human
erythrocyte membrane by chemical modification of sulfhydryl groups //
Biochemistry.- 1992.- 31, N 7.- Р. 1968-1973.
226. Yamaguchi T., Matsumoto M., Kimoto E. Effects of drugs, salts and
phospholipid vesicles on hemoglobin release from hydrostatic pressure-treated
human erythrocytes // J. Biochem.- 1993.- 114, N 4.- P. 576-581.
227. Yamashina S., Katsumata O. Structural analysis of red blood ceel membrane
with an atomic force microscope // J. Elecron Microsc.- 2000.- 49, N 3.- P.
445 – 451.
228. Yeagle P.L. P nuclear magnetic resonance studies of the phospholipid-
protein interface in cell membranes // Biophys. J., 1982.-37, N 1.- P. 227-239.
229. Zachowski A. Phospholipids in animal eukaryotic membranes: Transverse
asymmetry and movement // Biochem.- 1993.- 1.- 294
230. Zade-Oppen A.M.M. Posthypertonic hemolysis in sodium chloride
systems // Acta Physiol. Scand.- 1968.- 73.- P. 341-364.
231. Zimmerman S.B., Harrison B. Macromolecular crowding increases binding
of DNA polymerase to DNA: an adaptive effect // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-
1987.- 84.- P. 1871 – 1875.
232. Zimmerman S.B., Minton A. P. Macromolecular crowding: biochemical,
biophysical, and physiological consequences // Annu. Rev. Biophys. Biomol.
Struct.- 1993.- 22.- P. 27 – 65.
233. Zhang D., Kiyatkin A., Bolin J.T., Low P.S. Crystallographic structure and
functional interpretation of the cytoplasmic domain of erythrocyte membrane
band 3 // Blood 2000.- 96, N 9.- Р. 2925-2933.