ANALISIS MICROBIOLOGICO

DE ALIMENTOS

SEMINARIO
24 de julio de 2019

1
 CONTENIDO
• Fundamentos y control en los métodos…
NOM-092-SSA1-1994 Bacterias aerobias
NOM-111-SSA1-1994 Mohos y levaduras
BAM Ch. 18 Mohos y levaduras
NOM-113-SSA1-1994 Coliformes
NOM-210 Apéndice H Coliformes, Coliformes fecales y E. coli
NOM-210 Apéndice B Staphylococcus aureus
BAM Ch. 14 Bacillus cereus

• Fundamentos y control en los métodos

NOM-210 Apéndice A Salmonella
NOM-242-SSA1-2009 Vibrio cholerae

• Requisitos de calibración, calificación y verificación.

• Evaluación

2
CONTROL PREANALITICO

Materiales de referencia
Medios de cultivo
Promoción de crecimiento

3
 MATERIALES DE REFERENCIA

CONSERVACION DE CEPAS
OBJETIVOS DE LA CONSERVACION

1.- Mantener el cultivo puro

2.- Mantener la viabilidad
3.- Mantener la genética estable

4
 MATERIALES DE REFERENCIA

CEPAS LIOFILIZADAS
• Ahorro en medios, tiempo y energía (preparación y
esterilización)
• Cepas modificadas para trazabilidad (por ejemplo
Salmonella atenuada y sensible a amikacina)
• Estabilidad

5
 MEDIOS DE CULTIVO

Permiten el desarrollo de la
mayoría de los microorganismos.

Idealmente contienen los

requerimientos básicos para el
desarrollo de microorganismos.

Muchas bacterias y hongos

necesitan del aporte extra de
factores de crecimiento específicos
en forma de suero, sangre y
extracto de levadura entre otros.

6
 MEDIOS DE CULTIVO
PREPARACIÓN
Los medios de cultivo comercialmente disponibles se
presentan como polvo, granulados, o listos para usarse.
En cada caso deben ser conservados en sus frascos originales
con la tapa fuertemente ajustada.
Antes de preparar cualquier medio se debe leer
cuidadosamente el rótulo del envase (formulación) y la fecha
de vencimiento.

7
 MEDIOS DE CULTIVO

PREPARACIÓN
1. Prepararse empleando material de vidrio limpio y seco.

8
 MEDIOS DE CULTIVO
PREPARACIÓN

2. Pesar en balanza calibrada la

cantidad indicada en el envase
considerando el volumen total
que se desee preparar.

3. Se pesa sobre platillos de

polipropileno y se vuelca en un
recipiente graduado; caso
contrario se mide el volumen en
otro recipiente limpio y
graduado).

Fuente: Guia de BPL, CENAM

9
 MEDIOS DE CULTIVO
PREPARACIÓN
4. Se agrega agua y se agita vigorosamente hasta obtener una
suspensión o solución (si es caldo) homogénea.

Agua para uso en Microbiología

 Conductividad < 25 uS/cm ISO 7218:2007
Conductividad < 1 uS/cm ASTM D1193:91
 Cuenta aerobia < 100 UFC/ml ISO 11133:2014

10
 MEDIOS DE CULTIVO

PREPARACIÓN

5. Se dosifican los medios líquidos (los tubos deben llenarse

hasta 2/3 partes para evitar desbordes).

11
 MEDIOS DE CULTIVO

PREPARACIÓN

6. Los medios se esterilizan en autoclave (15’ a 121°C - 15 psi).

Algunos solo requieren ebullición (ARVB).

12
 MEDIOS DE CULTIVO
PREPARACIÓN

7. Se vierte el agar en cajas Petri.

8. Se conserva en refrigeración
hasta su uso ó a 55 ° C en
baño de agua si se va a usar
inmediatamente.
Algunos medios no pueden
refrigerarse (ARVB)

13
 MEDIOS DE CULTIVO
PROMOCION DE CRECIMIENTO
MEDIOS LIQUIDOS NO
SELECTIVOS

A) Medio sin inocular

B) Medio inoculado e incubado

A B

14
 MEDIOS DE CULTIVO
PROMOCION DE CRECIMIENTO
MEDIOS LIQUIDOS
SELECTIVOS
A) Medio sin inocular
B) Microorganismo negativo
C) Microorganismo positivo

¿Cuantas bacterias?
50 UFC/ml
A B C

15
MEDIOS DE CULTIVO
PROMOCION DE CRECIMIENTO
MEDIOS PARA RECUENTO

Una forma normalizada de

comparar ambos resultados se
establece en ISO 4833:2003.

16
 MEDIOS DE CULTIVO
PROMOCION DE CRECIMIENTO
MEDIOS DIFERENCIALES Y SELECTIVOS
Método ecométrico

17
 MEDIOS DE CULTIVO
PROMOCION DE CRECIMIENTO

Método ecométrico Se considera válida cualquier

estría que tenga un crecimiento
superior al 25% de la línea total.
Cada estría Azul vale 0,2
La línea central Naranja vale 1

La suma es el Índice de
Crecimiento Absoluto (ICA)
El valor máximo es 5

(Tortora,1993; Mossel, 2003).

18
 MEDIOS DE CULTIVO
PROMOCION DE CRECIMIENTO
Método ecométrico

ICA PRODUCTIVIDAD El microorganismo de interés

4,5 - 5 ALTA debe tener productividad alta.
2,5 - 4,5 MEDIA
< 2,5 BAJA
0 NO PRODUCTIVOS El microorganismo
interferente debe
productividad baja o nula.

Tortora,1993; Mossel, 2003.

19
 METODOS

Alcance
Generalidades

20
 ALCANCE

ALCANCE
El alcance de un método son las matrices para las que ha sido
completada su validación con resultados satisfactorios.

 NOM-092-SSA1-1994
 “1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el método
para estimar la cantidad de microorganismos viables
presentes en un alimento, agua potable y agua
purificada…”.

 NOM-111-SSA1-1994
 “1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el método
general para determinar el número de mohos y
levaduras viables presentes en productos destinados al
consumo humano…”

* Tomado de http://www.uam.es/
21
 ALCANCE
 BAM Chapter 18 (mohos levaduras y micotoxinas)
 Alimentos que pueden manipularse con pinzas (frijoles,
nueces, especias enteras, café y cocoa, etc.)
 Alimentos con superficies no desinfectadas
 Alimentos con superficies desinfectadas.

 NOM-113-SSA1-1994
 “Esta Norma Oficial Mexicana establece el método
microbiológico para determinar el número de
microorganismos coliformes totales presentes en
productos alimenticios…”.
 NOM-210-SSA1-2014 Apéndice H
 “Este método es aplicable para la estimación de la
densidad de coliformes totales, fecales y E. coli… en
muestras de alimentos para consumo humano y agua...
en bajas concentraciones de microrganismos”.
22
 ALCANCE
 BAM Chapter 18 (Bacillus cereus)
 Alimentos.

 NOM-210-SSA1-2014 Apéndice B
 Se establece el método microbiológico para determinar
la cuenta de S. aureus presente en alimentos
para consumo humano nacionales o de importación.

 NOM-242-SSA1-2009 Apéndice B18/B19

 Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y
procesados.

23
 ALCANCE

 NOM-210-SSA1-2014 Apéndice A
 “Este método es aplicable para la detección
de Salmonella spp en productos para consumo
humano… especialmente en productos donde las
condiciones ambientales permiten la contaminación de
estos productos por microorganismos de la
familia Enterobacteriaceae.…”.
 A.6.2.29 Muestras ambientales (superficies)

24
 GENERALIDADES

PESO DE LA MUESTRA

NOM-210-SSA1-1994 A (Salmonella) 25 ó 250 g

NOM-242-SSA1-1994 B18/B19 25 ó 50 g

NOM-210-SSA1-1994 A.6.1 125, 250, 375, 700 g

25
 GENERALIDADES
PREPARACION DE LA MUESTRA

Para cuantificar frecuentemente es necesario

hacer diluciones decimales de la muestra.

NOM-110-SSA1-1994 10 u 11 g

BAM Ch. 18 (Y&M) 25 a 50 g

BAM Ch. 16 (Bc) 50 g

NOM-210-SSA1-1994 B Mínimo 10 g

NOM-210-SSA1-1994 H 25 g ó 100 ml

26
 GENERALIDADES
DILUCION DE LA MUESTRA

NOM-110-SSA1-1994 Buffer de fosfatos ó AP 0.1%

Agitación manual

BAM Ch. 18 (Y&M) Agua peptonada 0.1 %

Stomacher 2 minutos ó
Procesador 30 a 60 segundos *

BAM Ch. 14 (Bc) Buffer de fosfatos Butterfield

Procesador 2’ - 10,000 rpm

NOM-210-SSA1-1994 B SRF ó APA

Licuadora ó stomacher, 1 a 2’

27
 GENERALIDADES

DILUCIÓN DE LA MUESTRA

NOM-210-SSA1-1994 H SRF ó APA

Licuadora ó stomacher, 1 a 2’

NOM-242-SSA1-1994 B18/B19 25 ó 50 g

NOM-210-SSA1-1994 A.6.1 Diluyente variable

Homogeneización

28
 GENERALIDADES

EFECTO DE LA PREPARACION

celulas / acumulo

Ejemplo B
Ejemplo A 6 colonias
6 colonias 600 células/g
6 células/g

29
 PARTICULARIDADES
BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS

BMA ≠ Cuenta Total

CONDICIONES NO INCLUYE
Incubación aerobia Anaerobias

En 35 + 2 oC * Psicrofilas
Termófilas
En 48 horas Especies de crecimiento lento
En agar cuenta standard Especies con requerimientos especiales

ISO 4833-2003 Incubación a 30 °C, 48 h

NOM-089-SSA1-1993 Incubación a 30 °C, 48 h

30
 PARTICULARIDADES
BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS

CONTEO DE COLONIAS
Dilución 1:1000
39 colonias
Resultado = 39 000 UFC/g
NOM-092 indica un intervalo
óptimo de 25 a 250 colonias
Fuera del intervalo el resultado
se marca como
“valor estimado”

31
 PARTICULARIDADES
MOHOS Y LEVADURAS

La NOM-111 indica el uso de agar

papa dextrosa (APD ó PDA).

El medio de cultivo que se utiliza

para mohos y levaduras
generalmente tiene como objetivo la
selección de dichos
microorganismos.

El agente selectivo es el pH = 4.5

con la adición de ácido tartárico.

32
 PARTICULARIDADES
MOHOS Y LEVADURAS

Limitantes del APD

Mohos de crecimiento rápido

Mohos de crecimiento lento

Mohos con requerimientos especiales

33
 PARTICULARIDADES
MOHOS Y LEVADURAS

BAM Chapter 18
Agar Dichloran Rosa de Bengala
Cloranfenicol (DRBC) *

DRBC con glicerol 18 % *

Agar cuenta standard cloranfenicol

Agar Malta
Agar Extracto de Malta

Agar Papa Dextrosa

34
 PARTICULARIDADES
POSIBLE CONTAMINACION FECAL

Bacilos Gram negativos, facultativos, desarrollan en presencia

de bilis

ENTEROBACTERIAS COLIFORMES C. FECALES

Fermentan glucosa (gas) Fermentan glucosa c/gas Fermentan glucosa (gas)
Fermentan lactosa c/gas Fermentan lactosa (gas)

Medio RVBA-G Medio RVBA-Lactosa Caldo EC

NMS F23, 35 + 2 °C NOM-113, 35 + 1°C NOM-210, 45.5 + 0.2 °C

Caldo LT
NOM-210, 35 + 0.5 °C

35
 PARTICULARIDADES
POSIBLE CONTAMINACION FECAL

ENTEROBACTERIAS COLIFORMES C. FECALES

• Escherichia • Escherichia • Escherichia *
• Enterobacter / Cronobacter • Enterobacter • Enterobacter **
• Klebsiella • Klebsiella • Klebsiella
• Citrobacter • Citrobacter • Citrobacter
• Hafnia alvei • Hafnia alvei
• Providencia • Providencia
• Serratia • Serratia
• Yersinia • Yersinia
• Erwinia • Erwinia
• Shigella
• Salmonella
• Proteus
• Morganella morganii
• Ewingella americana GENEROS
• Kluyvera INVOLUCRADOS
• Cedecca
• Moellerella wisconsensis
• Rahnella aquatilis

36
 PARTICULARIDADES
POSIBLE CONTAMINACION FECAL

COLIFORMES
INTERFERENCIAS
Alimentos que contienen cantidades significativas de
azucares diferentes a la LACTOSA.

Alternativas:

Numero Más Probable

Filtración

37
 PARTICULARIDADES
POSIBLE CONTAMINACION FECAL

COLIFORMES
INTERFERENCIAS
Alimentos con presencia de Pseudomonas ó Enterobacter aerogenes.

Enterobacter
aerogenes

Escherichia
coli
Pseudomonas
aeruginosa

38
 PARTICULARIDADES
Staphylococcus aureus

• Comensal • Oportunista en •Habitual en

habitual en la heridas y piel alimentos grasos
piel, mucosa suceptible y salados
oral y nasal

39
 PARTICULARIDADES
Staphylococcus aureus

• Inoculo 0.1 ml • Extensión con varilla estéril

• Sobre la superficie

40
 PARTICULARIDADES
Staphylococcus aureus

• AGAR BAIRD – PARKER

Seleccionar 5 colonias típicas
(negras con lipólisis)

• Confirmación
Termonucleasa
Coagulasa
Gram •S. aureus
Oxidasa •S. epidermidis
Catalasa
Manitol / Glucosa anaerobiosis

41
 PARTICULARIDADES
Staphylococcus aureus

Resultados

UFC/g = Proporción * #colonias / dilución

Colonias Colonias Proporción
seleccionadas positivas
Ejemplo: 65 colonias
5 5 1.0
5 4 0.8 3 de 5 confirmadas
5 3 0.6
5 2 0.4
Dilución 1/100
5 1 0.2 Resultado: 3,900

42
 PARTICULARIDADES
Bacillus cereus

• AGAR BACARA
Seleccionar 5 colonias típicas
rosa/naranja (manitol +) con
precipitación (lecitinasa +)

• Inoculo 0.1 ml
• Sobre la superficie
• Extensión con varilla estéril

43
 PARTICULARIDADES
Bacillus cereus
• Confirmación
Caldo glucosa anaerobio (+)
Caldo nitrato (+)
VP modificado (+)
Agar Tyrosina (+)
Agar Lysozima (+)

UFC/g = Proporción * #colonias / dilución

Ejemplo: 65 colonias
4 de 5 confirmadas
Dilución 1/10,000
Resultado: 5,200,000

44
 PARTICULARIDADES
Salmonella y Vibrio cholerae

Investigación en etapas Salmonella Vibrio cholerae

Pre-enriquecimiento Caldo lactosado (y otros) ---

Enriquecimiento
Aislamiento selectivo
Identificación Bioquímica *
MKTTN + CVR APA 35°C + APA 42°C
VB, Hektoen, SB, XLD TSBC ó mCPC
LIA, TSI, ureasa, VP, KIA, TSI, Arginina,
Indol, β-galactosidasa AGS, Glucosa O/F,
Oxidasa

Identificación serológica Poly O, Poly H O1 + Ogawa / Inaba

En cada etapa el control de tiempo y temperatura es crítico para la

validez del resultado

45
 PARTICULARIDADES
Salmonella
Aislamiento en Agar Selectivo y Diferencial (Seleccionar 1 colonia
típica ó 3 sospechosas)

Agar Entérico
Agar XLD
Hektoen

Agar Sulfito -
Bismuto Agar SM2

46
 PARTICULARIDADES
Vibrio cholerae

Aislamiento en Agar Selectivo y Diferencial (Seleccionar 3 colonias

sospechosas)

TCBS mCPC
Amarillo - V. cholerae (fermenta sacarosa) Purpura - V. cholerae El Tor
Azul/Verde - V. parahaemolyticus Amarillo - V. vulnificus
Verde - V. vulnificus Verde – Otros Vibrio

47
 PARTICULARIDADES
CONTROLES ANALITICOS

NOM-210-SSA1-1994 A A.5.8 Salmonella Typhimurium ATCC 14028

A.5.9 Salmonella diarizonae ATCC 12325
A.5.10 Salmonella abortus equi ATCC 9842

NOM-242-SSA1-1994 B18/B19 Prohibida su venta

NOM-210-SSA1-1994 B Positivo Staphylococcus aureus

Negativo Escherichia coli

NOM-210-SSA1-1994 H Positivo E. coli ATCC 25922

Negativo Enterobacter aerogenes ATCC 13048

48
 PARTICULARIDADES
CONTROLES ANALITICOS

BAM Chapter 14 Positivo - ATCC 14579 B. cereus

Negativo - ATCC 64 Brevibacillus laterosporus

BAM Chapter 18 No se menciona

NOM-092-SSA1-1994 No se menciona
NOM-111-SSA1-1994 No se menciona

NOM-113-SSA1-1994 No se menciona

49
 PARTICULARIDADES
CONTROLES ANALITICOS

ISO 17025:2017
7.7 Aseguramiento de la validez de los resultados

7.7.1 El laboratorio debe contar con un procedimiento para

hacer el seguimiento de la validez de los resultados. Los datos
resultantes se deben registrar de manera que las tendencias
sean detectables…

50
 CONTROL
GRAFICOS

• Analizar 20 muestras control (límites temporales con 7 datos)

• Transformar los datos en UFC ó NMP a Log10
• Calcular Promedio (X) y Desviación Std (s)
• Calcular LIC y LSC como X + 2s
• Calcular el AntiLog10 para obtener los límites en UFC ó NMP

51
 CONTROL
TENDENCIAS
Rule 1. One point is more than 3 standard Rule 2. Nine (or more points in a row are on the
deviations from the mean. One sample (two same side of the mean. Some
shown in this case) is grossly out of control. prolonged bias exists.

Rule 3. Six (or more) points in a row are Rule 4. Fourteen (or more) points in a row alternate in
continually increasing (or decreasing). direction, increasing then decreasing. This
A trend exists. much oscillation is beyond noise.

52
 CONTROL
TENDENCIAS
Rule 5. Two (or three) out of three points in a
row are more than 2 standard deviations from
the mean in the same direction.
Rule 7. Fifteen points in a row are all within 1
standard deviation of the mean on either side
of the mean.
Rule 6. Four (or five) out of five points in a row are
more than 1 standard deviation from the mean in
the same direction
Rule 8. Eight points in a row exist, but none within
1 standard deviation of the mean, and the points
are in both directions from the mean.
53
 CONTROL
REPETICIONES

La diferencia absoluta entre dos resultados sencillos

independientes, utilizando el mismo método, la misma
muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo analista, con
el mismo equipo, en un periodo corto de tiempo, no debe ser
mayor que el LIMITE DE REPETIBILIDAD (r) en log de
base 10.
r = 0.25

Tomado de ISO 4833:2003

54
 CONTROL
REPETICIONES

Ejemplo:
Un laboratorio emite un resultado de bacterias meofilicas
aerobias con el que el cliente no está de acuerdo y solicita una
repetición (muestra no perecedera). El método es NOM-092-
SSA1-1994
Primer resultado 900 000 UFC/g Log = 5.95
Segundo resultado 1 600 000 UFC/g Log = 6.20

Diferencia absoluta 6.20 – 5.95 = 0.25

Como 0.25 = 0.25, los resultados SI son repetibles

Tomado de ISO 4833:2003

55
CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION

NOM-210-SSA1-2014
6.1 Todos los equipos deberán estar incluidos en un programa
de calibración, mantenimiento preventivo y verificación, de
acuerdo a las características del equipo.

56
CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION
MEDIDOR DE pH

NOM-210-SSA1-2014
6.2 Los potenciómetros deben tener una precisión de
verificación mínima de ± 0.1 pH a 20°C-25°C.

ISO 7218:2007
5.5.1 Debe ser capaz de medir con precisión ± 0.5 UpH con
resolución 0.1 pH a 20°C-25°C.

57
 CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION
MEDIDOR DE pH

• Verificación diaria con soluciones trazables al CENAM o INM.

Al menos 2, idealmente 3.
• Tras la verificación con las soluciones de referencia, debe
verificarse con una tercera o cuarta solución (control).
• Registrar las verificaciones, el resultado del control y la
pendiente reportada por el equipo (mínimo 0.90)

58
CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION
BALANZAS

NOM-210-SSA1-2014
6.3 Las balanzas deberán ser verificadas el día de uso
utilizando un marco de pesa<s calibrado o verificado.

CENAM Guía de BPL

• Autocalibración interna diaria.
• Verificación con pesas del 50% y 100 % de la capacidad
de la balanza, clase F1 OIML (M1 OIML ≈ ASTM 5).
AOAC Criterios de aplicación de la Norma 17025
• Si el uso es frecuente se recomienda verificarlas* 2 x dia.
• Se verifican* tras 20 minutos de calentamiento.

59
Tomado de ISO 4833:2003
 CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION
INCUBADORAS

• 6.4 Los equipos para incubación (incubadoras y baños de

agua), deberán demostrar muestreando diferentes puntos de
la cámara, durante un tiempo determinado, que asegure las
condiciones de incubación de la prueba que pueden trabajar
a los intervalos de temperatura indicados en los métodos.

60
 CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION
INCUBADORAS

6.7 Los equipos de incubación deberán contar

con termómetros calibrados con división
mínima de la mitad de la variación permitida al
equipo por el método, por ejemplo cuando se
indique una variación de ± 1ºC, el termómetro
deberá tener una división mínima de 0.5ºC.

6.5 Cuando se indique el uso de un

termómetro, éste deberá estar dentro
de un programa de calibración y/o
verificación vigente, esta última
contra un termómetro patrón.

61
CALIBRACION, CALIFICACION Y VERIFICACION
AUTOCLAVES

6.6 Las autoclaves y hornos, que se utilicen para la

esterilización de material y medios de cultivo, deberán contar
con instrumentos de medición calibrados.

Cada ciclo de esterilización debe estar controlado

paramétricamente (temperatura y presión) y con indicadores
biológicos o contar con un programa de monitoreo con
indicadores biológicos, considerando la frecuencia de uso

62
EVALUACION

63
 GRACIAS!

 Nos vemos pronto…

José Tabla
jose.tabla.6@gmail.com
442 – 396 9398

64