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Bacteriología
Curso de Bacteriología
HISTORIA
Curso de Bacteriología
THEODOR ESCHERICH 1886
Curso de Bacteriología
Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron
realizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.
Curso de Bacteriología
En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos con
disturbios intestinales “un vibrión” microaerófilo, al que
denominaron Vibrio jejuni.
En 1944 Doyle describió “un vibrión” aislado del intestino de
cerdos con diarrea y lo denominó Vibrio coli.
Curso de Bacteriología
En 1957 E. King
Estudia las características de
Vibrios aislados de diferentes
fuentes.
Estableció que no todos
correspondían a Vibrio fetus .
Determinó dos grupos con
características serológicas y
bioquímicas diferentes
Algunos eran capaces de crecer a
25 y 37°C
Otros lo hacían a 42°C, a estos
† Elizabeth King 1966
los consideró como “Vibrios
“related Vibrio” relacionados” y se comprobó que
eran agentes causantes de diarrea
aguda.
Curso de Bacteriología
En 1972 Dekeyser y Butzler aislaron
los microorganismos de las heces de
pacientes con enteritis aguda usando
una técnica de filtración que permitía
el pasaje de pequeños bastones
curvos a través de una membrana,
pero retenía microorganismos fecales
más grandes.
Curso de Bacteriología
La primera asociación entre “vibriones” microaerófilos
y diarrea en el hombre fue sugerida por Levy en 1946,
el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritis
sobre 357 pacientes en un penal en Illinois,
observando en exámenes directos la presencia de
vibrios en el 20% de las muestras.
Curso de Bacteriología
Taxonomía
REINO Procaryotae
DIVISION Gracillicutes
CLASE Proteobacteria
FAMILIA Campylobacteraceae
GENEROS Campylobacter
Arcobacter
Sulfospirillum
ESPECIE Bacteroides ureolyticus
Curso de Bacteriología
PFEIFFER 1987
Describe:
- hallazgos clínicos post-mortem en
intestino grueso compatibles con
enteritis por Campylobacter
- bacterias espiraladas, de 2 a 3 vueltas
regulares, móviles, no cultivables
Curso de Bacteriología
Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron
realizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.
Curso de Bacteriología
CAMPYLOBACTER : taxonomía y nomenclatura
V. jejuni
V. coli Related V. fetus
Vibrios
V. hepaticus
C. fetus subsp.
C. fetus intestinalis
subsp. jejuni
Curso de Bacteriología
Género % G-C Metabolismo
Curso de Bacteriología
Vandamme y col. 1992
Curso de Bacteriología
Vandamme y col. 1992
Superfamilia VI del rARN
Campylobacter
Bacteroides ureolyticus
Campylobacteraceae
Arcobacter
Flexispira
Wolinella
rRNA superfamilias I a V
Helicobacter
Curso de Bacteriología
Vandamme y col. 1992
Cambios de Nomenclatura
Curso de Bacteriología
Vandamme y col. 1992
FAMILIA
CAMPYLOBACTERACEAE
Curso de Bacteriología
ESPECIES DEL GÉNERO ARCOBACTER
CARACTERÍSTICAS
• bacilos gram negativos curvos
• cultivos viejos: formas cocoides y
• A. nitrofrigilis* filamentos largos
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ESPECIES DEL GÉNERO
SULFUROSPIRILLUM
• S. deleyianum* CARACTERÍSTICAS
• bacilos gram negativos curvos
• S. archaconense • oxidasa positivos
• crecen entre 8 y 36ºC
• de difícil cultivo ¿fastidiosos?
• S. arsenophilum
• G + C 32 a 42 mol%
• de vida libre
• S. barnesii • asociados a presencia de metales
Curso de Bacteriología
ESPECIE
BACTEROIDES UREOLYTICUS
Curso de Bacteriología
ESPECIES DE CAMPYLOBACTER
Campylobacter lari
• ssp. lari (cepas clásicas NARTC)
• ssp. ureasum (variedades atípicas -urea neg, AN S)
• ssp. subantaricum (animales subantárticos)
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Especies de Campylobacter emergentes o
con patogenicidad no bien establecida
• C. jejuni ssp. doylei
•C. hyointestinalis (hyointestinalis, lawsonii)
• C. sputorum (sputorum, fecalis, ureolyticus)
• C. concisus
• C. mucosalis
• C. gracilis
• C. rectus
• C. curvus
• C. lenienae
Curso de Bacteriología
Especies de Campylobacter no patógenos
para el hombre
Curso de Bacteriología
Curso de Bacteriología
Curso de Bacteriología
CEPA CONTROL POSITIVO: C. jejuni
CEPA CONTROL NEGATIVO (DÉBIL): C. upsaliensis ATCC 43954
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CEPA CONTROL POSITIVO: Campylobacter jejuni ssp jejuni
CEPA CONTROL NEGATIVO: Escherichia coli
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA
CARACTERÍSTICAS DE CRECIMIENTO
• 42ºC – 48 h de incubación
• Microaerofilia
MORFOLOGÍA DE LA COLONIA
(Colonia invasora)
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
• Gram (bacilo Gram – curvo)
• Contraste de fase (bacilo curvo, móvil)
CATALASA (+)
OXIDASA (+)
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IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA (determina especie)
TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO
• crecimiento a 26 – 37 y 42ºC
SUSCEPTIBILIDAD A CEFALOTINA Y
ÁCIDO NALIDÍXICO
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• hidrólisis del hipurato
• hidrólisis del indoxil acetato
• producción de H2S
• reducción de NO3 y otras
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CAMPYLOBACTER: TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO
Curso de Bacteriología
V = variable
ALGUNAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTER
C. fetus C. jejuni C. jejuni C. coli C. lari C. upsa-
fetus jejuni doylei liensis
Catalasa + + + + + d/-
Red. NO3 + + - + + +
H2S - +/- - - + -
Hipurato - + - - - -
Indoxilacet. - + + + - +
Crecim. 25ºC + - - - - -
Crecim. 37ºC + + + + + +
Crecim. 42ºC - + - + + V
Sens. Ác. Nal. R S S S R R
Sens. Cefalot. S R S R R V
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Patogenicidad de Campylobacter
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Infección Intestinal
• Trasmisión: oral-fecal
• Dosis infectante 5x102 a 106
• Mecanismos defensivos del huésped
• Factores de virulencia
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Mecanismos de virulencia
• ADHERENCIA
• INVASIÓN
• ENTEROTOXINA
• CITOTOXINAS
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Adhesinas
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Curso de Bacteriología
Campylobacter: producción de
enterotoxina
Demostrada utilizando:
• Perfusión intestinal en ratas
transporte de electrolitos al intestino
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PERFUSIÓN EN ASA INTESTINAL DE RATA
Dr. Heriberto FernándezUniversidad Austral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica
Curso de Bacteriología
ASA LIGADA DE RATA
Dr. Heriberto FernándezUniversidad Austral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica
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Célula CHO normales
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CDT +
C. jejuni 74.2%
Célula VERO normales
C. coli 64.7%
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BIOTIPIA Y SEROTIPIA DE
Campylobacter
Curso de Bacteriología
BIOTIPIA DE Campylobacter
Curso de Bacteriología
Esquemas propuestos para
biotipia de Campylobacter
Hidrólisis del Hipurato y la Prueba Rápida para H2S.
M.B. Skirrow and J. Benjamin. 1980. Differenciation of enteropathogenic campylobacter. J. Clin. Path.
33:1122
Curso de Bacteriología
Esquema de Biotipia del Dr. Hermy Lior
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BIOTIPIA DE Campylobacter
Curso de Bacteriología
BIOTIPIA DE Campylobacter
Esquema del Dr. H. Lior
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PRUEBA RAPIDA DE
HIDRÓLISIS DEL HURATO
Curso de Bacteriología
Hidrólisis del Hipurato
H2O
Ácido hipúrico Benzoato de sodio + Glicina
Hipuricasa
(hidrolasa)
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PRUEBA RAPIDA DE
HIDROLISIS DEL HIPURATO
MATERIAL NECESARIO
Hipurato de sodio al 1% en H2O
Ninhydrina al 3.5% en butanol acetona (1:1)
preparación fresca, cada semana.
PROCEDIMIENTO
Colocar una pequeña asada de cultivo de 24 a 48 Hrs. en el tubo con
la solución de hipurato de sodio.
Mezclar bien e incubar por 2 horas a 37°C en baño maría.
•Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis” J. Clin. Microbiol. 20:636-640
•H. wang, M.N. 1975. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of Group B Streptococci. J. Clin. Microbiol. 1:114-115
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PRUEBA
RAPIDA DE
HIDROLISIS
DEL
HIPURATO
Hidrólisis del Hipurato positivo Hidrólisis del Hipurato negativo
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PRUEBA RÁPIDA DE H2S
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Prueba Rápida de H2S
MATERIAL NECESARIO
El medio FBP Agar ha sido modificado como sigue
A : Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 g
Na2HPO4 (anhidro) 0.118 g
K H2PO4 (Anhidro) 0.023 g
Agar (L28-Oxoid) 0.2 g
H2O 97 mL
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 lb y dejar enfriar a 45°C.
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Preparación del Medio FBP Agar
modificado
Mezcla B+C+D
1 mL sol B
+
1 mL sol C
1 mL sol B
A Medio base
Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 g
Na2HPO4 (anhidro) 0.118 g
K H2PO4 (Anhidro) 0.023 g
Agar (L28-Oxoid) 0.2 g
H2O 97 mL
1 mL
sol B
+
Medio
1 mL
1 mL
sol B
sol C Base
Mezclar +
+
1 mL
bien 1 mL
sol D
A
1 mL B Sulfato ferroso 7H2O 10%
sol B sol C C Metabisulfito de sodio 10%
D Piruvato de sodio 10%
1 mL 1 mL 1 mL
sol B sol C sol D
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Prueba Rápida de H2S
PROCEDIMIENTO
Coloque un inóculo grande semejante a una bolilla (con un asa de 5
mm de diámetro) de un cultivo de 24 horas en el tercio superior del
medio de cultivo. NO MEZCLE.
Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640
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H2S negativo H2S positivo
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HIDRÓLISIS DEL DNA
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DNasa
Ácido Desoxyrribonucleico DNA depolimerizado
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Prueba de Hidrólisis del DNA
MATERIAL NECESARIO
Agar DNA Azul de toluidina Modificado
Ácido Desoxyrribonucleico (DIFCO DNA Cat#3321-12-1) 0.3 g
0.01 M Cloruro de Calcio 1 mL
Cloruro de sodio 10.0 g
Agar Oxoid L 28 6.5 mL
0.05M Buffer TRIS pH 9.0 * 1000 Ml
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Prueba de Hidrólisis del DNA
PROCEDIMIENTO
En la placa de Agar DNA- Azul de Toluidina modificado*
Se inocula con un asa de 3 mm de diámetro y en un área circular
pequeña, a partir de cultivos de 24 - 48 horas.
Incubar 43°C bajo condiciones de atmósfera de mezcla de gases
recomendado para Campylobacters por 24 a 48 horas.
Una zona clara incolora o algo rosada alrededor del inoculo es
considerado una reacción positiva.
En una placa se pueden probar varios cultivos y se debe incluir
controles, positivo y negativo.
Control Positivo = C. jejuni LIO 36
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SEROTIPIA DE
Campylobacter
Curso de Bacteriología
Esquemas de Serotipia de
Campylobacter
Sistema Penner y Hennessy: detecta antígenos somáticos
termoestables; puede identificar 60 serotipos de C. jejuni y C.
coli.
Penner, J.L., Hennessy, J.N. 1980. Passive hemagglutination technique for serotyping Campylobacter fetus subsp.
jejuni on the basis of soluble heat-stable antigens. J. Clin. Microbiol. 12: 732-737
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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli
MATERIAL NECESARIO
DNasa (10 mg /vial DNasa Bovina pancreática Grade II N° de Catalogo 104 159
(EC3.1.21.1)
Boehringer Mannheim, Alemania)
Solución Stock DNasa – PBS 0.1%
Agregar asépticamente 10 mL de PBS al vial, mezclar bien y
dispensar en tubos de tapa rosca alícuotas de 1 mL,
mantener congelado a -20°C.
Solución de trabajo DNasa -PBS
Diluir 1 mL de la solución stock con 4 mL de PBS
Dispensar alícuotas de 0.5 mL en tubos con tapa rosca
Los tubos que no están en uso se deben mantener
congelados a -20°C
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MATERIAL NECESARIO
Buffer Fosfato Saline 0.01M , pH 7.2 (PBS).
PBS-Merthiolate 1:10,000
NaCl al 2%
Láminas de vidrio (300 mm x 150 mm x 3 mm)
Placas de Petri 90 x 15 mm
Asas de siembra de 2 mm de diámetro
Mezcla de gases 5% O2, 10% CO2, 85 % N2
(Skirrow)
Medio de cultivo: Mueller Hinton con 5% de sangre
de carnero en placas de Petri
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PROCEDIMIENTO
Previamente antes de realizar la serotipia:
Los cultivos deberán ser sembrados en placas de
Mueller Hinton sangre (frescas y húmedas) e incubadas
a 37°C por 48 horas en atmósfera de mezcla de gases
recomendado para Campylobacters.
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Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%
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Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%
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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y C. coli
POR AGLUTINACIÓN EN LÁMINA
1. Verificar que el cultivo no este rugoso
En una lámina colocar una gota pequeña (10-20 mL) de DNasa y hacer una
suspensión bacteriana con el cultivo. Agregar 1 gota (50 ml) de ClNa al 2% y
chequear si autoaglutina o no.
Si el cultivo esta rugoso, resembrar y volver a probar.
2. Si el cultivo esta liso se procede de la siguiente manera:
Colocar una gota pequeña (10-20 µl) de DNasa-PBS en cada uno de 5
rectángulos en la lámina.
Emulsificar una pequeña asada del cultivo con DNasa-PBS.
Agregar (50 µl) de cada pool (1-4) de antisueros y con un mondadiente o
con el asa mezclar bien en sentido longitudinal.
Mover lámina con movimientos de vaivén por 45 segundos.
LEER LA PRUEBA DE INMEDIATO
Los resultados obtenidos después de 1 minuto o las reacciones débiles,
podrían representar reacciones cruzadas.
Si no se observa aglutinación con los pools 1 a 4, repetir el procedimiento
con los pools remanentes (5 a 16)
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3. Lectura de Resultados
Utilizando iluminación indirecta sobre un fondo negro, registre el grado de aglutinación como
sigue:
± = ligera aglutinación y el fluido turbio
1+ = cerca del 25% de células aglutinadas y el fluido turbio.
2+ = cerca del 50% de células aglutinadas y el fluido es moderadamente turbio.
3+ = aproximadamente el 75% de las células aglutinadas y el fluido es ligeramente turbio.
4+ = todas las células están aglutinadas y el fluido es claro.
El título del antisuero en los pools es usualmente definido como una dilución menor que la
dilución más alta que muestre 3+ o una aglutinación más fuerte en 1 minuto.
4. INTERPRETACION DE RESULTADOS
Los antisueros no absorbidos en los pools, contienen aglutininas para antígenos heterólogos de
Campylobacter jejuni y C. coli.
Podrían producir reacciones de aglutinación en más de un pool.
Los pools estan diseñados solo para screening.
Los serogrupos son identificados con antisueros monovalentes y confirmados por antisueros
absorbidos.
Los antisueros han sido agrupados en lo posible para reducir la ocurrencia de reacciones en varios
pools.
A veces las reacciones en más de un pool podría deberse a la presencia de más de un serotipo en
el mismo cultivo. Esto se puede resolver haciendo la serotipia a partir de una clona de colonias
individuales.
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Esquema de la Serotipia de
Campylobacter
Serotipo LIO 36
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