CODIGO: P-SA-66

PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de

FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 1
PAGINA:
de 15

PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de Detección Bax® Método

Automatizado
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp.
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO SECRETARIO DE SALUD REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN
REPRESENTANTE DE CALIDAD
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 2
PAGINA:
de 15

1. OBJETIVO

Establecer el Procedimiento para la Determinar la presencia de Salmonella spp. Por la Técnica

Sistema de Detección Bax® Método Automatizado Ensayo de PCR Estándar para detectar
Salmonella spp. AOAC Método Oficial Internacional 2003.09.

2. ALCANCE

Esta técnica aplica para los siguientes productos: Productos cárnicos (crudos, cocido,
madurado); aves (crudo, cocido); pescados y productos alimenticios marinos (crudos, cocidos);
productos lácteos (crudos, congelados, secos, procesados); productos de chocolate, leche en
polvo descremada; pimienta negra, Flan, comidas preparada refrigerada, macarroni, masa de
pizza, arvejas congeladas, huevos, mantequilla de maní, semillas de alfalfa, jugo de naranja,
espinaca y lechuga.

3. DEFINICIONES

§ Salmonella: El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae de la familia

Enterobacteriaceae. Los microorganismos del genero Salmonella son bacilos gram –
negativos, no espatulados, móviles (excepto S. gallinarum y S. pollorum) mesolíticos
anaeróbicos facultativos están distribuidos ampliamente en la naturaleza, se encuentran en
el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, en humanos puede haber un
estado de portador asintomático.

La puerta de entrada en humanos y en animales es la vía oral, a través del consumo de

alimentos contaminados con excretas y orina o por contaminación de los alimentos debido
a las malas prácticas higiénicas de manipuladores que son portadores asintomáticos, por
contaminación cruzada de productos crudos a cocidos o por deficiencias en buenas
prácticas de manufactura. La Salmonella es una de las causas más comunes de
enfermedades transmitidas por alimentos. Varios serotipos se han asociado con la carne,
las aves de corral, huevos, leche, pescado, salsas, postres rellenos de crema, mantequilla
de maní, chocolate y otros alimentos. Con un aumento de la resistencia a los antibióticos y
una tendencia al alza en la prevalencia de los pollos de engorde, los procesadores de
alimentos necesitan métodos de pruebas rápidas y precisas.

Las infeccione por Salmonella son de distribución mundial, la tasa de prevalencia de la

infección es mayor en lactantes y en niños de corta edad. El período de incubación es de
12 a 36 horas manifestando síntomas como náuseas, dolor abdominal, somnolencia,
diarrea, fiebre, septicemia.

§ ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de

referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que
es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas,
bioquímicas y moleculares.
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 3
PAGINA:
de 15

§ ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de

referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que
es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas,
bioquímicas y moleculares.

4. RESPONSABLES

Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico del
Laboratorio de Salud Pública del Meta de aplicar este procedimiento en forma adecuada,
sin hacer ningún cambio o variación que no esté debidamente documentado, autorizado y
se ejecutara según cronograma de análisis de muestras.

5. GENERALIDADES

La puerta de entrada de la Salmonella spp. en humanos y en animales es la vía oral, a

través del consumo de alimentos contaminados con excretas y orina o por contaminación
de los alimentos debido a las malas prácticas higiénicas de manipuladores que son
portadores asintomáticos, por contaminación cruzada de productos crudos a cocidos o por
deficiencias en buenas prácticas de manufactura.

Las infeccione por Salmonella son de distribución mundial, la tasa de prevalencia de la

infección es mayor en lactantes y en niños de corta edad.
El período de incubación es de 12 a 36 horas manifestando síntomas como náuseas, dolor
abdominal, somnolencia, diarrea, fiebre, septicemia.

6. REFERENCIAS

§ El AOAC Research Institute ha validado el sistema Bax® para detectar Salmonella en carne,
pollo, productos de fruta y vegetales, productos lácteos, productos de panadería/chocolate,
alimentos para animales y pasta. AOAC Internacional también ha validado el sistema Bax®
como AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 en carne cruda de res molida, pollo
crudo, pescado crudo congelado, queso mozarella, salchichas y jugo de naranja

§ Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA

7. DESARROLLO

7.1. FUNDAMENTO

§ Fundamento Técnica Sistema de Detección Bax® método automatizado Ensayo de

PCR Estándar para detectar Salmonella spp: El Sistema Bax®, está enfocado en la
estructura genética de las bacterias para detectar un único fragmento de ADN solamente
encontrado en el microorganismo blanco (target).
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 4
PAGINA:
de 15

El Sistema Bax® usar la tecnología de la reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), el cual

crea rápidamente millones de copias del fragmento de ADN buscado, solo sí está presente. Así,
usted puede claramente detectar respuestas “si o no” (“yes or no”) pocas horas después de
comenzar el ensayo, sin la necesidad de la interpretación de resultados por parte de expertos.

Todos los reactivos necesarios (cebadores, enzima polimerasa, nucleótidos y control positivo)
se encuentran combinados en una simple tableta, empacada de manera conveniente dentro de
los tubos que usted recibe con cada kit de ensayo. Esto elimina la transferencia múltiple de
líquidos usada en otros métodos y reduce efectivamente el potencial de error debido a la técnica
del analista. Esta propiedad de las tabletas también permite el procesamiento eficiente de
grandes números de muestras, 96 en una misma corrida.

El sistema automatizado Bax® combina PCR con detección fluorescente, que reduce
significativamente las horas de trabajo, minimiza el potencial de contaminación cruzada y
provee resultados coherentes basados en algoritmos computarizados para análisis. Usted
simplemente carga las muestras preparadas, corre el programa y lee los resultados en la
pantalla.

• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): El PCR es una herramienta analítica para

replicar rápidamente un fragmento blanco de ADN. En una aplicación típica, la muestra de
ADN es combinada con ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores que son específicos para
una secuencia de nucleótidos dada. Esta mezcla luego pasa una serie de ciclos de
calentamiento y enfriamiento. El calentamiento denatura el ADN, separándolo en dos
hebras simples, en los cambios de disminución de temperatura, el cebador reconoce y se
une (alinea) a la secuencia de ADN blanco complementaria. La enzima Taq Polimerasa
luego usa los nucleótidos para extender la secuencia a partir de los cebadores, creando dos
copias del fragmento del ADN blanco (amplificación). La repetición del ciclo de
denaturación, alineación y extensión produce un incremento exponencial en el número de
fragmentos de ADN blanco, creando millones de copias en un corto tiempo. Si la secuencia
blanco no está presente, no hay amplificación.

7.2. MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara

conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras
de alimentos para consumo humano.

7.2.1. Equipos

• Incubadora a 35°C ± 1°C

• Bloques de calentamiento y fíjelos a temperaturas de 37°C y 95°C
• Bloques de enfriamiento (Refrigeración 2°C-8°C )
• Equipo Bax® System Q7
• Micropipeta (Para medir volúmenes: 40 ul, 150 ul)
• Micropipeta (Para medir volúmenes: 5 ul, 10 ul)
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 5
PAGINA:
de 15

• Micropipeta Multicanal (Para medir volúmenes: 5 ul, 30 ul, 50 ul)

• Micropipeta (Para medir volúmenes: 500 ul)

7.2.2. Reactivos

• Agua peptona Buferada (Según grupo de alimentos - Preparados con agua desionizada)
• Caldo Lactosado (Según grupo de alimentos - Preparados con agua desionizada)
• Caldo BHI
• Kit de PCR para detección de Salmonella
• Agar XLD (Confirmatoria)
• Agar Hectoen (Confirmatoria)
• Agar TSAYE (Confirmatoria)
• Pruebas rápidas – Kit para confirmación bioquímica de Salmonella)
• Colorantes para Gram

7.2.3. Cepas De Referencia

• Salmonella Typhimurium ATCC 14028

• Escherichia coli ATCC 25922

7.3. PROCEDIMIENTO

7.3.1. Condiciones Ambientales Y Manejo De Equipos

• El acondicionamento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los

mismos.

• El método no establece condiciones ambientales de temperatura y humedad

específicas.

• La muestra se debe analizar en cuarto de siembra y cabina de bioseguridad.

7.3.2. Condiciones Generales

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83

Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para
consumo humano.

7.3.2.1. Condiciones Previas

• Usar nueva punta cuando transfiera muestra o hidrate las tabletas.

• Cambiar de guantes entre cada uno de los pasos.
• Use pinzas cuando remueva los tubos y las tapas de la bolsa. Una vez la bolsa sea
abierta, almacene las tapas en un contenedor que se pueda cerrar.
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 6
PAGINA:
de 15

• Corte o separe los tubos en strip antes de ser usados para prevenir post- contaminación
entre las muestras durante la transferencia.
• No reusar ninguna tapa o tubos de PCR.
• Usar los termómetros para asegurar la temperatura de incubación correcta.
• Nota: Los guantes NO deben tener polvo, deben ser de Nitrilo.

7.4. Descripción Del Método

a. Enriquecimiento de la Muestra.

Pesar en la bolsa para homogenización de muestras previamente tarada 25g ó ml

representativos de la muestra total (tomando de la superficie como de su interior) la preparación
de la muestra se realizara conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis
Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

Adicionar en caso general 225ml de Agua Peptonada Bufferada a temperatura ambiente

(medio pre enriquecimiento no selectivo).

Incubar a 35°C ± 1°C X 22 - 24 horas.

Nota: para ciertos comestibles es necesarios de otros procedimientos de pre enriquecimiento.

“ver preparaciones específicas”.

Preparaciones específicas para ciertos alimentos:

Enriquecimiento secundario

Nota: Marcar cada tubo de lisis con

Tipo de Muestra Enriquecimiento primario el número de la muestra
Lique (si es molida o procesada), o homogenice
suavemente (si no es molida), 25g de la muestra en
225ml de Agua de peptona bufferada pre calentada.
Carne y pollo Incubar a 35°C ± 1°C por 20-24 horas Ninguno
Transferir 10μL de la muestra
Llevar 25g de muestra en 225ml de agua de enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
peptona bufferada. Incubar a 35°C ± 1°C por 20-24 calentado (37°C). Incubar a 37°C por
Queso Mozzarella horas 3 horas
Transferir 10μL de la muestra
Llevar 25g de muestra en 225ml de agua de enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
peptona bufferada. Incubar a 35°C ± 1°C por 22-26 calentado (37°C). Incubar a 37°C por
Huevo liquido horas 3 horas
Llevar 25g de muestra en 225ml de Caldo Transferir 10μL de la muestra
Lactosado. Dejar a temperatura ambiente por 55-56 enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
minutos. Ajuste el pHa6.8±0.2.Incubar a 35°C ± 1°C calentado (37°C). Incubar a 37°C por
Mantequilla de maní por 22-26 horas. 3 horas

PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
Detección Bax® Método Automatizado
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp.
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09
Llevar 25g de muestra en 225ml de agua de
peptona bufferada pre calentada (42°C) con
novobiocina (20mg/L). Incubar a 42°C ± 1°C por 20-
Semillas de alfalfa 24 horas
Llevar 25g de muestra en 225ml de caldo lactosa
por 2 minutos. Dejar a temperatura ambiente por 55-
65 minutos. Ajustar el pH 6.8± 0.2. Incubar a 35°C ±
Pescado crudo congelado 1°C por 22-26 horas
Llevar 25g de muestra en 225ml de caldo
preenquecimiento universal. Dejar A temperatura
ambiente por 55-65 minutos. No ajustar el pH.
Jugo de naranja Incubar a 35°C ± 1°C por 22-26 horas
Llevar 25g de muestra en 225ml de leche en polvo
descremada reconstituida. Dejar en cuarto de
temperatura 55-65 minutos. Ajustar el pH 6.8± 0.2.
Adicionar 0.45ml de solución de colorante verde
brillante al 1%. Incubar a 35°C ± 1°C por 22-26
Leche achocolatada horas
Llevar 25g de muestra sobre 225ml agua verde
brillante (2ml solución de colorante verde brillante
1% /agua desionizada).Dejar temperatura ambiente
Leche en polvo por 55-65 minutos. Sin mezclar o ajustar el pH.
descremada Incubar a 35°C ± 1°C por 22-26 horas.
Tipo de Muestra Enriquecimiento primario
Llevar 25g de muestra en 225ml de caldo tripticasa
soya. Dejar de temperatura 55-65 minutos. Ajustar
el pH a 6.8± 0.2. Incubar a 35°C ± 1°C por 22-26
Pimienta negra horas
Flan, 2% de leche, comida
preparada refrigerada,
pescado cocido, camarón,
macarroni, masa de pizza, Llevar 25g de muestra en 225ml de caldo lactosado
arvejas congeladas, pre calentado a (35°C). Incubar a 35°C ± 1°C por
alimento para mascotas 22-26 horas
Llevar 25g de muestra en 225ml de caldo lactosado
en un frasco. Dejar a Temperatura ambiente por 55-
56 minutos. Cerrar flojamente. Incubar a 37°C por
Proteína de soya 18-22 horas
Humeder la esponja con 10ml de caldo DE
Neutralizing o equivalente, luego muestrear en un
área de 4x4 pulgadas (10 x 10cm). Áreas
de producto terminado-Ponga la esponja en 225
caldo pre calentado a (35°C) lactosado. Incubar a
35°C ± 1°C por 22-26 horas.
Área de Materias primas- Ponga la esponja en 225
de agua de peptona tamponada pre calentado a
Esponjas ambientales (35°C) de. Incubar a 35°C ± 1°C por 22-26 horas.
Homogenice 25g de la muestra con 225ml de caldo
pre-calentado (42°C) de medio BAX System
Carne Molida MP).Incubar a 42°C por 8-24 horas. Ninguno
CODIGO: P-SA-66
FECHA DE
27/10/2015
EMISION:
VERSION: 01
Página 7
PAGINA:
de 15
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Ninguno
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Enriquecimiento secundario
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
Transferir 10μL de la muestra
enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
calentado (37°C). Incubar a 37°C por
3 horas
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 8
PAGINA:
de 15

Homogenice 65g de la muestra con 585ml de caldo

pre-calentado (42°C) de medio BAX System MP).
Corte de Res Incubar a 42°C por 8-24 horas. Ninguno
Homogenice 25g de la muestra con 225ml de caldo
pre-calentado (42°C) de medio BAX System MP).
Espinaca y lechuga Incubar a 42°C por 8-24 horas. Ninguno
Llevar la muestra en dilución 1:10 de agua de
Carne y pollo crudo no peptona bufferada. Incubar a 35°C ± 1°C por 16-20
sazonado horas N/A
Llevar la muestra en dilución 1:10 de agua de
Lácteos (excepto leche peptona bufferada con novobiocina (20mg/L).
pulverizada) Incubar a 42°C ± 1°C por 20-24 horas N/A
Transferir 10μL de la muestra
Llevar la muestra en dilución 1:10 de agua de enriquecida a 500μL de caldo BHI pre
Otros alimentos y peptona bufferada. Incubar a 37°C ± 1°C por 16-20 calentado (37°C). Incubar a 37°C por
ambientes horas 3 horas
Carne cruda, incluida Homogenice 25g de la muestra con 225ml de caldo
carne sazonada y pre-calentado (42°C) de medio BAX System MP).
congelada Incubar a 42°C por 8-24 horas. Ninguno
Homogenice 65g de la muestra con 585ml de caldo
pre-calentado (42°C) de medio BAX System MP).
Otras carnes crudas Incubar a 42°C por 8-24 horas. Ninguno

b. Preparación del Equipo

• Encienda los bloques d calentamiento y fíjelos a temperaturas de 37°C y 95°C.
• Asegúrese que los bloques de enfriamiento están en el refrigerador a 2-8°C. Si encuentra
que estos no han sido refrigerados correctamente, llame para asistencia técnica. Una vez
los bloques ha sido retirados del refrigerador, deben usarse en un tiempo no mayor a 30
minutos.
• Crear el Archivo (Favor ver creación de rack BAX® System Software detalles en la hoja de
vida F-SA-18 del equipo en Manejo del: “Preparación del equipo”).

c. Etapa de Lisis

Preparación de los tubos de lisis

• Rompa los tubos de lisis aparte. Márquelos y alinee los tubos en el rack, de acuerdo a su
archivo.
• Prepare el Agente de lisis adicionando 150μL de proteasa con 12ml de buffer de lisis (Esta
mezcla tapada tiene una estabilidad de hasta 15 días en refrigeración de 2 a 8 °C)

Nota: Marcar cada tubo de lisis con el número de la muestra

• Transfiera 200μL del agente de lisis a cada tubo de lisis (Verifique que todos los tubos de
lisis tengan el mismo nivel de reactivo)
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 9
PAGINA:
de 15

• Transfiera 5μL de la muestra enriquecida al tubo de lisis correspondiente (No agitar las
muestras antes de hacer la lisis). Usando una nueva pipeta para cada muestra.
Ø Muestras Viscosas: Cuando transfiera estas muestras, inserte sola y únicamente la
punta den trapo limpio o tela la punta de la pipeta en la muestra; esto con el fin de
evitar que se recubra todala punta por la muestra. Limpie cualquier exceso de
muestra realizando un raspado de la punta sobre el borde.
Ø Muestras con partículas: Cuando se observan partículas en el caldo de
enriquecimiento, pipetear desde la superficie del líquido y no desde el fondo.
Ø Muestras con capas de grasa o aceite: Pipetear solo la fase acuosa que se
encuentra por debajo de la capa de grasa/aceite y limpie cualquier exceso de
muestra realizando un raspado de la punta sobre el borde.

Nota: No agite o mezcle la muestra enriquecida antes de transferir las muestras a los tubos.
Si las muestras se agitaron, deje que se sienten por 10 minutos antes de transferirla la
alícuota a los tubos.

• Verificación en la transferencia del lisado al tubo de PCR:

o Cada tubo de PCR contenga una tableta de PCR

o Cada tubo de PCR colocado en la gradilla concuerde con la posición de la gradilla
en el software.

o Nota: No hidrate las tabletas de PCR con el lisado hasta que el termociclador
alcance la temperatura correcta y que indique que está listo para iniciar la corrida.
“Ready for Rack Load”.

o Una vez terminada las transferencias tape los tubos.

• Calentamiento de los tubos de lisis

o Ponga el rack de los tubos de lisis en el bloque de calentamiento que está a 37°C
por 20 minutos.

o Transfiera los tubos al bloque de calentamiento que está a 95°C por 10 minutos.

o Después que la lisis ha sido completada, utilice un bloque de enfriamiento de (2-

8°C) para poner los tubos de lisis.

o Ponga los tubos de lisis y enfríelos por 5 minutos,

Nota: Utilizar los bloques de refrigeración dentro de los 30 minutos una vez los
ha sacado del refrigerador.

d. Hidratación de la tableta de PCR con el lisado

o Ponga el rack de PCR en el bloque.

 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 10
PAGINA:
de 15

o Ponga los tubos en el soporte. Marque la parte superior de la tirilla para mantener la
orientación cuando se pongan las tirillas en el instrumento.

§ Una vez hidratadas las tabletas colocar en el equipo antes que pasen 10
minutos.

o Verificar que el equipo ha alcanzado la temperatura para continuar, después

remueva las tapas de los tubos con la herramienta y transfiera 50μL del lisado a los
tubos de PCR.

o Ponga las tapas ópticas en la tirilla y asegúrelas.

o Repita el mismo procedimiento desde el punto 4, hasta que todos los tubos se hallan
tapado nuevamente.

o Tome el rack de los tubos que se encuentran en el bloque de enfriamiento al Equipo

BAX® System. Cargue las muestras como se describe en la hoja de vida del equipo
F-SA-18 en Manejo del equipo: “Amplificar y detectar”.

§ Nota: Las muestras deben permanecer refrigeradas de 2-8°C hasta que se

llevan al equipo.

§ Desinfecte el bloque de enfriamiento y la gradilla con hipoclorito de sodio al

10% y enjuagar con agua desionizada.

7.5. CÁLCULOS Y/O VALORES DE REFERENCIA

El método no requiriere cálculos para la expresión de resultado y el valor de referencia para los
alimentos debe ser NEGATIVO.

7.5.1. Obtención de resultados

Cuando se complete el proceso (aproximadamente 3,5 horas), siga las instrucciones en pantalla
para retirar sus muestras y revisar los resultados. Los resultados se muestran en una cuadrícula
de iconos y en la mitad superior de la pantalla:

De acuerdo con la interpretación de los resultados, indicar la presencia o ausencia de

Salmonella x 25g o ml, como POSITIVO ó NEGATIVO.

El resultado del análisis se registra en el resultado microbiológico de alimentos F-SA-75

Perfil de curvas de fusión de Salmonella positiva

a. Tres picos del microorganismo aproximadamente a 85, 88 y 90ºC

b. Aproximadamente 5ºC de distancia entre el primer y tercer pico
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 11
PAGINA:
de 15

c. Pico del microorganismo en un rango 82 a 91°C

d. Rango del pico control de 76-80ºC

Cuando el nivel de Salmonella en una muestra es muy alto, los picos de 88ºC y 90ºC pueden
unirse, por lo que puede ver dos picos distintos, el pico de fusión es más alto y el pico de
control puede ser muy pequeño o ausente.

Salmonella Positivo fuerte Salmonella positivo moderado

Salmonella positiva fuerte con picos Salmonella positiva débil

2 y 3 fusionados

Perfil de curvas de fusión de Salmonella negativa

No hay picos de blanco, se presenta pico de control grande

En algunos casos, puede ver picos no específicos muy pequeños en el rango de temperatura
de 84-92ºC, pero no aparecerán como se describió antes para resultados positivos.

Confirmación de Resultados positivos

 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 12
PAGINA:
de 15

Método ISO: Use los métodos convencionales descritos en los métodos estandarizados por
CEN (http://www.cen.eu) o ISO (http://www.iso.org), incluyendo la purificación. El paso de
confirmación empieza desde el caldo de enriquecimiento primario o (en caso de medio
cromogénico) a partir de colonias típicas identificadas en medios selectivos. Ver NF EN ISO
7218 para el protocolo de confirmación de los métodos estandarizados.

El resultado del análisis se registra en el resultado microbiológico de alimentos F-SA-75

8. VERIFICACIONES

8.1. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS

Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar Salmonellas con el método y los
medios descritos en este procedimiento se cuenta con control positivo y control negativo, los
cuales se procesan como una muestra normal:

Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra
desechable estéril se inocula directamente al vial que contiene el reactivo y se procesa como
una muestra (actividad 7.5).

8.1.1. Control de Calidad Interno

En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 25922 de E. coli
(control negativo)

En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 14028 Salmonella
typhimurium (Control positivo)

Medio de Imagen
Cultivo Cepa de Referencia

Las colonias E. coli son

grandes, amarillas con
Agar Xilosa E. coli ATCC o sin precipitado de
Lisina 25922 bilis.
Desoxicolato
- XLD Las colonias típicas de
la Salmonella son de
Salmonella color rojo con el centro
typhimurium negro debido a la
ATCC 14028 producción de H2S.
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 13
PAGINA:
de 15

Colonias grandes, color

entre amarillo y salmón.
E. coli ATCC Algunas especies
25922 pueden ser inhibidas
Agar Hektoen

Salmonella
typhimurium Colonias con centro
ATCC 14028 negro y regulares

Registrar en los formatos

• F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

• F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas
• F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos
• F-SA-34 Control Interno de Equipos
• F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.
• F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Criterios Para Aprobación O Rechazo De La Muestra

ACCION POR
CRITERIO LECTURA INCUMPLIMIENTO DE
CRITERIOS
La prueba de esterilidad de los Repetir Análisis
Esterilidad del medios utilizados, no debe Verificar proceso de
Medio de Cultivo presentar crecimiento de ningún preparación de medios de
tipo. cultivo de nuevo lote.
No debe presentar crecimiento.
Control Negativo Las colonias no deben poder
Repetir siembra de cepas
diferenciarse claramente si los
ATCC y repetir el Análisis
E. coli ATCC 25922 medios utilizados son
selectivos..
Control Positivo
Observando que el crecimiento
Salmonella Repetir siembra de cepas
sea adecuado y las colonias
typhimurium ATCC ATCC y repetir el Análisis
características.
14028
Descartar Reactivos y
Vigencia del reactivo dentro de
Reactivos vigentes adquirir y procesar con
la fecha
reactivos en fechas vigentes
Temperaturas de Temperatura ajusta a Ajustar control de
Incubadoras 37°C ± 1°C Temperatura y tomar
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 14
PAGINA:
de 15

nuevamente hasta obtener

temperatura deseada.
Solicitar y ejecutar los
mantenimientos o
Mantenimiento de Calibración, verificación y
verificaciones pendientes
equipos mantenimiento vigente
para realizar análisis con
equipos idóneos
Verificar la fecha de
Descartar el Material y
Control de esterilización de Material que no
realizar el proceso con
Esterilización de supere 8 días, verificar la cinta
material que cumpla la
Material indicadora de esterilización su
fecha y el viraje de la cinta.
viraje.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis

Microbiológico F-SA-101

8.1.2. Control de Calidad Externo

El laboratorio participa en programas de evaluación externa como API para alimentos.

Los resultados de los controles se registran en el análisis de resultados de control de calidad

externo F-SA-109

9. REGISTROS

Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-18 Hoja
de Vida de Profesional
Equipos Universitario o Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Profesional del
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Laboratorio Físico y/o Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Electrónico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-34
Control Interno Auxiliar de
de Equipos. Laboratorio, Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Profesional del Físico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental
 CODIGO: P-SA-66
PROCEDIMIENTO TÉCNICO Sistema de
FECHA DE
Detección Bax® Método Automatizado 27/10/2015
EMISION:
Ensayo de PCR Estándar
Para Detectar Salmonella spp. VERSION: 01
AOAC Método Oficial Internacional 2003.09 Página 15
PAGINA:
de 15

Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-46
Control De Auxiliar de
Temperatura, Laboratorio,
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Limpieza y Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Desinfección Universitario o Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
de Equipos Profesional del Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-64
Identificación Auxiliar de
de Sustancias Laboratorio,
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Químicas Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Profesional del Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-75
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Resultados Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Microbiológico Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
s de Alimentos Profesional del
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
Físico
documental documental documental
F-SA-101 Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Control de
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
calidad análisis Profesional del Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
microbiológico Laboratorio Físico y/o
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Electrónico tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental
F-SA-109 Profesional Físico y/o Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Análisis de Universitario / Electrónico Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
resultados de Profesional de Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
control de Laboratorio maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
calidad tabla de retención tabla de retención tabla de retención
externo documental documental documental

10. ANEXOS

No Aplica

11. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS
1 27/10/2015 Versión inicial.