Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería

Departamento de Ciencias Básicas

Química Analítica e Instrumental
Guía de laboratorio No. 6
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE COLORANTES EN
BEBIDAS DEPORTIVAS

1. OBJETIVO

Determinar el contenido de rojo allura (E129, rojo No40) y azul brillante (E133, azul No1)
presentes en diferentes bebidas deportivas mediante una técnica espectrofotométrica y
verificar en las mismas, el cumplimiento de la normatividad colombiana en cuanto al uso de
colorantes sintéticos para alimentos.

2. FUNADAMENTO TEORICO

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección

específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físicoquímicos de la espectrofotometría son
relativamente sencillos.

La ley de absorción, también llamada Ley de Beer-Lambert o simplemente Ley de Beer,

indica cuantitativamente la forma en que el grado de atenuación depende de la concentración
de las moléculas absorbentes y de la longitud del trayecto en el que ocurre la absorción.
Cuando la luz atraviesa un medio que contiene un analito absorbente, disminuye su
intensidad como consecuencia de la excitación del analito. Cuanto más largo sea el medio
por el que pasa la luz en el caso de una solución del analito de concentración dada, existirán
más moléculas o átomos absorbentes en el trayecto, y por tanto, mayor será la atenuación.
Además, para una longitud de trayecto dada de la luz, cuanto mayor sea la concentración de
los átomos o moléculas absorbentes, tanto mayor será la atenuación.

Según la Ley de Beer, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la

especie absorbente (c) y a la longitud del trayecto (b) del medio de absorción:

A = abc

Donde (a) es la constante de proporcionalidad llamada absortividad. Dado que la absorbancia

es una cantidad sin unidades la absortividad debe tener unidades que eliminen las de (b) y
(c). Cuando la concentración se expresa en moles por litro y (b) en cm, la constante de
proporcionalidad se llama absortividad molar y se simboliza como:

A = εbc

Donde ε tiene las unidades L mol-1 cm-1. La absortividad molar depende de variables como
el disolvente, la composición de la solución y temperatura, por lo cual no es aconsejable
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depender de valores de la literatura para trabajos cuantitativos. Así pues, se utiliza una
solución patrón del analito en el mismo disolvente y a temperatura similar para obtener la
absortividad en el momento del análisis. Lo más frecuente es recurrir a una serie de
soluciones patrón del analito para preparar una curva de calibración.

El empleo de colorantes en los alimentos imparte una primera impresión a la compra de un

producto, pudiendo llegar a definir el éxito o el fracaso del mismo en el mercado. Los
colorantes se clasifican según ciertos criterios: 1. El grupo cromóforo presente: colorantes
azoicos, de trifenilmetano, de indofenol, ftaleínas, pirinonas, antraquinónicos e indigoideos.
2. Según su modo de aplicación, 3. Su solubilidad en agua, 4. Su origen: sintéticos, naturales.

El empleo de colorantes sintéticos tiene la ventaja de no sufrir cambios en el color por

cambios en el pH de la solución, presencia de minerales (formación de quelatos), acción de
enzimas, o efectos de temperatura. Su empleo se encuentra regulado debido principalmente
a su toxicidad y carcinogenicidad que algunos presentan. Dentro de los métodos de detección
de los colorantes se encuentran la espectrofotometría, la cromatografía en papel y en capa
fina.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos
Por grupo de Laboratorio:
- Rojo allura, E129, Rojo No40
(1) balón aforado de 100 mL (polvo)
(1) Vaso de precipitados - Azul brillante, E133, Azul No1
(1) frasco lavador (polvo)
(1) pipeteador
(2) pipeta graduada de 5 mL
(2) pipeta aforada de 1 mL
(2) pipeta aforada de 10 mL

Generales para todos los grupos:

- Espectrofotómetro UV-Vis y celdas.

- (5) micropipetas de 10 a 100 µL.
- (5) micropipetas de 100 a 1000 µL.
- (2) micropipetas de 1000 a 10000 µL.
- Cinta de enmascarar
- 10 balones 25 mL
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- 6 balones 10 mL

4. PROCEDIMIENTO Y TABLAS DE DATOS

4.1. Preparación de las soluciones patrón de colorantes

A partir de cada solución que se prepara se construirá una curva de calibración. (el profesor
decide si trabajar uno o los dos colorantes)

Azul brillante E133 : Pesar 60.0 mg de colorante y completar a volumen de 250 mL en un

balón aforado.

Rojo allura E129 : Pesar 50.0 mg de colorante y completar a volumen de 1000 mL en un

balón aforado.

Colorante Masa (mg) Volumen balón

aforado (mL)

4.2. Preparación de la curva de calibración de colorantes

Para toda la clase se realizarán dos curvas de calibración, correspondientes a cada colorante.
Medio curso trabaja en cada curva.

En balones aforados de 25 mL preparar cada curva de calibración por adición de los

volúmenes correspondientes de la solución patrón (cálculos previos). No olvide
homogenizar las soluciones. Registre los volúmenes experimentales de la alícuota (deben ser
cercanos a los que calculó en el preinfome) y el volumen final de afore (25 mL o del volumen
del balón que se disponga en el laboratorio).

Azul brillante E133 Rojo allura E129

Volumen Volumen final Volumen Volumen final
N° N°
(µL) (mL) (µL) (mL)
A1 R1
A2 R2
A3 R3
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A4 R4
A5 R5

En la marcación del balón aforado, la primera letra significa azul (A) o rojo (R), y el número
diferencia entre las diferentes diluciones, A1-A8 contiene colorante siendo 1 el más diluido.

4.3.Muestras problema: Bebidas deportivas

Por normatividad, cualquier alimento que incluya algún colorante como aditivo, debe
mencionarlo explícitamente en la etiqueta. Se sugiere trabajar tres bebidas deportivas en
función del tipo de colorante que se declara en la etiqueta:

No Bebida deportiva Colorantes declarados

P1 Gatorade® cool blue; Azul brillante – Azul No1
PowerRade ® Berry blast
P2 Gatorade® frutas tropicales Rojo allura – Rojo No 40
P3 Gatorade® uva Azul brillante – Azul No1
Rojo allura – Rojo No 40

Prepare dos diluciones de cada una de las bebidas, con factores de dilución 1/2 y 1/5. Si se
usan balones de 10 mL (volumen final), serían 5 mL y 2 mL respectivamente. Registre
también el nombre y marca de la bebida.

Bebida Nombre Dilución 1 (D1) Dilución 2 (D2)

No Volumen Volumen Volumen Volumen
inicial (ml) final (mL) inicial (ml) final (mL)
P1
P2
P3

4.4. Determinación Espectrofotométrica

- Realizar un espectro de absorción o curva espectral de la solución patrón de cada

colorante entre 350 y 750 nm. Establecer, a partir del espectro obtenido, la longitud
de onda correspondiente al máximo de absorción de cada compuesto.

- A continuación, realice un esquema del espectro de absorción para cada muestra,

especificando las regiones de máxima absorción y mínima absorción. Cuestiónese
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respecto a la gráfica: ¿será posible cuantificar los colorantes si se encontrasen

mezclados en una bebida como es el caso de la de uva? ¿Porqué?

- Medir la absorbancia de las soluciones estándar (soluciones 1 a 9) a la longitud de

onda determinada en el punto anterior.
- Medir la absorbancia de la solución de la muestra problema y sus dos diluciones.

Curva de calibración

Azul brillante E133 λmáx.____________ Rojo allura E129 λmáx._______________

N° A %T N° A %T
A1 R0
A2 R1
A3 R2
A4 R3
A5 R4
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Patrón Patrón
E133 E110

Muestras problema

Azul brillante E133 λmáx.____________ Rojo allura E129 λmáx.____________

N° A %T N° A %T
P1
P2
P3
P1 D1
P1 D2
P2 D1
P2 D2
P3 D1
P3 D2

P1, P2 y P3 corresponden a las muestras problemas 1, 2 y 3 respectivamente. D1 y D2,

corresponden a cada una de las dos diluciones de cada colorante.

5. BIBLIOGRAFÍA
- Skoog D., Holler F., Crouch S. Principios de análisis instrumental, 6ed. Cengage
Learning, 2008.
- Skoog D., West D., Holler F., Crouch S. Química Analítica, 8ed. Thomson, 2005.
- Harvey, D. C., 2002, "Química Analítica Moderna". Editorial Mac Graw-Hill
México.
- Bolaños, N., Lutz, G., & Herrera, C. H. (2003). Química de Alimentos: Manual de
laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica.
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- Salcedo, A. M. C. (1997). Nuevos métodos fotométricos y cromatográficos para la

determinación de colorantes rojos en alimentos (No. 49). Univ de Castilla La
Mancha.

PREINFORME

1. Temas de Consulta

 Qué es un colorante para alimentos y numere cinco de los más comúnmente

empleados como aditivos.
 Consulte y dibuje las estructuras del rojo allura (E129) y azul brillante (E133).
 Consulte sobre los colorantes azoicos y de triarilmetano. De los colorantes usados en
la práctica, ¿a qué grupo pertenece cada uno?
 El rojo allura y el azul brillante actualmente se encuentran aprobados por la FDA
como aditivos para alimentos. Consulte los límites permitidos al emplearse de manera
individual y en mezclas. (recomendado: Base de datos en línea de la Norma General
del Codex para los Aditivos Alimentarios).
 Consulte sobre los riesgos para la salud el consumo de colorantes sintéticos en dosis
superiores a la recomendada por la FDA.
 En la preparación de las soluciones patrón de los colorantes (sección 4.1), ¿cuál es la
concentración en ppm y molaridad de cada uno de ellos?
 A partir de las soluciones patrón se prepararán cinco (5) diluciones como se indica en
las siguiente tabla. -Complete las columnas faltantes, calculando la concentración en
molaridad y el volumen de la solución patrón que se debe tomar para preparar cada
concentración en mL y µL y determinando que tipo de micropipeta se usaría para
medir el volumen (una micropipeta trabaja en un rango de volumen específico)
 ¿Cuáles son los componentes principales de un espectrofotómetro?

Azul brillante E133

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Balón
Concentración Concentración Volumen Volumen Tipo de
Aforado
(ppm) (M) (mL) (µL) micropipeta a usar
N°
A1 10
A2 20
A3 40
A4 80
A5 120
Patrón 240 3.03 x 10-4 0 0 -----------

Rojo allura E129

Balón
Concentración Concentración Volumen Volumen Tipo de
Aforado
(ppm) (M) (mL) (µL) micropipeta a usar
N°
R1 6
R2 12
R3 20
R4 30
R5 40
Patrón 50 1.0 x 10-4 0 0

2. Determinación del contenido de Rojo allura y azul brillante en bebidas y sus respectivas
diluciones.

Resultados esperados:

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

Diagrama de Flujo:
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3. Curva de calibración. Complete la tabla:

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4. Tabla de toxicidad de reactivos

Disposición
de Residuos
Primeros
Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* (orgánicos,
Auxilios
ácidos,
básicos)

*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable
(F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn),
irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N).

4. Bibliografía.
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Informe

TRATAMIENTO Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

- ¿Que colorante tiene una menor longitud de onda de máxima absorción? ¿porqué?
(E= hc/λ).
- A partir del espectro de absorción de los dos colorantes, ¿es viable la cuantificación
de cada uno de ellos en una bebida donde se encuentren mezclados?
- Analice la pregunta anterior, pero suponiendo dos colorantes similares, como es el
amarillo ocaso y tartrazina. ¿Qué se puede hacer en ese caso?
- La gráfica de Ringbom permite determinar el intervalo de concentraciones donde se
cumple la ley de Beer. Determine este intervalo dentro del rango de concentraciones
trabajado.
- A partir del gráfico de Ringbom, determine el valor de concentración alrededor del
cual el error relativo del análisis será mínimo (punto de inflexión).
- Construya una curva de calibración, graficando los valores de absorbancia obtenidos
vs. concentración para cada una de las soluciones preparadas.
- Aplique el método de regresión lineal por cuadrados mínimos a los datos obtenidos.
Determine el rango lineal de trabajo. ¿Se presentó desviación negativa o positiva?
¿Hubo necesidad de descartar algún punto?
- La línea obtenida, ¿pasa por el origen de coordenadas?. Según la ley de Lambert-
Beer debería hacerlo, de no ser así, ¿a qué se debe esta desviación?
- ¿Qué valor y qué unidades tiene el coeficiente de absortividad en la curva de
calibración que realizó?
- Interpole el valor de absorbancia de las muestras problema y sus diluciones en la
curva de calibración obtenida y cuantifique la concentración de cada colorante.
- Entre la muestra problema sin diluir y las dos diluciones, ¿cuál dilución recomienda
usar en la cuantificación de cada colorante?
- Compare los valores obtenidos para cada colorante en las bebidas analizadas respecto
a las cantidades máximas permitidas según la normatividad colombiana (Rojo 40, 300
ppm; azul brillante: 100 ppm, mezclas 300 ppm sin que se sobrepase el límite individual)