BIOLOGIA MOLECULAR

AULAS PRÁTICAS

3º ano, 1º semestre

2019-20
EXERCÍCIO Nº 1

Na elaboração do mapa de restrição de uma molécula de pDNA, foram

digeridas três amostras deste pDNA com as enzimas de restrição EcoRI (E),
HindIII (H) e BamHI (B). Estas enzimas foram usadas em ensaios de digestão
dupla e tripla: EcoRI x HindIII; EcoRI x BamHI; e EcoRI x BamHI x HindIII. Após
digestão, os fragmentos de restrição obtidos foram separados por electroforese
em gel de agarose, e os fragmentos de DNA foram visualizados por coloração
com brometo de etídio. O tamanho dos fragmentos de restrição encontram-se
na tabela seguinte:

Enzimas Fragmentos de restrição (Kb)

EcoRI x HindIII 42,8 - 9,2
EcoRI x BamHI 48 - 4
EcoRI x BamHI x HindIII 38,8 - 9,2 - 4

Construa o mapa de restrição do pDNA assinalando as posições relativas dos

sítios de restrição E, H e B indicando as distâncias entre eles, bem como o
tamanho da molécula do pDNA em estudo.
EXERCÍCIO Nº2

A sua mais recente tarefa laboratorial teve como objectivo a elaboração do

mapa de restrição de um fragmento de DNA resultante de uma digestão com a
enzima de restrição BamHI. Foram digeridas três amostras deste fragmento de
DNA com as enzimas de restrição EcoRI, PstI, e com EcoRI e PstI em
simultâneo. Após digestão, os fragmentos de restrição obtidos foram separados
por electroforese num gel de agarose, e foram visualizados por coloração com
brometo de etídio. O tamanho dos fragmentos de restrição encontram-se na
tabela seguinte:

Enzima(s) Fragmentos de restrição (kb)

EcoRI 1,7
0,9
0,4
PstI 1,6
1,4
EcoRI x 1,2
PstI 0,9
0,5
0,4

a) A partir dos resultados obtidos construa o mapa de restrição onde

mostre as posições relativas dos sítios de restrição EcoRI e PstI
assinalando as distâncias entre eles.

b) Indique o tamanho em bp (ou em kb) do fragmento de DNA em estudo

EXERCÍCIO Nº3

Analise os resultados dos ensaios de restrição com as enzimas EcoRI e BamHI

que estão esquematizados na Fig. 1 (painel A e painel B).
Na mesma figura estão representados os mapas de restrição para as enzimas
EcoRI (E) e BamHI (B) de um pDNA (em C), e de um fragmento de DNA
genómico (em D).

A. B.
1 2 3 4 1 2 3 4

6 Kb 6 Kb
5 Kb 5 Kb
4 Kb 4 Kb
3 Kb 3 Kb
2 Kb 2 Kb
1 Kb 1 Kb

C. D.
2 kb
B
B
B E
2 kb 3 kb 1 kb
6 Kb 1 kb

E
3 kb

Figura 1 – Resultados da análise de amostras de duas amostras de DNA

(genómico e plasmídico). (A e B) Esquema dos resultados da electroforese em
gel de agarose a 1% das amostras de DNA digeridos com enzimas de restrição
EcoRI (ensaio 1), BamHI (ensaio 2), digestão dupla EcoRI x BamHI (ensaio 3).
A amostra 4 corresponde ao marcador de pesos moleculares; (C e D) Mapas
de restrição do pDNA e do fragmento de DNA genómico, respectivamente.

a) Identifique o ensaio de restrição que corresponde a cada uma das amostras

de DNA digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI.
EXERCÍCIO Nº4

A seguinte sequência de DNA contém o sítio de reconhecimento para a

endonuclease de restrição SstI (a seta indica o sítio de clivagem):

REACÇÃO 1

Se a sequência for alterada na posição indicada (letra a negrito), a enzima SstI

já não corta esta sequência; em vez disso, a sequência passa a ser clivada
pela enzima de restrição MboI (seta):

REACÇÃO 2

(as regiões de DNA digeridas pelas enzimas de restrição são cadeias duplas
mas para simplificar só se representa uma das cadeias)

a) Qual das sequências seguintes poderá ser o sítio de reconhecimento

da enzima SstI?

A. 5’-GGAGCTCG-3’
B. 5’-GGAGCT-3’
C. 5’-GAGCTC-3’
D. 5’-AGCTCG-3’
E. 5’-CTCG-3’

b) Qual das sequências seguintes poderá ser o sítio de reconhecimento

da enzima MboI?

A. 5’-GGATCTCG-3’
B. 5’-GGATCT-3’
C. 5’-GATCTC-3’
D. 5’-ATCCTG-3’
E. 5’-GATC-3’
EXERCÍCIO Nº5

Na Figura está esquematizado um ensaio de sequenciação de um

fragmento de DNA, segundo o método enzimático ou de Sanger.

DNA 5’ - TGC CCA – 3’

3’ - ACG GGT – 5’
(429) (460)

primer
ENZIMA (E):___________________

reacção A reacção C reacção G reacção T

α-32P dATP α-32P dATP α-32P dATP α-32P dATP
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
dGTP dGTP dGTP dGTP
dCTP dCTP dCTP dCTP
dTTP dTTP dTTP dTTP

A C G T
____
____
____
ntd 460 ____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
ntd 429 ____
____
5.1. Identifique a enzima (E) utilizada.

5.2. Por que razão se utilizaram os nucleótidos dideoxi (ddNTP) para definir a
posição do nucleótido correspondente na sequência de DNA?

5.3. Faça a leitura do gel de sequenciação, apresentado no esquema da Fig.1,

entre os nucleótidos 430 e 440, indicando a orientação da sequência lida.

5.4. Escreva a estrutura nucleotídica do fragmento correspondente.

EXERCÍCIO Nº6

A tecnologia do DNA recombinante, baseada em avanços essenciais da

Biologia Molecular de diversos tipos de organismos vivos, tornou
possível, de modo insubstituível, o aprofundamento do conhecimento da
estrutura e funcionamento de genomas complexos.
A Figura 6 corresponde ao esquema de um cDNA full-length (A) e de um vector
de clonagem (B) utilizado na clonagem molecular do mesmo:

A. ATG
E B S H P X B

5’ 3’

B.
KpnI
BstXI
SmaI
ClaI
ApaI
NotI
XbaI
ScaI
XhoI
HindII
EcoRI
BamHI
SpeI
PstI
BssHII
SacI

Figura 6 - A. Mapa de Restrição do cDNA full-length. Sítios de restrição:

E- EcoRI; B- BamHI; S- SmaI; H- HindIII; P- PstI; X- XhoI.

B. Vector de Clonagem: pBK-CMV. MCS – multiple cloning site; P CMV –

promotor de citomegalovírus; P Lac – promotor lac; Lac Z – β- galactosidase; P
SV-40 – promotor SV-40; SV-40 pA – SV-40 poliA; neo/kan – gene de
resistência a neomicina/ kanamicina.
6.1. Quais os critérios que utilizaria para seleccionar as enzimas de restrição a
utilizar na clonagem direccional do cDNA no vector pBK-CMV? Especifique o
sistema escolhido.

6.2. Refira o método que utilizaria na selecção de clones positivos

eventualmente obtidos no ensaio de clonagem. Justifique.
EXERCÍCIO Nº7

Imagine que está a tentar clonar o cDNA que codifica para a proteína X, num
vector de expressão eucariótico (pBM).
Começou por ligar um fragmento de 2Kb de DNA com extremidades EcoRI,
que corresponde ao quadro de leitura da proteína, com o vector de expressão
pBM, que anteriormente tinha sido linearizado com EcoRI.
Após transformação de células E. coli foram obtidas 5 colónias (A, B, C, D e E).
O DNA plasmídico for extraído a partir de cada uma destas colónias, e foi
digerido com as enzimas de restrição EcoRI e SalI.
Os produtos de digestão foram analisados em gel de agarose, e os resultados
do gel estão representados no diagrama seguinte:
7.1. Explique os vários padrões de restrição obtidos, e escolha o clone que
usaria (A, B, C, D e/ou E), se quisesse exprimir a proteína X numa linha celular
eucariótica.
EXERCÍCIO Nº8

Considere o fragmento HindIII de 1,6 kb (A) e o vector plasmídico

hipotético de 2,7 kb (B), representados na Figura 1 abaixo indicada.

A. B.
Hind III Hind III Hind III

0,3 Kb
2,7 Kb
1,6 Kb
Eco RI
fragmento Hind III

vector plasmídico

Quando se digere o referido fragmento A com BamHI originam-se dois

fragmentos, de 1,2 kb e 0,4 kb. Admita que clonou o fragmento
representado em A no sítio HindIII do vector representado em B.

Como procederia para determinar a orientação do fragmento num dos clones

recombinantes?
EXERCÍCIO Nº9

O gene biomol exprime-se no fígado de rato e a sua expressão é regulada

pelos glucocorticóides. Foram tratados ratos com 30 mg /Kg de dexametasona,
e sacrificados a diferentes tempos após administração do indutor. Foi extraído
RNA total a partir dos fígados de ratos controlo e de ratos tratados, e foi
efectuada uma experiência de Northern blot. Na Figura seguinte está
esquematizado o resultado da experiência de Northern blot.

Tempo (h) 0 1 2 3 4 5 6

mRNA
gene X
biomol

mRNA
- actina

9.1. Analise o esquema anterior e descreva os resultados obtidos, referindo-se

aos tempos de indução do gene biomol pelos glucocorticóides. Justifique a sua
resposta.
O esquema seguinte representa os resultados de um outro ensaio de Northern
blot, em que se analisaram os níveis de expressão de três factores de
transcrição potencialmente envolvidos na regulação do gene biomol.

Tempo (h) 0 1 2 3 4 5 6

mRNA TF1

mRNA TF2

mRNA TF3

mRNA -actina

9.2. Comparando a relação cronológica entre a expressão dos vários

factores de transcrição (TF1, TF2 e TF3) e a activação da transcrição do
gene biomol, diga qual destes factores estará potencialmente envolvido a
expressão do gene biomol. Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº10

A figura 10-A representa um clone genómico, que comporta a sequência

nucleotídica que codifica para um factor de transcrição de Drosophila
melanogaster.
As setas indicam o sítio de iniciação da transcrição (seta 1), bem como a região
3’ do último exão (seta 2).
Dois fragmentos de restrição obtidos a partir deste clone foram marcados com
32P e usados como sondas (sonda 1 e sonda 2) em ensaios de Northern blot.
As amostras de mRNA que se utilizaram foram obtidas a partir de diferentes
estadios de desenvolvimento: embrião (E), larva (L) e adulto (A).
O resultado da análise de Northern blot está esquematizado na fig. 10-B.

Fig. 10 - A
1 2
Clone genómico

sonda 1 sonda 2

Fig. 10 – B

E L A E L A

Resultados obtidos Resultados obtidos

com a sonda 1 com a sonda 2
10.1. Interprete os resultados obtidos através da análise de Northern blot, com
ambas as sondas.

10.2. Imagine que quer clonar o cDNA que codifica para este factor de
transcrição:
a) Que estadio de desenvolvimento (E, L ou A) utilizaria para gerar a sua
biblioteca de cDNA? Porquê?

b) Que sonda utilizaria para fazer o screening de uma biblioteca de cDNA.

Porquê?
Depois de ter clonado com sucesso o cDNA que codifica para o factor de
transcrição em estudo, utilizou dois fragmentos do cDNA como novas sondas
(sonda 3 e sonda 4), em novos ensaios de Northern blot.

10.3. Desenhe no diagrama abaixo representado, os resultados que esperaria

obter após hibridação de dois novos blots, com as sondas 3 e sonda 4.
Justifique a sua resposta.

Sequência do cDNA:

5’ ACGTATGATACTGGTACGTCTGTAATGCGAAAAAAAAAAAAAA 3’

sonda 3 sonda 4
EXERCÍCIO Nº11

Resultados experimentais demonstraram que factor de transcrição FT1

tem capacidade de heterodimerizar com outros dois factores de
transcrição (FT2 e FT3), e que alguns destes heterodímeros são
importantes na regulação da transcrição do gene X.

Imagine que está interessado em caracterizar os diferentes domínios da

proteína FT1.
Para tal, construiu uma série de mutantes de deleção e co-transfectou cada um
destes mutantes com um plasmídeo reporter que contém o promotor próximo
do gene X.
Foram também efectuados ensaios em que adicionalmente se co-transfectaram
os vectores de expressão que codificam para as proteínas FT2 ou FT3
selvagens.
Na tabela seguinte encontram-se os níveis de activação da transcrição do gene
X pelos diferentes mutantes do factor FT1, na presença ou ausência de FT2 ou
FT3:

Domínio mutado de FT1 FT1 FT1 + FT2 FT1 + FT3

1 Wt + +++ +++
1
2 1 + + +++
2 3 4 5
3 2 + +++ +
1 3 4 5
4 3 - - -
1 2 4 5
5 4 - - -
1 2 3 5

Por outro lado foram efectuados ensaios de EMSA em que se utilizou como
sonda o elemento de resposta do factor FT1 no promotor do gene X e extractos
nucleares de células COS-7 que tinham sido transfectadas com cada um dos
mutantes de deleção. Os resultados obtidos estão representados no diagrama
seguinte:

wt 1 2 3 4

shift

sonda livre
11.1. Qual o domínio de ligação ao DNA da proteina FT1? Justifique a sua
resposta.

11.2. Qual o domínio de transactivação da proteina FT1? Justifique a sua

resposta.

11.3. Será que FT1 heterodimeriza com FT2 e FT3 através do mesmo
domínio? Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº12

O gene isca é um gene de expressão hepática, importante nos processos de

destoxificação do organismo. Num artigo recente, investigadores testaram o
papel do factor de transcrição FEL (FTY) na indução da transcrição do gene
isca.
Para tal, foram construídos vários recombinantes contendo a região reguladora
do gene isca, com deleções tanto a montante como a jusante do sítio de
iniciação da transcrição deste gene.

-1560 -1175
SV Luc 6
-1175 -790

SV Luc 5
-2274 -790
SV Luc 4

-790 +1 +50
Luc 3

-2274 +1 +50
Luc 2

-2274
+1 +145
Luc 1

0 1 2 3 4 5 6 7
Actividade Luc (x de indução)

Controlo FTY

Figura 12: Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em culturas de

células CV1 (fibroblastos de rim de macaco). Co-transfecção do vector de
expressão para o factor de transcrição fel (FTY) com os vários recombinantes
contendo a região reguladora do gene isca.
Luc – gene reporter luciferase; SV – promotor SV-40.
12.1. Existe uma diferença fundamental ao nível do promotor utilizado na
construção dos vectores recombinantes 1, 2 e 3, e dos 4, 5 e 6. Diga qual é
essa diferença.

12.2. De acordo com a análise dos resultados indique qual é a região

responsável pela activação da transcrição do gene isca pelo factor FEL.
Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº13

O gene isca é um gene de expressão hepática induzido pelos glucocorticóides.

Num artigo recente, investigadores tentaram identificar o elemento de resposta
aos glucocorticóides na região reguladora do gene isca.
Para tal, foram construídos vários recombinantes contendo a região reguladora
do gene isca, com deleções tanto a montante como a jusante do sítio de
iniciação da transcrição do gene.

-1560 -1175

SV Luc 6
-1175 -790
SV Luc 5
-2274 -790

SV Luc 4

-790 +1 +50
3
Luc
-2274 +1 +50
Luc 2

-2274
+1 +145
1
Luc

0 5 10 15 20 25
Actividade Luc (x de indução)

Controlo 10uMDEX

Figura 13: Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em células HuH7

(hepatoma humano). Transfecção de vários recombinantes contendo a região
reguladora do gene X. As células foram tratados com veículo ou com 10M de
dexametasona (DEX). Luc – luciferase; SV – promotor SV-40.
Pela análise dos resultados podemos identificar duas regiões reguladoras no
gene isca: uma das regiões é importante para a expressão basal do gene,
enquanto a outra é responsável pela resposta aos glucocorticóides.

13.1. Identifique essas duas regiões, justificando a sua resposta.

EXERCÍCIO Nº14

Trabalhos recentes de investigação laboratorial conduziram à clonagem

de um novo receptor nuclear denominado WINTER-FARMO (WF), tendo
sido identificadas uma série de moléculas capazes de activar este novo
factor de transcrição. Uma consulta bibliográfica detalhada permitiu
verificar que os ligandos identificados são igualmente conhecidos como
sendo indutores do gene student.

Na tentativa de identificar o elemento de resposta do factor de transcrição WF

no promotor do gene student foram construídos vários recombinantes contendo
deleções da região reguladora do gene. Estes mutantes sido co-transfectados
com o vector de expressão do factor WF, em culturas da linha celular COS-1.
Na Figura 14 encontram-se representados os níveis de activação dos
diferentes mutantes de deleção do gene student pelo factor WF.
BamH I

BamH I

Kpn I
Sph I
Xho I

Bgl I

+1

Actividade
Luc
LUC wt +

LUC m1 -

LUC m2 +

LUC m3 -

m4 +
LUC

Figura 14 - Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em células

eucariotas da linha COS-1. Co-transfecção de vários recombinantes contendo
a região reguladora do gene student, com o vector de expressão do receptor
nuclear WF. Luc – luciferase; wt - wild type ou selvagem; m – mutante.
14.1. De acordo com a análise destes resultados indique qual é a região
responsável pela activação da transcrição do gene student pelo factor de
transcrição WF. Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº15

Na Figura 15 está esquematizado o resultado de uma experiência de EMSA.

Extractos nucleares preparados a partir de vários tecidos animais foram
incubados com o fragmento de restrição da região promotora do gene student
que contém o elemento de resposta do factor WF, e que foi marcada
radioctivamente com 32P.
De modo a testar a especificidade da ligação foram efectuados ensaios de
competição com um excesso molar de competidor que contém a sequência de
consenso de ligação do factor WF.

Sonda + + + + + + + + +

Competidor - - + - + - + - +

Extracto - F F C C I I R R
nuclear

Figura 15 - F: fígado; C: cérebro; I: intestino; R: rim.

15.1. O que é que pode concluir analisando esta auto-radiografia?
Refira-se especificamente à capacidade de ligação do factor WF nos diferentes
tecidos animais.

15.2. Que experiência(s) é que deveria fazer para determinar se o receptor WF

se encontra nos complexos formados?
EXERCÍCIO Nº16

O gene REGABOFE (RGB) codifica para uma proteína de expressão hepática.

A expressão basal do gene é regulada positivamente pelo factor de transcrição
SEF (Sempre Em Festa), no entanto ainda não tinha sido identificado o
elemento de resposta para este factor.
Dados recentes (ver Figura 16.1 – A, B e C), vieram não só identificar a região
do promotor do gene RGB transactivada pelo SEF, bem como o tipo de
interacções que se estabelecem, a nível da região 5’- adjacente, entre este
factor e os receptores nucleares PXR (Paródia X Receptor) e CAR
(Comemoração Anual Receptor).

A
CAR/PXRRE GRE EcoRV EcoRI AvrII AvrII
RGB -1874 LUC
-1839 -1697 -1358 -362 -250 -114
SmaI
RGB / SV40 LUC
SV40

RGB -1874? -1357/-362 LUC

RGB -1874? -250/-114 LUC

Figura 16.1 – Transactivação do promotor RGB pelos factores de transcrição

SEF, PXR e CAR. Co-transfecção de plasmídeos reporter wild-type e mutantes
contendo a região 5’- adjacente do gene RGB, com os vectores de expressão
que codificam para as formas humanas dos factores de transcrição SEF, CAR
e PXR.
Analise a Figura 16.1 e responda às seguintes perguntas:

14.1. Que enzima(s) de restrição foram utilizada para construir o mutante de

deleção RGB -1874Δ -1357/-362?

14.2. Qual a diferença entre os mutantes RGB/SV40 e RGB -1874Δ -1357/-

362? Justifique a sua resposta.

14.3. Qual a região do promotor do gene RGB transactivada pelo SEF?

Justifique a sua resposta.
Tendo em conta que o fenobarbital é um activador do receptor CAR e que
a rifampicina e o 4-hidroxitamoxifeno são agonistas do receptor PXR, e
que ambos os receptores estabelecem interacções proteína-proteína com
o receptor SEF, analise as Figuras 14.1 e 14.2, e responda à pergunta
seguinte:

DMSO
4OHT
RIF
PB
RGB
-ACTINA

Figura 16.2 – Efeito do tratamento com agonistas dos receptores nucleares

PXR e CAR nos níveis de mRNA do gene RGB em células HepG2. Análise por
RT-PCR do RNA total (20g) de células HepG2 tratadas durante 24 h com
veículo (DMSO), com fenobarbital (PB), com rifampicina (RIF) ou com 4-
hidroxitamoxifeno (4OHT), utilizando primers específicos para o RGB e para a
-actina.

16.4. Qual é o efeito da interacção entre os receptores nucleares CAR e PXR e

o factor SEF, na regulação da transcrição do gene RGB?
Justifique a sua resposta.
Uma análise bioinformática identificou um potencial elemento de resposta
ao factor SEF na região -362 a +34. Foi efectuado um ensaio de EMSA,
para verificar se o factor SEF tinha capacidade de se ligar a esta
sequência.

Analise a Figura 16.3 e responda às questões seguintes:

RGBCYP-152wt
-152wt

EN
Competidor

anticorpoanti-SEF
Anticorpo anti-HNF4

Figura 16.3 – Caracterização da actividade de ligação de proteínas presentes

nos extractos nucleares das células HepG2, ao oligonucleótido RGB-152 wt.
Ensaio de EMSA foi efectuado utilizando um oligonucleótido em cadeia dupla
marcado radioactivamente que corresponde ao potencial elemento de resposta
ao SEF no promotor do gene RGB como sonda (RGB-152 wt). Os ensaios de
competição foram efectuados adicionando oligonucleótidos mutados em cadeia
dupla não marcados, numa concentração 100 vezes superior à da sonda. O
ensaio de supershift foi efectuado utilizando um anticorpo anti-SEF.
16.5. O factor SEF tem capacidade de se ligar à sonda? Existirão mais
proteínas nucleares capazes de se ligarem a esta região? Justifique a sua
resposta.

16.6. Qual das mutações (-152mut1 ou -152mut2) introduzidas nos

oligonucleotidos competidores impede a ligação das proteínas nucleares à
sonda? Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº17

Um grupo de investigadores estudou o papel da proteína PXR na

regulação da expressão do gene CYP2B6. O CYP2B6 está envolvido no
metabolismo de numerosos fármacos, e a sua expressão é induzida por
compostos que são ligandos do PXR (por exemplo, rifampicina,
fenobarbital e dexametasona). Resultados de estudos anteriores
identificaram uma sequência reguladora localizada numa região
enhancer, denominada CYP2B6-PBREM. Este módulo regulador contém 2
elementos –cis DR4 (NR1 e NR2) que funcionam como sítios de ligação
para heterodímeros CAR-RXR.

Os recombinantes contendo o gene repórter Luciferase (Luc) foram preparados

inserindo as estruturas oligonucleotídicas (fig.17.1 - A) correspondentes às
sequências wild-type e mutadas do CYP2B6-PBREM no vector de expressão
pGL3-tk-Luc.
Fig. 17.1 – Regulação do PBREM do CYP2B6 pelo PXR e CAR. (A) Estrutura da
sequência reguladora CYP2B6-PBREM. Os elementos DR4 (NR-1 e NR-2) estão
assinalados por setas, e as bases mutadas estão em letra minúscula.
Ensaios de transactivação dos recombinantes selvagem e mutantes do CYP2B6-
PBREM pelo PXR (B) e CAR (C) foram feitos através da transfecção transitória de
células HuH7 (hepatoma humano). A activação mediada pelo PXR foi caracterizada
pelo tratamento das células transfectadas com rifampicina ou DMSO (veículo) por 24
horas.

A capacidade de ligação das proteínas PXR e CAR aos sítios NR1 e NR2
foi avaliada por EMSA (fig.17.2).

Fig. 17.2 - Ligação das proteínas reguladoras aos elementos de resposta NR1 e
NR2. (A) EMSA com sondas oligonucleotídicas de dsDNA correspondentes às
sequências de ligação NR1 e NR2 (ver Fig.2-A). Nas reacções de binding foram
usadas proteínas RXR, CAR e PXR traduzidas in vitro.
17.1. Sabendo que o PXR é um receptor nuclear, diga quais os domínios
estruturais que poderão fazer parte desta proteína, e qual o papel
desempenhado por eles na regulação da expressão genética.
17.2. Com base nos resultados apresentados nas figuras anteriores, responda
às perguntas seguintes:

a) O PXR é um activador ou um repressor da transcrição do gene CYP2B6?

Justifique a sua resposta.

b) Qual é a informação mais evidente que retira da análise do resultado do

EMSA?
Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº18

O conjunto de resultados apresentados na Fig.18 corresponde a uma

experiência na qual foi avaliada a regulação da expressão do gene fos
pelo micro-RNA, miR-7b.
O miR-7b tem uma sequência parcialmente complementar com uma sequência
da região 3’ não traduzida do mRNA fos. Um fragmento de DNA codificando o
RNA miR-7b e um outro fragmento codificando para um micro-RNA não
relacionado com o mRNA fos foram clonados em vectores de expressão, e os
plasmídeos recombinantes (designados si-miR-7b, amostras 3 e 4, e si.miR-7b-
neg, amostras 5 e 6, respectivamente, na Fig.1) foram transfectados para
culturas de fibroblastos de ratinho; células não transfectadas foram usadas
como controlo (amostras 1 e 2).
Algumas das culturas foram tratadas com ésteres de forbol (PMA; amostras 2,
4 e 6), enquanto outras foram mantidas na ausênca de tratamento (amostras 1,
3 e 5). Os ésteres de forbol são análogos do diacilglicerol e actuam como
activadores da PKC (Protein Kinase C).
Duas horas após o tratamento com PMA, prepararam-se extractos proteicos a
partir das culturas celulares que foram analisadas por Western blotting usando
anticorpos anti-Fos (painel superior, Fig.1a) e anti-Actina (painel inferior,
Fig.1a).
O RNA foi isolado a partir de outras culturas celulares, após o tratamento com
o PMA durante uma hora. As amostras de RNA foram sujeitas a electroforese
em gel desnaturante de agarose, e coradas com brometo de etídio (painel
inferior, Fig. 1b). As mesmas amostras foram analisadas por Northern blot
usando como sonda o cDNA fos (painel superior, Fig.18b).
 Controlo miR-7b miR-neg transfecção

PMA
fos
Actin

Controlo miR-7b miR-neg transfecção

PMA
fos
28S rRNA
18S rRNA

1 2 3 4 5 6 amostras
Figura 18 – Análise do efeito do miR-7b na expressão do gene fos por Western
blotting (a) e Northern blotting (b).

18.1. Diga qual o objectivo do ensaio de Western blotting

18.2. Diga qual o objectivo do ensaio de Northern blotting.

18.3. Após análise da Figura 1, diga a que nível de regulação é controlada a

expressão do gene fos nos fibroblastos de ratinho. Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº19

O gene AWAKE codifica para um factor de transcrição que participa na

regulação de genes envolvidos na plasticidade sináptica. A atividade
transcricional deste factor depende do seu estado de fosforilação em resposta
à activação de um receptor de membrana PROF, e à sua subsequente
translocação para o núcleo (Fig. 19). De entre os inúmeros genes alvo do factor
AWAKE encontra-se o gene GRADE. Uma análise genética minuciosa levou à
conclusão que o gene AWAKE apresenta diferentes tipos de polimorfismos
genéticos que afectam a função da proteína, e que são frequentes entre os
alunos de Ciências Farmacêuticas.

Figura 19.1 - Mecanismo molecular de activação do factor de transcrição AWAKE: o

factor AWAKE é fosforilado após activação do receptor de membrana PROF pelo seu
ligando, e é translocado para o núcleo onde se liga a elementos cis- no promotor dos
seus genes alvo, nomeadamente o gene GRADE.

Inicialmente foram genótipados diferentes indivíduos, tendo sido caracterizados

os diferentes tipos de polimorfismos genéticos encontrados entre a população
de alunos da FFULisboa.

19.1. Sugira uma abordagem experimental que permita a genotipagem dos

polimorfismos do gene AWAKE na população de alunos da FFULisboa.
Após a análise genética foram encontrados diferentes tipos de polimorfismos:

a) Mutuação pontual no promotor do gene AWAKE (M1).

b) Mutação pontual na sequência do gene AWAKE que codifica para o
domínio de ligação ao DNA (DBD) (M2).
c) Deleção de um nucleótido na sequência do gene AWAKE, na região que
codifica para o DBD, que leva a um frameshift (M3).
d) Substituição de uma serina por um glutamato, na região que codifica
para proteína que é fosforilada em resposta à ativação do receptor
PROF (M4).

Na tentativa de melhor perceber a consequência destes polimorfismos, foram

geradas diferentes linhas de ratinhos transgénicos com estas alterações
genéticas, e foi extraído RNA total a partir do encéfalo destes ratinhos. Na
Figura 19.2 estão representados os níveis de mRNA AWAKE em ratinhos wild-
type e ratinhos transgénicos contendo as diferentes mutações.

Figura 19.2 – Níveis de mRNA AWAKE no encéfalo de ratinhos wild-type (WT)

e de ratinhos transgénicos contendo as mutações M1, M2, M3 ou M4,
analisados por Northern Blot.

19.2. Descreva o efeito das diferentes mutações nos níveis de expressão do

gene AWAKE. Justifique a sua resposta.
Foi efectuado um ensaio de EMSA (Electrophoretic Mobility Shif Assay) usando
como sonda um oligonucleótido que comporta a região do promotor do gene
AWAKE (WT) ou a sequência com a mutação 1 (M1), e extratos nucleares
preparados a partir do encéfalo de ratinhos wild-type (Figura 19.3).

Figura 19.3 – Actividade de ligação de proteínas reguladoras à região promotora do

gene AWAKE. EMSA em que foi usado como sonda um oligonucleótido que comporta
a região do promotor do gene AWAKE (WT) ou a sequência com a mutação 1 (M1), e
extratos nucleares preparados a partir do encéfalo de ratinhos wild-type. A seta indica
um shift específico.

19.3. Comente a seguinte afirmação, com base nos resultados das Figuras
19.2 e 19.3: “A mutação M1 no promotor do gene AWAKE poderá levar a uma
diminuição da ligação de uma proteína ativadora ao promotor deste gene ”.
Seguidamente foram clonados os cDNAs que contêm as sequências WT ou as
sequências com as mutações M2, M3 e M4 num vector de expressão
eucariótico, e foram feitos ensaios de transfeção-transactivação com um
plasmídeo repórter que contém o promotor do gene GRADE (Figura 19.4A).
Foram igualmente preparados extratos nucleares de células em que foi feita a
sobre-expressão da proteína AWAKE wild-type e das diferentes proteínas
mutadas (M2, M3 e M4), tento as células sido tratadas ou não com um agonista
do receptor PROF. Seguidamente os níveis de proteína AWAKE no núcleo
foram determinados por Western Blot (Figura 19.4B).

Figure 19.4 – Efeito das mutações na M2, M3 e M4 na atividade transcricional da

proteína AWAKE. (A) Ensaios de transfeção-transactivação em que foram co-
transfectados os vectores de expressão que codificam para a proteína wild-type ou as
suas formas mutadas (M2, M3 e M4), e um vector repórter que contém o elemento de
resposta à proteína AWAKE no promotor do gene GRADE. Os resultados
apresentados representam a actividade luc relativa.
(B) Os níveis de proteína AWAKE no núcleo foram determinados por Western Blot
com um anticorpo específico anti-AWAKE, e com um anticorpo anti-actina como
controlo interno.

19.4. Dê uma explicação para a diferença de resultados obtidos com os

mutantes M2 e M3, tendo em consideração que ambas as mutações se situam
no domínio de ligação ao DNA.
Finalmente foram medidos os níveis de mRNA GRADE em várias amostras de
diferentes alunos da FFULisboa, por PCR em tempo real (Figura 19.5).

Figura 19.5 – Níveis de mRNA GRADE em amostras (A a G) de diferentes alunos da

FFULisboa determinados por RT-PCR em tempo real.

19.5. Faça a correspondência entre as amostras (A, B, C, D, E, F, G) e o tipo

de polimorfismo genético (WT, M1, M2, M3 ou M4) que estes alunos deverão
apresentar. Justifique a sua resposta. (2,0 valores)

A–

B–

C–

D–

E–

F–

G–
EXERCÍCIO Nº20

O seu mais recente projecto de investigação consiste no estudo de dois

genes, Bms1 e Mffs2 que suspeita estarem envolvidos no
desenvolvimento embrionário no murganho.

Para estudar estes genes isolou DNA total, RNA total e amostras de
proteína total de murganhos nas seguintes fases de desenvolvimento:
1) embriões num estadio de desenvolvimento precoce (8 dias pós-fertilização,
ou 8dpf)
2) embriões num estadio de desenvolvimento tardio (15 dias pós-fertilização,
ou 15dpf)
3) crias recém-nascidas (NB)
4) adultos com 3 meses de idade (A)

A expressão de Bms1 e de Mffs2 durante o desenvolvimento pode ser

controlada a nível do RNA (regulando a transcrição ou a estabilidade do
mRNA) ou a nível da proteína (regulando a tradução ou a estabilidade da
proteína).
Para compreender a regulação de Bms1 decide executar os métodos de
Northern e Western blot usando as amostras anteriormente descritas.

No ensaio de Western blot para além de pesquisar a presença da proteína

Bms1 determinou igualmente a presença de uma outra proteína, a tubulina.
Observe o resultado obtido na sua primeira experiência:

Bms1

tubulina

20.1. Por que razão pesquisou os níveis de tubulina nas amostras em estudo?

20.2. Comente o resultado obtido no que respeita à expressão de Bms1.

De seguida, fez o Northern blot, usando uma sonda molecular marcada
radioactivamente para detectar especificamente Bms1. No decurso desta
experiência fotografou o resultado obtido no final da separação das amostras
de RNA no gel de agarose (A) e após exposição da membrana incubada com a
sonda a um filme sensível a raios X (B). Obteve o resultado seguinte:

(a)

(b)

(A) gel corado com brometo de etídio (B) autoradiografia

20.3. Identifique as duas bandas visualizadas (a) e (b) nas amostras separadas
no gel corado com brometo de etídio.

20.4. Um colega seu concluiu que o Bms1 não é transcrito nos murganhos
recém-nascidos (NB). Esta afirmação é corroborada pelos resultados obtidos
no ensaio de Northern blot e na autoradiografia? Justifique a sua resposta.

20.5. Baseando-se nos dados obtidos para o Bms1 a partir do Western blot e
do Northern blot, diga a que nível (RNA ou proteína) é regulada a sua
expressão no murganho.

20.6. Justifique a resposta anterior referindo-se especificamente aos resultados

que suportam a sua conclusão.
Com o objectivo de estudar a regulação da expressão de Mffs2 decidiu realizar
um Northern blot. Extraiu RNA total de murganho nos 4 estadios de
desenvolvimento, separou as amostras em gel, transferiu o RNA para uma
membrana e incubou com um sonda específica para Mffs2. Observou o
seguinte resultado:

(A) gel corado com brometo de etídio (B) autoradiografia

20.7. Interprete os resultados obtidos no Northern blot.

20.8. Admitindo a hipótese de que a expressão de Mffs2 seja regulada apenas

a nível da transcrição, desenhe no esquema seguinte o resultado que espera
ver no ensaio de Western blot usando um anticorpo específico para detectar a
proteína Mffs2. (1,0 valor)

NB Adulto
Mffs2

Tubulina