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DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE
SUCCINATO DESHIDROGENASA DE
Escherichia coli 
HIPOTESIS
Si Escherichia coli   tiene mayor afinidad con la glucosa, entonces, al utilizarla como fuente de
carbono tendrá un mayor crecimiento que en succinato.
Si la enzima succinato deshidrogenasa es inducida con succinato, entonces, hay mayor actividad de
la enzima con esta fuente de carbono que la inducida con glucosa.
Si se mide la actividad enzimática de la succinato deshidrogenasa por el método de Ells, entonces
Escherichia coli no hace una cadena transportadora de electrones natural sino una cadena

transportadora de electrones artificial.

DISEÑO EXPERIMENTAL

a)  Obtención de la Suspensión Celular

• Solución que será diluida para preparar los matraces

Glucosa al con glucosa como fuente de carbono.
50%

• Solución que será diluida para preparar los matraces

Succinato de
Sodio al
con succinato como fuente de carbono.
25%

• Medio de suspensión para las células inocuo.Ideal

Regulador de
Fosfatos
para diluciones ó lavados.

• Es un medio mínimo con las condiciones necesarias

Medio de
Sypher y
para que cualquier microorganismo crezca.
Strauss

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Se utiliza una cepa silvestre de Escherichia coli , organismo que representa nuestro objeto de estudio, es
decir, del cual determinaremos la actividad de succinato deshidrogenasa. Esta cepa se utiliza para inocular 2
matraces que contienen cada uno 50 mL del medio sintético Sypher y Strauss, un medio sintético del cual se
conoce las cantidades concretas de las sustancias químicas puras que lo conforman; en el primer ensayo la
fuente de carbono es la glucosa, que se encuentra presente en el 1.0% y el en segundo la fuente de carbono
es succinato 0.5%.
centrifugación Se incuba
en condiciones de aesterilidad
37°C, eny se
agitación
lavan y durante 12 horas.conLas
se resuspenden célulasdesefosfatos,
regulador cosechan por
el cual
mantiene el pH óptimo para la enzima succinato deshidrogenasa. Las suspensiones anteriores se emplean
para elaborar una serie de cuatro ensayos:
En el primero y segundo ensayo se utiliza un cultivo previo de Succinato, y se emplea como fuente de
carbono adicional Succinato 0.5% y Glucosa 1.0%, respectivamente (SS y SG). En el tercer y cuarto ensayo
el cultivo previo empleado es Glucosa, y la fuente de carbono adicionada es succinato 0.5% y Glucosa 1.0%
respectivamente (GS, GG). En condiciones de esterilidad, se toman alícuotas de 4 mL y se leen las
absorbancias a 600nm, al tiempo inicial y final de incubación, de 37°C por 5 horas, contra un blanco (medio
de cultivo sin inóculo), esto nos permitirá conocer el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento y
actividad enzimática de Escherichia coli .
b)  Efecto de la fuente de Carbono sobre la actividad de la succinato deshidrogenasa.

• Se utilizó una celda espectrofotométrica debido a que

se medirá la transmitancia de la solución en un
Celda
espectrofotométrica
espectrofotómetro

• Éste es un indicador de reacción óxido- reducción que

va a actuar como aceptor artificial final de electrones
2,6 diclorofenol inespecífico al término de la cadena artificial creada
indofenol por medio del método de Ells

• Es un inhibidor de la enzima oxidasa terminal que

permite que el 2,6 diclorofenil indofenol sea el aceptor
KCN final de electrones

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• Se utilizó Regulador de Fosfatos con la finalidad de mantener un pH de 7.3 para

poder crearse la cadena transportadora de electrones artificial y así mismo, es un
Regulador de pH óptimo para medir la actividad de la Succinato Deshidrogenasa
Fosfatos

• Se utilizó para realizar el método de Ells en dónde actúa como donador de

electrones para llevar a cabo la cadena artificial de transporte y así medir el
Succinato de efecto de la fuente de carbono sobre la actividad de succinato deshidrogenasa.
Sodio

• Es utilizado como transportador de electrones, ya que acopla la transferencia de

Metosulfato electrones entre los nucleótidos de piridina y el 2, 6- diclorofenil indofenol.
de Fenazina

• Se utilizaron
en las 4 diferentes
siguientes suspensiones
fuentes de de células de Escherichia
carbono : Succinato/Succinato, coli crecidas
Succinato/Glucosa,
Glucosa/Glucosa y Glucosa/ Succinato, con el fin de medir la actividad de cada
Suspensión uno de succinato deshidrogenasa..
celular

• En seguida que se agregó la suspensión celular, se selló la celda con

papel parafilm y se agitó rápidamente para comenzar a llevar a cabo la
Mezclar por reacción e inducir la formación de la cadena artificial de transporte.
inversión

• Después de haberse mezclado la solución por inversión , inmediatamente se

comienza a leer el %T de ésta en un espectrofotómetro previamente calibrado
Lectura contra un blanco de Regulador de fosfatos.

• Finalmente se registran los datos de %T en un intervalo de 30 segundos por

Registrar lectura.
datos

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Se realiza la determinación de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa   de la siguiente

manera:
Ya que ninguno de los componentes clave puede medirse directamente, la reacción Succinato → Fumarato
se medirá mediante la reducción de un aceptor de electrones artificial, el colorante 2,6- diclorofenol indofenol,
se añaden 0.25 ml de este colorante a una celda de espectrofotómetro, se adicionan 0.6 ml de KCN para
bloquear la trayectoria normal de electrones a través del sistema de transporte de electrones mitocondrial,
inhibiendo la transferencia de electrones del citocromo a, al aceptor final de electrones (el oxígeno, se
adicionan también a la celda 3.25 ml de regulador de fosfatos para mantener el pH óptimo de la enzima, 1.0
ml de Succinato de sodio como sustrato que la enzima oxidará, 0.4 ml de metosulfato de fenazina, compuesto
que actúa como acarreador para garantizar que los electrones sean captados por el aceptor artificial de
electrones, y por último se añade 0.5 ml de suspensión celular, que contiene a Escherichia coli,
microorganismo del que se pretende lleve a cabo esta cadena artificial de transporte de electrones.
Rápidamente la celda se sella con papel parafilm, se mezcla por inversión y se lee el porciento de
transmitancia a 600nm contra un blanco de regulador de fosfatos. Leemos en realidad la reducción del

colorante (cambio
procedimiento de color
se realiza conazul
los a4 incoloro).
ensayos, esSedecir
registran lecturas cada
suspensiones 30 segundos
celulares SS, GS, por
GG cinco
y SG.minutos. Este

OBJETIVOS 

Observar el crecimiento de E. coli al utilizar como fuentes de carbono a succinato y la glucosa.

Inducir una cadena artificial de electrones para E. coli y así poder determinar la actividad enzimática
de succinato deshidrogenasa.
Determinar qué fuente de carbono genera una mayor actividad enzimática en succinato
deshidrogenasa.

REGISTRO DE DATOS
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. coli
Después del desarrollo experimental, se obtuvieron los siguientes datos:
Se presentan las absorbancias inicial y final obtenidas a 600 nm, las cuales son un indicativo del crecimiento
de Escherichia coli en los distintos cultivos y fuentes de carbono empleadas.
*Cabe destacar que este ensayo no se realizo, por lo cual solo no se discutirán técnicas experimentales

T 
 ABLA 1  E FECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E.  COLI 
 .

Cultivos previos Matraces con + Fuente de Crecimiento Crecimiento

en: medio base carbono (Absorbancia a 600nm)
Inicial Final
Succinato 1 Succinato 0.712 1.005 0.293
2 Glucosa 0.720 1.200 0.486
Glucosa 3 Succinato 0.894 1.105 0.211
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4 Glucosa 0.889 1.211 0.322

Y, a partir de estos datos, obtenemos la gráfica correspondiente al ensayo:

GRÁFICA 1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI  

0.5

0.45

0.4

0.35

0.3 S-S
S-G
0.25 G-S

0.2 G-G

0.15

0.1

0.05

0
S-S S-G G-S G-G

SS = Cultivo previo en Succinato + adición de Succinato como fuente de carbono.

SG = Cultivo previo en Succinato + adición de Glucosa como fuente de carbono.

GS = Cultivo previo en Glucosa + adición de Succinato como fuente de carbono.
GG = Cultivo previo en Glucosa + adición de Glucosa como fuente de carbono.

EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA

SUCCINATO DESHIDROGENASA
Se muestran los resultados obtenidos dónde las fuentes de carbono para los cultivos son:
S-S: Succinato-succinato.
S-G: Succinato-glucosa.
G-S: Glucosa-succinato.
G-G: Glucosa-glucosa.

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TABLA 2 LECTURAS OBTENIDAS DE %T  A 600  NM PARA ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA EN LAS
DIFERENTES FUENTES DE CARBONO .

TIEMPO % DE TRANSMITANCIA A 600 nm DE LAS SUSPENCIONES CELULARES CRECIDAS

EN LAS FUENTES DE CARBONO
S-S S-G G-S G-G
0 15.5 15.6 16.2 16.3
30 17.4 16.5 17.4 19.8
60 19.5 17.3 17.8 20.8
90 22.8 18.1 18.6 22
120 25.5 19.2 19.2 22.8
150 28.4 16.2 19.5 24
180 31 17.1 20.6 24.9
210 34 18.1 21.3 25.9
240 36.8 18.7 21.7 26.7

270 40.1 19.3 22.3 27.3

300 43 19.8 23 28

TABLA 3 DIFERENCIA DE %T  A 600  NM PARA SUCCINATO DESHIDROGENASA EN LAS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO .

Δ%T 
TIEMPO
S-S S-G G-S G-G
0 0 0 0 0
30 1.9 0.9 1.2 3.5
60 4 1.7 1.6 4.5
90 7.3 2.5 2.4 5.7
120 10 3.6 3 6.5
150 12.9 0.6 3.3 7.7
180 15.5 1.5 4.4 8.6
210 18.5 2.5 5.1 9.6
240 21.3 3.1 5.5 10.4
270 24.6 3.7 6.1 11
300 27.5 4.2 6.8 11.7

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GRÁFICA 2 ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA DE ESCHERICHIA COLI CRECIDAS CON FUENTES DE CARBONO
GLUCOSA Y SUCCINATO POR EL MÉTODO DE ELLS  

30

25

20

 
   m S-S
   n 15
   0
   0
   6 S-G
   a
   T
   %10 G-S
   Δ
G-G
5

0
0 50 100 150 200 250 300 350

-5
Tiempo (min)

MANEJO DE DATOS
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. coli  
Para el ensayo del efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli:
Graficamos el crecimiento obtenido en cada uno de los diferentes ensayos con cultivos previos y fuentes de
carbono adicionales, para esto obtenemos el ∆ de absorbencia, el cual corresponderá al crecimiento total
para cada ensayo:
Matraz con cultivo previo en Succinato + Succinato como fuente de carbono:
∆ Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial

∆ Abs600nm = 1.005  – 0.712

∆ Abs600nm = 0.293

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Matraz con cultivo previo en Succinato + Glucosa como fuente de carbono:

∆ Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial

∆ Abs600nm = 1.200  –0.720

∆ Abs600nm = 0.486

Matraz con cultivo previo en Glucosa + Succinato como fuente de carbono:

∆ Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial

∆ Abs600nm = 1.105  – 0.894

∆ Abs600nm = 0.211 

Matraz con cultivo previo en Glucosa +Glucosa como fuente de carbono:

∆ Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial

∆ Abs600nm = 1.211 –0.889

∆ Abs600nm = 0.322

EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA

SUCCINATO DESHIDROGENASA
Se obtuvo la diferencia del % de transmitancia para cada cultivo cada treinta segundos durante 5 minutos a
partir de los resultados registrados de la tabla 1.

      

EJEMPLO:
Para el cultivo de succinato-succinato:

           

           
           
           
           
           
           
           

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             

           
           

A Continuación se muestra el comportamiento que se espera obtener en la medición de la actividad

de succinato deshidrogenasa para cada una de las condiciones de cultivo por el método de Ells.

Gráfica. 3 Comportamiento Esperado de la actividad de succinato deshidrogenasa,

medido como porcentaje de transmitancia en funcion del tiempo para cada una de las
12 condiciones de cultivo

10

8
gluc - succ
succ - gluc
   s
   T
  6 gluc - gluc
   %
succ - succ

0 Tiempo (seg)
0 50 100 150 200 250 300

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DISCUSIÓN
Según los resultados de efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli,  se observa que la
bacteria si puede incorporar succinato a su metabolismo 1, ya que sí presento crecimiento en este medio de
cultivo. La bacteria creció mejor en glucosa que en succinato ya que la absorbencias iniciales de los
matraces 3,4 son mayores que las absorbencias de los matraces 1,2, (tabla 1) esto se debe a que el uso de
glucosa como sustrato utiliza dos vías centrales en condiciones aerobias, la glicolisis y el ciclo de Krebs, lo
cual genera un mayor poder reductor que se verá reflejado en mayor síntesis de ATP 2, mientras que el
succinato es un sustrato que se va a incorporar en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, pero produciendo
menor poder reductor 3 . El mecanismo para que E. coli  incorpore succinato a su metabolismo requiere una
fase de adaptación de mayor tiempo, ya que como se observo el cultivo sí presento crecimiento en succinato
pero de manera más lenta en comparación con las células crecidas en glucosa 4. El cambio en la fuente de
carbono afecto el crecimiento celular ya que las lecturas finales de absorbencia de los matraces 1,2 y 3,4 no
son iguales.
En el matraz 2 (succinato - glucosa) Se observa que el crecimiento se acelero mas al cambiar las células pre
incubadas en succinato por otra fuente de carbono como glucosa, esta observación es notoria si restamos las
absorbencias iniciales de las finales (los valores son de M1 =0.293 y M2 =0.486), mientras que
para el matraz 1 donde no se cambio la fuente de carbono, las células continuaron replicándose pero de una
manera un tanto más constante.
En los resultados del segundo par de matraces (3,4) se presento un mejor crecimiento en
glucosa  – glucosa, comparado con el crecimiento glucosa  – succinato, los valores de absorbencia iniciales
son similares pero al cambiar la fuente de carbono, el crecimiento en succinato fue afectado disminuyendo
(matraz 3 Abs = 1.105) en comparación con el de las células crecidas en glucosa (matraz 4 Abs = 1.211).La
succinato deshidrogenasa es una enzima que está presente en procesos en la última parte del ciclo de Krebs,
una conversión de succinato a fumarato, la des hidrogenación depende de FAD . Esta enzima está unida a la
membrana de E. coli y pasa los electrones del succinato a la CoQ, por medio del FAD para permitir que se
lleva a cabo la fosforilación oxidativa. 5 
En los resultados de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa  se observa que la enzima de la
bacteria presenta una mayor actividad cuando E. coli   creció en los medios de cultivo succinato  – succinato.
También se observa que para el crecimiento en los medios de cultivo succinato – glucosa se vio afectada la
actividad de la succinato deshidrogenasa, pero no de manera determinante, es decir, que la enzima si
presento actividad, si esta actividad se compara con las de enzimas de las células que crecieron en glucosa
 – succinato podemos decir que la tendencia de éstas rectas fueron muy parecidas.

Para los ensayos de acuerdo a la bibliografía, se reporta que la actividad de la succinato deshidrogenasa se
ve reprimida cuando  E. coli es crecida en un medio que contiene glucosa, pero además esta enzima
incrementa su actividad cuando en el medio de cultivo existe succinato como la principal fuente de carbono 6.
Si succinato deshidrogenasa es una enzima reprimible, se debe tener una clara disminución en la actividad
de la enzima para el crecimiento en glucosa  –  glucosa y un aumento en el porciento de transmitancia
(cuantificación de la actividad) para el ensayo de succinato  – succinato. . En el caso de los otros dos ensayos
se esperaba un comportamiento similar, de valores de porcentaje de absorbencia entre los de succinato  – 
succinato y glucosa – glucosa, se realizo una tendencia de estos datos, representados en el gráfico 3.

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La metodología por la cual se determino la actividad de la enzima es un conjunto de reacciones de oxido

reducción que conforman una cadena de transporte de electrones artificial, donde el ultimo aceptor de
electrones fue el 2,6-diclorofenol indofenol, que genero un color verde 7, para que posteriormente se leyera la
absorbencia en un espectrofotómetro, donde para el ensayo de glucosa – glucosa se presento una desviación
muy notable en nuestros resultados, esto lo podemos atribuir a que como equipo tuvimos un error
experimental en aconfundir
glucosa-glucosa las celdas en donde
su celda correspondiente, se midió
agregamos esta
otras actividad
células al agregar
crecidas en vez de células de
en succinato-glucosa.
La tendencia de las graficas obtenidas no concuerda con lo reportado en la bibliografía 6 ya que como se dijo
se presentaron errores experimentales, sobre todo en el ensayo donde utilizamos a las células crecidas en
glucosa-glucosa cuyo valor debería ser muy diferente, pero cabe destacar que las condiciones de las células
con las cuales se trabajo, no eran conocidas, ya que como se menciono en el registro de datos solo realizo la
determinación de la actividad enzimática y no se incubaron estas. Por otro lado al ser un método indirecto y
colorimétrico las interferencias inherentes al método, y, a los errores del espectrofotómetro fueron eliminadas
mediante el tratamiento de datos. Los resultados del método realizado, el cual era la formación de una cadena
artificial para medir la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa, no son satisfactorios como se
esperaba, ya que aunque estos resultados muestran que la enzima es inducible por la presencia de succinato
no muestra que sea reprimible por la presencia de glucosa.

CONCLUSIONES
E. coli presenta un alto crecimiento en un medio que contiene células incubadas en succinato-
glucosa.
E. coli presenta un buen crecimiento en un medio de glucosa-glucosa comprado con el crecimiento
en succinato-succinato.
El crecimiento de E. coli disminuye con la presencia de succinato como principal fuente carbono y
aumenta si la fuente de carbono es glucosa.
Se determinó que la mejor fuente de carbono que genera una mayor actividad enzimática de
succinato deshidrogenasa en E. coli fue cuando se utilizó sólo Succinato.
No obtuvieron resultados que demuestren que la enzima succinato deshidrogenasa de E.coli sea
inducible según la fuente de carbono presente en el medio.

Bibliografía
1.  J. Monza, S. Doldan y S. Signorelli. Ciclo De Krebs
2.  http://www.unavarra.es/genmic/metabolismo/glucolisis.htm
3.  Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell. Bioquímica. Edit. CENGAGE Learning. Pág 560 – 565.
 
4. Curso Químico Biológico en Línea de la UCV: http://www.bioquimicaqui11601.ucv.cl/
5.  Christopher k. Mathew kensal e. Van hole kevin g. Ahern. Pearson. Bioquimica 3a edit. 586 -
587
6.  J. Rufz Herrera y L. G. García. Marzo 1972.  Regulation of succinate dehydrogenase in
escherichia coli . Departamento de microbiología, Escuela nacional de ciencias biológicas,
instituto politécnico nacional, México 17, D. F.
7.  H. Alan Ells. A colorimetric Method for the Assay of Succinic Dehydrogenase and
Pyridineucleoticde – Linked Deshudrogenases .

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOQUÍMICA MICROBIANA

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE

Escherichia coli

 ALUMNOS: 
ALVARADO RODRÍGUEZ DIANA KAREN
MARTÍNEZ PINEDA MICHELLE
RODRÍGUEZ RAMÍREZ ALEJANDRA
GRUPO: 5IV1

SECCIÓN: 1
EQUIPO: 1

FECHA DE ENTREGA DE INFORME: 13/03/14

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