Lilian Aparecida Colebrusco Rodas

Colonização e infecção experimental de

Lutzomyia longipalpis, para padronização da técnica
de PCR e identificação de Leishmania sp no vetor

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças
da Secretaria de Estado da Saúde de
São Paulo, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Pesquisas
Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Profa. Dra. Hermínia
Yohko Kanamura

SÃO PAULO/SP
2006
Dedico este trabalho à minha mãe Hilda e
ao meu pai Elyseu Rodas “in memoriam”,
que com sabedoria me mostraram o
caminho do respeito, carinho, amizade e
amor.
 AGRADECIMENTOS

Vários pesquisadores, colegas de trabalho, amigos e minha

querida família estiveram sempre comigo durante toda esta jornada.
Agradeço a todos pelo apoio incondicional.

À Profa. Dra. Hermínia Yohko Kanamura, do Programa de Pós

Graduação em Ciências da Coordenaoria de Controle de Doenças–CCD,
pela orientação, confiança e apoio.

Às funcionárias da Secretaria da Área de Concentração

Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública, Claydes de Quadros Zamboni,
Tirces Francine Guilherme Martins, e Líria Maria de Jesus Silva, pela
amizade e atenção em todos os momentos.

À Superintendência de Controle de Endemias e Coordenadoria de

Controle de Doenças-CCD, pela oportunidade oferecida, apoio
administrativo e financeiro.

À Profa. Dra. Caris Maroni Nunes, por possibilitar a realização da

padronização da Técnica de PCR no Laboratório de Bioquímica e Biologia
Molecular da Unesp-Araçatuba, pelo fornecimento dos insumos e pela
inestimável contribuição no desenvolvimento do trabalho, na interpretação
dos resultados, além do carinho e apoio em todos os momentos.

Ao estagiário do Laboratório de Bioquímica e Biologia Animal da

UNESP-Araçatuba, Juliano Rodrigues Sangalli e Henrique Borges de Paula,
pela realização das PCRs e aos demais estagiários e funcionários pela
amizade e atenção.

Aos Médicos Veterinários Fábio Varoni Pereira e Maria Esther

Gonçalves, pela colaboração nas atividades de padronização da técnica de
PCR.

Ao Prof. Dr. Reginaldo Peçanha Brazil e Dra. Beatriz Brazil, do

Instituto René Rachou, pela orientação quanto às técnicas de colonização de
flebotomíneos e à equipe de estagiárias, pelo carinho e acolhida.

Ao Dr. Paulo Pimenta, Dra. Nágila Secundino e Kenya Borges de

Paula, do Instituto René Rachou, pela receptividade e ensinamentos
transmitidos para a realização da infecção experimental dos flebotomíneos.

Às Médicas Veterinárias, Dra. Andréa Maria Andrade, Dra. Elza

Aparecida Silva Ribeiro Carvalho e à Silvana Rodrigues Alves, do Centro de
Controle de Zoonoses de Araçatuba, pela colaboração nos experimentos de
infecção experimental dos flebotomíneos.
 À Dra. Valéria Marçal Felix de Lima do Departamento de Clínica,
Cirurgia e Reprodução Animal do Curso de Medicina Veterinária – Unesp –
Araçatuba, pelo fornecimento das amostras de Leishmania chagasi e do
hamster infectado.

À amiga de todas as horas, Dra. Vera Lúcia Fonseca de

Camargo-Neves, pela oportunidade da realização deste e de vários
trabalhos, pelo estímulo, orientação, dedicação, amizade, além do apoio
técnico e administrativo.

Às colegas de trabalho e amigas do Laboratório de Leishmaniose

da SUCEN-Araçatuba, Neusa Fernandes Chierici e Ana Gláucia Guiatti
Xisto, pelo apoio, amizade e dedicação durante todo o desenvolvimento do
trabalho e especialmente pelo cuidado com a nossa colônia de
flebotomíneos.

À equipe de Apoio a Pesquisa, Osvaldo Rodrigues Pereira,

Matilde Olímpio Ribeiro, Elizabeth Maria Bini, Sílvia Valéria Marchette,
Jurandir Silva Cordeiro e Francisco de Carvalho (in memoriam), pela
realização das capturas de flebotomíneos.

À colega de trabalho e amiga, Rosemari Suto, pelo apoio

administrativo e incentivo em todos os momentos.

Ao colega de seção pela colaboração na apropriação dos dados

Wilson Alves Pereira Júnior.

Ao Diretor Técnico do Serviço Regional – 09 – Araçatuba, Clóvis

Pauliquévis Júnior, pelo apoio administrativo e amizade.

À Educadora de Saúde e amiga, Clélia Moreira Martinelli, pelo

incentivo, carinho e apoio em todos os momentos.

A todos os funcionários da Superintendência de Controle de

Endemias, que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste
trabalho.

Aos membros da Banca de Qualificação, Dra. Eunice Galati, Dra.

Vera Chiocolla e Dra. Rita Maria da Silva, pelas sugestões e valiosa
contribuição.

Finalmente, à minha querida família, por estarem sempre ao meu

lado, nos dias atropelados, nas idas e vindas a São Paulo, na falta de tempo,
enfim, obrigada por tudo, pelo amor e dedicação de todos vocês, Mãe,
Marcos, Dri, Sérgio, Gô, Eliseuzinho, meus amados filhos Helinho, Jô e
Chico, como vocês são importantes para que eu tenha força e vontade de
caminhar sempre na procura de um mundo bem melhor, amo vocês.
 RESUMO

Rodas LAC. Colonização e infecção experimental de Lutzomyia

longipalpis, para padronização da técnica de PCR e identificação de
Leishmania sp no vetor. São Paulo, 2006 [Tese - Mestrado – Coordenadoria
de Controle de Doenças da Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo].

No período de 1999 a agosto de 2005, 54 óbitos e 462 casos

humanos de leishmaniose visceral americana foram confirmados na região
de Araçatuba, noroeste do Estado de São Paulo, onde a enzootia canina
está presente em 31 municípios. Frente ao agravamento desta situação, a
identificação da taxa de infecção dos flebotomíneos é um parâmetro
importante para a priorização das áreas a serem trabalhadas. O presente
estudo teve como objetivos: padronizar e avaliar a técnica da reação em
cadeia pela polimerase (PCR) para identificar flebotomíneos
experimentalmente infectados por Leishmania chagasi, bem como
estabelecer e manter a colônia de Lutzomyia longipalpis; infectar
experimentalmente exemplares de Lu. longipalpis; definir a sensibilidade da
PCR para detecção da L. chagasi e comparar a microscopia direta do trato
digestivo e a PCR para detecção e identificação de flebotomíneos
experimentalmente infectados por L. chagasi. Para a extração de DNA foi
utilizado o método fenol/clorofórmio, após digestão prévia com proteinase K.
A partir de uma sequência que codifica para a região 28S ribossomal de Lu.
longipalpis, oligonucleotídeos foram desenhados utilizando-se o programa
Primer 3®. Exemplares F1 de Lu. longipalpis, obtidos de colônia, foram
contaminados artificialmente com diluições seriadas, na base 10, de formas
promastigotas de L. chagasi mantidas em cultura e exemplares de
flebotomíneos, capturados em campo, foram infectados experimentalmente
por formas amastigotas e promastigotas de L. chagasi. Para a amplificação
de fragmento de DNA de cinetoplasto de Leishmania sp foram utilizados
oligonucleotídeos iniciadores descritos por Rodgers et al. (1990). A PCR
padronizada para identificação de Lu. longipalpis resultou em amplificação
de um fragmento de DNA de 370 pares de bases (pb). Quanto aos
exemplares de Lu. longipalpis contaminados com as formas flageladas de L.
chagasi, quando submetidos à técnica de PCR, observou-se a presença de
fragmento de 120 pb em todas diluições testadas, bem como nos
exemplares infectados experimentalmente, demonstrando-se a
potencialidade desta ferramenta na detecção de flebotomíneos infectados.

Palavras-chave: leishmaniose visceral, Psychodidae, insetos

vetores, experimentação animal, infecções por protozoário, reação em
cadeia da polimerase.
 ABSTRACT

Experimental colonization and infection of Lutzomyia longipalpis for

standadrdization of PCR technique and identification of Leishmania sp in the
vector
During the period of 1999 to August 2005, 54 deaths and 462 human cases
of American visceral leishmaniasis were confirmed in the Araçatuba region,
at the northwest of the São Paulo State, where the canine enzootic disease
is present in 31 cities. Facing the aggravation of this situation, the
identification of the phlebotomine infection rates can be an important
parameter to prioritize the areas to be worked. The present work has as
objectives: to standardize and evaluate the polimerase chain reaction (PCR)
to identify phlebotomine sandflies experimentally infected with Leishmania
chagasi, as wel as to establish the Lutzomyia longipalpis colony; to
experimentally infect Lu. longipalpis exemplars; to define the sensitivity of the
PCR for detention of L. chagasi and to compare the direct microscopy of the
digestive tract and the PCR for detention and identification of phlebotomine
sandflies experimentally infected with L. chagasi. DNA was extracted by
phenol/chloroform method, after previous digestion with proteinase K. Based
on the sequence that codifies for the Lu. longipalpis 28S ribosomal region,
primers were designed using the Primer 3® Program. F1 exemplars from the
Lu. longipalpis colony were artificially contaminated with serial dilutions of L.
chagasi promastigote culture forms and field-captured flebotomine samples
were experimentally infected by amastigote and promastigote forms of L.
chagasi. Primers described by Rodgers et al. (1990) were used for the
amplification of a DNA fragment of Leishmania sp kinetoplast. The PCR
standardized for identification of Lu. Longipalpis resulted in the amplification
of a 370 bp DNA fragment. When Lu. longipalpis exemplars contaminated
with the L. chagasi flagellate forms were submitted to PCR a 120 bp DNA
fragment was obtained in all tested dilutions, as well as in the experimentally
infected samples, demonstrating the potential of this tool for detection of L.
chagasi infected phlebotomine vectors.
Key words: visceral leishmaniasis; Psychodidae, insect vectors, animal
experimentation, protozoan infections, polimerase chain reaction.
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

µL microlitro
DNA Ácido desoxirribonucleico
ELISA Ensaio imunoenzimático
F1 primeira geração
kDNA DNA do cinetoplasto
LPG lipofosfoglicana
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana
LVA Leishmaniose Visceral Americana
PCR Reação em Cadeia pela Polimerase
RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta
RNA Ácido ribonucléico
SST solução salina tamponada
NNN meio de cultivo de Novy & Mc Neal (1904) e Nicolle
(1908)
Pb pares de base
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
TE Tampão Tris-EDTA
TBE Tampão Tris-Borato-EDTA
 LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 - Peridomicílios com características favoráveis à proliferação de Lu.

longipalpis......................................................................................................49

Figura 2 - Aspirador manual..........................................................................50

Figura 3 - Armadilha elétrica modelo CDC modificado..................................50

Figura 4 - Acondicionamento de Lu. longipalpis capturados em campo para

transporte até o laboratório............................................................................51

Figura 5 - Potes de individualização de fêmeas de Lu. longipalpis: (A) Pote

de polietileno de 4,5 cm de diâmetro por 4,0 cm de altura (B) Caixas
plásticas para acondicionamento dos potes individuais................................52

Figura 6 - Potes de criação: (A) Pote de polietileno de 7,0 cm de diâmetro

por 8,5 cm de altura (B) Interior do pote de criação revestido com gesso
umedecido (C) Potes de criação acondicionados em caixa plástica.............52

Figura 7 - Interior do Pote de criação revestido com gesso umedecido e

ração larval para o desenvolvimento das diferentes formas: (A) Ovos (B)
Larvas L1 (C) e (D) Larvas L3 e L2 (E) Pupa (aumento 10x)........................53

Figuras 8 - Alimentadores artificiais: (A) Três unidades (B) Uma unidade

revestido por pele de pinto (Gallus gallus), contendo as formas de L. chagasi
(C) Três unidades contendo as formas de L. chagasi, acoplados aos potes
contendo exemplares de Lu. longipalpis para repasto..................................54

Figura 9 - Número de fêmeas de Lu. longipalpis capturadas em campo nos

anos: (A) 2003 (B) 2004...............................................................................60

Figura 10 - Número de ovos e alados F1 de Lu. longipalpis, produzidos a

partir de fêmeas capturadas no campo, nos anos de 2003 (A) e 2004 (B),
nos diferentes potes de criação (Dados numéricos Tabela A - Apêndice)....61

Figura 11 - Rendimento em oviposição das fêmeas de Lu. longipalpis

capturadas no campo, nos anos de 2003 (A) e 2004(B), nos diferentes potes
de criação. (Dados numéricos Tabela B - Apêndice)....................................62

Figura 12 - Tempo (dias) de desenvolvimento de cada fase do ciclo de Lu.

longipalpis, em condições laboratoriais, nos anos de 2003 (A) e 2004 (B).
(Dados numéricos Tabela C e D - Apêndice)................................................63

Figura 13 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA extraído segundo protocolo de
Cabrera et al. (2002): (A) com iniciadores para Lutzomyia sp e (B) com
iniciadores para Leishmania sp (1 a 7) = Tubos contendo um flebotomíneo e
diferentes quantidades de formas promastigotas, como segue: (1) 104, (2)
103, (3) 102, (4) 101, (5) 100, (6) 10-1, (7)10-2 ; (C+) Controle com L. chagasi;
(C) controle sem DNA; (M) = marcador de peso molecular em escada de
100pb.............................................................................................................64

Figura 14 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de kinetopalsto de Leishmania sp
extraído segundo protocolo de Michalsky et al. (2002): (A) com iniciadores
para Lutzomyia sp e (B) com iniciadores para Leishmania sp (1 a 7) = Tubos
contendo um flebotomíneo e diferentes quantidades de formas
promastigotas, como segue: (1) 104, (2) 103, (3) 102, (4) 101, (5) 100, (6) 10-1,
(7)10-2 ; (C+) Controle com L. chagasi; (C) = controle sem DNA; (M) =
marcador de peso molecular em escada de 100pb.......................................65

Figura 15 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 370 pares de base de Lu.
longipalpis. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb; (C+) =
controle positivo; (1 a 15) = exemplares de flebotomíneos submetidos ao
experimento de infecção experimental por formas amastigotas de
Leishmania sp; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados
numéricos Tabela E – Apêndice; 1 a 15 corresponde aos exemplares
identificados por A3 a A17)............................................................................66

Figura 16 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 370 pares de base de Lu.
longipalpis. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb; (C+) =
controle positivo; (1 a 4) = exemplares de flebotomíneos submetidos ao
experimento de infecção experimental por formas amastigotas de
Leishmania sp; (5 A 16) = exemplares de flebotomíneos coletados em
campo; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA......................................67

Figura 17 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 16) = exemplares de flebotomíneos coletados
em campo; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados numéricos
Tabela F – Apêndice; 1 a 16 corresponde aos exemplares identificados por
C9, 13, 15, 16, 20, 21, 23, 24, 26, 27 a 33)...................................................68

Figura 18 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 13) = exemplares de flebotomíneos submetidos
ao experimento de infecção experimental por formas amastigotas de
Leishmania sp; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados
numéricos Tabela E – Apêndice; 1 a 13 corresponde aos exemplares
identificados por A1 a A13)............................................................................69
Figura 19 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de
prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 15) = exemplares de flebotomíneos submetidos
ao experimento de infecção experimental por formas promastigotas de
Leishmania sp; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados
numéricos Tabela G – Apêndice; 1 a 15 corresponde aos exemplares
identificados por P 23 a 37)...........................................................................70

Figura 20 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 14) = exemplares F1 de flebotomíneos de
colônia controlada com repasto em hamster infectado por Leishmania
chagasi; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados numéricos
Tabela H – Apêndice; 1 a 14 corresponde aos exemplares identificados por
F1 a F14).......................................................................................................71

Tabela 1 - Resultados do exame parasitológico de exemplares fêmeas de

flebotomíneos submetidos aos experimentos de infecção de Lu. longipalpis
em condições laboratoriais, realizados através de repasto em cão infectado
com L. chagasi (experimentos 1 a 5), com alimentadores artificiais contendo
formas amastigotas de L. chagasi (experimentos 6 e 7) e com alimentadores
artificiais contendo formas promastigotas de cultura (experimento 8)..........72

Tabela 2 - Resultados do exame parasitológico e de PCR para detecção de

Leishmania sp de flebotomíneos coletados no campo ou produzidos em
laboratório e submetidos ou não aos experimentos de infecção com L.
chagasi .........................................................................................................73

Tabela 3 - Comparação entre os resultados dos métodos parasitológico e

PCR na totalidade dos exemplares estudados, incluindo-se os submetidos à
infecção experimental e coletados em campo...............................................74

Tabelas do Apêndice

Tabela A - Número de exemplares das diferentes fases evolutivas de Lu.

longipalpis, produzidas em laboratório a partir de fêmeas coletadas em
campo, nos anos de 2003 e 2004.

Tabela B - Número de exemplares fêmeas de Lu. longipalpis, com

oviposição e porcentagem em relação ao número de fêmeas coletadas em
campo e número médio de ovos por fêmea, nos anos de 2003 e 2004.

Tabela C - Tempo de desenvolvimento de cada fase evolutiva de Lu.

longipalpis em condições de laboratório, no ano de 2003.
Tabela D - Tempo de desenvolvimento de cada fase evolutiva de Lu.
longipalpis em condições de laboratório, no ano de 2004.

Tabela E - Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares

de flebotomíneos submetidos ao experimento de infecção experimental por
formas amastigotas de Leishmania chagasi.

Tabela F - Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares

de flebotomíneos coletados em campo.

Tabela G - Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares

de flebotomíneos submetidos ao experimento de infecção experimental por
formas promastigotas de Leishmania chagasi.

Tabela H - Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares

de flebotomíneos F1 submetidos ao experimento de infecção experimental
por Leishmania chagasi.
 ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO 15

1.1 O vetor 20
1.2 Agente etiológico 25
1.3 Interação Leishmania sp – Hospedeiro invertebrado 26
1.4 Estabelecimento de colônias de flebotomíneos 27
1.5 Reservatórios 29
1.6 Diagnóstico Laboratorial da LVA 32
1.7 Biologia Molecular aplicada ao estudo da LVA 33

2. OBJETIVOS 37

3. MATERIAL E MÉTODO 38

3.1 Capturas de flebotomíneos com aspiradores manuais 38

3.2 Manutenção da colônia de Lutzomyia longipalpis 39
3.3 Infecção experimental de flebotomíneos por Leishmania chagasi 40
3.3.1 Infecção experimental através de repasto sanguíneo em cães 41
3.3.2 Infecção experimental através de alimentadores artificiais 42
3.3.3 Infecção experimental através de repasto sanguíneo em hamster 43
3.4 Cultivo de Leishmania chagasi 44
3.5 Identificação da infecção por Leishmania chagasi
por microscopia do trato digestivo de Lutzomyia longipalpis 44
3.6 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) 45
3.6.1 Extração de DNA 45
3.6.1.1 Extração de DNA segundo Michalsky et al. (2002) 46
3.6.1.2 Extração de DNA segundo Cabrera et al. (2002) 47
3.6.2 Iniciadores 47
3.6.3 Condições da reação de PCR 48
3.6.4 Eletroforese em gel depoliacrilamida 48
4. RESULTADOS 55

4.1 Colonização de Lutzomyia longipalpis 55

4.2 Infecção experimental de flebotomíneos por Leishmania
chagasi e observação da positividade por microscopia 56
4.3 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) 57
4.3.1 Amplificação de fragmento de DNA de Lutzomyia sp 57
4.3.2 Avaliação do limiar da PCR para detecção de DNA em
Leishmania sp em flebotomíneo 58
4.3.3 Detecção de Leishmania sp através do parasitológico e PCR,
nos diferentes grupos de Lutzomyia longipalpis (vide item 3.6.1) 58

5. DISCUSSÃO 75

6. CONCLUSÕES 83

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 84

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 85

9. ANEXOS 96

10. APÊNDICE 102

 1. INTRODUÇÃO

A leishmaniose visceral americana (LVA) apresenta-se como um

importante problema de saúde pública, tanto pela incidência, gravidade dos
casos, alta mortalidade como principalmente pelo poder de expansão
verificado nestas últimas décadas.

A LVA deixou de ser característica de ambientes rurais e

periurbanos. Observa-se claramente a mudança no padrão de transmissão
da doença; até a década de 90, a Região Nordeste era responsável por
cerca de 90% dos casos notificados, hoje os dados mostram a
periurbanização e urbanização da doença, com a ocorrência de casos em
grandes centros urbanos como: Rio de Janeiro (RJ), Corumbá (MS), Belo
Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Palmas (TO), Três Lagoas (MS), Campo
Grande (MS), entre outros (Ministério da Saúde, 2003).

A doença só não ocorre na Região Sul, sendo o Nordeste ainda

hoje a Região mais afetada, com 77% das notificações. A média anual dos
casos no país nos últimos dez anos foi de 3.156 casos e a incidência de dois
casos/ 100.000 habitantes, com 54,4% de ocorrência em crianças menores
de dez anos e 41% dos casos registrados em menores de cinco anos
(Ministério da Saúde, 2003).

Lainson e Shaw (1971) verificaram a distribuição da doença por

quase todo o país, ocorrendo em ambientes com características geográficas,
de vegetação, climáticas e sociais tão diversos, desde regiões semi-áridas
do Nordeste com secas frequentes, a regiões com alta pluviosidade.
Portanto constatamos o poder de adaptação dos elementos envolvidos no
ciclo de transmissão, bem como o grande desafio no controle desta
enfermidade.

Acredita-se que o processo migratório das populações carentes

para as periferias das grandes cidades e a degradação ambiental, como
conseqüência à falta de infra-estrutura adequada, propiciaram a adaptação

15
do vetor à zona urbana, com o cão assumindo o papel de principal
reservatório (Ministério da Saúde, 2003).

Na década de 50, observações feitas na zona norte do Ceará

mostraram dois reservatórios importantes: a raposa Lycalopex vetulus e os
cães domésticos (Deane e Deane, 1954). Em Belém, no Pará, outra espécie
de raposa, Cerdocyon thous, aparentemente sadia, foi encontrada
parasitada por Leishmania sp (Lainson e Shaw, 1969) e mais recentemente,
já na década de 90, quando a reação de imunofluorescência indireta foi feita
em cinco canídeos silvestres (Cerdocyon thous) da região de Araçatuba,
Estado de São Paulo, a reação foi positiva em um deles (Tolezano et al.,
1999).

No Estado de São Paulo, no período de 1999 a agosto de 2005,

462 casos humanos foram confirmados em 21 municípios da região de
Araçatuba, com 54 óbitos distribuídos por 11 municípios da mesma região
(Secretaria Estadual da Saúde, Vigilância Epidemiológica DIR VI). O
município de Araçatuba, sede de DIR, concentra até então 42,2% dos casos
e a enzootia canina ocorre em 33 municípios, onde a presença do vetor Lu.
longipalpis só não foi confirmada em quatro destes (Gabriel Monteiro, Nova
Luzitânia, Sud Mennucci e Suzanápolis).

Na década de 1970, na grande São Paulo, foi levantada a

suspeita de transmissão autóctone de LVA (Iverson, 1983), porém após
investigação epidemiológica não foi constatada a presença do vetor ou de
fontes de infecção nos locais investigados, portanto a LVA não constava, até
1998 entre as doenças de transmissão autóctone no Estado de São Paulo,
os casos diagnosticados sendo todos importados de outras regiões
endêmicas. Após a detecção do vetor em área urbana do município de
Araçatuba, região noroeste do Estado (Costa et al., 1997), a identificação do
agente L. chagasi em cães do município em 1998 e o aparecimento de
casos humanos em 1999, várias atividades foram implementadas pelos
órgãos competentes, para entender melhor esta nova situação
epidemiológica.

16
 Foram realizadas pesquisas entomológicas em domicílios da área
urbana de Araçatuba com a constatação de 10,2% de positividade dos
imóveis para a presença de Lu. longipalpis e o encontro deste vetor em mais
cinco municípios da região: Andradina, Valparaíso, Guararapes, Santo
Antônio do Aracanguá e Auriflama. Também foi realizado inquérito canino
através da reação de imunofluorescência indireta em 423 cães, com 14,4%
de positividade e a identificação do agente etiológico através de técnicas
moleculares, onde foi constatado L. chagasi em 10 cães com sintomatologia
clínica (Galimbertti et al., 1999).

Depois da estruturação de um Programa de Controle da LVA no

Estado de São Paulo em 1999, com o objetivo de reduzir a morbimortalidade
humana, medidas de controle foram implementadas através de um trabalho
interinstitucional.

Inquéritos caninos focais, realizados nos municípios desta região,

demonstraram uma variação da taxa de prevalência de 1% a 25,5% nos
municípios de Coroados e Avanhandava respectivamente, bem como a
ocorrência desta zoonose em mais 23 municípios. Em Araçatuba, no ano de
2000, a variação da prevalência foi de 4,1% a 25,8% nas diferentes
localidades investigadas, com uma média de 12,1%. As taxas mais altas da
prevalência canina foram coincidentes com os índices de casas positivas
para Lu. longipalpis mais elevados. Dos 78 municípios investigados quanto a
presença do vetor, 23,1% foram positivos, sinalizando a importância da
implantação de indicadores entomológicos para a análise de risco, bem
como a necessidade da melhoria no critério diagnóstico da LVA em cães e
humanos (Katz et al., 2000).

Verifica-se, portanto a grande capacidade de expansão desta

doença e a dificuldade de operacionalização das medidas de controle,
fundamentadas no tratamento dos casos humanos, eliminação dos cães
sorologicamente positivos além da borrifação das casas em um raio de 200
metros em torno dos casos humanos e nas localidades com prevalência
canina maior do que 1%.

17
 Camargo-Neves et al. (2001) buscaram detectar um padrão de
distribuição da LVA a fim de propor medidas preventivas, utilizando-se de
ferramentas de análise espacial. O geo-referenciamento dos dados mostrou
uma correlação entre os setores com alta prevalência canina e ocorrência de
casos humanos, além de sinalizar as regiões de maior risco de ocorrência da
doença. Verificou-se uma distribuição focal do vetor, onde alguns domicílios
foram os responsáveis pela produção de um grande número de
flebotomíneos.

Posteriormente, um estudo dos fatores relacionados ao meio

ambiente na distribuição de Lu. longipalpis, no município de Araçatuba,
confirmou a associação entre maior densidade do vetor e ocorrência de
degradações ambientais, com habitações inadequadas, acúmulo de matéria
orgânica de origem vegetal e presença de animais domésticos; o estudo
apontou as áreas críticas onde as medidas educativas e de saneamento
deveriam ser priorizadas (Camargo-Neves et al., 2004).

Frente à complexidade desta nova situação, faz-se ainda

necessário identificar parâmetros relativos ao vetor e um destes parâmetros
refere-se à taxa de infecção destes flebotomíneos. Estes dados seriam com
certeza de grande valor epidemiológico bem como norteariam os trabalhos
na priorização de áreas a serem borrifadas.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde os critérios mais

importantes para a identificação de vetores são: o vetor deve picar o homem,
portanto ser antropofílico, picar o hospedeiro ou os hospedeiros
reservatórios, deve transmitir o parasita através da picada e sua distribuição
geográfica deve ser coincidente com a da doença, em estado natural deve
estar infectado pelas mesmas leishmânias que o homem, portanto a
identificação das leishmânias nos flebotomíneos é essencial para avaliar sua
participação na transmissão da leishmaniose para o homem (WHO1990).

Uma das primeiras estratégias para diagnóstico da leishmaniose

foi o método parasitológico, quando Vianna (1911) identificou o protozoário
no raspado de lesões ulcerativas corado pelo Giemsa.

18
 A identificação deste agente no inseto geralmente é feita a partir
do encontro das formas promastigotas (flageladas) no intestino médio do
vetor associado ou não ao posterior cultivo in vitro do protozoário. O
problema mais comumente associado à identificação do protozoário é a
contaminação das culturas e a infecção por formas flageladas não
identificáveis. Estes métodos são trabalhosos e demorados, uma vez que há
necessidade de dissecar vários exemplares de insetos para confirmar a
infecção, além da detecção de uma baixa taxa de infecção natural.

Rodriguez et al. (1999), obtiveram 2,2% de infecção natural por

formas flageladas de L. braziliensis no exame parasitológico, estes mesmos
autores citam Pifano (1940) que trabalhando com Lu. panamensis relata
11,11% de infecção por estas formas. Em um foco de leishmaniose visceral
em São Luis do Maranhão a taxa de infecção natural de Lu. longipalpis
encontrada foi de 1,8% (Brazil et al., 1984).

Por sua eficácia e sensibilidade, a utilização de técnicas

moleculares, como a reação em cadeia pela polimerase (PCR), tem
permitido avanços na entomologia médica, pois além de ser relativamente
rápida permite diferenciar espécies e subespécies do gênero Leishmania
(Harris et al., 1998).

Portanto, o uso da PCR para a detecção e identificação de

leishmânia em insetos vetores, com certeza, é uma ferramenta útil para o
Programa de Controle da LVA. A possibilidade da automatização desta
técnica permitiria reduzir o número de resultados inespecíficos na
identificação de flebotomíneos infectados, agilizaria e aumentaria a
produtividade, identificando áreas prioritárias para as intervenções e
direcionando as medidas de controle.

19
 1.1 O vetor

Flebotomíneos são dípteros pertencentes à família Psychodidae,

subfamília Phlebotominae. São insetos de pequeno porte, medindo de 2 a 3
mm, com o corpo revestido de intensa pilosidade. Apresentam as fases de
ovos, larvas, com quatro estadios, pupas e alados no seu ciclo de vida.
Tanto os machos como as fêmeas alimentam-se de sucos vegetais, mas
somente as últimas são hematófagas, necessitando de pelo menos um
repasto sanguíneo para a produção e amadurecimento dos ovos (Forattini,
1973).

Ready (1979) mostrou que a quantidade e composição do

repasto, feito pela Lu. longipalpis, foram os principais fatores de influência na
oviposição, sendo o número de ovos produzidos dependente da quantidade
de sangue ingerida.

Uma característica dos flebotomíneos é apresentar concordância

gonotrófica, porém em um trabalho feito numa floresta tropical do Oceano
Pacífico, na entrada do Canal do Panamá, observou-se que um grande
número das fêmeas pertencentes às 12 espécies mais comuns da área (Lu.
vespertilionis, Lu. carpenteri, Lu. panamensis, Lu. trapidoi, Lu. ovallesi, Lu.
olmeca bicolor, Lu. camposi, Lu. pessoana, Lu. sanguinaria, Lu. gomezi, Lu.
dysponeta e Lu. trinidadensis) que foram coletadas em armadilhas,
impregnadas com óleo mineral e distribuídas ao redor de gaiolas com
diferentes animais, para avaliação da preferência alimentar, estavam
grávidas, mostrando a necessidade de um segundo repasto antes da
oviposição, (Christensen et al., 1980). Este dado é de grande importância
epidemiológica se comprovado para as espécies de importância médica.

Segundo Brazil e Gomes Brazil (2003) o repasto sanguíneo nos

insetos hematófagos é facilitado pela ação da saliva, que atua inibindo os
mecanismos de homeostasia do hospedeiro, induzindo a vasodilatação e a
inibição da coagulação sanguínea. Este repasto normalmente ocorre depois
de 48 horas da emergência das fêmeas, podendo ocorrer até depois de 24

20
horas, dependendo do endurecimento das peças bucais e amadurecimento
das glândulas salivares.

Cada fêmea põe de 40 a 70 ovos por desova, que ficam aderidos

ao substrato graças à substância produzida pelas glândulas acessórias, que
pode atuar como hormônio de oviposição. Em condições ideais de
temperatura, que está entre 25˚C e 27˚C, e elevada umidade relativa do ar, o
período de incubação é de aproximadamente uma semana (Forattini, 1973).
Os ovos são extremamente sensíveis à falta de umidade, não resistindo à
dessecação por 48 horas (Sherlock e Sherlock, 1959).

Também as larvas necessitam de ambiente úmido, porém não

resistem ao excesso de umidade, em torno de 100%. Quanto à temperatura,
acima de 34˚C é prejudicial, aumentando a mortalidade. As larvas de
estadios mais evoluídos são mais resistentes, podendo sofrer uma parada
no seu desenvolvimento caso as condições climáticas não sejam favoráveis
(Sherlock e Sherlock, 1959; Forattini, 1973). O desenvolvimento da fase
larval é em média de duas semanas, dependendo dos fatores climáticos e
da alimentação.

As pupas se desenvolvem em aproximadamente uma ou duas

semanas, e são mais resistentes às variações de umidade, não se
locomovem e nem se alimentam.

As formas imaturas são encontradas no solo, a aproximadamente

5 cm da superfície, raramente chegando a 10 cm. A umidade, ausência de
iluminação direta, presença de matéria orgânica em decomposição de
origem vegetal e/ou restos de fezes de animais, constituem fatores
imprescindíveis para o desenvolvimento destas formas, portanto são estes
os locais preferenciais para a oviposição das fêmeas de flebotomíneos.
Forattini (1973) ressalta ainda as tocas de animais, buracos no solo e
ambientes rochosos, entre as pedras, fendas e grutas.

Estes psicodídeos pertencem ao grupo de insetos bastante

primitivos, apresentando como características, o pequeno porte, pernas
longas e pouco funcionais, reduzido poder de vôo e pequena espessura da

21
cutícula, fazendo com que estes dípteros sejam bastante sensíveis às
mudanças climáticas do meio ambiente, principalmente quanto ao teor de
umidade. Portanto as formas aladas permanecem nos locais de abrigo
durante o dia, protegidos das variações climáticas, só saindo para a
realização do repasto sanguíneo, que se dá após o crepúsculo e durante a
noite, quando as condições macroclimáticas se tornam igualmente
satisfatórias (Forattini, 1973).

Pouco se conhece com relação à dispersão destes insetos em

natureza. Alexander (1987), trabalhando com marcação e recaptura na
Colômbia, relata que a maior distância percorrida foi de 163 metros por uma
fêmea de Lu. shannoni, com um grande número de exemplares
recapturados a 100 metros do ponto de partida. Segundo Morrison et al.
(1993b), em um foco de LVA na Colômbia, tanto os machos como as fêmeas
não se afastam muito dos seus criadouros, a maioria se desloca cerca de
250m, podendo alcançar até 1 km de distância do seu abrigo.

O poder de adaptação destes dípteros a ambientes modificados

pela ação do homem foi demonstrado pelo encontro de doze espécies
diferentes de flebotomíneos, tanto dentro das casas quanto no peridomicílio,
entre elas: Lu. intermedia (60,1%), Lu. migonei (37,5%), Lu. longipalpis
(1,1%) em Vargem Grande, município do Rio de Janeiro, no período de
junho de 1984 a maio de 1985 (Rangel et al.,1986).

Gomes et al. (1982) também relatam a capacidade de Lu.

intermedia, sensu latu, de se abrigar em ecótopos artificiais, trabalhando
com galinheiro experimental em Pariquera- Açú, Estado de São Paulo.

Atualmente na área urbana de Araçatuba e em mais 33

municípios da região oeste do Estado de São Paulo, Lu. longipalpis é
encontrada tanto no peridomicílio como no intradomicílio, mostrando a
urbanização da doença.

Em um levantamento entomológico realizado neste município, em

1999, de 565 imóveis pesquisados para verificar a presença do vetor, 10,2%
foram positivos para Lu. longipalpis. Dentre as coletas positivas, a relação

22
encontrada foi de 1,3 fêmeas e 5,0 machos por imóvel (Galimbertti et al.,
1999).

Com relação à preferência alimentar, as espécies neotropicais

picam com muita avidez o homem, o cão, as aves e outros animais, sendo
Lu. longipalpis um bom exemplo (Brazil e Gomes Brazil, 2003).

Este fato foi comprovado por Camargo-Neves et al. (2002), onde

de um total de 288 fêmeas ingurgitadas, capturadas no município de
Araçatuba, testadas quanto ao hábito alimentar através da técnica de
precipitina, observou-se que das reações que reagiram com os antisoros,
1,04% reagiu para sangue humano, 37,85% para sangue de cão e 4,17%
para sangue de aves.

Já Azevedo e Rangel (1991), trabalhando com Lu. whitmani

capturada em Baturité, Ceará, observaram que dentro de uma mesma
espécie pode ocorrer variações entre as diferentes populações, tanto quanto
a preferência alimentar como local de ocorrência, nesta localidade esta
espécie mostrou-se adaptada ao peridomicílio e com alto grau de
antropofilia, como nos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Bahia; já na
Região Amazônica ela tem comportamento selvagem e pouca tendência
para picar o homem.

Das aproximadamente 800 espécies de flebotomíneos conhecidas

no mundo, 60% são encontradas na Região Neotropical e destas 229 estão
presentes no Brasil. Existem espécies que se alimentam do sangue de
vários hospedeiros, tem grande capacidade de dispersão, portanto ampla
distribuição, como Lu. intermedia, Lu. migonei e Lu. whitmani, que são
encontradas em todas as regiões do Brasil. Outras, porém são altamente
específicas, menor poder de dispersão e dependentes de alguns ambientes.
As preferências alimentares influenciam na dispersão das espécies, e
algumas se restringem as áreas próximas de sua fonte de alimentação
(Aguiar e Medeiros, 2003).

Os principais vetores da leishmaniose tegumentar americana

(LTA), segundo classificação adotada por Galati (1995), pertencem aos

23
gêneros: Lutzomyia França, 1924, Pintomyia Costa Lima, 1932,
Psychodopygus Mangabeira, 1941, Nyssomyia Barreto, 1962 e Migonemyia
Galati, 1995.

Com relação à LVA, em praticamente todas as áreas de

ocorrência, Lu. longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) tem sido identificada como a
espécie vetora (Lainson & Shaw, 1987).

Galati et al. (1997) sugerem a participação de Lu. cruzi na

transmissão da LVA em Corumbá, principalmente por conta do predomínio
da espécie em área urbana, sendo encontrada tanto no peridomicílio quanto
no intradomicílio e também por sua sua antropofilia; relatam também a
ocorrência de Lu. forattinii em ambiente domiciliar na mesma área,
chamando a atenção também para esta espécie, já que apresenta estreito
grau de parentesco com Lu. cruzi e com Lu. longipalpis.

Atualmente, no Brasil, duas espécies estão relacionadas com a

transmissão da LVA, sendo considerada a principal Lu. longipalpis, e mais
recentemente Lu. cruzi que foi incriminada como vetora no Estado do Mato
Grosso do Sul. Lu. longipalpis tem ampla distribuição e se encontra em
ampla expansão, sendo encontrada em quatro regiões geográficas:
Nordeste, Norte, Sudeste e Centro-Oeste (Ministério da Saúde, 2003).

Anteriormente, na década de 1970, no Estado de São Paulo, a

presença de Lu. longipalpis estava restrita aos municípios de Salto do
Pirapora, Pirapora do Bom Jesus e Cássia dos Coqueiros. Já em 1995,
Gomes et al. assinalam sua presença na Serra da Mantiqueira, nos
municípios de Itupeva, Socorro e Espírito Santo do Pinhal. Com a
descoberta desta espécie na zona urbana do município de Araçatuba,
amplia a sua distribuição para uma região com características diferentes das
observadas anteriormente, região de planalto a 400 metros acima do mar
(Costa et al., 1997).

A partir deste primeiro encontro de Lu. longipalpis em área urbana

no Estado de São Paulo, várias atividades de vigilância entomológica foram
implementadas pelo Programa de Controle do Estado de São Paulo e

24
atualmente 7 municípios são classificados como receptivos por
apresentarem Lu. longipalpis adaptada em área urbana, 41 municípios estão
com transmissão canina da LVA e 30 com transmissão humana desta
parasitose.

1.2 Agente etiológico

Leishmanioses são agravos à saúde causadas por diversas

espécies de protozoários tripanossomatídeos do gênero Leishmania
Ross,1903, com 350 milhões de pessoas vivendo em áreas de risco, e cerca
de 12 milhões de pessoas infectadas, segundo estimativas da Organização
Mundial da Saúde (WHO 1990).

Lainson e Shaw (1979) propuseram uma classificação das

leishmânias de acordo com o comportamento destas no tubo digestivo do
vetor, dividindo-as em três categorias: suprapilária, com o desenvolvimento
das promastigotas na parte do trato digestivo anterior ao piloro, peripilária,
com estas formas se desenvolvendo no intestino médio abdominal e região
pilórica, e hipopilária, com o desenvolvimento na porção posterior ao piloro.
Posteriormente, em 1987 os mesmos autores, classificaram as leishmânias
em dois subgêneros, Viannia com os parasitos se desenvolvendo na região
peripilária e Leishmania com o desenvolvimento na região suprapilária.

A taxonomia das leishmânias do Novo Mundo anteriormente era

baseada nos aspectos clínicos e epidemiológicos das doenças e nas
características biológicas dos parasitos, em animais de laboratório e
flebotomíneos, e atualmente está sendo suplementada por uma variedade
de métodos bioquímicos e imunológicos. Os critérios moleculares definem
características intrínsecas dos parasitos que não são modificados ou
influenciados por hospedeiros ou fatores ambientais (Grimaldi & Tesh,
1989).

25
 As principais espécies causadoras da LTA no Brasil estão
incluídas nos Subgêneros Viannia e Leishmania, com as espécies: L. (V)
braziliensis, L. (V) guyanensis, L (V) lainsoni, L (V) naiffi, L (V) shawi , L. (V)
lindenbergi e L. (L) amazonensis (Grimaldi & Tesh, 1993; Silveira et a.,
2002).

A forma visceral da leishmaniose tem como agente etilógico nas

Américas Leishmania (L) chagasi Cunha & Chagas, 1937 (Grimaldi & Tesh,
1993; Lainson e Shaw, 1987).

1.3 Interação Leishmania sp - Hospedeiro invertebrado

Das 476 espécies de flebotomíneos encontradas nas Américas,

aproximadamente 40 foram relatadas como possíveis vetores das
leishmanioses. Vários fatores próprios de cada espécie determinam a sua
capacidade de ser susceptível ou refratária ao desenvolvimento do parasito,
sugerindo a existência de um processo de co-evolução entre esses seres.
Os mecanismos que determinam a preferência tecidual ou visceral dos
protozoários ainda não estão determinados, o que se observa é que são
específicos para cada espécie de Leishmania (Pimenta et al., 2003).

O gênero Leishmania possui duas formas evolutivas em seu ciclo

biológico: amastigotas e promastigotas.

As formas amastigotas, encontradas nos organismos vertebrados,

se localizam e se multiplicam nas células do sistema mononuclear
fagocitário, os macrófagos; essa forma é ovóide e não possui flagelo livre.

Dentro do trato digestivo do flebotomíneo, juntamente com a

alimentação sanguínea, as amastigotas se transformam e se multiplicam em
várias formas extracelulares, flageladas denominadas promastigotas.

26
 Para que haja a infecção do flebotomíneo pelas leishmânias,
estas formas têm que resistir, sobreviver e se multiplicar dentro do trato
digestivo do inseto. Durante o processo de digestão, algumas espécies do
protozoário sobrevivem e outras não resistem a este processo,
determinando assim a competência vetorial dos flebotomíneos. De acordo
com Pimenta et al. (2003), a resistência das formas promastigotas às
enzimas digestivas, após a excreção do alimento, é por conta da proteção
conferida a essas formas pelo lipofosfoglicana (LPG), molécula encontrada
na superfície do promastigota, protegendo-o da lise.

As formas que são inoculadas no momento da picada e que

sobrevivem no hospedeiro vertebrado são denominadas promastigotas
metacíclicos. Lainson e Shaw (1987) demonstraram que após
aproximadamente quatro a cinco dias do repasto infectante essas formas
podem ser inoculadas no hospedeiro mamífero.

1.4 Estabelecimento de colônias de flebotomíneos

O estabelecimento de colônias de espécies de flebotomíneos é de

grande importância, pois permite que se façam observações sobre sua
biologia, fisiologia, genética, comportamento, competência vetorial,
mecanismos de infecção, ciclo da leishmânia no inseto vetor, dinâmica de
transmissão, efetividade de inseticidas e testes de suscetibilidade, buscando
assim alternativas para o controle (Blanco, 1995).

Um outro aspecto muito importante para o estabelecimento de

uma colônia é a possibilidade de contar com insetos garantidamente não
contaminados para os diferentes experimentos (Sherlock e Sherlock, 1959).

A primeira colônia que se tem evidência bibliográfica foi

estabelecida por Grassi, em 1907 em Roma, e eram espécimens de

27
Plhebotomus mascitti. No Novo Mundo, o primeiro relato foi de Bayma
criando Lu. intermedia em 1916 (Ward, 1972).

Para o estabelecimento de colônias devem-se conhecer as

características de cada espécie e as condições necessárias para o seu
estabelecimento, pois não há um método único que atenda a tão grande
variação. O estabelecimento de uma colônia é bem mais difícil do que a
manutenção de uma já estabelecida (Killick-kendrick, 1991).

Verificam-se, nos últimos anos, vários pesquisadores trabalhando

com colonização de flebotomíneos: Sherlock e Sherlock, 1959; Johson e
Hertig, 1961; Eldrige et al., 1963; Ward,1972 e 1977; Chaniotis, 1975; Killick-
Kendrick e Leaney e Ready, 1977; Modi e Tesh, 1983; Rangel et al., 1985, e
outros.

Whittingham e Rook (1922) mantiveram Phlebotomus papatasi

por três gerações, e a partir daí, vários pesquisadores têm usado uma
variedade de técnicas dependendo da espécie a ser criada (Eldridge et
al.,1963).

Colônias de P. papatasi e P. orientalis foram mantidas em

laboratório no Cairo, em 1959 e 1962, com uma produção de mais de um
milhão de flebotomíneos para se estudar a relação parasito-vetor,
potencialidade do vetor para calazar e suscetibilidade a inseticidas. Segundo
o autor, os fatores que contribuíram para o sucesso da colonização foram a
manutenção da alimentação suficiente para a postura dos ovos e
desenvolvimento larval e o controle do crescimento dos fungos os quais
imobilizavam as larvas e reduziam suas atividades de alimentação (Schmidt,
1964).

Safyanova (1964) também relata as condições ideais para a

colonização de diferentes espécies de flebotomíneos. Como melhor
alimentação para a forma larval cita uma mistura de substâncias orgânicas
decompostas pelo excremento de diferentes animais e folhas vegetais,
manutenção de um grau moderado de umidade como sendo o maior pré-
requisito para o sucesso da colônia e temperatura entre 25°C e 30°C. Com a

28
manutenção da temperatura de 25°C a 28°C, P. papatasi completou o ciclo
de vida em 49 dias e em 84 dias sob a temperatura de 23°C a 24°C.

Sherlock e Sherlock (1972) fazem uma revisão sobre 16 métodos

usados por alguns pesquisadores, observando que estes métodos são muito
semelhantes, com algumas modificações dependentes das adaptações
feitas para cada local de trabalho. Salientam que o método deve ser simples,
de fácil confecção e manipulação, deve-se evitar a contaminação por fungos,
ácaros e insetos predadores, e ressaltam a necessidade da manutenção do
ambiente úmido para o desenvolvimento das formas imaturas, superfície
para a oviposição das fêmeas e alimento adequado.

Segundo Brazil e Gomes Brazil (2003), a colonização de

flebotomíneos exige dedicação diária e os métodos são normalmente pouco
produtivos elencando como principais dificuldades a alta mortalidade nos
primeiros estadios larvários, canibalismo entre as larvas, alimentação
inadequada, presença de fungos e a alta taxa de mortalidade das fêmeas
grávidas.

1.5 Reservatórios

Uma grande variedade de mamíferos silvestres e domésticos,

além do homem, desempenha o papel de reservatórios nas leishmanioses.
Normalmente existe um hospedeiro reservatório primário para cada espécie
de leishmânia por foco, porém pode ocorrer a infecção de outros mamíferos,
tornando-os hospedeiros secundários ou acidentais (WHO, 1990).

O hospedeiro reservatório deve ter vida longa e estar presente em

grande quantidade na área de transmissão, constituindo-se assim, uma fonte
constante de alimentação para o flebotomíneo; deve estar próximo do inseto
transmissor, facilitando assim a veiculação do agente entre os hospedeiros
reservatórios.

29
 Existe certa dificuldade na definição dos principais hospedeiros
reservatórios com relação à LTA e observa-se que mais de uma espécie de
mamífero pode se infectar com uma mesma espécie de parasito; são poucos
os mamíferos identificados como os que realmente apresentam papel
importante como hospedeiro natural, sendo os demais hospedeiros
acidentais (Grimald et al., 1989).

No Brasil, como principais reservatórios silvestres da L. (L)

amazonensis, na Amazônia, temos os roedores do gênero Proechimys e
como secundários: roedores do gênero Oryzomys e Neacomys, os
marsupiais Didelphis marsupials, Marmosa murina, M. Cinerea, Metachirus
nudicaudata e Philander opossum, e o canídeo Cerdocyon thous (Lainson e
Shaw, 1987).

Com relação a L. (V) guyanensis, são incriminados a preguiça de

dois dedos, Choelopus didactylus e o tamanduá Tamandua tetradactyla,
assumindo papel secundário o gambá Didelphis marsupialis e roedores do
gênero Proechimys (Lainson e Shaw, 1987).

Quanto a L. (V) braziliensis, não se sabe com certeza qual é o

principal reservatório silvestre; alguns roedores, marsupiais e preguiças
estão envolvidos no ciclo silvestre e ocorre a participação de cães e equinos
no ciclo urbano, demonstrando o poder de adaptação deste parasita a
diferentes vetores e reservatórios e às mudanças do habitat natural (
Lainson e Shaw, 1987; Grimaldi et al., 1989).

Já em relação à LVA, no município de Sobral, Estado do Ceará,

Deane e Deane (1954) relatam o encontro de duas raposas (Lycalopex
vetulus) infectadas por “Leishmania donovani”, além da comprovação da
infecção de Lu. longipalpis, quando alimentados experimentalmente nessas
raposas infectadas.

Em Belém, no Pará, uma raposa do gênero Cerdocyon thous foi

encontrada parasitada com “L. donovani”; o animal apresentava aparência
saudável, sugerindo, portanto tratar-se de um reservatório primitivo (Lainson
et al., 1969).

30
 Em Jacobina, Estado da Bahia, o gambá Didelphis albiventris foi o
primeiro mamífero silvestre, não canídeo, encontrado com infecção natural
por “L. donovani” (Sherlock et al., 1984).

O cão é considerado pela maioria dos autores como o principal

reservatório doméstico da LVA e seu papel adquire grande importância
epidemiológica por conta de sua proximidade com o homem e na dispersão
da doença.

Em Araçatuba, município da região noroeste do Estado de São

Paulo, em 1998, foram encontrados cães com suspeita clínica de LVA. Em
dez cães confirmou-se a presença de L. chagasi, através de técnicas
moleculares. Após realização de inquérito sorológico através da reação de
imunofluorescência indireta, constatou-se positividade de 14,4% em 423
amostras examinadas (Galimbertti et al., 1999).

Camargo-Neves (2004), buscando conhecer aspectos importantes

sobre a epidemiologia da doença, bem como respostas quanto às medidas
de controle empregadas, procurou avaliar a situação da LVA na região de
Araçatuba. Através de um estudo de coorte, com duração de dois anos,
determinou as taxas de prevalência canina e o comportamento da incidência
da infecção em três diferentes áreas do município de Araçatuba, as quais
apresentavam maiores índices de positividade canina e humana e de óbitos
da região. Neste estudo, foram definidas as seguintes: área testemunha,
sem intervenção; área tratada, com realização de borrifação; e área
calagem, onde se procedeu a limpeza dos quintais de todos os imóveis, com
posterior aplicação de calcário. Foram realizados inquéritos sorológicos
quadrimestrais, tendo sido observadas diferenças significativas quanto às
taxas de incidência nas diferentes áreas. Outro aspecto observado que
chama a atenção foi a alta freqüência (98%) de cães assintomáticos nas três
áreas, mostrando o importante papel destes cães na manutenção da
doença.

31
 1.6 Diagnóstico Laboratorial da LVA

O diagnóstico da leishmaniose pode ser feito através de métodos

sorológicos, clínicos e epidemiológicos, porém para o diagnóstico definitivo e
classificação dos casos em área sem transmissão, é necessário a
identificação do parasito. Neste caso, em vertebrados, o material coletado de
lesões de pele, biópsia de linfonodo ou de medula óssea, por serem os
órgãos naturalmente mais parasitados, são corados pelo Giemsa para a
visualização das formas amastigotas em microscopia. Quando o material é
escasso o mesmo pode ser cultivado em meios de cultura e/ou inoculados
em hamster para isolamento e identificação (São Paulo, 2004).

Devido à grande produção de anticorpos pelos portadores desta

parasitose, diferentes técnicas sorológicas têm sido utilizadas para o
diagnóstico do calazar, sendo a imunofluorescência Indireta (RIFI) e o teste
de ELISA as mais empregadas por conta da alta sensibilidade e
especificidade (Badaró et al., 1983).

Atualmente no Programa de Controle da LVA do Ministério da

Saúde, estas duas técnicas sorológicas estão sendo recomendadas para os
inquéritos caninos amostrais e censitários, sendo o teste de ELISA
recomendado para a triagem de cães negativos e a RIFI para a confirmação
dos sororreagentes ao teste de ELISA (Ministério da Saúde, 2003).

Quanto ao diagnóstico humano a punção esplênica apesar de

oferecer uma sensibilidade de 90 a 95% no parasitológico, apresenta
restrições por conta do risco no procedimento, sendo a punção aspirativa da
medula óssea a mais recomendada.

Segundo o Ministério da Saúde (2003), levando-se em

consideração a avaliação da área endêmica, o tipo de amostra, o alvo do
DNA utilizado para a amplificação e o método de extração, uma nova
perspectiva para o diagnóstico da LVA é o método da Reação em Cadeia
pela Polimerase.

32
 1.7 Biologia Molecular aplicada ao estudo da LVA

Os métodos clássicos para se estimar a taxa de infecção em

hospedeiros reservatórios e vetores baseiam-se, portanto, na análise
microscópica e no isolamento em cultura, que são técnicas, além de
trabalhosas e demoradas, inespecíficas, pois os flagelados são
morfologicamente indistinguíveis.

Nas fêmeas de flebotomíneos podemos encontrar espécies

primitivas de Trypanosoma e Endotrypanum que podem ser confundidas
com as leishmânias por conta da forma flagelada (Michalsky et al., 2002).

Nas duas últimas décadas, verificou-se um grande avanço na

área de biologia molecular. A partir da descoberta, purificação e aplicação
das enzimas que reconhecem sequências específicas de nucleotídeos, as
técnicas de biologia molecular e DNA recombinante estão contribuindo para
o aperfeiçoamento dos métodos de pesquisa de marcadores biológicos
específicos para o diagnóstico de doenças infecciosas. Essas técnicas
proporcionam a detecção da presença do microorganismo no hospedeiro,
bem como indicam a exposição deste ao agente infeccioso (Cotrim, 2001).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a amplificação

e detecção de mínimas quantidades de DNA do agente infectante, definido
como DNA alvo, mesmo na presença de altas concentrações de DNA do
hospedeiro ou de outro patógeno co-infectante; desde que haja a escolha
correta da região a ser amplificada, com o uso de “primers” apropriados, sua
especificidade pode chegar a 100% (Cotrim, 2001).

Uma das características dos protozoários do gênero Leishmania é

a presença de uma organela celular denominada cinetoplasto, composta por
moléculas de DNA agrupadas. O kDNA (DNA do cinetoplasto) é formado por
maxicírculos e minicírculos, e essas moléculas se concatenam formando
uma rede compacta. Cerca de 95% da massa de kDNA é representada por
minicírculos. Essas moléculas apresentam uma região conservada de 120 a
150 pares de base, que são bem homogêneas entre os representantes de

33
um mesmo gênero. Os minicírculos, portanto, são bons substratos para
sondas moleculares (Degrave et al., 1994).

Recentemente a técnica de PCR tem sido usada para amplificar

sequências de kDNA e detectar Leishmania no material de biopsia de
pacientes e de reservatórios suspeitos, bem como de espécimens de
flebotomíneos. Estas técnicas permitem o processamento de um grande
número de amostras, facilitando os estudos epidemiológicos.

Oligonucleotídeos sintéticos, propostos como iniciadores

(“primers”), específicos para os complexos L. donovani e L. braziliensis têm
sido avaliados em condições de campo (Grimald and Tesh,1993).

Aransay et al. (2000) desenvolveram um ensaio de PCR

“seminested” para amplificar o minicírculo do kinetoplasto de Leishmania em
flebotomíneos capturados em algumas áreas da Grécia com casos de LVA.
O minicírculo do kinetoplasto é um alvo ideal, como já citado, porque está
presente em 10.000 cópias por célula e esta sequência é conhecida na
grande maioria das espécies de Leishmania. Eles usaram uma combinação
de primers (LINR4, LIN17 E LIN19) para aumentar a sensibilidade da PCR
padrão. Quando diferentes concentrações de L. infantum foram testadas
com PCR “seminested”, detectou-se um pouco menos do que 0,25 parasitas
por reação, enquanto com a PCR padrão não se conseguiu detectar cinco
parasitas por reação. Das 522 fêmeas que não continham sangue e 123 com
presença de sangue, respectivamente 35 (6,7%) e seis (4,8%),
apresentaram resultado positivo, com amplificação do fragmento alvo. Este
ensaio foi capaz de detectar pouco menos do que três parasitas por
flebótomo e amplificar o minicírculo de DNA de até oito espécies de
Leishmania.

Rodriguez et al. (1999) confirmaram a utilidade da técnica PCR-

hibridização para identificar espécies de flebotomíneos naturalmente
infectadas, em estudo realizado na Venezuela. De um total de 2700
espécimes examinadas, 2,2% apresentaram formas flageladas no intestino,
ou seja, com infecção natural, porém apenas em cinco destas, a infecção

34
por Leishmania foi confirmada pela PCR, correspondendo a 7,7% de
infecção. A hibridização com sonda espécie específica foi capaz de
confirmar a infecção natural por Leishmania (V) braziliensis, com
amplificação do fragmento de 500 pares de bases em dois exemplares de
Lu. gomesi e três de cinco Lu. panamensis analisados; duas Lu. panamensis
negativas na PCR pode ter sido por conta do reduzido número de parasitas.
Neste trabalho, os autores confirmaram o papel da Lu. panamensis e da Lu.
gomesi na transmissão da L. braziliensis na Venezuela, estado de
Carabobo, mostrando a utilidade das técnicas de biologia molecular na
correta identificação de parasitas em flebotomíneos.

Harris et al. (1998) desenvolveram um ensaio da PCR multiplex,

para diferenciar os três complexos de Leishmania do Novo Mundo, L.
braziliensis, L. mexicana e L. donovani. Esta técnica foi específica para o
gênero Leishmania e não reconheceu espécies de outros gêneros, como
Trypanosoma cruzi, T. brucei e Critidia. Utilizaram como alvo a região
repetida do RNA (mini-exon) e, para a escolha dos primers, levaram em
consideração o grande número de cópias, a presença de sequências
conservadas entre todas as espécies de leishmânias dentro de cada
complexo e a presença de sequências variáveis, as quais diferem entre os
complexos. Com isso puderam detectar os três complexos simultaneamente,
gerando produtos de diferentes tamanhos para cada um. Para L. donovani, o
tamanho variou de 351 a 397 pares de bases, para L. mexicana, de 218 a
240 pb e para L. braziliensis, de 146 a 149 pb. Outra vantagem é que é
adequada para laboratórios não sofisticados, que é a regra nas regiões onde
a leishmaniose é endêmica. Atualmente várias técnicas para a identificação
de Leishmania em nível de gênero e caracterização de complexos têm sido
descritas, porém este protocolo possibilitou a identificação dos três
complexos simultaneamente.

Michalsky et al. (2002) aplicaram a PCR para investigar a

presença de Leishmania em flebotomíneos. Três pares de
parasito/flebotomíneos foram testados: Lu. longipalpis e L. chagasi, Lu.
migonei e L. amazonensis e Lu. migonei e L. braziliensis. A infecção com

35
pouco menos do que dez exemplares de Leishmania sp por flebotomíneo
foram suficientes para a amplificação com “primers” gênero específico e
utilizando-se iniciadores para os complexos L. braziliensis e L. mexicana, os
mesmos autores conseguiram separar L. braziliensis e L. amazonensis.

Cabrera et al. (2002) avaliaram as condições e práticas

adequadas para o armazenamento de flebótomos com o objetivo de aplicar
a técnica de PCR. Após infecção experimental dos flebotomíneos com uma
cepa de L. chagasi do Vale do Rio Magdalena (Quipile, Cundinamarca), os
insetos infectados foram preservados em três soluções diferentes: etanol a
100%, etanol a 70% e buffer Tris-EDTA (TE) e foram mantidos a -80°C, -
20°C e a temperatura ambiente. Concluíram que as amostras entomológicas
podem ser preservadas a temperatura ambiente em etanol a 70%, facilitando
assim seu uso em estudos epidemiológicos em áreas endêmicas.

Esses mesmos autores, em 2003, avaliaram a efetividade da PCR

como uma ferramenta na detecção de L. chagasi transmitida
experimentalmente a hamster. Para a amplificação usaram primers
específicos para a região conservada dos minicírculos de DNA e observaram
o aparecimento de uma banda de 120 pb, correspondente ao tamanho
esperado da fração do minicírculo.

36
 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Padronizar e avaliar a técnica da Reação em Cadeia pela

Polimerase (PCR) para identificação de flebotomíneos experimentalmente
infectados por L. chagasi.

2.2 Objetivos Específicos

Estabelecer e manter a colônia de Lu. longipalpis no laboratório

do Serviço Regional - 09 - Araçatuba – SUCEN.

Infectar experimentalmente exemplares de Lu. longipalpis

capturados em campo, assim como exemplares de 1ª geração de Lu.
longipalpis obtidos em laboratório.

Definir a sensibilidade da PCR para detecção da L. chagasi em

flebotomíneos artificialmente contaminados.

Comparar a microscopia direta do trato digestivo e a PCR para

detecção e identificação de flebotomíneos experimentalmente infectados por
L. chagasi ou coletados em campo.

37
 3. MATERIAL E MÉTODO

3.1 Capturas de flebotomíneos com aspiradores manuais

As capturas foram realizadas na zona urbana da cidade de

Araçatuba, ao longo dos anos de 2003 e 2004 em imóveis com
características favoráveis à proliferação de flebotomíneos, conforme
estabelecido no Manual de Controle da LVA do Estado de São Paulo (São
Paulo, 2004), ou seja, aqueles com presença de vegetação abundante
(principalmente árvores frondosas ou arbustos adensados) com acúmulo de
matéria orgânica em decomposição no solo, como restos de vegetais e fezes
de animais; priorizaram-se os abrigos de animais, principalmente galinheiros
(Figura 1).

Organizados em duplas, os capturadores iniciaram o trabalho de 3

horas de duração, meia hora após o crepúsculo, por meio de aspiradores
manuais (Figura 2); o tempo de permanência em cada imóvel foi variável,
dependendo das condições dos mesmos. Eventualmente eram deixadas no
peridomicílio armadilhas elétricas modelo CDC modificado, por 12 horas,
instaladas meia hora após o crepúsculo e retiradas ao amanhecer (Figura 3).

Os exemplares capturados foram acondicionados em gaiolas de

náilon, envoltas em sacos plásticos transparentes, contendo chumaços de
algodão embebidos em água para manter a umidade e transportados até o
laboratório nas mesmas gaiolas mantidas em caixas de isopor (Figura 4).

Os registros dos dados foram feitos em boletins padronizados

para captura entomológica e de acordo com a rotina estabelecida pelo
Programa de Controle de LVA da Superintendência de Controle de
Endemias - SUCEN (Anexo 1).

38
 3.2 Manutenção da colônia de Lutzomyia longipalpis

Para a instalação e manutenção da colônia em laboratório,

seguiram-se os procedimentos conforme Brazil e Gomes Brazil (2003).
Todas as etapas, até a produção de exemplares F1, deram-se em
estufa modelo BOD à temperatura de 25,5ºC e umidade relativa de
aproximadamente 86%, sendo expostos à luz apenas durante a
manipulação.

Os exemplares de flebotomíneos levados ao laboratório,

receberam mel de abelha diluído em água destilada, na proporção de 1:1,
embebidos em chumaços de algodão colocados diretamente sobre a parte
superior das gaiolas envoltas em sacos plásticos.

Após 24 horas, exemplares fêmeas de flebotomíneos, capturadas

no campo, receberam sangue de hamsters (Mesocriscetus auratus); estes
foram imobilizados em grades de arame, durante 2 horas, no interior das
gaiolas cobertas com pano preto. Feito o repasto, as fêmeas foram mantidas
juntamente com os machos para garantir a fecundação, durante 48 horas.

Depois deste período, as fêmeas foram individualizadas, com o

auxílio de capturador de Castro, em pequenos potes de polietileno (4,5 cm
de diâmetro por 4,0 cm de altura) com fundo de gesso umedecidos em água
destilada e cobertos com tecidos de malha fina para a oviposição (Figura
5A). Os potes foram acomodados dentro de caixas plásticas tampadas, com
fundo revestido por papel filtro umedecido em água destilada e observados
diariamente para controle de umidade, presença de ovos, proliferação de
fungos e troca da solução de mel para a alimentação (Figura 5B).

Os ovos pertencentes à mesma espécie, aproximadamente 400

ovos por pote, foram transferidos para os potes de criação (7.0 cm de
diâmetro por 8,5 cm de altura), também com fundo de gesso umedecido em
água destilada, onde todos os estadios larvais e pupas se desenvolveram
(Figuras 6 e 7).

39
 Após a primeira eclosão dos ovos, os potes de criação receberam
pequenas quantidades de ração larval envelhecida, peneirada e autoclavada
antes de seu uso. Esta ração era constituída por uma mistura composta por
terra vegetal e pó de xaxim, acrescido de mesma quantidade de fezes secas
de coelho suplementado com 1% de ração para peixe (Vitormonio-
RCW/Brasil); diariamente, observaram-se os potes para a retirada dos
fungos, ácaros e adição da ração.

Quando formadas as primeiras pupas, diminuiu-se a oferta da

ração para evitar proliferação de fungos e morte dos adultos recém-
emergidos.

Após o nascimento, os flebotomíneos transportados para gaiolas

de náilon receberam, nos três primeiros dias, soluções diluídas de mel, na
proporção 1:1, e após o 4º dia, repasto em hamster.

Os flebotómíneos F1 obtidos na colônia foram utilizados para a

padronização da Reação em Cadeia pela Polimerase – PCR.

3.3 Infecção experimental de flebotomíneos por Leishmania

chagasi

Um total de nove experimentos de infecção de Lu. longipalpis por

L. chagasi foram feitos; cinco através de alimentação dos flebotomíneos
diretamente na região inguinal de cães sabidamente positivos, dois através
de alimentadores artificiais, utilizando as formas amastigotas de L. chagasi ,
um com a utilização de alimentadores artificiais e formas promastigotas
obtidas em cultura e um último grupo onde 15 exemplares F1 de Lu.
longipalpis obtidos de colônia, foram submetidos ao repasto em hamster
infectado por L. chagasi.

40
 3.3.1 Infecção experimental através de repasto sanguíneo em
cães

Os flebotomíneos capturados em galinheiros de imóveis da área

urbana de Araçatuba foram infectados através de alimentação em cães
sabidamente positivos para LVA, recolhidos pelo Centro de Controle de
Zoonose de Araçatuba para eutanásia, conforme preconizado pelo
Programa de Controle da LVA do Estado de São Paulo.

Para todos os cães recolhidos para eutanásia foi preenchido um

termo de doação (Anexo 2). Salientamos que o protocolo para uso de
animais em experimentação foi aprovado pelo comitê de Ética em Pesquisa
do Instituto Adolfo Lutz (Anexo 3).

Realizou-se um total de cinco experimentos, utilizando-se dois

cães em cada. Os cães procedentes de domicílio, com diagnóstico positivo
para LVA, entregues espontaneamente, foram submetidos à anestesia geral
com Thiopental sódico, na dose de 25mg/Kg e após o período da
alimentação dos flebotomíneos, eutanasiados pelo aprofundamento da
anestesia, seguido de aplicação de cloreto de potássio 19,1% em dose
suficiente para parada cardíaca.

Os flebotomíneos fizeram o repasto sanguíneo na região inguinal,

em uma área de aproximadamente 5 cm de diâmetro, após tricotomia. Para
o repasto, os flebotomíneos foram acondicionados em gaiola de PVC com
tela em aço na parte inferior (malha fina), possibilitando o contato destes
com a pele do cão, por aproximadamente 1 hora e cobertos com pano de cor
preta para manutenção na penumbra.

Depois da alimentação, as gaiolas contendo os insetos foram

retiradas e acondicionadas em sacos plásticos com chumaços de algodão
umedecidos em água destilada, dentro de caixa de isopor e levadas para o
laboratório, onde após a transferência para gaiola de náilon, os insetos
receberam solução de mel na proporção de 1:1 em água destilada e

41
permaneceram por 4 dias na estufa BOD a temperatura de 25,5ºC e
umidade relativa de 86% para posterior identificação e procura da leishmânia
através de observação em microscópio óptico com aumento de 400 vezes.

3.3.2 Infecção experimental através de alimentadores

artificiais

A infecção experimental através de alimentadores artificiais foi

realizada de acordo com a metodologia descrita por Michalsky et al. (2002).

Procedimento utilizado para as formas amastigotas de L. chagasi :

Fígado, baço e linfonodo de cão, sabidamente positivo para LVA,

foram macerados em solução salina tamponada com fosfatos, pH 7,2 (SST).
A suspensão obtida foi distribuída em micro tubos de polipropileno
(capacidade 2ml) e centrifugada durante 5 minutos a 2000 rpm. O material
em suspensão, acondicionado em outro micro tubo, foi centrifugado
novamente por 5 minutos a 8000 rpm. Desprezou-se o sobrenadante e o
sedimento contendo L. chagasi foi ressuspenso com SST e centrifugado
novamente; repetiu-se este procedimento por três vezes. Depois da última
etapa de centrifugação, acrescentou-se ao sedimento 2µl de antibiótico
garamicina puro e sangue heparinizado. O homogeneizado foi colocado em
alimentadores artificiais, revestidos na parte inferior por pele de pinto (Gallus
gallus). Sobre uma bancada forrada com papel filtro, foram dispostos três
recipientes de plástico, de 5,5 cm de altura e 5,0 cm de diâmetro, forrados
com gesso umedecido, contendo no total, 92 fêmeas e alguns machos
capturados em galinheiros, no campo; sobre esses recipientes foram
acoplados os alimentadores artificiais contendo as formas amastigotas de L.
chagasi (Figuras 8A , 8B e 8C).

42
 Depois do repasto através dos alimentadores artificiais, à
temperatura de 37ºC, mantida por banho-maria, por um período de 2 horas,
os flebotomíneos foram soltos em gaiola de náilon e permaneceram na
estufa BOD por 4 dias onde receberam solução de açúcar contendo
antibiótico (5ml de glicose, 30ml de água destilada e 2ml de garamicina
40mg diluído em água (0,001%). O procedimento para identificação dos
flebotomíneos positivos foi o mesmo citado no item anterior.

Procedimento usado para as formas promastigotas de L. chagasi :

O procedimento foi semelhante ao protocolo anterior, com a

seguinte alteração: as formas promastigotas, contendo 2x107 parasitas por
ml, foram obtidas em cultura, lavadas em SST e centrifugadas; o soro,
utilizado na mistura com as formas promastigotas obtidas em cultura, ficou a
57ºC por 1 hora para inativar o sistema complemento antes de ser
reconstituído e colocado nos alimentadores artificiais para alimentação dos
flebótomos.

3.3.3 Infecção experimental através de repasto sanguíneo em

hamster

Após 48 horas da emersão os exemplares fêmeas de primeira

geração obtidas em colônia, receberam sangue de hamsters (Mesocriscetus
auratus) infectados por Leishmania chagasi; para tanto estes foram
imobilizados em grades de arame, durante 2 horas, no interior de gaiolas de
náilon cobertas com pano preto. Feito o repasto, as fêmeas foram
acondicionadas dentro dos potes individuais na estufa modelo BOD a 25,5ºC
e umidade relativa de aproximadamente 86% onde receberam solução de
mel na proporção de 1:1 em água destilada. Foram mantidas nestas

43
condições até a oviposição e morte. Após este período as fêmeas foram
acondicionadas em micro tubos de polipropileno à temperatura de -22ºC até
a realização da extração de DNA e PCR.

3.4 Cultivo de Leishmania chagasi

As cepas de MHOM/BR/74PP5 L. chagasi foram cultivadas em

meio NNN contendo 3ml de fase líquida composta por RPMI-1640. As
culturas foram mantidas em temperatura apropriada para o crescimento do
parasito. As amostras foram cedidas pela Profa. Dra. Valéria Marçal Felix de
Lima do Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal do Curso
de Medicina Veterinária – Unesp – Araçatuba.

3.5 Identificação da infecção por Leishmania chagasi por

Microscopia do trato digestivo de Lutzomyia longipalpis

A identificação e dissecação das fêmeas infectadas

experimentalmente foram realizadas a partir do 4º dia do repasto sob
aumento de 400 vezes ao microscópio óptico, com adição de uma gota de
solução salina.

Posteriormente, o material foi acondicionado em micro tubos de

polipropileno com etanol a 70%, à temperatura de -22ºC, para posterior
análise do conteúdo do trato digestivo, quanto à presença de material de
DNA de formas flageladas pela PCR.

44
 3.6 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)

3.6.1 Extração de DNA

Seis exemplares de Lu. longipalpis F1, mantidos em colônia

controlada, foram identificados e separados individualmente para a extração
de DNA e usados como controle negativo.

Com o objetivo de avaliar o limiar de detecção de DNA de

Leishmania sp pela PCR, procedeu-se a contaminação artificial dos
flebotomíneos com L. chagasi mantidas em cultura (MHOM/BR/74/PP5).
Sete tubos foram preparados, por diluição seriada na base 10, a partir de
uma suspensão inicial contendo 10x106 formas promastigoras por mL.
Utilizaram-se sete tubos contendo um exemplar de flebotomíneo, por tubo,
aos quais foram adicionados 10µL de cada diluição, contendo diferentes
quantidades de formas promastigotas, como segue: (1) 104, (2) 103, (3) 102,
(4) 101, (5) 100, (6) 10-1, (7)10-2. O experimento foi feito em duplicata.

Os flebotomíneos artificialmente contaminados foram então

macerados em tubos de polipropileno de 1,5 mL, com ajuda de pistilo
plástico, adotando-se todos os cuidados para que não houvesse
contaminação cruzada por DNA exógeno.

Foram testados dois protocolos de extração de DNA, segundo

Michalsky et al. (2002) e Cabrera et al. (2002).

Seguindo o protocolo de Michalsky et al. (2002), o DNA foi

extraído de exemplares individuais de Lu. longipalpis pertencentes a quatro
diferentes grupos: (a) 45 flebotomíneos coletados em campo, (b) 23
flebotomíneos submetidos a infecção experimental por formas amastigotas
de Leishmania sp, (c) 60 flebotomíneos submetidos a infecção experimental
por formas promastigotas e (d) 15 flebotomíneos F1 produzidos em colônia
controlada com repasto em hamster infectado (vide item 3.3).

45
 3.6.1.1 Extração de DNA segundo Michalsky et al. (2002)

A maceração foi realizada utilizando-se 45 µL de tampão de lise

(100 mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS, pH 8.0), com
posterior lavagem do pistilo em 35 µL de tampão de lise, para que não
houvesse perda de material. Adicionou-se 1,25 µL de proteinase K
(10µg/µL), incubando-se a seguir a 37oC, em banho-maria, por 18 horas.
Após este período, utilizaram-se 80 µL de fenol/clorofórmio/ álcool isoamílico
(25:24:1), agitando-se vigorosamente (em vortex) por 30 segundos. Em
seguida as amostras foram centrifugadas por 2 minutos (14.000 x g), sendo
o sobrenadante cuidadosamente removido e colocado em outro tubo de 1,5
ml. À camada aquosa obtida no passo anterior foram adicionados 100 µL de
álcool etílico absoluto gelado misturando-se por inversão do tubo,
armazenando-se em seguida à -20ºC durante 30 minutos. Após a incubação,
as amostras foram centrifugadas por 10 minutos (14.000 x g), sendo o
líquido sobrenadante removido por decantação. Adicionou-se ao sedimento
400 µL de álcool etílico 70%, a temperatura ambiente, com posterior
centrifugação por 5 minutos. Após a centrifugação (14.000 x g), o líquido
sobrenadante foi descartado por decantação e as amostras foram
submetidas à secagem em centrífuga SpeedVac®. Ao sedimento resultante
foram adicionados 50 µl de tampão TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH
8,0), misturando-se e incubando-se a 56ºC durante 3 horas. Após a
incubação os tubos foram agitados vigorosamente por 10 segundos, estando
dessa maneira as preparações de DNA prontas para serem submetidas à
eletroforese. O DNA extraído foi conservado a -20ºC.

46
 3.6.1.2 Extração de DNA segundo Cabrera et al. (2002)

Os flebotomíneos foram individualmente macerados em 50µL de

etanol a 70%, com posterior centrifugação (14.000 x g), por 3 minutos. O
sobrenadante foi desprezado por decantação e adicionaram-se 100 µL de
Chelex® 100 a 5%. As amostras foram incubadas a 56ºC durante 30
minutos, em banho-maria e, após este período, foram agitadas
vigorosamente (em vortex), durante 10 segundos, sendo então submetidas à
fervura, em banho-maria, por 8 minutos. As amostras foram novamente
agitadas em vortex durante 10 segundos e centrifugadas (14.000 x g), por 3
minutos. O sobrenadante contendo o DNA extraído foi retirado e conservado
a -20ºC.

3.6.2 Iniciadores

Para a amplificação de fragmento de DNA de kinetoplasto de

Leishmania sp foram utilizados os oligonoucleotídeos iniciadores 13A (5´-
GTG GGG GAG GGG CGT TCT -3´) e 13B (5´-ATT TTA CAC CAA CCC
CCA GTT-3´) descritos por Rodgers et al. (1990) que resultam em
amplificação de fragmento de DNA de 120pb.

Com o intuito de avaliar a presença de DNA extraído dos

flebotomíneos, padronizou-se a amplificação de fragmento de DNA da região
28S ribossomal de Lu. longipalpis. Oligonucleotídeos iniciadores específicos
para Lutzomyia sp foram desenhados utilizando-se o programa Primer3®
disponível no endereço eletrônico http://frodo.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer3/primer3_ww.cgi.

Para tal, com o auxílio do programa CLUSTAL-W ®, inicialmente

foram alinhadas 26 sequências obtidas de um banco de dados (Genbank),
relativas à região 28S de DNA ribossomal de 26 espécies diferentes do

47
gênero Lutzomyia. Após análise, optou-se por uma seqüência que codifica
para a região 28S ribossomal de Lu. longipalpis (número de acesso
AY349492). Os primers utilizados foram denominados Lu1 (5´ TGA GCT
TGA CTC TAG TTT GGC AC 3´) e Lu2 (5´ AGA TGT ACC GCC CCA GTC
AAA 3´).

3.6.3 Condições da reação de PCR

A PCR foi realizada em tubos de polipropileno de 0,2 mL, em

duplicata, contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 200µM de cada
desoxinucleotídeo trifosfato, 1,5 mM MgCl2, 0,2 µM cada primer, 0,04 U de
Taq DNA polimerase e 5 µL de DNA num volume final de 50 µL. As
amostras foram amplificadas em um aparelho termociclador (MJ Research
Thermal cycler®) com denaturação inicial a 95°C por 5 minutos, sendo
seguido por 35 ciclos de 95°C por 30 segundos para denaturação, 65°C por
45 segundos para anelamento, 72°C por 30 segundos para extensão e 72°C
por 5 minutos para extensão final.

As amostras negativas na primeira amplificação para DNA de

Lutzomyia sp, foram reavaliadas tanto para Lutzomyia sp como para
Leismania sp, diluindo-se as amostras em água na proporção de 1:2.

3.6.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida

Dez microlitros dos produtos da PCR foram submetidos à

eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%, durante 1 hora, a 100 V, em
tampão TBE (89 mM Tris borato, 2 mM EDTA, pH 8,3), sendo
posteriormente corado com nitrato de prata e fotografado.

48
Figura 1 - Peridomicílios com características favoráveis à
proliferação de Lu. longipalpis.

49
Figura 2 - Aspirador manual.

Figura 3 - Armadilha elétrica modelo CDC modificado.

50
Figura 4 - Acondicionamento de Lu. longipalpis capturados em
campo para o transporte até o laboratório.

51
A B

Figura 5 - Potes de individualização de fêmeas de Lu. longipalpis:

(A) Pote de polietileno de 4,5 cm de diâmetro por 4,0 cm de altura
e (B) Caixas plásticas para acondicionamento dos potes
individuais.

A B

C
Figura 6 - Potes de criação: (A) Pote de polietileno de 7,0 cm de
diâmetro por 8,5 cm de altura (B) Interior do pote de criação
revestido com gesso umedecido (C) Potes de criação
acondicionados em caixa plástica.

52
A B

C D

Figura 7 - Interior do Pote de criação revestido com gesso

umedecido e ração larval para o desenvolvimento das diferentes
formas: (A) Ovos (B) Larvas L1 (C) e (D) Larvas L3 e L2 (E) Pupa
(Aumento 10X).

53
 A B

Figuras 8 - Alimentadores artificiais: (A) Três unidades (B) Uma

unidade revestido por pele de pinto (Gallus gallus), contendo as
formas de L. chagasi (C) Três unidades contendo as formas de L.
chagasi, acoplados aos potes contendo exemplares de Lu.
longipalpis para repasto.

54
 4. RESULTADOS

4.1 Colonização de Lutzomyia longipalpis

As capturas entomológicas foram realizadas durante os anos de

2003 e 2004 e o número de fêmeas capturadas por mês é mostrado nas
figuras 9A e 9B.

No ano de 2003, o número de fêmeas, capturadas em campo,

variou de 21 a 172, sendo em média, 78,3; em 2004 variou de 21 a 165, com
uma média de 95,6 fêmeas. Durante o desenvolvimento do trabalho, um total
de 2322 fêmeas foi capturado, as quais renderam 27 potes de criação,
sendo 15 em 2003 e 12 em 2004.

A Figura 10A mostra os dados de produtividade de Lu. longipalpis

referente ao ano de 2003, verificando a partir do número de fêmeas
coletadas em campo, o número de ovos e de alados produzidos; a Figura
10B apresenta os mesmos dados referentes a 2004. O rendimento obtido do
total de ovos desenvolvidos até alados, foi de 16,4% em 2003 e 7,7% em
2004. As quantidades de ovos por pote variaram de 57 a 667, e de 160 a
725, respectivamente em 2003 e 2004.
As Figuras 11A e 11B mostram os dados referentes ao número e
porcentagem de fêmeas com oviposição e a média de ovos por fêmea,
respectivamente para 2003 e 2004. A média de ovos por fêmea foi de 15,0
em 2003 e de 12,7 em 2004, sendo a variação da média nos potes de
criação de 9,2 a 24,5 em 2003 e 7,0 a 28,4 ovos por fêmea em 2004. A
proporção de fêmeas com postura foi de 29,3% em 2003 e 32,3% em 2004,
ou seja, 715 fêmeas fizeram oviposição com produção de 5143 ovos em
2003 e 4698 em 2004.

As variações de tempo observadas, em condições de laboratório,

para cada uma das fases de desenvolvimento de Lu. longipalpis, de ovo a

55
alado, estão apresentados nas Figuras 12A e 12B, respectivamente para os
anos 2003 e 2004. As fêmeas ovipuseram, em média, após 7 dias a partir da
data da captura, sendo que o período mínimo e máximo para a oviposição
foi de 4 e 13 dias em 2003 e de 4 e 14 dias em 2004.

Observações diárias permitiram determinar o tempo de

desenvolvimento de cada fase; para tanto, acompanhou-se o ciclo evolutivo
a partir dos ovos até a emersão dos alados e verificou-se uma duração total
do ciclo, em média, de 40,9 dias em 2003 e 38,7 dias em 2004, variando de
30 a 52 dias. O período de incubação dos ovos, considerado como o
intervalo entre a postura e a emergência da primeira larva, variou entre 2 a 8
dias, em tempo médio de 5,7 dias em 2003, e de 2 a 14, com média de 6,2
dias, em 2004. A duração da fase larval foi de 17 a 38 dias em 2003 e de 17
a 31 dias em 2004, com duração média de 27,3 e 24,6 dias,
respectivamente. A fase de pupa durou em média 7,8 dias em 2003 e 7,9
dias em 2004, variando de 2 a 14 dias e de 4 a 11 dias em 2004 (Figura 12A
e Figura 12B).

4.2 Infecção experimental de flebotomíneos por Leishmania

chagasi e observação da positividade por microscopia

Do total dos nove experimentos de infecção de Lu. longipalpis por

L. chagasi, em oito foi feito dissecção do trato digestivo e observação da
presença de formas flageladas sob aumento de 400 vezes com a utilização
de microscopia óptica, onde obteve-se um taxa de infecção de 7,1%
(19/269) e 25,0% (19/76), respectivamente para o número de fêmeas
submetidas ao experimento e fêmeas com observação de presença de
sangue de cão (Tabela1).

Um total de 117 fêmeas foi submetido aos cinco experimentos de

infecção através da alimentação dos flebotomíneos diretamente sobre a pele

56
dos cães; destas, 47 provavelmente fizeram o repasto sanguíneo, com 13
positivas para a presença de flagelados, resultando em 27,6% (13/47) de
positividade. Se considerarmos o total de fêmeas que foram submetidas ao
experimento esta positividade cai para 11,1% (13/117).

Com relação à utilização de alimentadores artificiais e formas

amastigotas de L. chagasi, das fêmeas que foram submetidas aos
experimentos, quatro se infectaram, resultando numa positividade de 4,3%
(4/92) e 20% (4/20) se levarmos em consideração a presença de sangue.

Quanto ao experimento utilizando alimentadores artificiais e

formas promastigotas de L. chagasi obtidas em cultura, a positividade obtida
foi de 3,4% (2/60) e 22,2% (2/9) para o total de fêmeas submetidas ao
experimento e com presença de sangue respectivamente.

Dos 15 exemplares F1 de colônia de Lu. longipalpis submetidos

ao repasto em hamster infectado, 10(66,6%) foram positivos na PCR, estes
flebotomíneos não foram dissecados (Tabela 2).

4.3 Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

4.3.1 Amplificação de fragmento de DNA de Lutzomyia sp

A PCR realizada com os oligonucleotídeos desenhados para

amplificar fragmento de DNA de Lu. longipalpis resultou em amplificação de
fragmento de 370 pares de base em todos os exemplares avaliados (Figuras
13 A, 14 A, 15 e 16).

57
 4.3.2 Avaliação do limiar da PCR para detecção de DNA de
Leishmania sp em flebotomíneo

A amplificação de DNA de Leishmania sp em flebotomíneo

artificialmente contaminado revelou a presença de fragmento de 120pb em
todas as diluições testadas (Figuras 13 B e 14 B).

4.3.3 Detecção de Leishmania sp através do parasitológico e

PCR, nos diferentes grupos de Lutzomyia longipalpis (vide item 3.6.1)

Um total de 143 exemplares de Lu. longipalpis foram submetidos

às técnicas de diagnóstico (parasitológico e/ou PCR) para detecção de
Leishmania sp, sendo 45 flebotomíneos coletados em área endêmica, 23 de
campo que foram submetidos à infecção experimental com formas
amastigotas obtidas de macerado de fígado, baço e linfonodo de cães
sabidamente positivos para L. chagasi, 60 de campo e submetidos à
infecção experimental por formas promastigotas de L. chagasi mantidas em
cultura e 15 exemplares F1 que se alimentaram em hamster infectado por L.
chagasi, estes foram avaliados somente por PCR (Tabela 2).
Dos 45 flebotomíneos coletados em campo, em 2 (4,4%)
visualizou-se formas flageladas e 2(4,4%), foram classificados como
suspeitos por não apresentarem flagelo livre aparente. Na PCR, 80% (36/45)
apresentaram amplificação de fragmento de 120pb (Tabela 2 e Figura 17).
A positividade dos 23 exemplares submetidos à infecção por
formas amastigotas foi de 82,6% na PCR, sendo que em um exemplar, a
forma flagelada foi identificada e outro foi classificado como suspeito (Tabela
2 e Figura18).
Na infecção por formas promastigotas de cultura de L. chagasi,
em quatro exemplares não se identificou os flagelos livres e em dois estas
formas foram visualizadas, resultando em uma positividade de 3,3%. Quanto

58
a PCR a amplificação do fragmento de 120pb foi visualizada em 13
exemplares (21,7%) (Tabela 2 e Figura 19).
Os exemplares F1 de colônia, com repasto em hamster infectado
apresentaram 66,6% de positividade na PCR (Tabela 2 e Figura20).
Do total de 329 flebotomíneos submetidos ao diagnóstico
parasitológico e/ou molecular, todos os 21 exemplares positivos pelo método
parasitológico, foram também positivos por PCR. Dos oito classificados
como duvidosos na pesquisa parasitológica, quatro foram confirmados
através da PCR. Dos 95 exemplares positivos por PCR em 60 não foram
encontradas formas promastigotas pela pesquisa parasitológica (Tabela 3).

59
 A

250

200

Quantidade
150
Fêmeas coletadas
em campo em 2003
100

50

0
jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez

Meses

350

300

250
Quantidade

200 Fêmeas coletadas

150 em campo em 2004

100
50

0
jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez

Meses

Figura 9 - Número de fêmeas de Lu. longipalpis capturadas em

campo nos anos: (A) 2003 e (B) 2004.

60
 A

200 1200 6000

700
1000 5000
600
Núm ero de fêmeas
Número de alados

150

Número de ovos
500 800 4000

400 600 3000

100
300
400 2000
50 200
200 1000
100

0 0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - Total -

200
700 1200 6000

600
Número de fêmeas

1000 5000
Número de alados

150

Número de ovos
500
800 4000
400
100
600 3000
300
400 2000
50 200

100 200 1000

0 0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - Total -
Pote de criação

Número de fêmeas Número de alados Número de ovos

Figura 10 - Número de ovos e alados F1 de Lu. longipalpis, produzidos a

partir de fêmeas capturadas no campo, nos anos de 2003 (A) e 2004 (B),
nos diferentes potes de criação (Dados numéricos Tabela A - Apêndice).

61
 A

80 400

No. de fêmeas com oviposição

No.médio de ovos por fêmea
70 350
Porcentagem de fêmeas

60 300

50 250

40 200

30 150

20 100

10 50

0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 T

B
80 400

No. de fêm eas com oviposição

70 350
No.médio de ovos por fêm ea
Porcentagem de fêm eas

60 300

50 250

40 200

30 150

20 100

10 50

0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T

Pote de criação
% fêmeas com oviposição No. médio de ovos por fêmea No. fêm eas com oviposição

Figura 11 - Rendimento em oviposição das fêmeas de Lu. longipalpis

capturadas no campo, nos anos de 2003 (A) e 2004(B), nos diferentes potes
de criação. (Dados numéricos Tabela B - Apêndice).

62
 A
45
40
35
30
25
Dias

20
15
10
5
0
captura a ovos-L1 L1-L2 L2-L3 L3-L4 L4-pupa pupa-alado L1-pupa Ciclo
oviposição completo

Fases de desenvolvimento

45
40
35
30
25
Dias

20
15
10
5
0
captura a ovos-L1 L1-L2 L2-L3 L3-L4 L4-pupa pupa-alado L1-pupa Ciclo
oviposição completo

Fases de desenvolvimento

Figura 12 - Tempo (dias) de desenvolvimento de cada fase do ciclo de Lu.

longipalpis, em condições laboratoriais, nos anos de 2003 (A) e 2004 (B).
(Dados numéricos Tabela C e D - Apêndice).

63
 M 1 2 3 4 5 6 7 C

370 pb →
A

M C+ 1 2 3 4 5 6 7 C

120 pb →

Figura 13 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA extraído segundo protocolo de
Cabrera et al. (2002): (A) com iniciadores para Lutzomyia sp e (B) com
iniciadores para Leishmania sp.
(1 a 7) = Tubos contendo um flebotomíneo e diferentes quantidades de
formas promastigotas, como segue: (1) 104, (2) 103, (3) 102, (4) 101, (5) 100,
(6) 10-1, (7)10-2 ; (C+) Controle com L. chagasi; (C) controle sem DNA; (M) =
marcador de peso molecular em escada de 100pb.

64
 M 1 2 3 4 5 6 7 C

A
370 pb →

M C+ 1 2 3 4 5 6 7 C

B
120 pb →

Figura 14 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de kinetopalsto de Leishmania sp
extraído segundo protocolo de Michalsky et al. (2002): (A) com iniciadores
para Lutzomyia sp e (B) com iniciadores para Leishmania sp.
(1 a 7) = Tubos contendo um flebotomíneo e diferentes quantidades de
formas promastigotas, como segue: (1) 104, (2) 103, (3) 102, (4) 101, (5) 100,
(6) 10-1, (7)10-2 ; (C+) Controle com L. chagasi; (C) controle sem DNA; (M) =
marcador de peso molecular em escada de 100pb.

65
 M C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Neg No M

370 pb →

Figura 15 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 370 pares de base de Lu.
longipalpis. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb; (C+) =
controle positivo; (1 a 15) = exemplares de flebotomíneos submetidos ao
experimento de infecção experimental por formas amastigotas de
Leishmania sp; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados
numéricos Tabela E – Apêndice; 1 a 15 corresponde aos exemplares
identificados por A3 a A17).

66
 M C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Neg No

370 pb →

Figura 16 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 370 pares de base de Lu.
longipalpis. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb; (C+) =
controle positivo; (1 a 4) = exemplares de flebotomíneos submetidos ao
experimento de infecção experimental por formas amastigotas de
Leishmania sp; (5 A 16) = exemplares de flebotomíneos coletados em
campo; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA.

67
 M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Neg No

120 pb →

Figura 17 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 16) = exemplares de flebotomíneos coletados
em campo; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados numéricos
Tabela F – Apêndice; 1 a 16 corresponde aos exemplares identificados por
C9, 13, 15, 16, 20, 21, 23, 24, 26, 27 a 33).

68
 M C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Neg No

120 pb →

Figura 18 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 13) = exemplares de flebotomíneos submetidos
ao experimento de infecção experimental por formas amastigotas de
Leishmania sp; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados
numéricos Tabela E – Apêndice; 1 a 13 corresponde aos exemplares
identificados por A1 a A13).

69
 M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Neg No M

120 pb →

Figura 19 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 15) = exemplares de flebotomíneos submetidos
ao experimento de infecção experimental por formas promastigotas de
Leishmania sp; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados
numéricos Tabela G – Apêndice; 1 a 15 corresponde aos exemplares
identificados por P 23 a P37).

70
 M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Neg Neg No M

120 pb →

Figura 20 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de

prata. Amplificação de fragmento de DNA de 120 pares de base de
Leishmania sp. (M) = marcador de peso molecular em escada de 100pb;
(C+) = controle positivo; (1 a 14) = exemplares F1 de flebotomíneos de
colônia controlada com repasto em hamster infectado por Leishmania
chagasi; (Neg) = controle negativo e (No) sem DNA. (Dados numéricos
Tabela H – Apêndice; 1 a 14 corresponde aos exemplares identificados por
F1 a F14).

71
Tabela 1 - Resultados do exame parasitológico de exemplares fêmeas de
flebotomíneos submetidas aos experimentos de infecção de Lu. longipalpis
em condições laboratoriais, realizados através de repasto em cão infectado
com L. chagasi (experimentos 1 a 5), com alimentadores artificiais contendo
formas amastigotas de L. chagasi (experimentos 6 e 7) e com alimentadores
artificiais contendo formas promastigotas de cultura (experimento 8).

Número (%) de Fêmeas submetidas ao experimento

Fêmeas com sangue**

Experimento Total Positivas Negativas
Total Positivas

1* 35 11(31,4%) 24 35 11(31,4%)
2 28 0 (0%) 28 0 0 (0%)
3 16 0 (0%) 13(11,1%) 16 0 0 (0%) 13(27,6%)
4 14 1 (7,1%) 13 9 1(11,1%)
5 24 1 (4,2%) 23 3 1(33,3%)
6 52 3 (5,7%) 4(4,3%) 49 6 3(50,0%) 4(20%)
7 40 1 (2,5%) 39 14 1 (7,1%)
8 60 2 (3,4%) 58 9 2(22,2%)
Total 269 19 (7,1%) 250 76 19(25%)
* No experimento 1 todos exemplares foram considerados como “fêmeas com sangue”.
** Fêmeas com presença de sangue visíveis a olho nu.
Positivas – presença de formas flageladas de Leishmania sp
Negativas – Ausência de formas flageladas de Leishmania sp

72
Tabela 2 - Resultados do exame parasitológico e de PCR para detecção de
Leishmania sp de flebotomíneos coletados no campo ou produzidos em
laboratório e submetidos ou não aos experimentos de infecção com L.
chagasi.
Resultados do exame

Número de Parasitológico (%) PCR(%)

Grupo
fêmeas
Positivas Suspeitas Negativas Positivas Negativas
A 45 2(4,4%) 2(4,4%) 41(91,1%) 36(80,0%) 9(20,0%)

B 23 1(4,3%) 1(4,3%) 21(91,3%) 19(82,6%) 4(17,4%)

C 60 2(3,3%) 4(6,6%) 54(90,0%) 13(21,7%) 47(78,3%)

Não Não Não

D 15 10(66,6%) 5(33,3%)
realizado realizado realizado
Total 143 5(3,9%) 7(5,5%) 116(90,6%) 78(54,5%) 65(45,5%)
A = exemplares fêmeas coletadas em campo e examinadas por técnica parasitológica e PCR
B = exemplares fêmeas coletadas em campo, submetidas à infecção experimental com amastigotas e examinadas
por técnica parasitológica e PCR
C = exemplares f6emeas coletadas em campo e submetidas à infecção experimental com promastigotas e
examinadas por técnica parasitoógica e PCR
D = exemplares F1 produzidos em laboratório e submetidas à infecção experimental em hamster e examinadas por
PCR

73
Tabela 3 - Comparação entre os resultados dos métodos parasitológico e
PCR na totalidade dos exemplares estudados, incluindo-se os submetidos à
infecção experimental e coletados em campo.

Parasitológico
Positivo Duvidoso Negativo Não Total
realizado
Positivo 21 4 60 10 95

PCR Negativo 0 4 56 5 65

Não 0 0 169 0 169

realizado

Total 21 8 285 15 329

74
 5. DISCUSSÃO

A colonização de flebotomíneos torna possível o estudo de seu

ciclo de vida e aspectos da biologia e fisiologia (Sherlock & Sherlock,1959).

No nosso trabalho, buscamos a produção de indivíduos de

primeira geração, garantidamente não contaminados, para extração de DNA
e padronização da técnica de PCR para identificação de flebotomíneos
experimentalmente contaminados ou infectados com L. chagasi.

A espécie vetora de L. chagasi, o flebotomíneo Lu. Longipalpis é

considerada um complexo de espécies (Lanzaro et al. 1993) e, portanto a
produtividade de diferentes colônias pode variar.

Killick-Kendrick et al. (1991) listam 114 trabalhos publicados sobre

a colonização de 44 espécies de flebotomíneos, sendo as mais comuns
Phebotomus papatasi e P. peniciosus no Velho Mundo e Lu. longipalpis, Lu.
gomezi, Lu sanguinea, neotropicais, além de um apanhado geral sobre a
metodologia de criação dessas espécies. Como não há um método universal
onde todas as espécies respondam da mesma maneira, utilizamos uma
variação do método de Killick-Kendrick, sugerido por Brazil e Gomes Brazil
(2003).

Segundo Killick-Kendrick (1991), a implantação de uma colônia de

flebotomíneos é muito mais difícil do que sua manutenção. Diversos
aspectos devem ser observados durante este processo de estabelecimento
de colônia, desde as técnicas de captura das matrizes, alimentação
sanguínea, escolha e preparo da ração larval, potes de oviposição e criação,
temperatura, umidade relativa do ar, enfim, todos os fatores que possam
influenciar, tanto na duração do ciclo como na produtividade da colônia.

Quando comparamos nossos resultados com o de outras

colônias, observamos que o rendimento final obtido foi satisfatório. Blanco
(1995) obteve um rendimento do total de ovos desenvolvidos até adultos de
10,9%, quando trabalhou com Lu. ovallesi, 13% trabalhando com Lu. youngi

75
e 36% na colonização de Lu. migonei. Rangel et al. (1985), trabalhando com
Lu. intermedia, obteve uma proporção de adultos formados a partir de ovos,
na primeira geração de 34,4% e na quarta geração, de 17,7%. No total das
quatro gerações, obteve 28,5% de flebótomos adultos, a partir de 14.658
ovos. Em 2003, o rendimento médio obtido em nosso laboratório, do total de
ovos desenvolvidos até alados, foi de 16,4%, de um total de 5143 ovos, já
em 2004 o rendimento caiu para 7,7% de 4698 ovos, porém houve variações
nos diferentes potes de criação.

Blanco (1995) constatou que o êxito da colonização não está

relacionado com o número de fêmeas para o início da colônia, segundo ela,
Beach et al. (1983) iniciaram uma colônia de P. martini com 12 fêmeas que
produziram 86 alados a partir de 250 ovos, com uma média de 20 ovos por
fêmea e obteve 26% de sobrevivência das fêmeas após a primeira
oviposição. Nossos dados são concordantes com essas observações, pois
no ano de 2003 o pote 15 iniciou-se com 31 fêmeas e obteve 85,9% de
alados produzidos a partir de 57 ovos, enquanto o pote seis teve uma
produção de apenas 10,6% de alados com 172 fêmeas.

Rangel (1985) obteve na primeira geração de Lu. intermedia,

75,4% de fêmeas que desovaram com uma média de 40.2 ovos por fêmeas.
No nosso experimento a proporção de fêmeas com postura foi
comparativamente mais baixa, porém variou de 9,7 a 75,7% em 2003 e 12,4
a 64,9% em 2004, com uma média de 15,0 e 12,7 ovos por fêmeas em 2003
e 2004 respectivamente.

De acordo com Chaniotis (1967), para cada espécie, o número de

ovos maduros depende da quantidade de sangue ingerido. Observamos
uma grande variação do número de ovos postos, de 1 a 62 por fêmea, além
da observação de elevado número de ovos retidos.

O ciclo evolutivo de Lu. longipalpis, seguiu o esperado com uma

variação de 30 a 52 dias e com média de 40,9 em 2003 e 38,7 dias em
2004. O ciclo de Lu. intermedia observado por Rangel (1985) teve uma
variação de 26 a 56 dias e segundo Blanco (1995), Lu. ovallesi, Lu. migonei

76
e Lu. youngi tiveram um ciclo médio de 48,9, 44,0 e 56,3 dias
respectivamente.

As principais dificuldades encontradas para o estabelecimento da

colônia foram em relação à alta mortalidade, acentuada no primeiro estadio
larval, e ao alto índice de mortalidade das fêmeas grávidas, antes e durante
a oviposição, onde observamos um grande número de fêmeas mortas com
ovos retidos e à proliferação de fungos. Durante este período de
observação, houve perda de três potes de criação em 2003 e de seis em
2004, principalmente por contaminação com fungos.

Quanto aos experimentos de infecção de flebotomíneos por L.

chagasi, do total de 269 fêmeas submetidas ao repasto infectante, 76 se
apresentaram com sangue (28,3%). Se considerarmos os experimentos de 1
a 5, onde os flebotomíneos foram alimentados diretamente sobre a pele de
cães naturalmente infectados, do total de 117 fêmeas 47 fizeram o repasto,
lembrando que no primeiro experimento todas as 35 fêmeas submetidas ao
experimento entraram na somatória das fêmeas com repasto, já que esta
condição não pode ser verificada; assim, a positividade total das fêmeas
para a presença de Leishmania sp de foi de 27,6%. Se o número de fêmeas
do primeiro experimento que de fato fizeram repasto foi menor, esta
positividade poderia ter sido maior.

Também Cabrera et al. (2003) observaram que nem todas as

fêmeas de Lu. longipalpis, que foram submetidas ao repasto em hamster o
fizeram, cerca de 25,8% (31/120) e 26,5% (53/200) apresentaram presença
de sangue.

Chagas (1940) observou positividade de 27,9% de “F.

Intermedius” que se alimentaram em cão naturalmente infectado por L.
chagasi e seis “F. longipalpis” positivas de oito que fizeram o repasto no
mesmo cão, com 75% de positividade.

Silva et al. (1990) verificando a suscetibilidade de fêmeas de

colônia de Lu. longipalpis a diferentes espécies e raças de leishmânias,
relataram diferentemente dos nossos resultados, que não conseguiram

77
infecção quando estas foram submetidas a cães naturalmente infectados por
L. chagasi, ao passo que a positividade das fêmeas alimentadas em cães
infectados experimentalmente por esta espécie foi de 13%. Quanto a L.
guyanensis, L. amazonensis e L. braziliensis a taxa de infecção dos
flebotomíneos submetidos experimentalmente ao repasto em hamster
infectado com as referidas espécies de leishmânias foi de 100%, 37% e 9%
respectivamente.

Vexenat et al. (1986) trabalhando com Lu. whitmani e três cães

infectados com L. braziliensis, observaram 8,3%, 7,1% e 1,8% de
flebotomíneos infectados quando o repasto se deu em cima das lesões dos
respectivos cães, vale ressaltar que os 180 flebotomíneos que se
alimentaram fora das lesões, não se infectaram.

A positividade do experimento de repasto dos flebotomíneos

diretamente sobre os cães foi de 11,1%, se levarmos em conta todos os
exemplares submetidos ao experimento, portanto foi maior do que quando
utilizamos alimentadores artificiais (3,9%), bem como a porcentagem de
fêmeas nas quais notamos presença de sangue, 40,0% e 19,1%
respectivamente. A positividade observada pela microscopia foi bem inferior
quando comparada com a da PCR, observamos também que no
experimento de infecção experimental por formas promastigotas, em 9
exemplares observamos presença de sangue, e pela PCR 13 positivaram,
portanto mesmo algumas fêmeas identificadas como com ausência de
sangue, na PCR mostraram-se positivas para presença de Leishmania sp,
salientamos também que as fêmeas classificadas como ingurgitadas foram
as que visivelmente estavam repletas de sangue.

Aransay et al. (2000) coletaram exemplares em sete localidades

da Grécia e identificaram, por PCR, infecção por Leishmania em
flebotomíneos de diferentes espécies [Phlebotomus (Phlebotomus) papatasi,
Phlebotomus (Paraphlebotomus) alexandri, Phlebotomus (Paraphlebotomus)
sergenti, Phlebotomus (Larrossius) neglectus, Phlebotomus (Larrossius)
tobbi, Phlebotomus (Adlerius) simici e Sergentomyia minuta]; verificaram

78
uma positividade de 6,7% entre os flebotomíneos sem sangue e uma
positividade de 4,8% nos exemplares com presença de sangue, quando
coletados. Sugere-se que a taxa de infecção relativamente elevada,
encontrada principalmente nos exemplares sem presença de sangue, tenha
sido devida à alta sensibilidade da técnica; além disso, é possível que muitos
dos exemplares positivos tenham sido coletados em uma mesma localidade,
com grande chance de ter-se alimentado no mesmo animal infectado.

No nosso trabalho, com relação ao experimento de infecção

através de alimentadores artificiais, das 152 fêmeas submetidas, em 29
notamos a presença de sangue (19,1%), e destas em seis observamos
formas flageladas, portanto uma taxa de infecção de 20,7% na microscopia.

Cabrera et al. (2002) avaliaram as condições e práticas

adequadas para o armazenamento de flebotomíneos com o objetivo de
aplicar a técnica de PCR. Após infecção experimental dos flebotomíneos
com uma cepa de L. chagasi do Vale do Rio Magdalena (Quipile,
Cundinamarca), os insetos infectados foram preservados em três soluções
diferentes: etanol a 100%, etanol a 70% e buffer Tris-EDTA (TE) e foram
mantidos a -80°C, -20°C e a temperatura ambiente. Concluíram que as
amostras entomológicas podem ser preservadas a temperatura ambiente em
etanol a 70%, facilitando assim seu uso em estudos epidemiológicos em
áreas endêmicas. Nós optamos por conservar as amostras em etanol 70% a
-20ºC até serem processadas.

Testamos dois protocolos de extração de DNA de flebotomíneos,

segundo Michalsky et al. (2002) utilizando fenol/clorofórmio e Cabrera et al.
(2002) com uso do Chelex e a reação de PCR para Lu. longipalpis realizada
resultaram em amplificação de fragmento de 370 pares de base em todos
exemplares avaliados.

Segundo Arez et al. (2000), podem existir certos inibidores nos

tecidos dos insetos, que liberados no processo de extração pode diminuir a
sensibilidade da PCR. Estes autores observaram melhores resultados
utilizando o Triton X 100 1% e DTT ou Chelex. Nós obtivemos bons

79
resultados com o protocolo de Michalsky para a extração de DNA e
amplificação tanto do fragmento de 370pb de Lu. longipalpis como do
fragmento de 120pb da Leishmania sp, apesar de termos que diluir algumas
amostras para minimizar este efeito de inibição, optamos pelo o uso do
fenol/clorofórmio, por ter menor custo.

Michalsky et al. (2002) aplicaram a PCR para investigar a

presença de Leishmania em flebotomíneos. Três pares de
parasita/flebotomíneos foram testados: Lu. longipalpis e L. chagasi, Lu.
migonei e L. amazonensis e Lu. migonei e L. braziliensis. A infecção com
pouco menos do que 10 Leishmania sp por flebotomíneos, foram suficientes
para a amplificação com primers gênero específico.

Em nosso experimento, após contaminação artificial dos

flebotomíneos, com diluições seriadas, na base 10, de formas promastigotas
de L. chagasi, mantidas em cultura, um fragmento de 120 pb foi revelado em
todas as diluições testadas de 104 a 10-2 sendo, portanto uma ferramenta
adequada na detecção de flebotomíneos infectados.

Quando comparamos o resultado do exame parasitológico para

pesquisa de Leishmania sp nos exemplares de Lu. longipalpis com o da
PCR, este resultou em maior positividade, uma vez que, do total de 128
exemplares submetidos as duas técnicas de diagnóstico, em 53,1% (68/128)
houve amplificação do fragmento de 120pb esperado, e em apenas 5 foram
vistos formas flageladas de Leishmania sp (3,9%) sendo que 7 exemplares
foram classificados como suspeitos por não apresentarem as formas
flageladas.

Todos exemplares classificados como positivos no diagnóstico

parasitológico foram confirmados pela PCR, dos classificados como
suspeitos quatro não positivaram na PCR, talvez por se tratar da presença
de algum outro parasito que se confunde com a forma não flagelada da
Leishmania. Quando Rodriguez et al. (1999) processaram 65 exemplares
com presença de flagelados, utilizando a técnica de PCR e hibridização para

80
identificação da espécie, em apenas cinco, confirmou a presença de L.
braziliensis, mostrando a limitação da microscopia.

No Irã em um foco de leishmaniose cutânea, Parvizi et al. (2005)

detectaram 32,7% de positividade nos exemplares de P. papatasi infectados
por L. (L.) major quando submetidos à técnica da PCR. Já Gómez-Saladin et
al. (2005) trabalhando com L. infantum e P. perfiliewi e P. perniciosus,
obtiveram pela PCR 2,0% de positividade em uma área nas províncias da
Sicília e Agrigento na Itália.

A positividade total encontrada pela PCR nos exemplares

capturados em campo no nosso trabalho foi consideravelmente alta se
comparar-mos com os resultados da positividade encontrada nos
experimentos de infecção experimental. Acreditamos que contribuiu para
esta positividade a área escolhida para as capturas em campo, uma vez que
se trata de um setor do Município de Araçatuba com alta positividade
humana e prevalência canina, salientando que três exemplares foram
capturados sobre humano com LVA e outros cinco sobre cão com toda
sintomatologia, além de sempre ter a presença de cães nos imóveis
escolhidos para as capturas.

Salientamos que nossos dados de campo não podem ser

comparados com outros, primeiramente porque não se tratou de um estudo
epidemiológico, nossas capturas foram direcionadas com o objetivo de
capturar exemplares positivos para testarmos a técnica de PCR. Nossa
realidade é bem diferente das citadas, temos outro vetor, parasita e
condições ecológicas diferenciadas.

A positividade obtida pela PCR nos experimentos de infecção

experimental foi de 82,6%, 21,6% nos experimentos de infecção por formas
amastigotas e promastigotas, respectivamente, utilizando-se alimentadores
artificiais e 66,6% no repasto em hamster infectado, salientando que os
flebotomíneos submetidos ao repasto em hamster eram exemplares F1 de
colônia controlada, portanto a técnica apresentou um bom resultado.

81
 Paiva (2005) em seu experimento de infecção experimental por
formas promastigotas obteve 88,8%, 44,4% e 83,4% respectivamente para
diferentes primers, DNAr, Pg e PV e 50%, 45,4% e 45,4% utilizando os
mesmos primers, na infecção com formas amastigotas. Já no nosso
experimento a positividade obtida com o uso de formas amastigotas foi
maior do que na infecção com formas promastigotas.

Uma dificuldade encontrada nos estudos epidemiológicos é a

necessidade de se examinar grande quantidade de exemplares, o que torna
o custo elevado, pois há necessidade de se contar com funcionários
especializados, submetidos a constantes ciclos de capacitação e reciclagem;
além disso, é preciso lembrar as limitações da técnica de dissecação
empregada na pesquisa de formas flageladas da Leishmania sp, que é
extremamente demorada e pouco específica, já que a presença de
flagelados de outras espécies parasitárias pode dar origem a resultados não
conclusivos na microscopia. A técnica de PCR, devidamente padronizada e
aplicada de forma correta, pode se constituir em ferramenta importante nos
estudos epidemiológicos para identificação de flebotomíneos infectados e
determinação das taxas de infecção dos mesmos nas áreas endêmicas para
leishmaniose visceral.

82
 6. CONCLUSÕES

A metodologia adotada para a colonização de flebotomíneos foi

adequada para obtenção de exemplares de primeira geração (F1) para a
infecção experimental em hamster infectado com Leishmania chagasi.

O repasto diretamente sobre cães, positivos para Leishmania sp e
sintomáticos, foi o que apresentou melhores resultados para infecção
experimental de flebotomíneos.

A infecção através de alimentadores artificiais com formas amastigotas
de L. chagasi foi mais eficiente que com as formas promastigotas de
cultura.

A técnica de PCR padronizada resultou na amplificação de um fragmento
de DNA de Lu. longipalpis de 370pb (fragmento controle) e de um
fragmento de DNA de Leishmania sp de 120pb (fragmento positivo) em
todos os exemplares de flebotomíneos com pesquisa microscópica
positiva para presença de Leishmania sp.

Ao comparar a microscopia direta do trato digestivo e a técnica de PCR,
a última demonstrou maior sensibilidade para detecção de flebotomíneos
infectados por L. chagasi, tanto para os experimentalmente infectados
como os capturados em campo.

A alta positividade por PCR (80%) detectada para os flebotomíneos
capturados em campo pode ser explicada pela forma como foi
direcionada esta captura, privilegiando um setor do Município de
Araçatuba com alta positividade, tanto entre humanos como cães, e
exemplares capturados sobre pacientes com LVA e cães potencialmente
infectados.

83
 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nossos resultados demonstraram a potencialidade da técnica de

PCR padronizada para detecção de flebotomíneos infectados.
O uso de técnicas de biologia molecular, ao possibilitar a
automação do processo de detecção de flebotomíneos infectados, permitiria
a identificação de um grande número de exemplares em um tempo bem
menor, como requer os estudos epidemiológicos; além disso, a leitura
objetiva, feita através de equipamentos eletrônicos, dispensaria a
necessidade de profissionais altamente capacitados para a dissecação e
identificação microscópica das formas parasitárias presentes nos
flebotomíneos, que é trabalhosa e extremamente demorada.
A técnica de PCR descrita no presente trabalho necessita de
melhor avaliação para aplicação em estudos epidemiológicos, submetendo a
esta técnica uma amostragem significativa de flebotomíneos capturados em
campo, de diferentes regiões, endêmicas e não endêmicas para
leishmaniose visceral, e comparando os resultados obtidos em regiões com
diferentes características epidemiológicas em relação a esta doença
parasitária.

84
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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95
9. ANEXOS

96
 Anexo 1

Boletim para captura de flebotomíneos - Frente

Verso
 Anexo 2

Termo de doação para entrega de cães ao Centro de

Controle de Zoonoses de Araçatuba.
 Anexo 3

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo

Lutz.
 Anexo 3

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo

Lutz.
10. APÊNDICE
Tabela A - Número de exemplares das diferentes fases evolutivas de Lu.
longipalpis, produzidas em laboratório a partir de fêmeas coletadas em
campo, nos anos de 2003 e 2004.

2003 2004
Pote Pote
Nº FCC O M-F1 F-F1 A-F1 (% ) Nº FCC O M-F1 F-F1 A-F1 (% )

1 46 587 32 18 50 (8,5) 1 161 161 35 37 72 (44,7)

2 80 414 57 16 73 (17,6) 2 163 203 16 18 34 (16,7)
3 33 391 36 25 61 (15,6) 3 104 421 15 17 32 (7,6)
4 21 123 19 7 26 (21,1) 4 61 419 22 24 46 (10,9)
5 45 365 43 29 72 (19,7) 5 165 675 52 52 104 (15,4)
6 172 451 27 21 48 (10,6) 6 105 428 5 0 5 (1,2)
7 135 632 41 16 57 (9,0) 7 123 527 16 10 26 (4,9)
8 150 278 12 13 25 (8,9) 8 37 469 3 7 10 (2,1)
9 124 667 48 43 91 (13,6) 9 21 312 5 13 18 (5,7)
10 93 185 33 39 72 (38,9) 10 130 725 2 2 4 (0,5)
11 62 92 13 8 21 (22,8) 11 37 198 5 5 10 (5,1)
12 48 208 16 21 37 (17,8) 12 40 160 0 0 1 (0,6)
13 39 100 1 2 3 (3,0)
14 96 593 97 63 160 (26,9)
15 31 57 30 19 49 (85,9)
Total 1175 5143 505 340 845 (16,4) Total 1147 4698 176 185 362 (7,7)
FCC = Fêmeas coletadas em campo
O = Ovos
M-F1 = Machos F1
F-F1 = Fêmeas F1
A-F1 = Alados F1
(%) = Porcentagem de alados F1 produzidos a partir de ovos
Tabela B - Número de exemplares fêmeas de Lu. longipalpis, com
oviposição e porcentagem em relação ao número de fêmeas coletadas em
campo e número médio de ovos por fêmea, nos anos de 2003 e 2004.

2003 2004
Pote Nº Pote Nº
FCO (%) O/F FCO (%) O/F

1 24 52,2% 24,5 1 20 12,4% 8,1

2 32 40,0% 12,9 2 29 17,8% 7,0
3 25 75,7% 15,7 3 24 23,1% 17,5
4 10 47,6% 12,3 4 34 55,7% 12,3
5 18 40,0% 20,3 5 57 34,5% 11,8
6 32 18,6% 14,1 6 26 24,8% 16,5
7 45 33,3% 14,0 7 45 36,6% 11,7
8 25 16,7% 11,1 8 24 64,9% 19,5
9 52 41,9% 12,8 9 11 52,4% 28,4
10 17 18,3% 10,9 10 69 53,1% 10,5
11 10 16,1% 9,2 11 16 43,2% 12,4
12 13 27,1% 16,0 12 16 40,0% 10,0
13 7 17,9% 14,3
14 31 32,3% 19,1
15 3 9,7% 19,0
Total 344 29,3% 15,0 Total 371 32,3% 12,7

FCO = Fêmeas com oviposição

(%) = porcentagem de FCO em relação ao número de fêmeas capturadas em campo
O/F = Ovos por FCO (número médio)
Tabela C - Tempo de desenvolvimento de cada fase evolutiva de Lu.
longipalpis em condições de laboratório, no ano de 2003.

Nº Tempo em dias
pote Intervalo pupa- Ciclo
captura a oviposição ovos-L1 L1-L2 L2-L3 L3-L4 L4-pupa L1-pupa alado total
1 6 6 17 8 7 3 35 8 49
2 4 7 5 20 10 3 38 7 52
3 6 2 7 16 5 1 29 14 45
4 6 6 8 7 11 1 27 7 40
5 4 5 8 7 6 1 22 8 35
6 7 4 14 9 6 7 36 7 47
7 6 5 13 6 9 2 30 8 43
8 6 8 7 6 5 6 24 10 42
9 6 5 10 11 8 1 30 8 43
10 7 7 6 6 6 6 24 8 39
11 11 7 10 1 1 9 21 8 36
12 8 5 12 2 8 3 25 7 37
13 7 8 6 6 6 7 25 2 35
14 5 5 7 1 5 4 17 8 30
15 13 6 6 9 6 6 27 8 41
Média 6,8 5,7 9,1 7,6 6,6 4,0 27,3 7,8 40,9

Tabela D - Tempo de desenvolvimento de cada fase evolutiva de Lu.

longipalpis em condições de laboratório, no ano de 2004.

Tempo em dias
Nº
pote Intervalo pupa- Ciclo
captura a oviposição ovos-L1 L1-L2 L2-L3 L3-L4 L4-pupa L1-pupa alado total
1 6 7 3 6 3 5 17 8 32
2 6 7 8 8 8 4 28 8 43
3 6 6 10 6 4 3 23 8 37
4 8 2 6 6 8 1 21 8 31
5 4 14 8 2 7 6 23 7 44
6 9 11 3 12 6 1 22 9 42
7 14 5 13 8 1 7 29 6 40
8 6 2 11 7 1 11 30 4 36
9 6 7 8 6 3 11 28 10 45
10 10 3 9 7 7 1 24 11 38
11 7 6 5 8 2 4 19 9 34
12 8 5 7 9 6 9 31 7 43
Média 7,5 6,2 7,6 7,1 4,7 5,2 24,6 7,9 38,7
Tabela E – Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares
de flebotomíneos submetidos ao experimento de infecção experimental por
formas amastigotas de Leishmania chagasi.

Infecção experimental com formas amastigota de Leishmania chagasi

PCR PCR

Id.* Paras. * Leishmania sp Lutzomyia Id.* Paras. * Leishmania sp Lutzomyia

A1 n p p A13 n p p
A2 n n p A14 n n p
A3 n p p A15 n n p
A4 n p p A16 n p p
A5 n p p A17 n p p
A6 n p p A18 n p p
A7 n p p A19 n p p
A8 n p p A20 n p p
A9 n p p A21 p p p
A10 n p p A22 s p p
A11 n p p A23 n p p
A12 n n p
Id.* = identificação
Paras.* = parasitológico
n = negativo (ausência de formas parasitárias identificadas como Leishmania)
p = positivo (presença de formas parasitárias identificadas como Leishmania)
Tabela F – Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares
de flebotomíneos coletados em campo.

Flebotomíneos coletados em campo com avaliação microscópica

PCR PCR

Id.* Paras. * Leishmania sp Lutzomyia Id.* Paras. * Leishmania sp Lutzomyia

C1 n p p C23 n p p
C2 n p p C24 n p p
C3 n n p C25 n p p
C4 n n p C26 n p p
C5 n p p C27 n p p
C6 n p p C28 n p p
C7 n n p C29 n p p
C8 n p p C30 n p p
C9 n n p C31 n p p
C10 p p p C32 n p p
C11 n p p C33 n n p
C12 n p p C34 n p p
C13 n n p C35 n p p
C14 n p p C36 n p p
C15 n n p C37 n p p
C16 n n p C38 n p p
C17 n p p C39 n p p
C18 n p p C40 n p p
C19 n p p C41 n p p
C20 n p p C42 n p p
C21 n n p C43 p p p
C22 n p p C44 s p p
C45 s p p
Id.* = identificação
Paras.* = parasitológico
n = negativo (ausência de formas parasitárias identificadas como Leishmania)
p = positivo (presença de formas parasitárias identificadas como Leishmania)
Tabela G – Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares
de flebotomíneos submetidos ao experimento de infecção experimental por
formas promastigotas de Leishmania chagasi.

Experimento infecção experimental com promastigota

PCR PCR

Id.* Paras. * Leishmania sp Lutzomyia Id.* Paras. * Leishmania sp Lutzomyia

P1 n p p P31 n n p
P2 n p p P32 n n p
P3 p p p P33 n n p
P4 n n p P34 n n p
P5 n n p P35 n p p
P6 n p p P36 n n p
P7 n n p P37 n n p
P8 n n p P38 n n p
P9 n n p P39 n n p
P10 n n p P40 n n p
P11 n n p P41 n p p
P12 n p p P42 n p p
P13 n n p P43 n n p
P14 n n p P44 n p p
P15 n n p P45 n p p
P16 n n p P46 n n p
P17 n n p P47 n n p
P18 p p p P48 n n p
P19 n n p P49 n n p
P20 n n p P50 n n p
P21 n n p P51 ps n p
P22 n n p P52 ps n p
P23 n p p P53 ps n p
P24 n n p P54 n n p
P25 n n p P55 n n p
P26 n n p P56 n n p
P27 n p p P57 n n p
P28 n n p P58 ps n p
P29 n n p P59 n n p
P30 n n p P60 n n p
Id.* = identificação
Paras.* = parasitológico
n = negativo (ausência de formas parasitárias identificadas como Leishmania)
p = positivo (presença de formas parasitárias identificadas como Leishmania)
Tabela H – Resultados do exame parasitológico e da PCR dos exemplares
de flebotomíneos F1 submetidos ao experimento de infecção experimental
por Leishmania chagasi.

PCR
Leishmania sp Lutzomyia
Identificação Parasitológico ND* D*
F1 NR* n p p
F2 NR* n n p
F3 NR* n n p
F4 NR* n n p
F5 NR* p p p
F6 NR* p p p
F7 NR* p p p
F8 NR* n n p
F9 NR* p p p
F10 NR* p p p
F11 NR* p p p
F12 NR* n p p
F13 NR* p p p
F14 NR* n n p
F15 NR* p p p
NR* = não realizado
ND* = amostras de DNA não diluído
D* = amostras de DNA diluído em água