OBJETIVOS

 Extraer la enzima tirosinasa de diferentes fuentes.

 Determinar la actividad de la tirosinasa, utilizando como sustrato L-DOPA.
 Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa en diferentes fuentes, y sometida a
diferentes condiciones como calor y la presencia de inhibidor.

MATERIALES EMPLEADOS

Solución de fosfato 0.1M en buffer (pH=7.2)

Solución de L-DOPA 0.03M en buffer(pH=6.0)

Fuentes de tirosina

Arena para efectuar la trituración de la fruta

Lienzo o tela para filtrar

Mortero para triturar la fruta

Fotocolorímetro

Hielo para conservar la enzima e impedir su degradación

METODOLOGÍA

Se colocaron entre 10 a 15 gramos de la fruta en el mortero preenfriado con 30 mL de buffer de

fosfato 0.1M (pH=7.2). Se trituró la mezcla anterior agregando arena. Se filtró el extracto de la
fruta. Se centrifugó el filtrado durante 5 minutos. Se colocó la solución sobrenadante en un vaso
con hielo.

Antes de tomar la lectura se preparó el blanco necesario para calibrar el instrumento mezclando
las siguientes cantidades: 1 mL de solución de extracto o enzima, 4 mL de buffer de fosfato
(pH=6.0) 0.1 M y se agregó 1 mL de agua destilada en lugar de sustrato.

Se colocó 1 mL de solución de extracto en el tubo de ensayo y se completó a 4 mL agregando

buffer de fosfato (pH=6.0)0.1M. Luego se agregó 1 mL de solución que contiene L-DOPA
aproximadamente 0.02M.

Se registraron los resultados de la absorbancia en el fotocolorímetro fijando la longitud de onda en

420 nm. Tome esta lectura como la absorbancia a tiempo cero. Se repitió la lectura de absorbancia
cada 10 minutos, hasta completar seis lecturas. Se tabularon los resultados de absorbancia contra
tiempo. Se graficaron los resultados de absorbancia y tiempo. La pendiente obtenida con estos
datos y considerando una tendencia lineal corresponderá a la velocidad inicial a esta
concentración de sustrato y de enzima.

se repitieron los procedimientos, pero sometiendo una pequeña porción de la solución de extracto
enzimático en el baño María con agua hirviendo. De igual modo se repitieron los resultados
obtenidos, pero agregando a la solución de extracto enzimático unas gotas de solución de cianuro
de sodio (NaCN), o un cristal muy pequeño.

Se calculó la actividad de la tirosinasa y se expresó en absorbancia por minuto y por mL de

solución de enzima. Compare los diferentes casos: a condiciones normales, en agua hirviendo y
con cianuro de sodio como inhibidor.

Se comparó la actividad de la tirosinasa en las diferentes frutas y se señalo la que tenía mayor
concentración de enzima.