INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

ACAPULCO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
ASIGNATURA:
MICROBIOLOGÍA GENERAL
GRUPO:
B
ALUMNA:
CONTRERAS SALAS PAOLA
N° EQUIPO:
2
NO. CONTROL
16320350
PROFESOR:
M.C. MIGUEL ANGEL DIAZ ALDAY
DISEÑO EXPERIMENTAL
IDENTIFICACION DE GRAM POSITIVA.
Fecha de entrega: 25 de febrero del 2019

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ÍNDICE

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 3
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................. 4
OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................................... 4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................................... 4
JUSTIFICACION........................................................................................................................... 4
HIPOTESIS ................................................................................................................................... 4
MARCO TEORICO....................................................................................................................... 4
MATERIALES, EQUIPO Y SUSTANCIA ................................................................................ 10
PLAN DE INVESTIGACION. .................................................................................................... 11
PROCEDIMIENTO ..................................................................................................................... 11
CONCLUSIÓN ............................................................................................................................ 12
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 12

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INTRODUCCIÓN
El universo que descubrió Leeuwenhoek estuvo formado por bacterias y
protozoarios de muy diversas características. Es por ello que hoy en día sabemos
que hay millones de microorganismos que se encuentran en todos los lugares de
nuestro planeta, en al agua dulce y salada, por tanto, viven en el aire, agua y
tierra, se les halla también en los alimentos, en el exterior y el interior de los seres
vivos. También causan enfermedades y otros que son beneficiosos para nosotros.

Por eso es de vital importancia conocer sobre estos microorganismos.

Especialmente hablaremos sobre bacterias, tipos, características y diferencias
entre gramnegativos y positivas.

Las bacterias pertenecen al filum de las Shizomycophyta, se les llama también

microbios o gérmenes. Son de pequeño tamaño. Casi siempre son unicelulares.

Están recubiertas por una pared celular de naturaleza quitinosa en su superficie

externa. Poseen prolongaciones filamentosas que les permiten desplazarse otras
tienen flagelos.

La pared celular que rodea a las bacterias es compleja y existen dos formas
básicas: pared celular Gram positiva con una gruesa capa de peptidoglucano y
una pared gramnegativo con una delgada capa de peptidoglucano, así como una
membrana externa.

Algunas bacterias carecen de pared celular y compensan su ausencia

sobreviviendo tan solo al interior de células del organismo anfitrión o en un
ambiente hipertónico.

Para clasificar a las bacterias debemos tener en cuenta su tamaño, forma,

disposición espacial, propiedades.

Se encuentran en todos los lugares de nuestro planeta, en al agua dulce y salada,

por tanto, viven en el aire, agua y tierra, y se les halla también en los alimentos y
en el exterior y el interior de los seres vivos.

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OBJETIVO GENERAL

OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Explicar el fundamento de diferentes medios de cultivo y condiciones de
incubación para el aislamiento de microorganismos con características
específicas.
 Aplicar diferentes técnicas para el aislamiento de microorganismos.
 Comparar con cepas de referencia la eficiencia de las técnicas de siembra,
medios de cultivo y condiciones de incubación empleadas para el aislamiento
de microorganismos.
 Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados.
 Aplicar una técnica de conservación de corto o mediano plazo a los cultivos
puros obtenidos.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las bacterias están presentes en los diferentes ecosistemas, pero para su
crecimiento requieren de condiciones óptimas las cuales les permitan vivir. En esta
práctica se llevó a cabo el cultivo y aislamiento de las bacterias para identificar si
pueden o no ser fermentadoras.

JUSTIFICACION

HIPOTESIS

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la

mayoría de las bacterias. Algunas son rápidas, ya que evalúan la presencia de
una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas
horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo
con una incubación previa de 18 a 48 horas.

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la

mayoría de las bacterias.

MARCO TEORICO

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TINCION DE GRAM

Fue creada en 1884 por el médico danés Hans Christian Gram, Esta tinción nos
permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las Gram positivas
que se tiñen de color violeta y las Gram negativas que se tiñe de color rosa. La
diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las
bacterias.

PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS.

ILUSTRACIÓN 1 Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de

lipopolisacáridos. Pared celular de las bacterias Gram positivas.

ILUSTRACIÓN 2 Se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos

teicoicos.

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 Factores que considerar en la tinción de Gram.

 No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.

 Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o
totalmente de color rosa.
 Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el
rango de Ph 7-7.8 ya que:
 Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
 Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la
alcalinidad

PRUEBA OXIDASA.

Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada

citocromo C oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del
proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo
en la membrana celular bacteriana, en las siguientes líneas se dará una breve
explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde
proviene y que realiza la enzima citocromo C oxidasa, entiéndase que todo este
proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los

electrones desde sus sustratos hasta llegar al citocromo C, la enzima
llamada citocromo C oxidasa le quita electrones al citocromo C, estos electrones
son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones
en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de
electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos:
Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de
electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más
usados son:

 Tetrametil-p-fenilendiamina.
 Dimetil-p-fenilendiamina.
 Indo fenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%,

es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede

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impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se
venden tiras o discos impregnados con el reactivo.

Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro, pero al ponerlo en contacto

con la enzima citocromo C oxidasa cambia a un color morado debido a que
el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta
produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la
bibliografía en especial el libro de Mac Fadin.

Factores que considerar en la prueba de oxidasa.

 No considerar un resultado positivo después de 30 seg. ya que el oxígeno
molecular del ambiente oxida al reactivo.
 No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen
hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
 No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de
medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la
fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado
falsos negativos en la prueba.
 Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo
como son: Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar
Mueller Hinton.
Control positivo: Pseudomonas aeruginosa. Control negativo: Escherichia coli.

PRUEBA DE CATALASA

El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de

carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-
oxidativo. La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus
sp. Producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno
obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes
técnicas para realizar la prueba la más común es poner una gota de peróxido en el
portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir
de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa
que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de
la enzima catalasa.

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ILUSTRACIÓN 3 Burbujeo catalasa positivo, carencia de burbujeo catalasa
negativo.

PRUEBA DE LA COAGULASA

La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus

aureus del coagulase-negativa staphylococci. S. aureus produce 2 formas de
coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada
también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar mediante la
realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de
coagulasa de tubo.

Prueba de portaobjetos.

Prueba del portaobjetos se hace juntamente con un control negativo para descartar
auto aglutinación. Se ponen 2 gotas de solución salina en un portaobjetos rotulado
con el número de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con
el organismo de prueba mediante el uso de un cable de lazo, cable recto, o un
aplicador de madera. Se pone una gota de plasma (plasma de conejo con
anticoagulante (EDTA)1) en la gota de solución salina inoculada correspondiente a
la prueba y se mezcla bien con un aplicador de madera. Agitar el portaobjeto con
cuidado unos 10 segundos.

 Si es positivo: Se podrá observar aglutinación macroscópica en el plasma en los

10 segundos, mientras que no se observará aglutinación en la gota de solución
salina.
 Si es negativo: No se observará aglutinación.

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 Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero
coagulará, dando como resultado un coágulo (a veces el coágulo esta tan
desarrollado que el líquido se solidifica completamente).

 Si sale negativo, el plasma permanece líquido. Un resultado negativo podría

indicar que se podría tratar de S. epidermidis pero solo con unas pruebas más
precisas se puede confirmar este hecho, como por ejemplo el API o métodos
de BBL CRYSTAL.

Ilustración 4 Un resultado positivo se refleja en la coagulación del plasma

ESTOS SON ALGUNOS DE LOS Staphylococcus GRAM POSITIVOS EN LA

PRUEBA COAGULASA

 Staphylococcus aureus.
 Staphylococcus delphini.
 Staphylococcus hyicus.
 Staphylococcus intermedius.
 Staphylococcus lutrae.

PRUEBA PYR

Prueba rápida, utilizada fundamentalmente para la identificación de Estreptococos

pyogenes y Enterococcus spp. Es útil para la caracterización preliminar de
Streptococcus, Enterococcus y de microorganismos símil estreptococos.

Fundamento
Los discos contienen el sustrato: pirrolidonil-beta-naftilamida, y la prueba consiste
en determinar la presencia de la enzima l-pirrolidonil arilamidasa .
Los microorganismos que contienen dicha enzima, pueden hidrolizar el sustrato
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presente en los discos en forma rápida, con liberación del grupo pirrólico, el cual,
reacciona con el reactivo revelador: N-N dimetilamino cinamaldehído.
Esta es una prueba presuntiva específica tanto para los estreptococos b hemolíticos
del grupo A, como para los Enterococcus spp; y permite diferenciar los
estreptococos del grupo A de otras especies de Streptococcus.
Es altamente sensible y reemplaza a la bacitracina y a la prueba de tolerancia a la
sal (crecimiento en NaCl al 6.5%). A menudo se usa esta prueba junto con la prueba
de leucinaaminopeptidasa (LAP). Debe tenerse en cuenta que algunas especies de
Staphylococcus (S. lugdunensis, S. scheleiferi, S. haemolyticus y S. intermedius)
son generalmente PYR positiva, por lo que se puede utilizar para diferenciar
Staphylococcus.

Ilustración 5 diferencia de color en resultado positivo en la prueba PYR

MATERIALES, EQUIPO Y SUSTANCIA

cultivo puro con 24 horas de incubación previa

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 Mecheros
Asas
Gradillas
Piseta
Pipetas de 1.0 mL estériles
Pipetas Pasteur estériles

PLAN DE INVESTIGACION.

PROCEDIMIENTO

PRUEBA OXIDASA

1. Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de

una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
2. La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
3. Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a
30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

PRUEBA CATALASA

1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de

una pipeta Pasteur.
2. Suspender la bacteria
3. Detectar la formación de burbujas.

PRUEBA COAGULASA

1. Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazón) y 0,3 ml.
de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado.
2. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus.
3. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño
María a 37° C durante una hora.
4. Observando la muestra cada 15 minutos.
5. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

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PRUEBA PYR

1. Sembrar a partir de un cultivo puro.

2. Hacer una suspensión densa en 50 µl de solución fisiológica estéril, y agregar
un disco de PYR-A-ENTEROCOCOS.
3. Incubar durante 30 minutos a 35-37 °C, en aerobiosis.
4. Agregar una gota de reactivo revelador.
5. Dejar a temperatura ambiente, hasta 5 minutos.

CONCLUSIÓN
Todo esto se desarrolló con la finalidad de identificar las particularidades de
crecimiento de algunos microorganismos dependiendo del medio de cultivo, los
medios de cultivo se dividen dependiendo del propósito, en este caso era para
observar que bacterias pueden crecer y ser fermentadoras en los diferentes tipos
de agares.

BIBLIOGRAFÍA
Koneman, Diagnostico bacteriológico, texto y atlas a color, 6ed,
Panamericana, Argentina, 2006.
MacFadin, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica, 3ed, Panarmericana, Argentina, 2003.
Bailey y Scott, Diagnostico bacteriológico, 12ed Panamericana, Argentina,
2007.
http://microbitosblog.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas-primarias/
https://microral.wikispaces.com/12.+Cocos+Gram+positivos+I.
https://es.slideshare.net/revil4/clase-2fisiologa-microbiana

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