Scgdi505 - Guía para Las Prácticas de Laboratorio Septiembre 2019

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS
GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO

DE LA VIDA
CÓDIGO: DCVI-GS-v3-2018-001
Ciencias de la Vida Y la
DEPARTAMENTO: CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
Agricultura
PERIODO
ASIGNATURA: Fitoquímica 201955 NIVEL: 5to
LECTIVO:
DOCENTE: Dra. Blanca Naranjo NRC: 3571, 3578, 5628 PRÁCTICA N°: 1
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
Laboratorio N°3 de Docencia.
PRÁCTICA:
TEMA DE LA EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES MEDIANTE ARRASTRE DE VAPOR DE PLANTAS
PRÁCTICA: RECOLECTADAS EN CAMPO
INTRODUCCIÓN:
Este método aprovecha la capacidad de las moléculas de agua en estado de vapor de asociarse con moléculas de aceite. Los
aceites esenciales poseen puntos de ebullición altos y son insolubles en agua, sin embargo se pueden separar de su fuente natural
usando el punto de ebullición del agua (Los puntos de ebullición de los aceites esenciales pueden alcanzar hasta 300 ºC, se
evaporarán a temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua. El vapor de agua arrastra el D-Limoneno, a pesar de que este
tenga un punto de ebullición más alto que el agua (352ºF). El vapor y el aceite esencial son condensados y separados). Los
componentes de punto de ebullición elevado pero con presión de vapor relativamente pequeña puede obtenerse por arrastre o co-
destilación con un líquido en el cual sea miscible. Es así que los materiales con punto de ebullición alto pueden aislarse y
purificarse combinándolos en un proceso de destilación con algún líquido con un punto de ebullición inferior como el agua
(Ocampo, Ríos, Betancur, & Ocampo, 2008).
El método más utilizado consiste en calentar un balón de destilación que contiene agua y el material vegetal a partir del cual se
extraerá el aceite esencial. El vapor por presión entra en contacto con las células de las plantas y las rompe liberando el aceite
esencial y transportándolo hacia el condensador donde se transforma en líquido nuevamente y se recoge en un recipiente que
facilita la separación del agua y el aceite (Flórez & Mendez, 2003). El equipo Dean Stark es un dispositivo analítico, usado para ser
parar dos fases inmiscibles producidas en evaporación, que a través de solventes o agua, el aceite que saturan la muestra son
extraídos y destilados. También se pueden utilizar los extractores Soxhlet un tipo de material de vidrio utilizado para la extracción
de compuestos generalmente de naturaleza lipídica, contenidos en un sólido, a través de un disolvente afín para luego retirar el
solvente extractor a través de un rotaevaporador.
OBJETIVOS:
 Extraer el aceite esencial utilizando métodos normalizados de extracción.

 Comprender el procedimiento y mecanismo de una extracción por arrastre de vapor.
MATERIALES:
INSUMOS:
• Vasos de Precipitación
REACTIVOS: • 2 pinzas universales
- Agua. • mangueras
- Sulfato de sodio anhidro • 1 Erlenmeyer de 25 mL
• Cuchillo
• Botella de vidrio ámbar de 5 mL con tapar rosca
• Pipetas pasteur
EQUIPOS:
• Equipo de destilación de Dean Stark para extraer aceites esenciales.
• Equipo soxhlet.
MUESTRA:
Organismos vegetales de diferentes familias como: romero, izo, cáscara de limón, cáscara de naranja, cedrón, hierba luisa, etc.
CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

CODIGO: FRM.7.3.001 FECHA: 21-12-2018
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INSTRUCCIONES:
Utilice ropa de protección: vestimenta apropiada, mandil, guantes, gafas de seguridad, cabello recogido.
Llegue puntual a la hora de la práctica.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

1. Armar el equipo de extracción de aceites esenciales, se realizará por dos métodos:
con el equipo de Dean Stark y extracción con equipo soxhlet.
2. Se tritura o corta finamente la muestra vegetal y se coloca en un matraz de
destilación con suficiente agua que no supere las tres cuartas partes del balón para evitar
sobrepresión que puede ocasionar explosiones o accidentes.
3. Conecte la trampa de Dean Stark cobre el balón y el refrigerante. El ingreso y salida
al refrigerante se realiza de abajo hacia arriba.
4. Se somete a ebullición durante 1 horas. Cuidando que la ebullición sea constante y
homogénea si fuera necesario adicionar núcleos de ebullición al balón de destilación. No
derramar agua sobre las mantas de calentamiento para evitar corte circuitos.
5. Cuando el proceso de extracción termine apague las mantas de calentamiento y
espere que se enfríe para desmontar el equipo.
6. Reciba el producto (aceite esencial) en un erlenmeyer con sulfato de sodio y
manténgalo durante 3 horas.
7. Filtre y coloque el aceite esencial en una botella de color ámbar y tapa rosca, en el
caso de extracción con soxhlet evaporar el solvente en un rotavapor y guardar igualmente en un frasco de color ámbar y con
tapa rosca.
8. Guardar los productos en refrigeración. Realizar las diferentes reacciones de coloración y análisis cromatográfico y preparar un
producto.
RESULTADOS OBTENIDOS:
- Obtenga el volumen de Aceite Esencial (mL)
- Calcule el peso del extracto (g).
- Calcule el % Rendimiento tanto con el aceite esencial así como con el extracto obtenido.
- Desarrolle el cuestionario propuesto:
CUESTIONARIO:
1. Indique las Características físico-químicas y organolépticas observadas en el aceite esencial obtenido en la práctica.
2. Cuál es la razón para que el aceite esencial manifieste un olor fuerte y penetrante.
3. Porqué se produce la destilación de un aceite esencial utilizando el proceso de destilación.
4. Qué cuidados se deben tomar en cuenta en los procesos efectuados en la práctica.
5. Qué componentes forman cada uno de los productos obtenidos?
6. Indique cuáles son los principales métodos para obtener los aceites esenciales y de que depende la elección del método?
7. Qué efecto tiene la presión sobre el punto de ebullición de los componentes?
8. Qué rol cumplen estos compuesto en el ambiente?
CONCLUSIONES:
Se comprueba que las plantas contienen compuestos volátiles (terpenos de bajo peso molecular) que son recuperados mediante la
técnica de arrastre de vapor y se puede predecir su composición en función de sus características físicas y.
RECOMENDACIONES:
 Cuide que el material que va a utilizar esté completamente limpio.
 Cuidar que los equipos se encuentren correctamente armados para que no existan fugas de los productos que se desean
obtener.
 Evitar que existan fugas de agua por las mangueras para evitar rupturas del material de vidrio caliente.
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 Colocar una pequeña cantidad de carbón con un lápiz en las partes esmeriladas del equipo para evitar que las partes
queden totalmente unidas por efecto de la temperatura.
 Tenga cuida al trabajar con el material caliente utilice guantes o franelas.
 Recoger el aceite obtenido al finalizar todas las extracciones.
 Guarde en oscuridad y fuera de la luz ultravioleta los productos obtenidos
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

Nombre: Dra. Blanca Naranjo P. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez A.
DOCENTE COORDINADOR DE ÁREA DE JEFE DE LABORATORIOS
CONOCIMIENTO MULTIDISCIPLINARIOS
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
 Valencia del Toro, G. Garín Aguilar, M.C. Manual de Prácticas de Productos Naturales. Primera
Edición, 2010.
 Wagner, H., Blandt, S. Plant Drugs Analysis-A Thin Layer Chromatography Atlas. Second Edition.
Springer. 1996.
 Morelli, I., I Principi Attivi delle pliante Medicinali, Primera edición. Edagricole. 1981, 75-78.
 Torssell K. B. G., Kurt, B. Natural Product Chemistry - A mechanistic, biosynthetic and ecological
approach. Taylor & Francis. Second Edition. 1997.
 Harbone. J. B. Phytochemical Methods - A guide to modern Techniques of plant Analysis. Third
edition. 1997.
 Luck, O., Investigación Fitoquímica, Fondo Editorial de la Universidad Católica del Perú. 1988. 23-
36.
 Darmstadt, E. Merck. Chromatogrphy. Second Edition. 1998.
 Bollger, H.R., Brenner, M., Ganshirt, H. Mangold, H.K., Seiler, H. Stahl, E., Waldi, D. Thin Layer
Chromatography – A laboratory Handbook. Springer. 1992.

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PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LOS ACEITES ESENCIALES POR REACCIONES DE
PRÁCTICA: COLORACIÓN Y CROMATOGRAFÍA.
INTRODUCCIÓN:
Los aceites esenciales tienen compuestos terpenoides volátiles, éstos compuestos tienen como unidad estructural el isopreno que
se configuran en estructuras de 10 y 15 carbonos llamados monoterpenos y sesquiterpenos respectivamente. En éstos compuestos
se encuentran grupos funcionales que les dan características físicas y químicas distintas, los principales compuestos son:
Alcoholes, fenoles, aldehídos, cetonas, ésteres, éteres, peróxidos e hidrocarburos (Martinez, 1996).
Debido a la gran variedad de compuestos y la diversidad de grupos funcionales, no existe una sola prueba para reconocer los
grupos funcionales. Una de las formas para distinguir los grupos funcionales es el método colorimétrico. Para esto se pueden
utilizar distintos reactivos que permitan coloración de acuerdo a las moléculas presentes se puede utilizar indicadores universales
que al encontrase frente a un ácido se tornan rojos, frente a bases verde azulado, se queda amarillo si el compuesto no es ni ácido
ni base y se puede añadir permanganato de potasio (KMnO4) para descubrir grupos oxidables (Walter, 1987).
OBJETIVOS:
 Reconocer los grupos funcionales presentes en las moléculas que forman el aceite esencial.
 Identificar los tipos de reacciones de coloración existen para la determinación de grupos funcionales en una muestra.
MATERIALES:
REACTIVOS:
• Sulfato de sodio anhidro
• Sulfuro de carbono
• Hidróxido de potasio
• Etanol
• 2,4-dinitrofenilhidracina INSUMOS:
• Nitrato de plata  20 tubos de ensayo
• Hidróxido de sodio  Pinza para tubos de ensayo,
• Hidróxido de potasio  Gradilla,
• Hidróxido de amonio  Reverbero
• Hidroxilamina o clorhidrato de hidroxilamina
 1 Erlenmeyer de 25 ml.
• Ácido clorhídrico
 Pipetas Pasteur
• Permanganato de potasio
• Formaldehído  Pipetas de 5 mL
• Ácido sulfúrico  Vasos de precipitación de 75 mL.
• Yoduro de potasio • Soporte de vidrio o aluminio con gel de sílice
• Almidón • Papel de cromatografía 65x25 cm
• Yodato de potasio • Tubo capilar
• Agua destilada • Cámara cromatográfica
• Tolueno
• Acetato de etilo
• Diclorometano
• Hexano
• Anisaldehído
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EQUIPOS: Cámara Ultravioleta

MUESTRA:
Aceite de: Canela, Anís, Clavo o Pimienta dulce, romero, izo, cáscara de limón, cáscara de naranja.
INSTRUCCIONES:
1. ALCOHOLES:
 Reactivo de LUCAS. Se añaden 68 g de ZnCl2, en porciones, a 45 ml de HCl conc., procurando enfriar la disolución a lo
largo del proceso.
 Técnica. Colocar 1 ml del alcohol en un tubo de ensayos y agregar 6 ml de reactivo de Lucas. Tapar y dejar reposar
durante 5 minutos. El reactivo de Lucas reacciona con los alcoholes primarios, secundarios y terciarios con velocidades
bastante predecibles, y dichas velocidades se pueden emplear para distinguir entre los tres tipos de alcoholes. Cuando se
agrega el reactivo al alcohol, la mezcla forma una fase homogénea. La solución concentrada de ácido clorhídrico es muy
polar y el complejo polar alcohol-zinc se disuelve. Una vez que ha reaccionado el alcohol para formar el halogenuro de
alquilo, el halogenuro no polar se separa en una segunda fase.
2. ALDEHÍDOS Y CETONAS CON REACTIVO DE BRADY:
 Reactivo de Brady: disolver 1.0 g de DNPH (2,4- dinitrofenilhidrazina) en 5 ml de H2SO4 conc. Se añaden lentamente y con
agitación esta mezcla a una disolución de agua (7 ml) y etanol (25 ml) y finalmente se filtra para eliminar sólidos en
suspensión.
 Ensayo: A 5 gotas de aceite esencial se adiciona 2 gotas del reactivo de Brady. Forman precipitados amarillos o rojo
oscuro. Precipitados rojos indican carbonilos aromáticos, los anaranjados indican carbonilos α-β insaturados, y los
amarillos carbonilos saturados.
ALDEHÍDOS CON REACTIVO DE TOLLENS:
 Reactivo de Tollens: añadir 2 gotas de una disolución de NaOH al 5% a 1 ml de disolución acuosa de AgNO 3 al 5%. Agitar
el tubo y añadir gota a gota y con agitación NH4OH 2N, hasta que se consiga disolver el precipitado de AgOH, que
previamente se había formado.
o Precaución: el isocianato de plata, compuesto muy explosivo en seco, puede estar presente en los residuos de las
soluciones del reactivo de Tollens; por esta razón, es conveniente tirar el resto de la disolución de Tollens no utilizada y
lavar los tubos con HNO3 diluido.
 El ensayo se realiza tomando 1ml de reactivo con una gotas de aceite esencial y calentado en baño María hasta observar
la formación de un precipitado negro, o de un espejo de plata en las paredes del tubo de ensayo, constituye una prueba
positiva de la presencia de un aldehído.
3. DETECCIÓN DE ÁCIDOS
Para detectar la presencia de un ácido es el ensayo de iodato-ioduro, válido incluso para ácidos débiles.
 Ensayo del iodato-ioduro para ácidos carboxílicos. Se toman unas 2 gotas del aceite esencial y se colocan en un tubo de
ensayo. Se añaden 2 gotas de una solución de KI al 2% y 2 gotas de una solución de KIO3 al 4% (ambas en H2O). Se tapa
el tubo y se calienta en un baño de agua hirviendo durante 1 minuto. Se enfría el tubo y se añaden 2 gotas de solución de
almidón, recientemente preparada, al 0,1%. Si la sustancia es un ácido, aparecerá un color azul.
4. DETECCIÓN DE ESTERES:
 Ensayo para la detección de ésteres. Se colocan 0,5 ml de solución de clorhidrato de hidroxilamina 1N en alcohol, en un
tubo de ensayo. Se adicionan 2-3 gotas de aceite esencial y gota a gota, una solución de KOH 2N en metanol, hasta que
la mezcla tenga pH 9-10, luego se adicionan 4 gotas más de KOH 2N. Se calienta la mezcla hasta ebullición, se enfría y
se añade gota a gota y con agitación HCl 2N hasta pH 3 aprox. Seguidamente se añade 1 gota de solución de FeCl 3 al
10% y se observa el color. Una coloración rojo sangre es indicativa de la presencia de ésteres.

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5. FENOLES: Dan coloración violeta con una solución de FeCl3 (2,5 g de cloruro férrico diluido a 50 ml de agua y ajustado a
100 mL con etanol).
6. INSATURACIONES: El ensayo para identificar las instauraciones se realiza con una sol. de KMnO4 al 5 o 10%. El
ensayo se realiza con unas gotas de aceite esencial y unas gotas de reactivo hasta la aparición de un precipitado café que indica la
reducción del Mn y la oxidación del compuesto orgánico a un glicol.
7. HIDROCARBUROS AROMÁTICOS: Esteres aromáticos y algunos fenoles dan coloración cuando a una gota de esencia
se añade un ml de una mezcla de 1 gota de formaldehído más 1 ml de ácido sulfúrico concentrado. Los derivados del benceno dan
rápidamente en la superficie un color rosa, anaranjado o rojo. Los del naftaleno colores azul-verdoso o verde.
*Cromatografía en capa fina
1. PREPARACIÓN DE LA PLACA DE CROMATOGRAFÍA: Sobre un soporte de vidrio o aluminio conteniendo una lechada de
gel de sílice es activado en una estufa a 100°C, También se puede utilizar papel de cromatografía de 65 x 25 cm.
La placa o papel se marca con un lápiz desde la parte inferior hacia la parte superior 2 cm y se traza una línea horizontal, la
misma que será dividida en partes iguales de acuerdo al número de muestras que se desee separar.
2. APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS SOBRE LA PLACA CROMATOGRÁFICA. Después del marcaje de la palca
cromatográfica, con la ayuda de un tubo capilar se aplica la muestra sobre la placa de Sílica gel lo suficiente para que permita
una buena separación.
3. PREPARACIÓN DEL SOLVENTE CROMATOGRÁFICO: El solvente o fase móvil constituida por una mezcla de solventes,
cuya polaridad se elige de acuerdo a la naturaleza de los compuestos que se desea separar, para el caso de separar aceites
esenciales el solvente o disolvente apropiado es: Tolueno: Acetato de etilo (93:7). Si no existe una buena separación se realizará
pruebas hasta lograr una mezcla de disolventes que separen todos los componentes de la muestra.
Si todas las manchas salen próximas al frente del solvente se puede variar el solvente por una mezcla de diclorometano:hexano,
(a mayor cantidad de hexano menos avanzarán las manchas en el cromatograma). Si en cambio tenemos manchas no
separadas, cerca de la línea inferior, usaremos mezclas de diclorometano/acetato de etilo (el acetato de etilo hace aumentar el
valor de Rf de las sustancias). Disolventes más polares como metanol y etanol, agua se emplean cuando el acetato de etilo no es
suficiente para aumentar suficientemente el Rf de los componentes.
Mezclas típicas son: diclorometano/hexano 2:1
Diclorometano: acetato de etilo 2:1
4. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA. Se coloca el solvente dentro de la cámara cromatográfica, por lo menos 15 min antes
de introducir la placa con las muestras, para que se sature con los vapores del solvente seleccionado. Se coloca la placa al
interior de la cámara de cromatografía y se espera que el solvente recorra hasta 2 cm antes de la parte superior.
Al recorrer la fase móvil por la placa, asciende por capilaridad, va arrastrando a las sustancias apolares, y aquellas más polares
son retenidas por la fase estacionaria, dando lugar a la separación.
La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las sustancias de interés. La movilidad relativa o Rf, es
la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente
al momento de sacar la placa del solvente.
5. REVELADO DE LA CROMATOGRAFÍA.
La placa desarrollada se deja secar y si la visualización de las manchas no se puede realizar a simple vista es necesario utilizar
una de las propiedades de los aceites esenciales que es la absorción de luz ultravioleta (254nm) sobre la placa del
cromatograma. Otra forma de detectar e identificar manchas es utilizar sustancias reveladoras o sustancias que pulverizadas
sobre el cromatograma desarrollado originen una coloración específica sobre alguna de las manchas, debido a que el revelador
es una sustancia química que reacciona específicamente con algunos componentes originando un color visible característico.
Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo más precisamente posible, y anotando en cada caso las
observaciones como colores, florescencia, manchas: A simple vista Luz UV 254 nm Luz UV 366 nm Vapores de yodo, y una
mezcla de ácido sulfúrico y anisaldehído, o ácido sulfúrico-vainillina.
6. REVELADO DE LA CROMATOGRAFÍA.
Reactivo anisaldehído sulfúrico:Mezcla recién preparada de 50 l de anisaldehído con 1 ml de ácido acético glacial, seguido de
8,5 ml de metanol y 0,5 ml de ácido sulfúrico, en ese orden. Llevar a estufa a 100 °C, 5-10 min y evaluar al visible y al UV a 366
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nm.
7. MEDICIÓN DE LA DISTANCIA RECORRIDA.
La movilidad relativa o Rf (Factor de retardo), es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida
por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente.
En un sistema de CCF bien caracterizado, las sustancias pueden identificarse comparando los valores de Rf con los de
estándares, que se han analizado previamente, durante la cromatografía o utilizando datos bibliográficos.
8. FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO Y ANÁLISIS ESPECTRAL: Con el mejor eluyente seleccionado previamente,

proceder el fraccionamiento a escala mayor del extracto por cromatografía en capa preparativa CCP. Las fracciones coloreadas
se raspan, se enumera y se determina su espectro visible en el rango de 350 a 550mn. Es importante tener en cuenta que para
determinar el espectro cada compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes.
1. Escriba las reacciones realizadas utilizando moléculas que se encuentren en el aceite esencial e indicar colores y
precipitados si los hubiera.
2. Indique si las reacciones fueron positivas o negativas y por lo tanto si hubo presencia o ausencia de diferentes grupos
funcionales en el aceite esencial.
3. Desarrolle el cuestionario propuesto:
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué es una reacción de oxidación?
2. ¿Cuál de los procesos realizados indican oxidación?
3. ¿Por qué el hidrodestilado o agua floral presenta ciertas reacciones positivas?
4. ¿Qué compuestos pueden estar presentes en su aceite esencial y cuáles en el hidrodestilado?
5. ¿Qué proceso químico se produce para que las moléculas se mantengan en el hidrodestilado?
6. ¿Cuál es el principio de las técnicas cromatográficas?
7. ¿Qué fases constituyen un sistema cromatográfico y en qué consisten?
8. ¿De qué está formada la fase estacionaria en una CCF?
9. Cuál es el principio para que se dé la separación de los componentes de la muestra?
10. Qué papel juega la fase estacionaria?
11. Cuál es el rol de la fase móvil?
12. ¿Qué sucedería si se cambia la fase estacionaria y la fase móvil?
13. Mencione y fundamente dos técnicas cromatográficas modernas.
CONCLUSIONES:
Se confirma que el aceite esencial de una planta contiene moléculas con diferentes grupos funcionales.
RECOMENDACIONES:
 Cuide que el material que va a utilizar esté completamente limpio.
 Cuando se toman los reactivos para las diferentes reacciones, cuide no introducir las pipetas en los frascos de los
solventes y reactivos para evitar contaminarlos. Tomar una pequeña cantidad en un vaso pequeño calculando la cantidad
a usar.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
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 Valencia del Toro, G. Garín Aguilar, M.C. Manual de Prácticas de Productos Naturales.
Primera Edición, 2010.
 Wagner, H., Blandt, S. Plant Drugs Analysis-A Thin Layer Chromatography Atlas. Second
Edition. Springer. 1996.
 Torssell K. B. G., Kurt, B. Natural Product Chemistry - A mechanistic, biosynthetic and
ecological approach. Taylor & Francis. Second Edition. 1997.
 Harbone. J. B. Phytochemical Methods - A guide to modern Techniques of plant Analysis.
Third edition. 1997.
 Luck, O., Investigación Fitoquímica, Fondo Editorial de la Universidad Católica del Perú.
1988. 23-36.
 Bollger, H.R., Brenner, M., Ganshirt, H. Mangold, H.K., Seiler, H. Stahl, E., Waldi, D. Thin
Layer Chromatography – A laboratory Handbook. Springer. 1992.

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PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA
EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CAROTENOIDES DE UNA MATRIZ VEGETAL.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Los carotenoides son compuestos naturales presentes en diversas estructuras de plantas y en gran variedad de animales, algas,
hongos y bacterias.
Estos pigmentos son responsables del color de flores y frutos (para favorecer la polinización y dispersión de semillas), o de estructuras
animales como las plumas y picos de algunos pájaros, el exoesqueleto de crustáceos y el músculo o la piel de algunos peces.
Son considerados compuestos indispensables para la vida, fundamentalmente debido a las funciones que llevan a cabo en relación con
la fotosíntesis (captación de luz, foto protección).
Los antioxidantes naturales presentes en los vegetales y en algunos animales han sido estudiados por su papel en la protección de
diversas enfermedades como ciertos tipos de cáncer, enfermedad cardiovascular y la degeneración macular relacionada con la edad.
La evidencia experimental sugiere que estos compuestos son importantes en la protección de macromoléculas biológicas contra el daño
oxidativo.
La búsqueda de nuevos y más eficientes antioxidantes al parecer va dirigida a los carotenoides, que a través de su consumo podría
disminuir la incidencia de ciertas enfermedades.
Además representan una fuente de provitamina A, con actividad antioxidante en la célula al actuar en la neutralización de especies
reactivas de oxígeno y nitrógeno producidas como parte del metabolismo celular.
OBJETIVOS:
 Seleccionar una serie eluotrópica, el eluente que mejor separe los carotenoides presentes en diferentes muestras
vegetales.
 Conocer otros sistemas cromatográficos para la separación de carotenoides.
MATERIALES:
REACTIVOS: INSUMOS:
• Etanol al 95%  1 Erlenmeyer de 50, 100 y 1000mL.
• Diclorometano ó cloroformo  Algodón
• NaCl deshidratado  Papel filtro
• Sulfato de sodio anhido
 Embudo
• Diclorometano: Acetato de etilo (4:1)
 Mortero
• Éter de petróleo: Acetona (95:5)
• n-hexano:EtOAc (4:1)  Varilla de vidrio
• n-hexano:EtOAc (1:4)  Pipetas Pasteur
 Pipetas de 5 mL
• Buscar en bibliografia un solvente con los factores de retardo  Vasos de precipitación de 75 mL.
para aplicar en el laboratório
 Probetas
EQUIPOS:
• Lámpara Ultravioleta
• Equipo para cromatografía
MUESTRA:
Muestra vegetal: hojas, pétalos de flores, tallos, raíces, semillas, etc.

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INSTRUCCIONES:
1, DESHIDRATACIÓN: En un Erlenmeyer seco se colocan unos 30 g. de tejido fresco triturado finamente en un mortero. Se añade
un volumen suficiente de etanol al 95% para que recubra la muestra. Se lo calienta a ebullición sobre un baño maría durante 5
minutos. Se filtra en caliente con un algodón, procurando que la masa semisólida quede libre del solvente.
2. EXTRACIÓN: A la masa semisólida se añade un volumen suficiente de diclorometano (también puede usarse cloroformo) en
una campana de extracción y se remueve con una varilla de vidrio para que el solvente extraiga los carotenoides. Debe tenerse
precaución con el manejo de estos solventes pues son bastante volátiles y algunos son muy tóxicos. El extracto se filtra. El residuo
sólido se puede extraer varias veces con el fin de obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos filtrados se juntan, se
trasvasan a un embudo se separación y se añade si es necesario una cantidad de NaCl deshidratado. La fase orgánica se
recupera, se seca con sulfato de sodio anhidro si es necesario y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta un
volumen aproximadamente de 5 mL, mediante la aplicación de calor suave (40-50°C) y vacío. El extracto de carotenoides se
guarda para protegerlo de la luz, humedad, el calor y el aire. Selección de otra fase móvil. El extracto de carotenoides se analiza
por CCF con la serie eluotrópica siguiente:
CH2Cl2: EtOAc (4:1)
Éter de petróleo: C6H6 (49:1)
Éter de petróleo: Acetona (95:5)
n-hexano:EtOAc (4:1) 
n-hexano:EtOAc (1:4)
Acetato de etilo
Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo más precisamente posible, y anotando en cada caso las
observaciones como colores, florescencia, manchas: A simple vista Luz UV 254 nm Luz UV 366 nm Vapores de yodo.
3. FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO Y ANÁLISIS ESPECTRAL: Con el mejor eluyente seleccionado previamente,
proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor del extracto por cromatografía en capa preparativa CCP. Las fracciones
coloreadas se raspan, se enumera y se determina su espectro visible en el rango de 350 a 550mn. Es importante tener en cuenta
que para determinar el espectro cada compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes.
- Calcule los correspondientes valores de Rf.
- Elabore una tabla con los valores de la distancia recorrida por cada una de las muestras, junto con los valores Rf.
- Indique la composición de la solución problema, justificando la conclusión a la que ha llegado.
- Desarrolle el cuestionario propuesto:
CUESTIONARIO:
1. Cuál es la relación de la fase móvil con la muestra a separar?

2. ¿Qué ocurriría si la longitud de la placa se incrementara de 20 a 100 cm ó si se aumentara el tiempo cromatográfico de 2 a 20
horas?
3. Si no se cuenta con los solventes mencionados, se puede utilizar otros solventes y cuál podría ser?
4. Explicar por qué el Rf de las sustancias estudiadas es mayor en el diclorometano que en el hexano.
5. La CCF, puede aplicarse para cualquier tipo de sustancias o tiene algún tipo de restricción, explique.
CONCLUSIONES:
Se confirmará la solubilidad de los carotenoides en diferentes solventes, así como su separación y la presencia de los mismos en
diferentes matrices vegetales.
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RECOMENDACIONES:
Preparar los diferentes eluyentes lo más exactamente posible y observar los resultados inmediatamente después de su separación
debido a la rápida oxidación de los carotenoides con el oxígeno del aire.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

 Valencia del Toro, G. Garín Aguilar, M.C. Manual de Prácticas de Productos Naturales.
Primera Edición, 2010.
 Wagner, H., Blandt, S. Plant Drugs Analysis-A Thin Layer Chromatography Atlas. Second
Edition. Springer. 1996.
 Torssell K. B. G., Kurt, B. Natural Product Chemistry - A mechanistic, biosynthetic and
ecological approach. Taylor & Francis. Second Edition. 1997.
 Harbone. J. B. Phytochemical Methods - A guide to modern Techniques of plant Analysis.
Third edition. 1997.
 Luck, O., Investigación Fitoquímica, Fondo Editorial de la Universidad Católica del Perú.
1988. 23-36.
 Bollger, H.R., Brenner, M., Ganshirt, H. Mangold, H.K., Seiler, H. Stahl, E., Waldi, D. Thin
Layer Chromatography – A laboratory Handbook. Springer. 1992.

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Agricultura
PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE FENÓLES POR UN MÉTODO ANALÍTICO.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
El contenido fenólico total se determina con el reactivo de Folin-Ciocalteu según un procedimiento descrito por Singleton y Rossi,
1995, con modificación realizada al procedimiento descrito por (Dastmalchi 2007).
El método original de Folin – Ciocalteau consiste, en la oxidación de los fenoles con los reactivos de molibdotungstanato que
permite una reacción coloreada a λ máxima de 745 - 750 nm (Folin 1927).
Na2 WO4 / NaMoO -------------- (fenol – MoW11O40)4-
Mo (VI) (amarillo) + e- ------------- Mo (V) (azul)
Este método es simple, sensible y preciso. Sin embargo, la reacción es lenta a pH ácido, por lo que se pierde especificidad
(Singleton 1965), el método fue mejorado con la adición del reactivo heteropoliniónico molibdo- tungstofosfórico. La λ máxima para
el producto es 765 nm.
3H2O – P2O5 – 13WO2 – 5 MoO3 - 10H2O
3H2O – P2O5 – 14WO3 – 4 MoO3– 10 H2O
OBJETIVOS:
 Evaluar el contenido de compuestos fenólicos del extracto.

 Comprender el mecanismo de oxidación de fenoles con el reactivo de Folin-Ciocalteu.
MATERIALES:
INSUMOS:
REACTIVOS: • Mortero y pistilo
• Metanol • Vasos de precipitación de 50mL, 100mL
• Agua destilada • 1 probeta de 100 mL
• Ácido gálico • 1 pipeta de 10mL
• Reactivo de Folin- Ciocalteu • Tubos de ensayo
• Bicarbonato de sodio
• Gradillas
• Ácido clorhídrico
• Rutina • Micropipetas
• Embudo
EQUIPOS:
• Espectrofotómetro
• Baño maría
• centrifuga
MUESTRA:
Muestra vegetal de pétalos de geranio (secos o frescos)
INSTRUCCIONES:
- Utilice ropa de protección: vestimenta apropiada, mandil, guantes, gafas de seguridad, cabello recogido.
- Llegue puntual a la hora de la práctica.
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1. Se obtendrán los extractos con metanol a partir de 0,1 g de muestra seca (pétalos de geranio seca y molida), luego se llevarán a
extracción por agitación durante 15 min con 5 mL de solución de ácido clorhídrico 1N. El contenido total de fenoles será estimado
como equivalentes a ácido gálico.
2. A partir de una solución madre de 0.5 g por cada 100 mL, de ácido gálico (10 mL de metanol y aforar a 100 mL con H20), se
prepararán los estándares de calibración de 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25 y 0.5 mg/L ácido gálico. Se procederá de la siguiente manera.
3. Curva de Calibración:
Se toma 0,1 mL de cada uno de los estándares preparados, o en caso del blanco 0,1 ml de metOH (para diferentes
concentraciones, tomar 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 mL y aforar a 100 mL con H20).
A cada uno de los tubos adicionar 1,5 mL de reactivo de Folin- Ciocalteu (al 10% en agua).
Adicionar 1,4 mL de Bicarbonato de sodio (solución 7,5 %). Agitar.
Dejar en baño maría por 15 min a 45°C o 30 minutos a temperatura ambiente.
Agitar y dejar reposar por 5 min y leer en espectrofotómetro a 765 nm, leer las absorbancias de los estándares desde el más
diluido hasta el más concentrado.
4. Análisis de muestras:
Sobre una alícuota de 0,1 mL de extracto se transferirá a un tubo de ensayo luego se adicionarán 1,5 mL de reactivo de
Folin- Ciocalteu, se añade 1,4 mL de solución de bicarbonato de sodio (Na2CO3) al 7,5 %. Después de 15 minutos de
reacción a 45°C o 30 minutos a temperatura ambiente, determine la absorbancia a 765 nm y se comparará con la curva de
calibración realizada usando como solución estándar ácido gálico.
- Calcule la concentración de compuestos fenólicos en base a la curva de calibración obtenida de cada una de las muestras
en mg/L de ácido gálico.
- Repita los cálculos obtenidos por el software Visión Life en formato Excel.
- Compara los resultados obtenidos en los dos programas justifique los resultados.
CUESTIONARIO:
1. ¿En qué consiste la absorción?
2. ¿Qué es una regresión lineal?
3. ¿Qué precauciones se deben tomar en cuenta para realizar este tipo de análisis?
4. ¿Qué significa el factor de correlación “r”?
5. ¿Si el factor de correlación “r”, se aleja de uno qué significa?
CONCLUSIONES:
Se comprobará con los resultados obtenidos la concentración de compuestos fenólicos presentes en la muestra analizada,
expresada en mg/L de ácido gálico, que representa a los con grupos hidroxilos libres que pueden interactuar con el reactivo de
Folin-Ciocalteu.
RECOMENDACIONES:
La cuantificación de fenoles es un análisis cuantitativo, por lo que se requiere de un trabajo minucioso y exacto durante el pesaje y
pipeteo de los volúmenes de los diferentes reactivos y muestras.
Cuide que la reacción se realice en oscuridad y leer las muestras en el tiempo indicado.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

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 Valencia del Toro, G. Garín Aguilar, M.C. Manual de Prácticas de Productos Naturales. Primera Edición, 2010.
 Wagner, H., Blandt, S. Plant Drugs Analysis-A Thin Layer Chromatography Atlas. Second Edition. Springer. 1996.
 Torssell K. B. G., Kurt, B. Natural Product Chemistry - A mechanistic, biosynthetic and ecological approach.
Taylor & Francis. Second Edition. 1997.
 Harbone. J. B. Phytochemical Methods - A guide to modern Techniques of plant Analysis. Third edition. 1997.

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PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA
EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ANTOCIANOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales, Estos compuestos le confieren colores amarillos, naranja,
rojo, violeta y azul a muchas flores, hojas y frutos; con el fin de proteger a la planta frente a los rayos solares dañinos y también
filtran algunas radiaciones para que con ayuda de la clorofila puedan ser útiles en el proceso de la fotosíntesis. La estructura
química de estos compuestos consta de dos anillos aromáticos (bencénicos), unidos a través de una cadena de tres carbonos que
puede encontrase como un anillo central heterocíclico (ɤ-pironas) que es el más común, o también con la cadena de tres carbonos
abierta (Chalcona), C6C3C6 (Martínez, 2005). Contienen un número variable de grupos hidroxilo que les confiere la propiedad de
quelación de hierro y otros metales de transición.
Las antocianinas son pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las células vegetales y que otorgan el color rojo,
púrpura o azul a las hojas, flores y frutos. (Wagner, 1999). Las antocianinas tienen todas las propiedades de un filtro solar”. En
varios artículos, el último publicado en el Chemistry European Journal, muestran cómo hacen las moléculas de antocianinas para
absorber la luz y los rayos ultravioletas, transformando rápidamente su energía en calor inofensivo para la planta.
Aisladas en laboratorio con solventes polares, las antocianinas presentan una de las propiedades más singulares su capacidad
para cambiar de color en función del pH, mostrando una amplia gama de tonos, desde el rojo, pasando por el púrpura o el azul,
hasta el amarillo (al aumentar el pH), de modo que actúan como indicadores naturales del pH. Esto es debido a que su estructura
experimenta una amplia variedad de transformaciones moleculares en función de la concentración de protones.
Las antocianinas a pH ácido (típicamente pH < 4) adoptan una estructura de tipo oxonio (catión flavilio) [2] y presentan colores en la
gama de los rojos intensos gracias a la conjugación extendida entre los dos fragmentos aromáticos que permite la absorción de luz
visible con una longitud de onda variable (480 - 550 cm-1), dependiendo de los sustituyentes de los anillos. A pH en torno a 4-5, sin
embargo, estas moléculas experimentan un ataque nucleofílico sobre el C2 por parte de una molécula de agua, y adoptan una
configuración de tipo carbinol pseudobase carente de color debido a la ausencia de conjugación entre el fragmento monocíclico y el
resto de la molécula, lo que impide la absorción de luz visible. Por encima de pH 5 vuelven a adquirir colores intensos en la gama
de los azules, verdes y amarillos, gracias al predominio de conformaciones neutras o aniónicas con una fuerte conjugación:
Este movimiento electrónico puede ser detectado de forma visible con el cambio de coloración, y más precisamente con la
absorción de luz en la región UV-VIS, utilizando un especrofotómetro.
La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de moléculas, y además, para determinar el
contenido y fuerza de una sustancia. Utiliza radiación electromagnética (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e
infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagnético, es decir, una longitud de onda entre 380nm y 780nm. La radiación
absorbida por las moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones electrónicas que pueden ser cuantificadas
(Wagner, 1999).
Gracias a los anillos bencénicos que poseen en la estructura de los flavonoides, son capaces de absorber radiación ultravioleta y
le confieren sus características espectrales. La banda II que se encuentra en el rango de 240 a 285 nm, corresponde a la porción
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benzoílo, y La banda I que se encuentra en el rango de 300-400nm, es decir de mayor longitud de onda, corresponde a la porción
cinamoílo, que puede variar de acuerdo al patrón de sustitución y la conjugación del anillo C.
OBJETIVOS:
 Extraer los Flavonoides de diferentes matrices vegetales usando un solvente orgánico polar.
 Observar y analizar mediante espectrofotometría la variación que sufren los antocianos cuando existe un cambio de pH.
MATERIALES:
INSUMOS:
REACTIVOS: • pinzas universales
- Metanol • 1 Erlenmeyer de 25 mL
- Ácido clorhídrico • Tubos de ensayo
- Agua. • Gradilla
- Ácido Acético • Pipetas, 5 mL y 10 mL
- Bicarbonato de sodio • Micropipetas
• Bureta
EQUIPOS:
• Molino
• Espectrofotómetro.
• Peachímetro
• Balanza analítica
MUESTRA:
Material vegetal como: flores o frutos con fuertes tonalidades, salmón, rojo fuerte, morado, azul, blanco, amarillo.
INSTRUCCIONES:
No olvide su muestra, su franela y una práctica IMPRESA POR GRUPO.
EXTRACCIÓN.- Con 1 gramo de muestra seca y molida se extrae los flavonoides y antocianos utilizando como solvente una solución
de Metanol-ácido clorhídrico 0,1 N (9:1), se deja en agitación por 24 horas en oscuridad luego se filtra y se realiza los análisis
respectivos.
VARIACIÓN DEL pH CON UNA SOLUCIÓN DE NaOH 0,1 N o NaHCO3
Medir el pH de la solución inicial, y realizar un barrido de absorción entre 250-650 nm,

Separar una fracción representativa de extracto y,
Variar el pH levemente en razón de Una unidad utilizando la solución de NaOH o NaHCO 3, cuando exista un cambio significativo
(geranio a pH = 1, 4,5, 6, 8, 12 ) realizar un barrido de absorción a las longitudes de onda mencionadas.
Comparar las curvas Obtenidas y analizar los resultados.
Estudiar la relación que existe entre la el grado de hidroxilación de los núcleos aromáticos de la antocianidina con el grado de absorción
de luz UV.
Discusión de resultados
Realice una tabla donde pueda comparar los máximos de absorción de las diferentes curvas obtenidas.
Reporte además el máximo de absorción de los extractos observados en el espectrofotómetro Ultravioleta-Visible.
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CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué es necesario utilizar un solvente hidrofílico ácido para separar a estas moléculas de la matriz vegetal?
2. Qué significa espectrofotometría?
3. Qué consideraciones se deben tener en cuenta cuando se realiza un análisis espectrofotométrico?
4. Qué información proporciona un espectro UV-VIS?
5. Qué sucede cuando se varía el pH en las moléculas analizadas?
6. Qué grupos funcionales pueden actuar como cromóforos en estas moléculas?
7. Qué es un efecto batocrómico e hipsocrómico.
CONCLUSIONES:
Se comprobará la solubilidad de los flavonoides analizados en función del solvente usado. Y se evidenciará la capacidad de
absorción de luz UV-VIS generando diferentes curvas espectrales que dependerán fundamentalmente del pH.
RECOMENDACIONES:
Tener cuidado durante la adición de las soluciones que permitirán generar un cambio de pH.
Para obtener resultados apreciables en los análisis espectrofotométricos se realizarán con soluciones bastante diluidas.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

 Luck, O., Investigación Fitoquímica, Fondo Editorial de la Universidad Católica del Perú. 1988. 23-36.
 Bollger, H.R., Brenner, M., Ganshirt, H. Mangold, H.K., Seiler, H. Stahl, E., Waldi, D. Thin Layer Chromatography
– A laboratory Handbook. Springer. 1992.

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PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE LA SABILA (Aloe
PRÁCTICA: vera).
INTRODUCCIÓN:
El Aloe vera es una hierba perenne de hojas carnosas, lanceoladas, agrupadas formando una roseta. Flores tubulares, amarillas,
dispuestas en una espiga que se sitúa en el extremo de un tallo erguido que sobresale marcadamente por sobre las hojas.
Contenido y principios activos
Contiene hidroxiantraquinónicos (25-40%): Aloínas A y B (aloína, barbaloína), aloerresinas A, B y C (glucosilcromonas). Derivados
hidroxiantracénicos (15-30%): Aloínas A y B, 5-hidroxialoína A, aloe-emodina, crisofanol. Glucosil cromonas: Aloerresinas A, B y
menores cantidades de C, isoaloerresina; aloeninas A y B (principios amargos).
Parénquima: abundantes mucílagos.
OBJETIVOS:
 Extraer los principios activos de la sábila
 Reconocer sus componentes por cromatografía en capa fina.
MATERIALES:
INSUMOS:
REACTIVOS:
 Vasos de precipitación
 Agua destilada.
 Placas de Sílica Gel
 Metanol
 Probetas
 Acetato de etilo
 Pipetas
 Placas de sílica gel
 Mortero con pistilo
 Cuchillo
EQUIPOS:
 Cámara Ultravioleta.
 Bomba de vacío
 Cámara de Extracción
 Baño María
MUESTRA:
Matriz vegetal: Una hoja de aloe vera (sábila)
INSTRUCCIONES:
0.5 g de látex amarillo se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5 minutos sobre un baño de agua. El filtrado se aplica
directamente sobre la placa cromatográfica.
Fase estacionaria: Sílica gel 60F -254
Fase móvil: Acetato de etilo: Metanol : Agua 100 : 13.5 : 10
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Reveladores: 1) Hidróxido de potasio 10% en etanol./ UV 365 nm

2) Poiietilénglicol PN/UV 365 nm
- Realice un cuadro para las distancias recorridas por las muestras:
Rf Principio activo Revelador Color
0.3 Aloinósido A y B 1y2 amarillo
0.47 Aloína 1y2 amarillo
0.95 Aloe-emodina 1 rojo
-- Aloesinas A y B 1 Azul fluorescente
- Obtenga el factor de retardo y compárelo bibliográficamente para determinar los componentes de la muestra.
- Realice el siguiente cuestionario:
Observación: anote las coloraciones observadas antes y después de revelar.
Con KOH las antraquinonas presentan coloración roja al visible y al UV-365 nm. Las antronas y antranoles presentan
coloración amarilla al visible y amarillo brillante al UV-365. Las diantronas no reaccionan.
CUESTIONARIO:
1. Indique las estructuras de los componentes de la muestra que han sido separados e identificados por su Rf específico.
2. Cuál es la polaridad del solvente utilizado en la separación por cromatografía en capa fina?
3. Cuál es la relación entre el solvente y los componentes separados.
4. Qué Reacción se produce entre el principio activo y cada uno de los reveladores?
5. De que está constituida la fase estacionaria? Y cuál es su interacción con los componentes de la muestra analizada?
CONCLUSIONES:
Se confirma la presencia de componentes fenólicos tipo antracénicos en la muestra de Aloe vera, conocido comúnmente como
sábila.
Además se confirma que se puede separar e identificar los componentes del Aloe vera mediante cromatografía en capa fina
usando una fase estacionaria y móvil específica.
RECOMENDACIONES:
Aplique solamente la cantidad adecuada de muestra sobre la placa de sílica gel.

La fase móvil debe ser preparada lo más exactamente posible para confirmar con los datos teóricos existentes en la bibliografía.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..


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Agricultura
PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA PREPARACIÓN Y EXTRACCIÓN CON SOXLETH DE ALCALOIDES DE MUESTRAS VEGETALES.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Las plantas contienen diferentes metabolitos secundarios utilizados básicamente para defenderse de sus depredadores dándoles
un sabor desagradable a su paladar, estos metabolitos se llaman Alcaloides.
Los alcaloides bases son solubles en los solventes orgánicos (éter, cloroformo y prácticamente insolubles en agua; sus sales por el
contrario, se disuelven bien en agua y son generalmente insolubles en los solventes orgánicos.
Las muestras, previas la extracción de los principios activos “alcaloides” se debe secar de preferencia a temperatura ambiente, y
luego debe ser triturada hasta obtener un polvo fino.
La extracción se realiza tratando la droga con un solvente orgánico polar o apolar previa la alcalinización con un álcali (amoniaco,
soda) que dependiendo del proceso puede ser por maceración o una extracción semi continua con soxleth y un proceso simple de
filtrado, condensación y concentración. Después iniciar la purificación mediante una extracción ácido base o bien haciendo actuar
un ácido (ácido clorhídrico o sulfúrico diluido) por pasajes sucesivos del alcaloide de la fase acuosa a la orgánica, después de
acidificación (Morelli, 1981).
Para la identificación de alcaloides se recalca el uso de cromatografía de capa fina o por reactivos específicos como son
Dragendorff, Mayer, Erhlich y Wagner (Luck, 1988).
OBJETIVOS:
 Preparar y extraer con soxleth los alcaloides presentes en las diferentes muestras vegetales.
 Elegir los solventes apropiados para obtener un extracto que contenga alcaloides
MATERIALES:
REACTIVOS: INSUMOS:
• Reactivo de Dragendorff • 1 balón de 500 mL
• Reactivo de Mayer • 1 manta de calentamiento
• Reactivo de Erhlich • 2 pinzas universales
• Reactivo de Wagner • 1 Erlenmeyer de 25 mL
Cloroformo • Tubos de ensayo
• Metanol • Gradilla
• Hidróxido de amonio • Pipetas pasteur
• Ácido clorhídrico • Equipo Soxleth
EQUIPOS:
• Equipo de reflujo.
• Equipo Soxleth
MUESTRA:
Muestra vegetal como: semillas, hojas, flores de plantas que se sospeche o sepa poseen alcaloides.
INSTRUCCIONES:
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DE LA VIDA
Las determinaciones se realizarán a partir de hojas de matrices vegetales, secadas a temperatura ambiente o máximo 40°C, trituradas
antes de someterse a los procesos de separación que se explicarán a continuación (Figura 1 y 2).
Monte el equipo, en el matraz redondo de 500 mL coloque 250 mL de metanol acidificado o Cloroformo (alcalinizado). Llene el cartucho
de celulosa con 5 g de muestra en polvo y colóquelo en la cámara de extracción. Caliente cuidadosamente hasta la ebullición del
solvente, cuyos vapores deberán condensarse en el refrigerante para caer sobre el material biológico, se considera que una gota por
segundo es en el condensado es idónea para la extracción. En el momento en que la cámara de extracción se llena con el solvente,
éste cae por diferencia de presiones al matraz. Este proceso se repite continuamente de tal manera que cada vez se extrae mayor
cantidad del principio activo. El número de descargas del extracto puede variar en función de la cantidad y calidad de la muestra,
suspenda el calentamiento cuando ya no observe coloración del destilado en la cámara de calentamiento, se dará por terminada la
extracción.
Al finalizar, desmonte el equipo, pase a un vaso de precipitados de 500 mL, por medio de decantación y filtración el extracto obtenido,
decante el solvente, concentre a presión reducida con ayuda del rotavapor, hasta que ya no tenga solvente, guarde el extracto para la
siguiente práctica.
Figura 1. Esquema de separación con solvente orgánico apolar en medio alcalino
Figura 2. Esquema de separación con solvente orgánico polar en medio ácido

PRUEBAS:
Reactivos:
• Reactivo de Dragendorff, está compuesto por tetrayodo bismuto de potasio, indica la presencia del alcaloide con la formación de un
precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona a la solución ácida que contiene los alcaloides.
• Reactivo de Mayer: (mercurio tetrayoduro de potasio) Los alcaloides se detectan como un precipitado blanco o de color crema soluble
en ácido acético y etanol.
• Reactivo de Erhlich: (p-dimetilamino benzaldehído) En presencia de alcaloides, se forma una coloración naranja. (Arango, G., 2008;
Navarro, 2002)
• Reactivo de Wagner: solución de yodo - yoduro de potasio. Con la mayoría de alcaloides forma un precipitado color café
Identificación de los componentes de la TLC.
Reporte el resultado de las reacciones positivas o negativas.

Los resultados serán reportados de la siguiente manera:
CODIGO: FRM.7.3.001 FECHA: 21-12-2018
DE LA VIDA
Pruebas cualitativas con reactivos cromogénicos:
Tabla 2. (-) ausencia del alcaloide, (+) poca presencia del alcaloide, (++) moderada presencia del alcaloide, (+++) elevada presencia del
alcaloide.
Reacción Capa orgánica Capa acuosa
1 - Dragendorff +++ +++
2 - Mayer - ++
3 - Erlich - -
4 - Wagner ++ +
CUESTIONARIO:
1. Qué criterios se deben tomar en cuenta para seleccionar un amuestra que contenga alcaloides?
2. Cuál es el fundamento de la extracción con Soxleth?
3. Para obtener un extracto que contenga los metabolitos a analizar, cómo se debe preparar a la muestra?
4. ¿cómo se puede descartar la muestra NO contiene alcaloides?
CONCLUSIONES:
Se confirma la presencia de metabolitos secundarios alcalinos “ALCALOIDES” presentes en las matrices vegetales, identificados
con reacciones de coloración sobre el extracto obtenido por extracción semi continua soxleth.
RECOMENDACIONES:
Durante el desarrollo de la práctica, tenga cuidado con el uso y manejo de los solventes, no descarte lo residuos hasta no estar
claro de la fase donde se encuentran los compuestos presentes en el medio correspondiente.
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

Nombre: Dra. Blanca Naranjo P. Nombre: Claudia Segovia PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez A.

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Agricultura
PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA PURIFICACIÓN DE ALCALOIDES ATRAVÉS DE UNA EXTRACCIÓN ÁCIDO –BÁSE DE UN EXTRACTO
PRÁCTICA: VEGETAL.
INTRODUCCIÓN:
Los alcaloides debido a la presencia del nitrógeno puede variar la solubilidad dependiendo de la disposición química del nitrógeno
pueden ser bases son solubles en los solventes orgánicos (éter, cloroformo y prácticamente insolubles en agua; sus sales por el
contrario, se disuelven bien en agua y son generalmente insolubles en los solventes en los solventes orgánicos.
Su purificación se base en este principio (Morelli, 1981) hasta obtener un extracto totalmente des pigmentado o con ausencia de
clorofila, para luego evaporar el solvente y obtener un extracto total de alcaloides. La identificación de alcaloides se usa los
reactivos específicos como son Dragendorff, Mayer, Erhlich y Wagner (Luck, 1988).
OBJETIVOS:
 Purificar los alcaloides de una matriz vegetal mediante una extracción ácido-base.
 Concentrar el extracto obtenido libre de clorofilas hasta obtener un concentrado total de alcaloides.
 Investigar la presencia de alcaloides en los concentrados vegetales por medio de pruebas químicas de coloración.
MATERIALES:
REACTIVOS: INSUMOS:
• Reactivo de Dragendorff • Vasos de precipitación
• Reactivo de Mayer • Embudos de separación
• Reactivo de Erhlich • Pinzas
• Reactivo de Wagner • 1 Erlenmeyer de 25 mL
• Cloroformo • Tubos de ensayo
• Metanol • Gradilla
• Hidróxido de amonio • Pipetas
• Ácido clorhídrico • Probetas
EQUIPOS:
• Plancha de calentamiento
• Rotavapor
MUESTRA:
Muestra vegetal como: semillas, hojas, flores de plantas se sospeche o sepa poseen alcaloides.
INSTRUCCIONES:
No olvide su muestra, su franela y una práctica.
Las determinaciones se realizarán a partir de hojas de matrices vegetales, secadas a temperatura ambiente o máximo 40°C, trituradas
antes de someterse a los procesos de separación que se explicarán a continuación (Figura 1 y 2).

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DE LA VIDA
Figura 1. Esquema de separación con solvente orgánico apolar en medio alcalino
Figura 2. Esquema de separación con solvente orgánico polar en medio ácido
PRUEBAS:
Reactivos:
CODIGO: FRM.7.3.001 FECHA: 21-12-2018
DE LA VIDA
Navarro, 2002)
Reporte el resultado de las reacciones positivas o negativas, los resultados se reportarán de la siguiente manera:
Tabla 2. (-) ausencia del alcaloide, (+) poca presencia del alcaloide, (++) moderada presencia del alcaloide, (+++) elevada presencia del alcaloide.
2 - Mayer - ++
3 - Erlich - -
4 - Wagner ++ +
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué otras pruebas se pueden aplicar para identificar alcaloides?
2. ¿Cuál es el fundamento de la purificación y para que se aplica?
3. ¿Por qué se aplica la extracción ácido base a los alcaloides y no a otras moléculas?
4. ¿Cómo se puede descartar las posibles reacciones falsas positivas?
CONCLUSIONES:
con reacciones de coloración generales.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

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PERIODO
LECTIVO:
PRÁCTICA:
TEMA DE LA
IDENTIFICACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES POR VARIAS TÉCNICAS ANALÍTICAS.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Las técnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos ácidos), de
combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados; estos ensayos preliminares
se pueden realizar en el laboratorio o en el campo. En la práctica, se utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como: la
solución de yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner), mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo de Mayer), tetrayodo bismuto
de potasio (reactivo de Dragendorff), solución de ácido pícrico (reactivo de Hager), ácido sílico túngtico (reactivo de Bertrand), p-
dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich); nitración de alcaloides (reacción de Vitali-Morin se usa para alcaloides en estado
base). Existen reactivos específicos que colorean ciertos grupos de alcaloides.
• el p-dimetilamino benzaldehido para los alcaloides del ergot del centeno
• el sulfato de cerio (IV) y amonio, diferencia los indóles (amarillo), los dihidroindóles (rojo) los β-anilino acrilatos (azul). 1% de
solución de sulfato de cerio y amonio en una solución al 85% de ácido fosfórico.
• el sulfato cérico ácido sulfúrico para los alcaloides esteroidales, esteroles y saponinas. Se satura una solución al 65% de ácido
sulfúrico con sulfato cérico, se calienta por 15 min a 120º
•el nitroprusiato de sodio y amoniaco para los alcaloides de la cicuta
• el sulfato de hierro y amónio para los alcaloides de la vinca
• los reactivos de percloruro férrico en medio clorhídrico para tropolonas y en medio perclórico para alcaloides de las Rauwolfias
• el reactivo de yodoplatinato para los alcaloides del opio (morfina y codeína da coloración gris azuloso y los otros color castaño).
• ciertos alcaloides de la quina (principalmente quinina y quinidina) tienen la propiedad de ser fluorescentes (λ 366 nm) en
presencia de un ácido oxigenado.
OBJETIVOS:
 Separar y aplicar procedimientos que permitan aislar los alcaloides de matrices vegetales
 Investigar los diferentes tipos alcaloides presentes en las matrices vegetales por medio de pruebas químicas de coloración y
cromatografía de capa fina, espectros de absorción.
 Elegir eluyentes adecuados teniendo en cuenta características del analito como la polaridad y la fuerza de elución.
MATERIALES:
REACTIVOS:
• Reactivo de Dragendorff
• Reactivo de Mayer
• Reactivo de Wagner INSUMOS:
• Metanol • 1 Erlenmeyer de 25 mL
• Cloroformo • Tubos de ensayo
• Hidróxido de Amonio • Gradilla
• Acetona • pipetas
• Tolueno • Vasos de precipitación
• Ácido Acético
• Acido Fórmico
• Acetato de etilo
CODIGO: FRM.7.3.001 FECHA: 21-12-2018
DE LA VIDA
EQUIPOS:
• Cámara cromatográfica
• Lámpara Ultravioleta
• Espectrofotómetro
MUESTRA:
Muestra vegetal como: semillas, hojas, flores de plantas se sospeche o sepa poseen alcaloides.
INSTRUCCIONES:
PRUEBAS:
Reactivos:
Navarro, 2002)
Identificación de los componentes de la TLC.
Utilizar la cámara UV para identificar los componentes de la muestra a longitud de onda corta y Larga (250 y 350nm). Marcar las
manchas observadas con un lápiz.
Revelar las placas utilizando el reactivo de Dragendorff y volver a observar
IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES. Buscar un método de análisis según la muestra que se esté analizando.
Ensayo cromatográfico
Tabla 1. Respuesta de las diferentes capas a cada una de las fases móviles aplicadas.
Capa acuosa alcalina Capa etérica
Fase móvil: (CHCl3: MeOH ) (9:1) Separación de algunos analitos (Rf) Retención de los analitos en la fase estacionaria (Rf)
Fase móvil : (Benceno : Acetona) Retención de los analitos en la fase Retención de los analitos en la fase estacionaria (Rf)
(7:3) estacionaria (Rf)

CODIGO: FRM.7.3.001 FECHA: 21-12-2018
DE LA VIDA
Reporte el resultado de las reacciones positivas o negativas.

Realice los cálculos de Rf.
Los resultados serán reportados de la siguiente manera:
Tabla 2. (-) ausencia del alcaloide, (+) poca presencia del alcaloide, (++) moderada presencia del alcaloide, (+++) elevada presencia del alcaloide.
2 - Mayer - ++
3 - Erlich - -
4 - Wagner ++ +
CUESTIONARIO:
1. Cuál es el principio de las reacciones de coloración entre los alcaloides y los reactivos cromogénicos?
2. Porqué se debe aplicar varias reacciones de coloración para confirmar la presencia de un alcaloide?
3. Todos los alcaloides reaccionarían de la misma manera con los reactivos de coloración?
CONCLUSIONES:
con reacciones de coloración así como con cromatografía en capa fina y factores de retardo y los espectros de absorción
correspondientes.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F:
…………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

CODIGO: FRM.7.3.001 FECHA: 21-12-2018

Scgdi505 - Guía para Las Prácticas de Laboratorio Septiembre 2019

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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS

GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO

 Extraer el aceite esencial utilizando métodos normalizados de extracción.

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

EQUIPOS: Cámara Ultravioleta

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

*Cromatografía en capa fina

8. FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO Y ANÁLISIS ESPECTRAL: Con el mejor eluyente seleccionado previamente,

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

1. Cuál es la relación de la fase móvil con la muestra a separar?

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

 Evaluar el contenido de compuestos fenólicos del extracto.

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

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VARIACIÓN DEL pH CON UNA SOLUCIÓN DE NaOH 0,1 N o NaHCO3

Medir el pH de la solución inicial, y realizar un barrido de absorción entre 250-650 nm,

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

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Reveladores: 1) Hidróxido de potasio 10% en etanol./ UV 365 nm

Aplique solamente la cantidad adecuada de muestra sobre la placa de sílica gel.

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

Figura 1. Esquema de separación con solvente orgánico apolar en medio alcalino

Figura 2. Esquema de separación con solvente orgánico polar en medio ácido

Reporte el resultado de las reacciones positivas o negativas.

Pruebas cualitativas con reactivos cromogénicos:

Reacción Capa orgánica Capa acuosa

1 - Dragendorff +++ +++

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

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Figura 1. Esquema de separación con solvente orgánico apolar en medio alcalino

Figura 2. Esquema de separación con solvente orgánico polar en medio ácido

1 - Dragendorff +++ +++

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F: ……………………………………………..

Revelar las placas utilizando el reactivo de Dragendorff y volver a observar

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

Reporte el resultado de las reacciones positivas o negativas.

1 - Dragendorff +++ +++

CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCVI-v3-2018-001 REV. UPDI: F.MORENO

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