Содержание

Список сокращений.................................................................................................................. 2
Введение................................................................................................................................... 3
Глава 1. Определение, механизмы формирования и структурный состав НВЛ................. 4

1.1.Три альтернативные модели нетоза................................................................................. 4

1.2.Состав НВЛ.......................................................................................................................... 5

Глава 2. Роль НВЛ в норме и при патологии.......................................................................... 7

2.1. Положительная роль ловушек......................................................................................... 7

2.2. Участие НВЛ в патологических процессах....................................................................... 7

Заключение............................................................................................................................. 10

Список литературы................................................................................................................. 11

Приложение............................................................................................................................ 12

1
 Список сокращений

НВЛ – нейтрофильные внеклеточные ловушки

ФМА - форболовый эфир миристиновой и уксусной кислот
IL-8 – интерлейкин-8
NET - Neutrophil Extracellular Trap, нейтрофильные внеклеточные ловушки
NOX - NADPH-оксидазы
АФК – активные формы кислорода
МПО - миелопероксидаза
НЭ – эластаза нейтрофила
PAD4 - protein-arginine deiminase type 4
ИФН I типа - интерферон I типа
НК – нуклеиновые кислоты

2
 Введение
Нейтрофильные гранулоциты, или полиморфноядерные лейкоциты, являются наиболее
многочисленными клетками врождённого иммунитета. Они образуются в костном мозге,
где созревают, приобретая набор специфических антимикробных эффекторных молекул,
после чего выходят в периферическую кровь [1]. В ответ на воспалительные стимулы,
нейтрофилы первыми мигрируют из циркулирующей крови в очаг инфекции, где они
эффективно связывают, поглощают и инактивируют патогены [2]. Защитная функция
нейтрофилов осуществляется путём 3-х основных стратегий: фагоцитоза, дегрануляции и
образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) [3].

НВЛ представляют собой крупные, внеклеточные, сетеподобные структуры, состоящие из

антимикробных пептидов и протеаз, адсорбированных на деконденсированном
хроматине, в состав которого входит как ядерная, так и митохондриальная ДНК [3].
Формирование данных структур начинается уже через 10 мин после воздействия
активирующего фактора и зависит от его дозы. Предполагается, что НВЛ могут
обезвреживать широкий спектр патогенов [2] (Приложение, рис. 1).

НВЛ были открыты в 2004 г. Brinkmann et al., в ходе исследований, проведённых как in
vitro, так и in vivo [2]. Это открытие поколебало фундаментальную концепцию о защитных
механизмах врождённого иммунитета, так как долгое время считалось, что
обезвреживание микроорганизмов нейтрофилами происходит только путём фагоцитоза
[4] или дегрануляции [2].

Однако процесс уничтожения микроорганизмов в НВЛ и значение данных структур in vivo

остаётся недостаточно ясным. Так, формирование НВЛ не является безоговорочной
гарантией освобождения организма хозяина от инфекционного агента. Было показано, что
воздействие антимикробных агентов НВЛ индуцирует в бактериях экспрессию генов,
обеспечивающих защиту микроорганизмов от повреждения мембран и гибели, что как
следствие, ведёт к устойчивости к антимикробным пептидам и хронической персистенции
инфекции. Более того, существуют сведения, указывающие на связь между
формированием нейтрофильных сетей и возникновением других заболеваний [4].

Таким образом, несмотря на очевидную пользу, НВЛ играют в организме двоякую роль, и
представляется значимым как выяснение механизмов их действия, так и последствий их
формирования для организма в целом.

3
 Глава 1. Определение, механизмы формирования и структурный состав НВЛ

Ещё в 1996 году был описан новый механизм гибели нейтрофилов, отличный от некроза и
апоптоза. Было замечено, что данные клетки после химической стимуляции форболовым
эфиром миристиновой и уксусной кислот (ФМА) погибали, претерпев до этого ряд
изменений, таких как: деконденсация хроматина, набухание ядра, выход его
содержимого в цитоплазму, и в конце концов - перфорация клеточной мембраны [5].
Однако потенциальное значение данного наблюдения оставалось неизвестным до тех,
пока лаборатория Zychlinsky не опубликовала данные о том, гибель нейтрофилов под
воздействием ФМА или интерлейкина-8 (IL-8), приводит к выбросу сетеподобной
структуры, выполняющей защитную фунуцию. Эта структура, представляющая собой ДНК,
покрытую гистонами и эластазой, была названа НВЛ (или NET - Neutrophil Extracellular
Trap) [2], а новая форма гибели нейтрофилов, соответственно – нетозом (NETosis - NET +
osis) [5]. Она индуцируется микроорганизмами и эндогенными стимулами, такими как
«дистресс-ассоциированные молекулярные паттерны» (ДАМП), иммунные комплексы,
активированные тромбоциты. Связывание рецепторов нейтрофила с бактериями,
грибами, вирусами, иммунными комплексами, кристаллами активирует нетоз разными
путями [3].

1.1.Три альтернативные модели нетоза

К настоящему времени описаны 3 модели нетоза. Первая форма нетоза – литическая или
суицидальная (Приложение, рис. 2). При этом, после распознавания стимула
нейтрофилом, в нём происходит активация NADPH-оксидазы (NOX) посредством
увеличением концентрации цитозольного Са2+ и сигнального каскада Raf/MERK/ERK,
индуцируемого протеинкиназой С, что приводит к образованию активных форм
кислорода (АФК), и в свою очередь запускает миелопероксидазный (МПО) сигнальный
путь. Далее происходит МПО-опосредованная оксидативная активация нейтрофильной
эластазы (НЭ), под воздействием которой деградирует актиновый цитоскелет клетки и,
соответственно, блокируется фагоцитоз. НЭ также поступает в ядро и индуцирует
деконденсацию хроматина путём модификации гистонов. Подобное действие на
хроматин оказывает и МПО, а также активированная ионами Са2+ протеин-аргинин
дезаминаза 4 (protein-arginine deiminase type 4, PAD4) [3]. PAD4 повышает
дезаминирование гистонов, что ведёт к потере положительного заряда, необходимого
для взаимодействия гистонов и ДНК) [6] (Приложение, рис. 3).
4
 С прекращения динамики актина в нейтрофиле клетка деполяризуется. АФК также
обеспечивают постепенную разборку ядерной мембраны, которая разделяется на
индивидуальные везикулы [6]. После потери ядерной оболочки хроматин ядра свободно
выходит в цитоплазму, смешиваясь с её компонентами, в том числе с содержимым гранул.
После этого происходит пермеабилизация плазматической мембраны, и, в течение 3-8 ч
после активации нейтрофила, происходит лизис клетки и НВЛ выходит во внеклеточное
пространство [3].

Вторая, нелитическая (жизнеспособная) форма нетоза не зависит от АФК, а также

сигнального пути Raf/MERK/ERK, развивается в течение 5-60 минут после воздействия
стимулирующего агента и не сопровождается гибелью нейтрофила. Эта форма нетоза
запускается после распознавания стимула толл-подобными рецепторами (toll-like
receptors, TLRs) или рецепторами к протеину С3 комплемента. Ядро нейтрофила теряет
свою характерную сегментированную форму. Внешняя и внутренняя ядерные мембраны
разделяются и почкуются в виде везикул, содержащих внутри фрагменты ДНК. Эти
везикулы, а также часть цитоплазматических гранул подходят к интактной плазматической
мембране и выходят во внеклеточное пространство через небольшой участок
плазмалеммы, где ассоциируют друг с другом, представляя собой НВЛ. Активный
безъядерный цитопласт остаётся и продолжает фагоцитировать патогены, потеря ДНК не
оказывает влияния на его продолжительность жизни [5].

Описан также другой тип нелитического нетоза, зависящий от АФК, в котором вместо
ядерной ДНК выбрасывается митохондриальная ДНК. Этот процесс приводит к
формированию НВЛ 80% нейтрофилов после распознавания их рецепторами протеина
C5a комплемента или липополисахаридов [5].

1.2.Состав НВЛ

С помощью сканирующей электронной микроскопии высокого разрешения было

показано, что НВЛ включают в себя как гладкие нити диаметром 15-17 нм, так и
глобулярные домены размером около 25 нм, которые собраны в более толстые пучки
диаметром до 50 нм, не окружённые мембранами [2].

Первоначально в составе НВЛ было идентифицированно 24 протеина. Среди них были

гистоны, сериновая протеаза нейтрофилов эластаза, МПО, кальпротектин, кательцидины,
дефензин и актин [3]. Было показано, что эластаза в составе ловушек специфически
5
катализирует расщепление факторов вирулентности Shigella flexneri, Salmonella
typhimurium и Yersinia enterocolitica. В составе ловушек были также обнаружены катепсин
G и протеиназа 3, сходные с эластазой и способные расщеплять факторы вирулентности
других классов патогенов [7].

Есть данные, что ловушки включают белки, способные убить или ингибировать патогены.
Например, такие ферменты, как лизоцим и протеазы, антимикробные пептиды (белок BPI
и дефензины), хелаторы ионов (кальгранулин), и, что интересно, гистоны [7] и ДНК [8]. По-
видимому, антимикробная активность ловушек обусловлена совместным действием этих
компонентов, а также их высокой локальной концентрацией на фибриллах хроматина [7].

В составе ловушек были также обнаружены компоненты, способные действовать

самостоятельно. Так, активности МПО вполне достаточно, чтобы уничтожить
Staphylococcus aureus. В ловушках был обнаружен еще один белок, кальгранулин,
обладающий фунгицидной активностью. Этот белок хелатирует цинк, необходимый для
роста грибов, и эффективно сдерживает рост Candida albicans и виды рода Aspergillus. Что
интересно, была показана важная роль гистонов для киллинга патогенов [7].

НВЛ могут иметь морфологию не только вытянутых в длину филаментов, но и выглядеть

как облаковидные структуры, в 10-15 раз превышающие первоначальный размер
нейтрофила. Предположительно, данная морфология ловушек встречается in vivo в
условиях достаточного межклеточного пространства, например, в легочных альвеолах [7].

Механизм по которому НВЛ разбираются неясен. Во время инфекции они пресистируют

несколько дней, а затем , предположительно, расщепляются ДНКнуклеазой плазмы [3].

Таким образом, в результате исследований было установлено, что молекулярный состав

НВЛ варьирует в зависимости от стимулов. Например, различные штаммы Pseudomonas
aeruginosa индуцируют формирование НВЛ, содержащие 33 общих протеина и до 50
вариабельных. Изменяется ли функционирование НВЛ в зависимости от их состава пока
остаётся неясным [3].

6
 Глава 2. Роль НВЛ в норме и при патологии

2.1. Положительная роль ловушек

Известно, что основной функцией нейтрофилов является устранение патогенов. По

мнению исследователей, НВЛ эффективно расщепляют факторы вирулентности и/или
убивают бактерии даже до того, как они будут фагоцитированы. Также ловушки
представляют физический барьер для предотвращения дальнейшего распространения
инфекции. Более того, НВЛ могут сдерживать активные протеазы, содержащиеся в
гранулах нейтрофилов, которые в межклеточном пространстве вызывают повреждение
тканей, прилегающих к очагу воспаления [2].

Предполагают, что патогены попадают в ловушки благодаря электростатическим

взаимодействиям, возникающим между отрицательнозаряженными фибриллами
хроматина и положительнозаряженной поверхностью бактерий. Так, было показано, что
патогены, имеющие капсулы или способные изменять свой поверхностный заряд, не
связываются ловушками. Еще одним способом избежать попадания в ловушки является
синтез и присоединение к поверхности патогена нуклеаз, что позволяет микроооганизмам
высвобождаться из ловушек и распространяться дальше [7] (Приложение, рис. 4).

Кроме активности по отношению к бактериям, грибам и паразитам, НВЛ обладают

антивирусным действием. Недавно было показано, что ловушки индуцируются вирусом
иммунодефицита человека 1 (ВИЧ1 [7].

Таким образом, в системе in vitro было показано, что ловушки ингибируют

грамположительные и грамотрицательные бактерии, грибы, вирусы, простейшие и
паразитов. Однако, данные о действии НВЛ в системе in vivo недостаточно многочисленны
[7].8

2.2. Участие НВЛ в патологических процессах

Несмотря на защитную функцию НВЛ, постоянно расширяется список патологических

состояний, при которых ловушки играют негативную роль [3] (Приложение, рис. 5).

НВЛ повреждают ткани. Показано, что ловушки напрямую убивают эпителиальный и

эндотелиальные клетки. Например, массовый нетоз повреждает эпителий при лёгочной
грибковой инфекции. Таким образом, предположительно установлена вредоносная роль
НВЛ при бактериальном сепсисе. При сепсисе и остром повреждении циркулирующие
7
гистоны являются цитотоксичными, благодаря своей способности повреждать целостность
клеточной мембраны. Другие протеины ловушек, как дефинизины также пермеабилизуют
эукариотические клетки, а целью НЭ могут быть белки внеклеточного матрикса,
вследствие чего разрушаются клеточные контакты. Способность НВЛ повреждать ткани может
объясняться также ролью PAD4, которая индуцирует фиброз.

Прямые повреждения тканей, обусловленные НВЛ, могут иметь место при сепсисе,
инфекциях, аутоиммунных заболеваниях и диабете.

Таким образом, способность ловушек повреждать ткани объясняет, что лучше, когда их
высвобождение ограничивается инфекциями, которые невозможно очистить с помощью
менее вредных стратегий.

НВЛ вызывают стерильное воспаление. Ловушки регулируют воспалительные цитокины,

прямо или косвенно, воздействуя на другие иммунные клетки. Во время ранних стадий
атеросклероза, микроскопические кристаллы холестерина индуцируют формирование
НВЛ индуцируют сети, включающие транскрипцию генов, кодирующих IL-6 и pro-IL-1β в
макрофагах. Повышение синтеза этих цитокинов усиливают дифференцировку Т хелперов
17 типа и увеличивает количество миелоидных клеток в атеросклеротические
повреждения. Однако, хотя НВЛ могут усиливать воспаление, аккумуляция НВЛ
способствует разрешению воспалению путём деградации цитокинов и хемокинов.

НВЛ могут вызывать тромбоз сосудов. Было показано, что в процессе формирования
сгустка при коагуляции принимают участие нейтрофильные ловушки. Коагуляция при
участии нетоза снижает распространение патогенов в организме хозяина. Вместе с тем их
избыточное образование может привести к чрезмерной коагуляции, способной
блокировать кровоснабжение жизненно важных органов и тяжелой ишемии. При
формировании сгустка как артериальной, так и венозной крови, на эндотелии сосудов
адгезируются нейтрофилы. В местах прочной адгезии они выбрасывают хроматиновые
фибриллы (ловушки), образующие пробки, стимулирующие последующее тромбо-
образование. Эластаза и катепсин G, адсорбированные на фибриллах хроматина и являю-
щиеся сериновыми протеазами, деградируют ингибиторы коагуляции [7].

Участие ловушек в аутоиммунной патологии. Предполагается, что НВЛ являются

источниками аутоантигенов при аутоиммунных заболеваниях, особенно таких, которые
связаны с аутоантителами против белков нейтрофилов. Одним из главных цитокинов,
8
активирующих клетки врожденного иммунитета, являются интерфероны (ИФН) I типа.
ИФН I типа синтезируются практически всеми ядросодержащими клетками организма, в
основном плазмацитоидными дендритными клетками. Главными индукторами их синтеза
являются нуклеиновые кислоты (НК). В условиях нормально функционирующего
организма нуклеиновые кислоты всегда в небольшом количестве присутствуют вне
клеток. Но здоровый организм располагает механизмами, предохраняющими рецепторы
клеток врож денного иммунитета от контакта с НК. В нейтрофилах во вторичных гранулах
находится белок кателицидин, hCAP18, который при активации клетки расщепляется с
образованием катионного пептида LL37. С помощью электростатических связей этот
пептид образует комплексы практически со всеми видами нуклеиновых кислот, в том
числе, с аутоДНК и аутоРНК, обладающими выраженными иммуностимулирующими
свойствами, в частности, способностью индуцировать синтез ИФН I типа дендритными
клетками. Более подробно роль ловушек исследована при системной красной волчанке
[3, 7, 9].

НВЛ при злокачественных заболеваниях. Известно, что нейтрофилы повышают

метастазирование через механизмы, не связанные с НВЛ, однако ловушки также могут
быть вовлечены в это процесс. Так, в эксперименте in vitro показано, что клетки рака
молочной железы запускают нетоз, однако доказательств подобного процесса in vivo пока
недостаточно. Сформированные ловушки захватывают в свои сети мигрирующие
опухолевые клетки, особенно в очагах воспаления. Таким образом, таргетная терапия,
ингибирующая НВЛ может быть эффективным терапевтическим воздействием при
лечении злокачественных заболеваний [3].

Также существую сведения о негативном влиянии ловушек при муковисцидозе, псориазе,

а также поддержании хронической персистенции инфекции.

Заключение
9
Нетоз или образование нейтрофильных внеклеточных ловушек является важным
стратегическим ответом иммунной системы на разнообразные патогены. Такой компонент
ловушек, как хроматин, связывает патогены, ограничивая тем самым их распространение
в организме хозяина, а бактерицидные белки ядра и гранул эффективно снижают их
вирулентность или приводят к их полному уничтожению. Кроме выполнения
антимикробной функции, ловушки участвуют в регуляции ряда неинфекционных
процессов, а также являются этиологическим фактором многих воспалительных и
аутоиммунных заболеваний. Для положительного эффекта ловушек для организма
хозяина очень важен баланс между их образованием и деградацией.

В биологии этого явления остается еще много белых пятен. Так, не ясно, посредством
каких механизмов эластаза и МПО попадают в ядро из азурофильных гранул на
начальных стадиях формирования НВЛ, не понятно, как клетка выбирает конкретную
программу, направленную на защиту хозяина от патогенов: фагоцитоз, дегрануляцию или
нетоз.

Вероятно, что внимание, которое в настоящее время вызывает явление нетоза в научном
сообществе позволит в ближайшее время ответить на многие неясные вопросы,
позволяющие пролить свет на этот уникальный процесс.

Список литературы

10
1. Abi Abdallah D. S., Denkers E. Y. (2012) Neutrophils cast extracellular traps in response to
protozoan parasites. Front. Immun. 3:382. doi:10.3389/fimmu.2012.00382

2. Brinkmann V., et al. (2004). Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science
303, pp. 1532-1535 DOI: 10.1126/science.1092385

3. Papayannopoulos V. (2017). Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. NATURE

REVIEWS | IMMUNOLOGY. doi:10.1038/nri.2017.105

4. Baums K. G., von Kockrits M. (2015). Novel role of DNA in extrzcellular neutrophil traps.
Trends in Microbiology. doi.org/10.1016/j.tim.2015.04.003

5. Yipp B. G., Kubes Р. (2013). NETosis: how vital is it? BLOOD, VOLUME 122, NUMBER 16

DOI 10.1182/blood-2013-04457671.

6. Delgado-Rizo V., et al., (2017). Neutrophil Extracellular Traps and Its Implications in
Inflammation: An Overview. Front. Immunol., doi.org/10.3389/fimmu.2017.00081

7. Воробьева Н. В., Пинегин Б. В. (2014). Нейтрофильные внеклеточные ловушки:

механизмы образования, роль в норме и при патологии. БИОХИМИЯ, том 79, вып. 12,
с. 1580 – 1591

8. Halverson T. W.R. et al. (2014). DNAIsanAntimicrobialComponentof NeutrophilExtracellular

Traps. PLOSPathogens|DOI:10.1371/journal.ppat.1004593.

9. Saffarzadeh M., Preissner K. T. (2013). Fighting againast the dark side of neutrophil
extracellular traps in disease: manoeuvres for host protecnion. Curr Opin Hematol , 20:3–9
DOI:10.1097/MOH.0b013e32835a0025

Приложение
11
Рисунок 1. Электронная микроскопия покоящихся (А) и активированных (В) нейтрофилов.
Стрелкой показаны фибриллы ловушки [2].

Рисунок 2. Альтернативные пути формирования НВЛ: верхний ряд – нетоз (медленная

клеточная гибель); нижний ряд – нелитическая форма нетоза, быстрое высвобождение
НВЛ из живой клетки, с сохраненией активного фагоцитирующего цитопласта. [3].

12
Рисунок 3. Молекулярные механизмы регуляции нетоза. Объяснение части механизмов в
тексте [3].

Рисунок 4. Сканирующая электронная микроскопия. Е – НВЛ: короткие стрелки – гладкие

нити; длинные стрелки – глобулярные домены. А, В - Грампозитивные и грамнегативные
бактерии, ассоциированные с фибриллами НВЛ: S. aureus (A), S. typhimurium (B) [2].

13
Рисунок 5. Механизмы НВЛ-опосредованной патологии. Объяснения в тексте. [3].

14