1.- En concreto. ¿Experimentalme5nte cómo se mide la actividad de una enzima?

¿qué es
una unidad internacional de inulinasa? ¿Y cómo se obtiene la actividad específica y la
actividad volumétrica?

- La actividad enzimática se mide e n tiempos cortos, realizando diluciones enzimáticas.

Se obtiene mediante la determinación de la concentración de azucares reductores por unidad
de tiempo. Mediante rango de linealidad y por el método de DNS.
Se trabaja con tubos con sacarosa (2.9 ml) + 0.1 ml de enzima y un tubo de blanco sustrato y
blanco enzima, sometidos a baño María, a 55°C y pH=5, y extraídos en tiempos de 0, 5, 10, 15
y 20 minutos, para luego colocarlos en agua caliente (100°C) durante 5 minutos y someterlo a
frio (en hielo),durante 3 minutos, y mediante el método de DNS y curva de calibrado de DNS
obtener su concentración de sustrato, restándoles el BS y BE y utilizando la concentración
corregida para luego graficar vs el tiempo y obtener la pendiente, la cual viene a ser la actividad
enzimática.
- UI: unidad internacional de inulinasa, es aquella cantidad de enzima que se requieres para
liberar un micromol de azucares de sacarosa o inulina por minuto a 55°C y pH=5
- Actividad especifica (UI/mg): es la cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por
min por mg de proteína, y se obtiene mediante la determinación de proteínas (método de
Bradford).
- Actividad volumétrica (UI/ml): es la cantidad
-
- de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por min por ml de enzima. Se obtiene mediante
la actividad enzimática.

𝑔 𝑚𝑜𝑙 106 µmol 1𝐿 3 𝑚𝑙

𝑎𝑣 = 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 ( )∗1 ∗ * *( )*factor
𝐿.𝑚𝑖𝑛 180𝑔 1 mol 103 ml 0.1 ml
de dilución

2.- En la determinación experimental en el rango de linealidad de la inulinasa soluble, ¿Para qué

determinamos el rango de linealidad?, ¿Cómo se realizó?, ¿Cómo preparas un blanco para el
sustrato y un blanco para extracto crudo enzimático?

- Para ver en donde la enzima tiene un poder catalítico lineal, para ver en donde tiene un
comportamiento lineal la enzima.
- Se realizo cuando la velocidad de reacción tiende a cero, midiéndose en tiempos cortos y a
diferentes diluciones enzimáticas.
- Blanco sustrato: 2,9 ml de sacarosa + 0.1 ml de tampón citrato
- Blanco enzima: 2,9 ml de tampón citrato + 0.1 ml de enzima.

3.- ¿Porque es importante e indispensable determinar experimentalmente los valores de los

parámetros cinéticos de una enzima soluble?, Vmax y Km, ¿Como se denominan tales
parámetros?

- Para caracterizar químicamente a la enzima, para saber cuáles son las características
químicas de la enzima. Además para diseñar nuestro mini.reactor. Para ver el
comportamiento en el mini-bioreactor.
 - Vmax: Es la velocidad máxima, que se obtiene cuando la velocidad de reacción se hace
independiente de la concentración se sustrato.
- Km: Es la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es a la mitad de la
velocidad máxima. Indica afinidad de la enzima con el sustrato. Cuando menor es el Km,
mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato.

4.- Durante la experiencia ¿Cuál es el objetivo de seguir la cinética de la hidrolisis de sacarosa en

el mini—biorreactor?, ¿cómo influencia la presencia del glicerol? ¿Qué resultados obtuviste?

- El objetivo fue la de ver el comportamiento cinético del mini-bioreactor, determinada

mediante la conversión de sustrato en producto.
- El glicerol, actuó como estabilizador térmico, debido a q la enzima es sensible a la
temperatura.
- Se obtuvo que en los primeros 20 minutos con o sin glicerol la actividad de la enzima es
igual. A partir d e los 30 minutos esta actividad tenía estabilidad.

5.- Ecuación: 0.9234 (1/S) – 2.435. Hallar el valor de Vmax y Km, mediante la ecuación de
MICHAELIS-MENTEN y por el método inverso de Lineweaver– Burke.

- 1/ Vmax= 2.435  Vmax= 0.41068 g/L

𝒈
- Km/Vmax = 0.9234  km= 0.9234*Vmax  km = 0.3792 𝒍.𝒎𝒊𝒏