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TEMA 3

Estudio dE la alErgia por El


laboratorio:
dE las fuEntEs alErgénicas al
diagnóstico MolEcular

casas losada Ml
lópez guío ME
buhigas i
ocaña s; cava f.

Programa de
Formación Continuada
a Distancia
2014
Estudio dE la alErgia por El laboratorio:
dE las fuEntEs alErgénicas al diagnóstico MolEcular
casas losada Ml; lópez guío ME; buhigas i; ocaña s; cava f.
Área de laboratoriohospital universitario fundación alcorcón. Madrid

INDICE
10. alergenOs: de la fuente al
1. ObjetivOs específicOs extractO
2. intrOducción
3. definiciOnes 10.1. Materia prima alergénica y extracto
4. diagnósticO de alergia: alergénico
identificación del alérgenO 10.1.1. Materia prima alergénica
5. MarcadOres biOlógicOs 10.1.2. alergenos principales
dispOnibles para el diagnós- 10.1.3. extracto alergénico
ticO in vitrO de las reac- 10.1.4. estandarización del extracto
ciOnes de hipersensibilidad. 10.2. nomenclatura de los alergenos
6. el papel de la ige 11. diagnósticO MOlecular de
6.1. ige total: la alergia
6.1.1.estructura de ige y funcionalidad. 11.1. del extracto a las proteínas
6.1.2.Metabolismo y valores de ige total 11.2. componentes alergénicos marca-
esperados en suero dores de especie y componentes
6. ige específica alergénicos marcadores de reacti-
6.3. pruebas in vivo versus in vitro vidad cruzada
6.4. breve historia de un test: en busca 11.3. clasificación de los componentes
del ensayo ideal de sige alergénicos por grupos de prote-
7. tipOs de ensayOs para la ínas
deterMinación de ige tOtal y 11.3.1. pr-10 proteína, bet v 1 homóloga
específica. 11.3.2. ltp proteína transportadora de
7.1. calibración de los ensayos para la lípidos
determinación de anticuerpos ige 11.3.3. profilinas
7.2. Metodología general de los inmuno- 11.3.4. proteína de almacenamiento
ensayos 11.3.5. polcalcinas
7.3. tipos de inmunoensayos 11.3.6. ccd (cross- reactive carbohydrate
7.4. principales inmunoensayos disponi- determinants)
bles. 11.3.7. tropomiosina
7.4.1.immunocap specific ige 11.3.8. albúminas séricas
7.4.2.alastat 11.3.9. parvalbúmina
8. citOMetría de flujO y 11.3.10. lipocalinas
alergia. 11.4. diagnóstico in vitro con alérgenos
8.1. aplicaciones en el estudio de recombinantes
alergia. 11.5. aplicación clínica de los alergenos
8.2. determinación de ige específica por recombinantes: el diagnóstico por
citometría de flujo. separación de componentes (crd)
9. variables a evaluar en la 12. bibliOgrafía
deterMinación de ige especí- 13. casOs clínicOs
fica “in vitrO”: el papel del
alergenO
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Conocer la respuesta IgE y su monitorización “in Vitro” como pilares básicos del estudio de la
enfermedad alérgica.
• Características y particularidades de los inmunoensayos para la determinación de sIgE
• Diferenciar: fuente alergénica, extracto y proteína alergénica.
• Identificar los componentes alergénicos por grupos de proteínas

1. OBJETIVOS
al enorme impacto de la patología alérgica y la importancia del papel del laboratorio en el estudio
de la misma, se suman las innovaciones técnicas que facilitan la determinación de alergenos con
criterios de fiabilidad y rentabilidad clínica, y que permiten el acceso de un número mayor de espe-
cialistas a ésta área diagnóstica.
Objetivos generales:
• introducir al profesional del laboratorio en el diagnóstico “in vitro” de la enfermedad alérgica.
• realizar una puesta a punto de los nuevos marcadores, las estrategias analíticas disponibles, y
las nuevas perspectivas que se plantean con el diagnóstico por separación por componentes en
estos pacientes mediante la tecnología de alergenos recombinantes.
el estudio de las proteínas alergénicas arroja una nueva luz sobre las reactividades cruzadas entre
diferentes alergenos y nos permite diferenciar entre co y cross- sensibilización. en este sentido,
conocer las opciones que la nueva tecnología recombinante y nativa aporta al estudio de las prote-
ínas alergénicas con el diagnóstico por separación de componentes.

2. INTRODUCCIÓN
las patologías alérgicas desempeñan un papel preponderante en nuestro entorno con una
prevalencia cercana al 20%. de hecho, es considerada una preocupación de salud pública signifi-
cativa, debido a que puede afectar considerablemente a la calidad de vida de los pacientes.

3. DEFINICIONES

3.1. Atopía
es una tendencia personal o familiar a producir anticuerpos ige en respuesta a bajas dosis de
alérgenos, generalmente proteínas, y a desarrollar síntomas típicos como el asma, rinoconjuntivitis
o el síndrome eccema/dermatitis alérgica (seda).

3.2. Alergia
la alergia es la expresión clínica de la enfermedad atópica, supone una respuesta inmune exce-
siva o exagerada, y regulada genéticamente, frente a antígenos que son habitualmente inocuos
para la mayoría de la población y que denominamos alérgenos. la alergia puede ser mediada por
anticuerpos o células. en la mayoría de los casos, el anticuerpo responsable de una reacción alér-
gica pertenece al isotipo ige, y son las denominadas inmediatas o de tipo i. en la alergia no
mediada por ige, el anticuerpo puede pertenecer al isotipo igg, como en la anafilaxia producida
por inmunocomplejos que contienen dextranos y la enfermedad del suero. en la aspergilosis bron-
copulmonar alérgica se detectan ambos anticuerpos, tanto ige como igg.

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alergeno: son antígenos que provocan una modificación específica y adquirida de la respuesta
inmunológica de una persona, provocando reacciones alérgicas. la mayoría de los alergenos que
reaccionan con los anticuerpos ige e igg, son de naturaleza proteica (glicoproteínas y polipép-
tidos), a menudo con cadenas laterales de carbohidratos (ocasionalmente, algún carbohidrato puro
ha sido considerado como alergeno).

3.3. Hapteno
es un alergeno de bajo peso molecular que por sí solo no es capaz de producir una respuesta
de tipo alérgico. precisa unirse a otra molécula o proteína coadyuvante para producir una reacción
alérgica.

tipos de alergenos según su vía de entrada:


• aeroalergenos: pólenes, hongos, harina de cereales, productos de las plantas, epitelio y orina de
animales, plumas de aves, ácaros del polvo doméstico e insectos.
• Orales: alimentos, fármacos.
• inyectados: insectos y fármacos.

4. DIAGNÓSTICO DE ALERGIA: IDENTIFICACIÓN DEL ALÉRGENO


el diagnóstico de enfermedad alérgica debe hacerse en base a la combinación de la historia
clínica del paciente y las pruebas diagnósticas tanto in vivo como in vitro.
cuando un paciente presenta una reacción alérgica, la principal pregunta que nos debemos
hacer es: ¿cuál o cuáles son los alergenos causantes del cuadro clínico?
para identificarlos nos vamos a basar en tres pilares:
1. la historia clínica, a partir de la cual estableceremos un serie de protocolos con perfiles de alér-
genos
2. las pruebas cutáneas
3. diagnóstico “in vitro” con pruebas de laboratorio.
nuestra responsabilidad desde el laboratorio será la de llevar a cabo las técnicas adecuadas que
nos permitan enfrentar “in vitro” el anticuerpo con el alergeno o antígeno que produjo el cuadro
clínico, demostrando así una relación de causalidad.

5. MARCADORES BIOLÓGICOS DISPONIBLES PARA EL DIAGNÓSTICO IN


VITRO DE LAS REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD.
el laboratorio juega un papel cada vez más importante en el estudio de la patología alérgica
porque permite monitorizar diferentes etapas de la reacción de hipersensibilidad.
existe un panel de test in vitro que se puede realizar para el diagnóstico de la alergia y la identi-
ficación del alergeno pero además es posible la monitorización de la respuesta inflamatoria y la
anafilaxia con marcadores muy específicos de la misma como la triptasa.
los principales marcadores biológicos se muestran a continuación. de todos ellos en la evalua-
ción del paciente alérgico la ige total y específica son los parámetros más habitualmente monito-
rizados. sin embargo para el diagnóstico de las enfermedades alérgicas es necesario analizar en
combinación la historia clínica del paciente y los ensayos “in vitro” e “in vivo” para detección de ige
específicas.
• ige total
• ige específica
• igg e iga específica
• precipitinas

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• igg4
• rast inhibición
• ecp ( proteína catiónica del eosinófilo)
• leucotrienos
• triptasa
• Moléculas de adhesión
• citocinas
• til
• degranulación de basófilos
• test de liberación de histamina.

6. EL PAPEL DE LA IGE
las reacciones de hipersensibilidad mediadas por ige son las más frecuentes y estudiadas, por
ello nos centraremos en los test orientados a diagnosticar este tipo de reacciones.

6.1. IgE Total


la ige se descubrió en 1966 por teruko y Kimisighe ishizaka investigadores en la campo de la
alergia. la respuesta alérgica a diferencia de otras respuestas inmunitarias depende directamente
de la ige, de su receptor de alta afinidad fcεri, y del mastocito tisular (principal célula efectora).

6.1.1. Estructura de IgE y funcionalidad


la ige es una molécula glicoproteíca, cuya fracción proteíca es mayoritaria. está formada por 4
cadenas de aminoácidos, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, cada una de ellas está
formada por dominios de unos 110 aminoácidos que se unen entre ellos por puentes disulfuro.
cada una de las cadenas consta de secuencias de aminoácidos que se mantienen, denominadas
regiones constantes y secuencias de que varían de una molécula a otra, denominadas regiones
variables (fig 1).
la cadena l tiene un dominio terminal-n variable (vl) y un dominio constante (cl ) mientras que la
cadena h tiene un dominio terminal-n variable (vh) y cuatro dominios constantes (ch). la clase de
anticuerpo (ac), viene determinada por la secuencia ch, que se designa como cε para la ige. las
cadenas ligeras pueden ser kappa (K) o lambda (l), siendo en cada molécula iguales entre sí.

Figura 1. Estructura IgE. Representada la cadena pesada en azul y la cadena ligera en verde.

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los dominios variables constituyen el sitio de unión al antígeno y en el otro extremo se unen a la
célula efectora de la respuesta inmune, basófilos y células cebadas. ésta tiene en su superficie un
receptor de alta afinidad de la ige que se conoce como fcεri. los eosinófilos y las plaquetas
también pueden unirse a la ige pero lo hacen a través de receptores de baja afinidad conocidos
como fcεrii (conocido también como cd23).

6.1.2. Metabolismo y valores de IgE total esperados en suero


la ige (peso molecular de 190000 daltons) circula como monómero presentando una concentra-
ción muy dependiente de edad y una vida media de 1 a 5 días. en sangre de cordón los niveles
permanecen bajos (<2ku/l) ya que no atraviesa la barrera placentaria. los niveles van aumen-
tando hasta los 10 – 15 años de edad y después de los 20 comienzan a disminuir.
la población infantil atópica experimenta un aumento más temprano y más acusado de ige total
en los primeros años de vida si los comparamos con sujetos no atópicos. valores más elevados de
ige tienen mayor asociación con el desarrollo de reacciones de hipersensibilidad tipo i.
en adultos supone el 0.0005% del total de de inmunoglobulinas presentes en el suero por lo que
los ensayos para su determinación tendrán que ser altamente sensibles debido a su baja concen-
tración.

6.2. IgE específica


la existencia de anticuerpos ige específicos en suero y plasma humano es el resultado de una
sensibilización frente a un alérgeno concreto. los pacientes atópicos, genéticamente condicio-
nados, síntetizan ige específica (sige) cuando entran en contacto con el alérgeno frente al que
están sensibilizados y que se regula entre otros factores por la acción de la il4 que induce el
“cambio o switch” hacia la producción de ac de la clase ige y el receptor celular cd40 que permite
el contacto estrecho entre linfocitos t y b.
en el laboratorio es posible demostrar y cuantificar la existencia de sige frente a un determinado
alérgeno en el suero de los pacientes, de esta manera podemos identificar a los antígenos impli-
cados en la reacción de hipersensibilidad y confirmar nuestra sospecha diagnóstica inicial. por esto
la determinación de sige circulante se realiza como técnica de rutina en muchos laboratorios
clínicos, ya que proporciona una medida objetiva de dicho proceso.
la presencia de sige (sin entrar en particularidades de alergenos que excederían a esta revi-
sión), tiene un valor predictivo positivo muy alto con respecto a la propensión individual a desarro-
llar una reacción alérgica tras re-exposición a un alérgeno.
la sensibilización a un alérgeno, en algunas ocasiones puede ser subclínica y en otras la concen-
tración de dicha inmunoglobulina confirma el agente causal de una reacción alérgica ocurrida. en
ausencia de síntomas puede ayudar a predecir el desarrollo de enfermedad alérgica y permite
llevar a cabo medidas clínicas (evitar exposición a alérgenos, seguimiento de pacientes…). en este
sentido podemos decir que las indicaciones a la hora de solicitar una determinación de sige son
similares a las del prick (ver tabla 1).

sIgE Test “in vitro” vs Pruebas cutáneas


• Apoyo diagnóstico en hipersensibilidad IgE mediada, similar a las pruebas cutáneas
• No influenciada por la terapia farmacológica.
• No influenciada por enfermedades cutáneas
• Independiente del alergeno testado
• Elevado número de alergenos a testar
• En general más específica que las pruebas cutáneas y menos sensible
• Posibilidad de evaluar multialergenos
• Ausencia de reacciones adversas
• Menos impacto educativo en el paciente que las pruebas cutáneas

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6.3. Pruebas in vivo versus in vitro
como hemos dicho anteriormente el diagnóstico de enfermedad alérgica debe hacerse en base
a la combinación de la historia clínica del paciente, y las pruebas diagnósticas tanto in vivo como
in vitro. las ventajas/desventajas del estudio in vitro de la alergia vs el estudio “in vivo” se detallan
también en la tabla 1.
las pruebas in vivo (prick test, intradermo), son fundamentales para la confirmación del diagnós-
tico, sin embargo son muy variables debido a las distintas técnicas, la variabilidad en la interpreta-
ción, y a la calidad y estabilidad asociada a los alérgenos empleados.
algunas de las ventajas que presentan los test in vitro son: la ausencia de reacciones adversas
y requieren menos preparación previa del paciente. en general son más específicas aunque menos
sensibles que las pruebas cutáneas. finalmente, la realización de pruebas diagnósticas in vitro,
como la medida de los niveles de ige específica (sige), puede realizarse independientemente de
la integridad de la piel o del tratamiento farmacológico a diferencia de los métodos diagnósticos in
vivo (rast cutáneo, pruebas de provocación…) que no son compatibles con la administración de
antihistamínicos.

6.4. Breve historia de un test: en busca del ensayo ideal de SIgE.


desde el primer ensayo para cuantificar ige que apareció en 1967, los inmunoensayos se han
desarrollado mucho, sobre todo en la línea de reproductibilidad y sensibilidad analítica, el camino
recorrido incluye los siguientes hitos:

1 ª generación: años 60-70, la batalla de la detección


1972 prist phadebas ige: primer test de alergia
1974 primer test ige alergeno específico : rast®
los ensayos para la determinación de niveles ige total y específica fueron desarrollados entre
finales de los sesenta y principios de los 70, poco después del descubrimiento de la subclase e de
inmunoglobulina. esta 1ª generación de inmunoensayos se caracterizaba por los inmunosorbentes
con alérgenos unidos de forma covalente y por una detección añadiendo anticuerpos anti-ige purifi-
cados, de alta afinidad y marcados isotópicamente (yodo 125). semicuantitativos (informaban en
clases) y muy lentos.

2ª generación: años 90, la utilidad clínica del test


la 2ª generación aparece en los 90 y se caracteriza por la capacidad de poder cuantificar los ac
ige. surgen diferentes sistemas de detección (fia, eia) y se inicia la automatización. curvas de cali-
bración multipunto y se amplia el rango de medida (0.34-100) y el menú de alérgenos.

3 ª generación: de la automatización al diagnóstico molecular


la 3ª generación aporta la automatización, aumento del límite de detección (<o.35 Ku/l) y la obten-
ción de allergosorbent de alta capacidad de fijación.
el hito fundamental de este período en el que estamos es la introducción de componentes alergé-
nicos que inicia el camino del diagnóstico molecular de la alergia.
actualmente no existe ninguna metodología de referencia para la determinación de ige específica
sin embargo existen una serie de características que un ensayo debería poseer:
• sensibilidad elevada: capacidad de detectar bajas concentraciones.
• no debe producir reactividades inespecíficas ni con otras inmunoglobulinas, ni con otros alérgenos
no homólogos, ni con sustancias interferentes (bilirrubina, hemoglobina, lípidos, proteínas, autoanti-
cuerpos…).
• ensayo automatizado, con una calibración estable, amplio rango de medida extrapolable a todos
los alérgenos.
• los coeficientes de variación deberían ser menores del 10 % intraensayo y menores del 15 % inte-
rensayo.
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sin duda uno de los avances más destacables es la automatización de los ensayos y la mejora con
respecto a la estandarización interlaboratorio, sin embargo en esta línea todavía quedan aspectos
pendientes. el uso de una única unidad (Kiua/l) por todos los laboratorios para la calibración ha
aportado grandes mejoras no sólo en este último aspecto, sino también en la variabilidad intermé-
todo. sin embargo el mayor avance ha sido el empleo de métodos de calibración referidos a un
estándar internacional de referencia. debemos ser conscientes de que la calibración frente a un
mismo estándar internacional (WhO 75/502) no garantiza de forma automática la concordancia entre
distintos métodos, ya que existen otras variables analíticas (dependientes de cada ensayo comercial
concreto) que afectan al resultado final.
además, la cantidad de alérgenos ofrecidos por los laboratorios es cada vez más grande. en este
sentido uno de los avances más significativos ha sido la unificación de los códigos, lo que ha evitado
redundancias y conflictos en la nomenclatura.

7. TIPOS DE ENSAYOS PARA LA DETERMINACIÓN DE IGE TOTAL Y


ESPECÍFICA

7.1. Calibración de los ensayos para la determinación de anticuerpos IgE


los primeros ensayos que se desarrollaron eran cualitativos, (resultados positivos o negativos
basándose en el nivel de respuesta comparado con un umbral de positividad previamente estable-
cido) y semicuantitativos (resultados positivo o negativo y la magnitud de señal de medida).
actualmente las técnicas que se utilizan son las cuantitativas, que emplean métodos de calibración
más complejos. el objetivo de los métodos cuantitativos es establecer datos reproducibles de
concentración de sige en una muestra, mediante interpolación de una curva de referencia. la
construcción de dicha curva se realiza con múltiples puntos de calibración y la interpolación puede
ser homologa o heteróloga.
lo ideal sería contar con ensayos cuantitativos verdaderos en los que los resultados se informen
en unidades referidas a un estándar internacionalmente reconocido (WhO 75/702) sin embargo no
es posible hacerlo con el método de interpolación homóloga que requiere sige para cada uno de
los alérgenos individualmente. en general para la determinación de niveles de sige los ensayos
comerciales emplean una interpolación heteróloga, ya que por una parte es complicado mantener
un banco de sueros humano capaz de suministrar sueros humanos en una cantidad suficiente para
obtener una variabilidad interlote aceptable y por otra parte no es viable en la práctica diaria esta-
blecer curvas de calibración para cada uno de los alérgenos individualmente.
de esta manera definimos un ensayo cuantitativo como aquel que cumple linealidad, recupera-
ción y precisión interensayo. la calibración heteróloga ofrece una buena alternativa, en este
sistema de calibración la cantidad de ige específica frente a cada alérgeno se interpola en una
única curva de calibración heteróloga, como la curva de referencia de la ige total en suero.
los resultados se informan unidades internacionales: kiu/l para ige total y Kua/l para la ige
específica.

7.2. Metodología general de los inmunoensayos


el primer ensayo que apareció (rast) detectaba anticuerpos ige con una especificidad a un
alérgeno concreto. se trataba de un ensayo no competitivo, inmunoradiométrico, que usaba anti-
cuerpo anti-ige humano radiomarcado para detectar los anticuerpos ige unidos al alérgeno. éste
se encontraba insolubilizado en discos papel.
a lo largo del tiempo se han ido desarrollando diferentes variantes comerciales. todas ellas
tienen en común una serie de características:
• pocillos de reacción: varía en función de la técnica comercial: tubos de distintos materiales, tiras,
placas de microtitulación. un ejemplo es de “cap” de plástico con una matriz.
• alergeno: reactivos que contienen el alergeno bien en fase sólida bien en fase líquida.
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• reactivo específico de la cadena pesada épsilon para la detección de ige.
• sistema de calibración.
• tampón de reacción: mantiene el ph y favorece que desaparezcan las uniones inespecíficas.
• autoanalizador y software para procesamiento de datos.

7.3. Tipos de inmunoensayos.


ria: el marcador es un isótopo radiactivo como el yodo 125.
fia: fluoroinmunoanalisis. el marcador es un compuesto fluorescente.
eia: enzimoinmunoanalisis. el marcador es una enzima que actúa sobre un sustrato, que se
convierte en un producto coloreado o fluorescente, se cuantifica por tanto absorbancia y fluores-
cencia respectivamente.
clia: Quimioluminiscencia. el marcador genera luminiscencia por activación mediante una reac-
ción química.
son interferentes de los inmunoensayos: cualquier tratamiento que altere la composición o
volumen del compartimento sanguíneo del paciente (transfusiones, reacciones anafilácticas
recientes, quimioterapia…), el omalizumab interfiere con algunos de los ensayos de ige específica
y los esteroides sólo cuando tras largas terapias complemente el sistema inmunitario del paciente.

7.4. Principales inmunoensayos disponibles.

7.4.1. ImmunoCAP Specific IgE


thermofischer (anteriormente pharmacia) ofrece más de 650 alérgenos diferentes y 70 compo-
nentes de alérgenicos para la detección cuantitativa precisa y sensible de anticuerpos ige de alér-
genos determinados. los equipos que tiene en el mercado son: unicap 250, unicap 100 y unicap
1000, que varían fundamentalmente en la procesabilidad.
se trata de un fluoroinmunoensayo clásico tipo sándwich, en el que el alérgeno está fijado a una
matriz (fase sólida) y la anti- ige está marcada con la enzima galactosidasa que hidroliza el 4-metil-
umbeliferil-beta-d-galactosa, liberándose un producto fluorescente: 4 metil-umbeliferona.
el sistema de calibración (OMs 75/502) esta basado en una curva construida con 6 calibradores
de ige total, la curva es válida durante un mes y en la práctica diaria se controla con 2 puntos.
la tecnología immunocap detecta los anticuerpos ige en un rango de 0 a 100 kua /l, respecto
a un alérgeno en concreto, el resultado que se obtiene es por tanto cuantitativo. sin embargo el
rango cuantitativo real es de 0.1 a 100 kua /l.
el estudio en distintos centros de análisis ha permitido establecer los valores de sensibilidad (84
-95%), y especificidad (85 - 94%) de ensayo, lo que da una idea del rendimiento clínico.
el tiempo del ensayo es de 2,5 horas

7.4.2. AlaSTAT
siemens tiene en el mercado la tecnología alastat, una técnica de quimioluminiscencia amplifi-
cada con más de 350 alérgenos específicos disponibles. los equipos disponibles son iMMulite
2000 e iMMulite 2500.
los alérgenos se incorporan en fase líquida anclados a un polímero marcado con biotina. la
unión a la fase sólida se realiza a través de la alta afinidad que presenta la biotina por la estrepta-
vidina que porta una bola de poliestireno. la matriz soluble de polímero/co-polímero que alberga
los determinantes alérgenicos incrementa el número de sitios de unión y su accesibilidad para los
anticuerpos ige específicos de alérgeno. la detección de la señal quimioluminiscente amplificada
debida a la unión biotina-estreptavidina le confiere una mayor sensibilidad y la técnica exclusiva de
lavado aumenta su especificidad.
el sistema de calibración (OMs 75/502) esta basado en una curva master con 7 calibradores de

7
ige total, de tal manera que se analizan dos controles ajustadores en la rutina diaria, la curva es
válida para 28 días.
el rango de ensayo se encuentra entre 0.35- 100 kua /l,
el primer resultado se obtiene a los 65 minutos y tiene una buena capacidad de procesamiento:
100 determinaciones /hora.

8. CITOMETRÍA DE FLUJO Y ALERGIA.


la citometría de flujo es un campo complejo que tiene aplicaciones en distintos campos entre ellos
la inmunología y la alergia.
estudia las propiedades físicas y químicas de células vivas y de otras partículas de origen biológico.
los citómetros de flujo combinan sistema hidraúlico, óptica, electrónica y software:
sistema hidráulico: transforma una suspensión aleatorizada y tridimensional de partículas o células
en un flujo laminar.
óptica: fundamental para la iluminación de partículas teñidas y no teñidas y para la detección de
las señales de difracción de luz y de las señales fluorescentes.
• excitación y emisión: fuente de radiación monocromática (láser).
• selectores de longitud de onda
• detectores: fotodiodos.
forward angle light scatter: situado a 180º, proporciona información de tamaño y superficie.
side angle light scatter: varios en función de las fuentes de excitación. situados a 90º, uno da infor-
mación de complejidad citoplasmática y el resto cuantifican fluorescencia emitida por los fluorocromos
previamente excitados.

8.1. Aplicaciones en el estudio de alergia


la citometría de flujo tiene aplicaciones en la monitorización de la respuesta inflamatoria
mediante los test de activación de basófilos, niveles de citocinas y tests de transformación linfoci-
taria que exceden a esta revisión.
Otra aplicación es la determinación de ige específica, para ello utiliza micropartículas de poliesti-
reno teñidas con combinaciones de fluorocromos rojos y naranjas y con adhesión de un alérgeno
concreto.

8.2. Determinación de IgE específica por citometría de flujo


la muestra que contiene sige, se incuba con dichas micropartículas y se revela con un conjugado
anti-ige humana marcado con fluoresceína. de esta manera se detecta el tipo de microesfera (que
determina el tipo de alérgeno) y por otro lado la fluoresceína (que determina la cantidad de sige).
entre las ventajas está la posibilidad de cuantificar la sensibilización a múltiples alérgenos en un
mismo pocillo, debido a que realiza varios microinmunoensayos simultáneamente. además permite
analizar poblaciones minoritarias entre una mezcla compleja, puede utilizar varios marcajes al mismo
tiempo y analiza gran cantidad de células. estas tres últimas caracteristicas convierten a la citometría
en una técnica de sensibilidad muy elevada.
en realidad se trata de un ensayo multiplex en el que se analizan varios analitos de especificidad
diferente en una muestra de suero empleando una sola mezcla de reactivos.
Otra peculiaridad con respecto a otros inmunoensayos es que no requiere lavado. se obtiene gran
cantidad de información en muy corto espacio de tiempo, pudiendo obtener resultados en 2 horas.
una de las grandes ventajas es el software que lleva asociado el citómetro, que permite almacenar
datos, de manera que quedan disponibles para consultar.
uno de los inconvenientes de esta técnica es que, si lo comparamos con la citoquímica y la micros-
copia de fluorescencia, perdemos la visión de la arquitectura del tejido.

8
Figura 2. Ensayo IgE, puntos

9. VARIABLES A EVALUAR EN LA DETERMINACIÓN DE IGE ESPECÍFICA “IN


VITRO”: EL PAPEL DEL ALÉRGENO
como ya se ha mencionado, la determinación de sige chequea una de las fases de las reac-
ciones de hipersensibilidad, su presencia nos indica que el proceso de sensibilización frente a un
determinado alérgeno se ha puesto en marcha. esto nos va permitir establecer estrategias preven-
tivas o de evitación del antígeno causal en el tratamiento nuestros pacientes.
parte de las respuestas al desafío pendiente se encuentran en las mejoras en la definición y
estandarización de los alérgenos.
se trata de un marcador con una elevada rentabilidad clínica que puede verse mermada por
ciertas limitaciones técnicas, que debemos evaluar cuidadosamente a la hora de seleccionar un
test de laboratorio adecuado para su cuantificación:
a. las bajas concentraciones en suero del analito, en personas no sensibilizadas la concentra-
ción de sige suele ser < 0.35 Ku/l.
b. la complejidad alergénica que requiere un elevado compromiso de calidad del extracto de
alérgenos. ambos, las consideraciones tecnológicas y el extracto alergénico van a condicionar en
gran medida el rendimiento del test. (fig 2.)

10. ALERGENOS: DE LA FUENTE AL EXTRACTO


los alergenos son estructuras moleculares con capacidad para reaccionar frente a sige humana
lo que facilita su identificación “in vitro”. en el estudio serológico del paciente alérgico intentamos
identificar las fuentes alergénicas y establecer su perfil de reactividad de ige.
sin embargo en el caso de los alergenos, la compleja interacción de la reacción ag-ac, se ve
además potenciada por la gran diversidad de su composición molecular que está compuesta por
mezclas heterogéneas de material biológico, proteínas, hidratos de carbono y ácidos nucleicos.
la fuente de alergenos o sustancias potencialmente alergénicas es de una gran diversidad.
algunos pacientes presentan monosensibilización, aunque es mucho mas frecuente la polisensibi-
lización frente a alergenos diferentes y de orígenes diversos, pólenes, ácaros, mohos, alimentos.
por último hay que tener presente que en los ensayos hasta ahora descritos no trabajamos con
la materia prima alergénica (pólenes, ácaros, insectos, etc), sino con extractos que obtenemos de
dichas fuentes.

9
10.1. Materia prima alergénica y extracto alergénico

10.1.1. Materia prima alergénica


está constituida por mezclas complejas de material biológico: no todos los componentes de la
mezcla tienen interés alergénico y los que sí lo tienen, no todos alcanzan el mismo rango y
potencia. existe una “diversidad” de la sige es decir patrones de respuesta individuales frente a los
distintos componentes alergénicos de un mismo alérgeno. las fuentes alergénicas para un mismo
extracto alergénico de la misma especie pueden sufrir modificaciones en su obtención ya sea por
diferentes protocolos de preparación o simplemente sufrir variaciones geográficas.
Mediante técnicas de análisis estructural tridimensional, podemos conocer la composición y dispo-
sición espacial de los distintos determinantes antigénicos para definir cuáles son los principales.

10.1.2. Alergenos principales


los alérgenos principales son aquellos procedentes de una única fuente, que estimulan la
producción de ige en más del 50% de los pacientes alérgicos a dicha fuente.
se ha visto que la concentración de alérgenos principales individuales se correlaciona con la
potencia biológica y reactividad de ige de extractos alergénicos.

10.1.3. Extracto alergénico


es un producto biológico obtenido mediante la extracción de los componentes moleculares con
actividad alergénica contenidos en la materia prima o alérgeno. todos los componentes son aler-
génicos porque se ha eliminado el material antigénicamente irrelevante, obteniendo al final, una
mezcla compleja de proteínas alergénicas.
desde el punto de vista analítico es crucial que la totalidad de los componentes biológicamente
activos estén presentes y accesibles en el extracto y en la cantidad suficiente para poder reac-
cionar con el ac sige durante el inmunoensayo. es importante conseguir un extracto bien caracte-
rizado y altamente purificado con capacidad para generar una respuesta inmune mediada por anti-
cuerpos ige.

10.1.4. Estandarización del extracto


la estandarización del extracto, implica la determinación de la unidad de alergeno, el desarrollo
de material de referencia y la medición de la capacidad total de unión de la ige al alérgeno.
consiste en un conjunto de procesos y reacciones químicas en los que, partiendo de un alérgeno
en estado puro natural, se caracteriza, eliminando de su contenido todos los componentes y
materia impura no inmunológica, para la obtención de una fracción o fracciones proteicas mayores
y menores con una potencia igual en todos los lotes resultantes, y que sirva de referencia con el
fin de inducir a una respuesta de tipo inmunológico.
generalmente se lleva a cabo para evaluar la calidad de los extractos alergénicos:
• garantizar que la fuente alergénica viene de las especies adecuadas.
• garantizar que la fuente alergénica no está contaminada con otras fuentes alergénicas.
• todos los componentes alergénicos presentes en la mezcla tienen que estar en el extracto.
• debemos averiguar cuales son los determinantes alergénicos principales para que en ningún
caso estos no estén presentes en nuestro extracto alergénico.
• determinar que están la mayoría de los alérgenos.
• Medir y estandarizar el contenido alergénico total.
• determinar la concentración de los principales alérgenos en los casos en los que se puedan
realizar los análisis oportunos.
• garantizar que el extracto es biológicamente activo.

10
Figura 3. Nomenclatura alérgenos

10.2. Nomenclatura de los alergenos


se utilizan las 3 primeras letras del género, la primera letra de la especie, y un número arábigo
que indica, o bien el orden en el que fue aislado el alérgeno o bien su importancia clínica y que
identifica los antígenos contenidos dentro de un mismo organismo.
en el ejemplo de la figura 3 se describe el primer alérgeno purificado de dermatophagoides
pteronyssinus (ácaro del polvo) der p 1.
la iuis (international union of immunological societies) gestiona y mantiene actualizada la base
de datos oficial en cuanto a nomenclatura de alérgenos se refiere y que está disponible en internet
www.allergen.org.

11. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA ALERGIA

11.1. Del extracto a las proteínas


los métodos arriba descritos para el estudio “in vitro” de anticuerpos ige específicos, se basan
en el empleo de extractos alergénicos naturales, mediante ellos podemos averiguar si un paciente
reacciona frente a una fuente alergénica determinada, pero no nos proporciona información sobre
la naturaleza de las moléculas alergénicas sensibilizantes. en suma, desconocemos la naturaleza
molecular de los alergenos implicados.
sin embargo a partir del desarrollo de la tecnología dna recombinante, se empezaron a producir
grandes cantidades de proteínas alergénicas mediante dicha tecnología. estas proteínas tienen
capacidad de unión a ige y de inducir sus respuestas, es decir activación de células t y células
efectoras. tienen las mismas características inmunológicas que los alérgenos naturales y mues-
tran buena reactividad en los ensayos, por tanto son útiles para el diagnóstico in vitro de la alergia.
un alergeno recombinante es una molécula alergénica producida por biotecnología que se intro-
duce en un vehículo de clonación, plásmidos o fagos. el cdna se inserta finalmente en un sistema
de expresión o célula huésped generalmente escherichia coli y se incorpora a su genoma. el creci-
miento del cultivo implica la producción de proteínas recombinantes, su purificación y posterior vali-
dación con similares propiedades inmunológicas y funcionales que las fuentes naturales de aler-
genos (fig 4).

11
Figura 4. Obtención alérgenos recombinantes
la expresión recombinante de dna proporciona un sistema de producción ilimitada de alergenos
altamente homogéneos, sin variación genética o biológica y comparables a los naturales en reac-
tividad. por ello podemos utilizarlos para optimizar el estudio de la patología alérgica por el labora-
torio, mediante el empleo de diferentes estrategias:
• si el extracto alergénico natural presenta escasez de un determinado componente, es posible
equilibrarlo añadiendo la proteína alergénica recombinante deficiente al extracto (spiking), e incre-
mentado con ello la sensibilidad de nuestro ensayo. como sucede con el extracto natural del látex
K82. que la lleva incluida.
• es posible testar el extracto de la fuente alergénica y en un segundo ensayo optimizarlo estu-
diando la proteína alergénica recombinante, como sucede con el extracto de cacahuete y la
proteína ara h8.
• existen mezclas optimizadas de proteínas recombinantes, en las que se excluyen todos aquellos
componentes que no son relevantes desde el punto de vista diagnóstico, por ejemplo en el estudio
in vitro de la alergia a la cereza en el que se incluyen las proteínas pru av1, pru av2, r pru av3.
• finalmente podemos testar las proteínas alergénicas recombinantes de manera individualizada,
con este sistema se da un paso hacia delante en el estudio molecular de la alergia y el diagnós-
tico in vitro de la alergia medida por ige.
en la figura 5 se detalla el algoritmo del estudio in vitro de la sospecha clínica de alergia ige
mediada. en un primer paso se estudia la fuente alergénica en este caso ácaro. cuando hablamos
de fuente alergénica los extractos que obtenemos por extracción acuosa están compuestos por
mezclas de proteínas. es posible actualmente identificar las moléculas alergénicas.
en el caso del ácaro tenemos las proteínas marcadoras específicas nder p1 y rder p2 y una
proteína el r der p 10 que es una tropomiosina.
la tropomiosina es una proteína de unión a la actina existente en las fibras musculares y es un
marcador de reactividad cruzada entre crustáceos (camarón, moluscos, ácaros, cucarachas y otros
artrópodos).

11.2. Componentes alergénicos marcadores de especie y componentes


alergénicos marcadores de reactividad cruzada
los componentes alergénicos de especie son específicos de ella y están limitados por tanto a una única
fuente alergénica. la principal utilidad de su identificación es la de llegar a conocer cuales son las princi-
pales proteínas implicadas en la sensibilización frente a la misma. un ejemplo Ole e 1 componente
marcador de especie que es el alérgeno mayor del polen del olivo. existe una distribución geográfica de
los alérgenos ya que los pacientes se sensibilizan frente a las especies a las que están más expuestos.

12
Figura 5. Algoritmo estudio in vitro IgE
las proteínas según su función y estructura se agrupan en “familias”, debido a la similitud suelen
estar presentes en especies relacionadas biológicamente y además es muy probable que exista
reactividad cruzada entre especies entre las proteínas pertenecientes a una misma familia.
es posible tener una respuesta ige clínica sin exposición previa frente a un alergeno determinado
por sensibilización a otro alergeno de elevada homología, en este caso los anticuerpos ige reco-
nocen epítetos homólogos de proteínas que están presentes por ejemplo en pólenes y alimentos.
la reactividad puede ser clínica o silente (subclínica). los panalergenos son proteínas responsa-
bles de la reactividad cruzada entre especies no relacionadas entre sí. así uno de cada cinco
pacientes polínicos tiene sensibilización frente a alimentos de origen vegetal.
la identificación de las proteínas marcadoras de reactividad cruzada es de gran utilidad en el
diagnóstico de la alergia ya que permite conocer sensibilizaciones frente a diferentes fuentes
alergénicas y establecer medidas de evitación para prevenir los riesgos de exposición a las
mismas.

11.3. Clasificación de los componentes alergénicos por grupos de proteínas


la mayoría de los alérgenos según sus características estructurales y sus funciones se
pueden clasificar por familias o grupos de proteínas. las proteínas con mayor similitud estruc-
tural pueden ser reconocidas por ac ige aunque estén presentes en especies diferentes. por
eso es de gran utilidad la división en grupos ya que ayuda a comprender cuestiones clínica-
mente muy complejas sobre la reactividad cruzada. es muy útil conocer cuales son las princi-
pales familias de proteínas, que están agrupadas como tales en la base de datos de allfam:
www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/
si en un paciente con reacción alérgica a las frutas realizamos las pruebas in vivo o in vitro
podemos averiguar la fuente alergénica. sin embargo la sensibilización originaria puede deberse
a pólenes que serían los responsables de los síntomas clínicos, debido a reactividad cruzada entre
proteínas de elevada homología presentes no solo en las frutas, sino también en pólenes de
árboles o gramíneas.

13
11.3.1. PR-10 proteína, Bet v 1 homóloga
familia de proteínas termolábiles lo que permite en general tolerancia de los alimentos coci-
nados, fácilmente degradables por enzimas digestivas. suele asociarse a síntomas orales locales
y leves saO (síndrome de alergia oral).
proteína de 18 Kda homóloga a bet v 1 que es el sensibilizador principal del polen del abedul.
su distribución es fundamentalmente en el norte y centro de europa. se ha localizado en nume-
rosas frutas y vegetales cereza, manzana, apio, zanahoria, soja y cacahuete, por lo que se asocia
a las reacciones alérgicas por frutas rosaceae y vegetales en los países nórdicos.

11.3.2. LTP proteína transportadora de lípidos


proteína termoestable de 9 Kds, resiste a la cocción, la manipulación industrial y procesados
(zumos de frutas) y la digestión. también permanece en productos derivados como la cerveza.
responsable de reacciones alérgicas a frutas y vegetales en el sur de europa generalmente
asociado junto con saO a cuadros clínicos sistémicos y más graves. ejemplo rpru p 3 ltp
Melocotón y rara h 9 cacahuete.

11.3.3. Profilinas
las profilinas son proteínas de unión de actina y están presentes en el citoesqueleto de las
células están presentes en pólenes de plantas y alimentos vegetales y presentan una elevada
reactividad cruzada entre ellos incluso entre especies biológicamente alejadas. se ha descrito que
un 20% de lo pacientes alérgicos a pólenes tienen ac ige frente a profilina.
son panalérgenos importantes del reino vegetal por lo que podemos encontrar numerosas posi-
tividades frente a numerosas fuentes alergénicas. sin embargo clínicamente no son relevantes.
ejemplo rpru p 4 profilina Melocotón.

11.3.4. Proteína de almacenamiento


se encuentran en las semillas de las plantas ya que sirven de reserva para el desarrollo de la
planta, son termoestables. ejemplo albúminas 2s ara h 2 proteína de almacenamiento cacahuete
y albúminas 7s ara h 1 proteína de almacenamiento cacahuete . reactividad cruzada con
alimentos crudos y cocinados

11.3.5. Polcalcinas
proteínas de alta presencia en los pólenes y con elevada reactividad cruzada entre ellos pero no
con los alimentos de origen vegetal, en los que apenas están presentes. bet v4 polcalcina, abedul
y rphl p 7 polcalcina, hierba timotea.

11.3.6. CCD (Cross- reactive carbohydrate determinants)


están constituidos por carbohidratos unidos a proteínas. están presentes en plantas, insectos y
algunos ácaros. es un marcador de sensibilización y reactividad cruzada frente a determinantes de
los carbohidratos. en general no se asocia a síntomas clínicos pero pueden presentarse cuadros
clínicos severos en un número elevado de pacientes. ejemplo Muxf 3 bromelaína (anafilaxia).

11.3.7. Tropomiosina
proteína de unión a la actina presente en las fibras musculares. Marcador de reactividad cruzada
entre crustáceos, moluscos, ácaros, cucarachas y otros artrópodos y nematodos. ejemplo pen a 1
tropomiosina gamba, rder p 10 tropomiosina Ácaro.

11.3.8. Albúminas séricas


proteínas que están presentes de manera habitual en tejidos sólidos y fluidos biológicos de dife-
14
rentes especies de origen animal, carne de vaca, leche de vaca, carne de pollo, huevos.
pueden ser responsables de reactividades cruzadas alimentarias entre albúminas de diferentes
especies animales y producir cuadros de las vías aéreas frente a mamíferos. ejemplo nbos d 6
bsa vaca, nfel d 2 albúmina sérica gato.

11.3.9. Parvalbúmina
alérgeno principal del pescado, es una proteína termoestable que resiste la cocción del mismo.
Marcadores de reactividad cruzada entre diferentes especies de peces y anfibios. por ejemplo
rgad c1 bacalao.

11.3.10. Lipocalinas
proteínas estables y alérgenos mayores que a diferencia de las familias hasta ahora descritas
presentan una reactividad cruzada limitada entre diferentes especies animales, ejemplo rfel d 1
gato, rcan f 1 perro.

11.4. Diagnóstico In vitro con alergenos recombinantes


en la actualidad se han clonado y expresado como proteínas recombinantes un número elevado
de componentes alergénicos procedentes de diferentes fuentes: pólenes de gramíneas, malezas y
árboles; mohos; epitelios; insectos/venenos; ácaros; látex; carbohidratos; enzimas y alimentos.
existen más de 90 componentes alergénicos individuales disponibles en el mercado o mediante la
técnica de microarray de proteínas alergénicas.
las técnicas de microchips permiten la determinación de múltiples alérgenos purificados y
recombinantes de una manera sencilla.
estas técnicas están principalmente indicadas en aquellos pacientes polisensibilizados, en los
que podremos determinar si se trata de reacciones cruzadas por la presencia de panalergenos o
sensibilización frente a alergenos minoritarios.
numerosas fuentes biológicas contienen componentes alergénicos con reactividad cruzada. la
sensibilización frente a dicho panalergeno produce resultados positivos en las pruebas frente a
diferentes extractos alergénicos.
el estudio de los panalergenos mediante array permite conocer las verdaderas reactividades
cruzadas e identificar a los pacientes co-sensibilizados. la tecnología de inmunocap isac s ige
112 está basada en la biotecnología de los biochips que permite realizar simultáneamente en un
biochip el estudio de 112 proteínas alergénicas.
se trata de un inmunoensayo semicuantitativo de fase sólida, sobre un soporte de vidrio se
fijan los componentes alergénicos por triplicado en un área de cm2., se incuba con el suero del
paciente y mediante un anticuerpo marcador podremos detectar la unión de los ac ige especí-
ficos al correspondiente componente alergénico. la medición de la fluorescencia se realiza
mediante un scanner de micromatriz apropiado. finalmente los resultados se analizan con el
software phadia Microarray image analysis (Mia) y el cálculo se realiza en unidades estanda-
rizadas isac para sige (isu-e).
como nueva tecnología que es requiere estudios de validación para los distintos alérgenos.

11.5. Aplicación clínica de los alergenos recombinantes: el diagnóstico


por separación de componentes (CRD)
los test de alergia empleados de manera habitual en el diagnóstico de estas patologías simple-
mente señalan la fuente alergénica causal, por ejemplo el polen de una planta o un ácaro, pero
dicha fuente alergénica contiene como ya se ha mencionado diversos componentes alergénicos.
componentes alergénicos son los alérgenos moleculares purificados, obtenidos por purificación
de su fuente natural o producidos biotecnológicamente.

15
si testamos proteínas recombinantes o nativas aisladas podemos identificar de manera individual
estos componentes y evaluarlos por separado, de ahí la denominación de “diagnóstico por sepa-
ración de componentes”.
el dx por separación de componentes (crd component resolved) se basa en el empleo de
moléculas de alérgenos purificados recombinantes o nativos para el diagnóstico “in vitro” de la
alergia. el crd identifica individualmente los alérgenos que producen la enfermedad en cada
paciente lo que permite conocer el perfil de sensibilización del mismo.
Mediante crd podríamos llegar a identificar el perfil total de reactividad de anticuerpos de un
paciente alérgico y por tanto:
• conocer los anticuerpos implicados en el desencadenamiento de la enfermedad
• si existe en un paciente sensibilización independiente frente a diferentes fuentes alergénicas (co-
sensibilización).
• identificar a los pacientes sensibilizados a panalérgenos y las posibles interacciones causadas
por anticuerpos ige de reactividad cruzada a diferentes alérgenos.
• Mejorar en definitiva el perfil de sensibilización de un paciente y establecer el crd, mediante el
cual podemos proporcionar respuestas clínicas individualizadas.
el estudio molecular de la alergia implica un paso hacia delante y un cambio de concepto en el
abordaje clínico y diagnóstico. el cambio real de concepto es el salto que supone pasar de pensar
en el estudio de las especies y de las fuentes alergénicas al análisis de las proteínas puras. se
necesitan más evaluaciones técnicas y validaciones clínicas pero el camino ya se ha iniciado y es
irreversible.

16
BIBLIOGRAFÍA
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17
EVALUACIÓN
caso clínico 1

PACIENTE CON ALERGIA ESPECÍFICA AL LÁTEX.

- Mujer de 45 años vista en la consulta de Alergia en 1999 con diagnóstico de:


RINITIS CRONICA.
Rinoconjuntivitis polínica
Sinusopatía maxilar asociada.

-Acude de nuevo al Servicio de Alergia en Noviembre de 2011. Refiere que el 11 de Nov se


realizó una Ecografia Vaginal y a los 10 minutos siguientes una vez finalizada la prueba
presentó síntomas de rinitis (congestión nasal, hidrorrea y sensacion de inflamación facial) sin
angioedema. Niega ninguna sintomatología en genitales.
En la Historia Clínica se objetiva que ha estado en contacto con látex durante la ecografía por
lo que se le pregunta si recuerda haber tenido reacciones adversas al contacto con materiales
de Látex, a los que responde negativamente. No posee antecedentes de reacciones adversas
con frutas (plátano, kiwi, castaña, aguacate) ni con otros alimentos.
Trabaja en residencia de ancianos de hace 5 años y utiliza guantes de vinilo. La paciente
refiere que nunca ha utilizado guantes de Látex (le gustan mas los de Vinilo, porque los de
látex “le picaban”).
Persisten desde su primera consulta los síntomas de Rinitis durante casi todo año, que se
controlan con Corticoides nasal y AntiH1.

Exploraciones Complementarias

1) Pruebas cutáneas

Se le realiza una batería básica de neumoalérgenos y látex con los siguientes resultados
(referencia para p. cutáneas + 3 mm más que el salino):

POSITIVAS para polen de gramíneas 6mm, poa 7mm, olea 7mm, epitelio de perro 3mm.
NEGATIVAS: cynodon, plátano, ciprés arizónica, mezcla de malezas, profilina, ácaros del
género Dermatophagoides pteronyssinus, epitelio de gato, hongos del género aspergillus,
alternaria.

Prueba cutánea frente al LÁTEX: 6mm

2) Diagnóstico “in Vitro” de IgE específica


Se realiza la determinación de IgE específica frente al látex (extracto alergénico k82) con el
siguiente resultado:

k82 Látex 18.9 kU/L (<0.35kU/L)

3) Diagnóstico molecular
Se realiza un estudio de proteínas alergénicas nativas y recombinantes mediante la técnica
de Array.
En el estudio Array de alérgenos (ISAC 111) Se informan como positivos en unidades ISU-E
las siguientes proteínas alergénicas:
*Marcadores especie específicos plantas:
nCyn d1 Grama mayor Gramíneas grupo 1 1.06 ISU-E Moderado / Alto
rPhl p1 Hierba Timotea Gramíneas grupo 1 2.24 ISU-E Moderado / Alto,
nOle e1 Olivo Grupo 5 olivo comun 0.74 ISU-E Bajo,
rCan f1 Perro Lipocalina 1.99 ISU-E Moderado / Alto

18
*Marcadores especie específicos del LÁTEX:
rHev b1 Látex Factor de enlongacion de la goma < 0.3 ISU-E Indetectable
rHev b3 Látex Particula de goma < 0.3 ISU-E Indetectable
rHev b5 Látex Proteína acida < 0.3 ISU-E Indetectable
rHev b6 Látex Heveina 5.95 ISU-E Moderado,

*Componentes marcadores de reactividad cruzada:


Profilina:
Látex rHev b8 Profilina <0.3 ISU-E ISU-E Indetectable

Resultó positiva la proteína proheveína específica del Látex


4) - Prick prick:

Finalmente se realiza la prueba “in Vivo” prick –prick ya que la proheveína se asocia al
síndrome látex-frutas:
Aguacate: 5mm
castaña: 2 mm
Kiwi: 2 mm
Piña: 3 mm

Juicio Clínico
RINITIS CRONICA. SENSIBILIZACION A PÓLENES DE GRAMINEAS Y OLIVO, Débilmente
a Epitelio de Perro.
-.SENSIBILIZACION AL LÁTEX (urticaria-angioedema facial) tras exploración ginecológica.
Sensibilización a proteína Hev b 6 (proteína específica de látex), y asociada a síndrome
látex-frutas.

Medidas de evitación al Látex


Recomendaciones
Seguir indicaciones de evitación de látex
Evitará las frutas que no sabe si tolera relacionadas con sindroma látex-frutas: aguacate, kiwi,
castaña, piña.
Comerá plátano que tolera, con regularidad.

Se pauta un tratamiento en caso de reacción por exposición inadvertida al látex

1 - ¿cuál ha sido la aproximación diagnóstica en este caso clínico y que es extrapolable a todo
paciente que acude a la consulta de alergia?
a) realización de pruebas cutáneas, y en base a los resultados, determinación de ige especí-
fica en el laboratorio.
b) realización de microarrays para determinación de alérgenos recombinantes, y tener así una
idea exacta de las proteínas a las que es alérgico el paciente.
c) la historia clínica, a partir de la cual estableceremos una serie de protocolos con perfiles de
alérgenos, y en base a ella, realizar pruebas cutáneas y/o diagnóstico in vitro con pruebas de
laboratorio.
d) cualquiera de las 3 aproximaciones es correcta.

2 - ¿cuál de las siguientes afirmaciones es verdadera?


a) los resultados de los test in vivo frente a gramíneas del paciente del caso 1 guardan relación
con sus antecedentes clínicos.
b) los antecedentes clínicos recientes del paciente obligan a la realización de la prueba cutánea
frente al látex y la prueba ige específica frente al látex (extracto alergénico k82)
c) la prueba de ige específica frente al látex indica positividad frente a esta fuente alergénica.
d) todas son ciertas

19
3 - ¿Qué avance diagnóstico supone la realización de diagnóstico molecular en este paciente
una vez conocida la positividad de ige específica frente al látex?
a) el resultado de las proteínas alergénicas marcadores especie específicos del látex son lo
mismo que la prueba de ige específica frente al látex.
b) la positividad de la proteína proheveína específica del látex apoya el juicio clínico de este
paciente de sensibilización al látex.
c) la negatividad del marcador de reactividad cruzada del látex (profilina del látex) apoya el
juicio clínico de este paciente de sensibilización al látex y no de reactividad cruzada.
d) c y b son ciertas.

4 - ¿cuál de las siguientes afirmaciones sobre la utilidad del diagnóstico in vitro con alérgenos
recombinantes crees que aplica en este paciente?
a) permite determinar la proteína que causa dicha alergia específica.
b) las técnicas de microchips permiten la determinación de múltiples extractos alergénicos y
recombinantes de una manera sencilla.
c) es una tecnología basada en microchips que permite realizar simultáneamente en un biochip
el estudio de 112 extractos alergénicos.
d) el cálculo de los resultados se realiza en unidades internacionales iu/ml para ige específica.

5 - ¿cuál es la causa de la realización de la prueba prick-prick a aguacate, castaña, Kiwi, y piña?


a) la asociación existente entre la sensibilidad a gramíneas y a estos alimentos.
b) la positividad de este paciente a la proteína proheveína específica del látex, ya que se asocia
al síndrome látex-frutas
c) ninguna.
d) la positividad de este paciente al extracto alergénico Ole1, ya que se asocia al síndrome
látex-frutas.

20
caso clínico 2

HISTORIA DE PACIENTE CON ALERGIA A PANALERGENOS

Mujer de 19 años. Estudiante y empleada como administrativo. Sin Alergias conocidas


No presenta antecedentes personales o familiares de interés.Desde hace 5 años durante los
meses de Febrero hasta Junio: síntomas nasales consistentes en rinorrea acuosa, estor-
nudos en salva, picor nasal, obstrucción nasal bilateral, picor ocular e inyección conjuntival.
Mejora con cetirizina y Bilina parcialmente. No clínica de vías respiratorias bajas.
Desde la misma fecha presenta reacciones con frutas: picor orofaríngeo, edema de labios y
sensación de cuerpo extraño faríngeo, nunca objetivado edema de úvula. Le ha ocurrido a los
pocos minutos de comer sandía, manzana sin piel, pera sin piel, lechuga, melocotón sin piel,
fresas por los que los ha eliminado de la dieta.
Come judías verdes, tomate aunque en escasa cantidad. No le gusta la fruta ni la verdura por
lo que hay frutas que no las come.
Posteriormente acude a la consulta ya que refiere picor oral con pipas y avellanas. Come
cacahuetes y almendras. Hace años que no come pistachos.
Vuelve en un año más tarde, con un episodio de SAO (Síndrome de Alergia Oral) frutas y
verduras frescas. Come verduras cocidas (zanahorias, puerros, judía verde)
Refiere disnea y escucha de pitos cuando hace esfuerzos y al rato de parar.
evita las frutas, verduras frescas. Come alimentos cocidos en pequeñas cantidades: beren-
jena, puerro, cebolla, ajo, pimiento verde.

Exploraciones Complementarias

1) Pruebas cutáneas
(referencia para pruebas cutáneas positivo 3 mm mas que el salino)

-Pruebas cutáneas batería básica de neumoalérgenos resultan positivas para: polen de


gramíneas 16 mm, cynodon 11, phagmites5, poa 7, olea 4, plátano 5, ciprés arizónica 3, arte-
misia 4, amaranto15, chenopodium10, salsola9, plántago7, parietaria 4 mm, epitelio de perro
3 mm y gato 9 mm.
Resto de batería: negativas: ácaros del género Dermatophagoides pteronyssinus y farinae,
Lepidoglyphus destructor, hongos del género aspergillus, alternaria, cladosporium, penicilium.

-Pruebas cutáneas con profilina positiva: 10 mm.


-Pruebas cutáneas melocotón comercial piel y pulpa negativas.
-Pruebas cutáneas a batería comercial frutos secos, positivos: castaña 6 mm, pipas 4 mm,
pistacho 7 mm, cacahuete 3 mm, avellana 3 mm.
Almendra, nuez: negativas

Posteriormente se realizan: Provocación oral con acelga: A los 30 minutos de la primera


dosis, la paciente refiere discreto picor en boca. No se observa nada objetivable. A la hora de
la 3ª dosis la paciente refiere epigastralgia que desaparece al administrar Almax oral.
La paciente refiere que ha presentado 15 días con diarrea.

2) Diagnóstico “in Vitro” de IgE específica


(positivo >0.34kU/L)

Se realiza la determinación de IgE específica frente a:

f299 Castaña 0.04 kU/L


f242 Cereza 0.41 kU/L
f255 Ciruela 0.34 kU/L
f44 Fresa 0.39 kU/L
f84 Kiwi 0.29 kU/L

21
f215 Lechuga 0.02 kU/L
f49 Manzana 0.31 kU/L
f95 Melocoton 0.59 kU/L
f87 Melon 0.25 kU/L
f33 Naranja 0.31 kU/L
f92 Platano 0.33 kU/L
f25 Tomate 0.54 kU/L
f259 Uva 0.05 kU/L
f31 Zanahoria 0.73 kU/L
Alergia a ocupacioneales: k82 Látex 0.87 kU/L

3) Diagnóstico Molecular
Se realiza un estudio de proteínas alergénicas nativas y recombinantes mediante la técnica
de Array.
En el estudio Array de alérgenos (ISAC 111) Se informan como positivos en unidades ISU-E.
Resultado:
-POSITIVAS:
Marcadores de especie: ALÉRGENOS DE GRAMINEAS: 1, 2, 5, 6
Marcadores de reactividad cruzada:
*PR-10: rPrup1 melocotón
*PROFILINAS: rPrup4 melocotón, rHeb8 látex

4) - Prick prick:

Prick-prick :
Con productos frescos fueron Positivos: lechuga:13mm; manzana pulpa:7mm; pera
pulpa:4mm; plátano:6mm; sandia:12mm; melocotón pulpa:15mm; picota:15mm, Acelga 10
mm; judía verde 17 mm; pimiento verde 7 mm; puerro 10 mm; tomate 8 mm; zanahoria 10
mm; repollo 3 mm; lechuga 7 mm; limón 3 mm.
Alimentos cocidos: Acelga 6 mm; judía verde 3 mm; pimiento verde 3 mm; puerro 4 mm;
tomate 4 mm; zanahoria 3 mm y repollo 3 mm.

Juicio Clínico

RINOCONJUNTIVITIS POR SENSIBILIDAD A PÓLENES


S. ALERGIA ORAL POR SENSIBILIZACION A FRUTAS y VERDURAS:
PROFILINA (PANALÉRGENO PÓLENES-FRUTAS) y PR10

6 - en este caso clínico el paciente :


a) presenta dos cuadros clínicos independientes que no guardan relación entre sí.
b) se le clasifica con alergia a panalergénos porque presenta positividad frente a un número
elevado de anticuerpos ige específicos (alimentos, pólenes de plantas…)
c) la prueba de isac es crucial para clasificar a este paciente como síndrome de alergia Oral
(saO) debido a la positividad en esta prueba de marcadores de reactividad cruzada
d) para conocer el perfil molecular de sensibilización de este paciente se le realiza una batería
completa de ige específicas frente a extractos

7 - en este paciente existen resultados positivos frente a numerosos extractos alergénicos, ¿qué
estudios nos ayudan en este caso a identificar que existe reactividad cruzada?
a) pruebas cutáneas con profilina positiva 10mm.
b) estudio de array de alérgenos positivo frente a pr10 melocotón.
c) estudio de array de alérgenos positivo frente a profilinas
d) todas son ciertas.

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8 - ¿cuál de las siguientes afirmaciones sobre el diagnóstico por separación den componentes
(crd) aplica a este paciente?
a) el crd se basa en el empleo de multialérgenos para el diagnóstico “in vitro” de la alergia.
b) el crd permite conocer los anticuerpos implicados en el desarrollo de la enfermedad e iden-
tifica individualmente los alérgenos que producen la enfermedad en cada paciente lo que
permite conocer el perfil de sensibilización del mismo.
c) permite identificar a los pacientes sensibilizados a panalérgenos y las posibles interacciones
causadas por anticuerpos ige de reactividad cruzada a diferentes alérgenos.
d) b y c.

9 - se ha descrito que un 20% de los pacientes alérgicos a pólenes tienen anticuerpos ige frente
a profilina…
a) este paciente no se encuentra dentro de ese 20% ya que no tieneanticuerpos frente a esa
familia de proteínas
b) este paciente no se encuentra dentro de ese 20% ya que sí presenta alergia a pólenes pero
a lo que está sensibilizado es a pr10
c) este paciente se encuentra dentro de ese 20% ya que por un lado presenta sensibilidad a
pólenes y por otro también a profilina
d) esa afirmación es cierta en el caso de las polcalcinas y no en el caso de las profilinas

10 - ¿Qué ventaja presenta en este paciente la realización del diagnóstico molecular frente al
diagnóstico a través de la de terminación de ige específica frente a diferentes extractos?
a) ninguna porque los resultados de ige específica mediante cap nos dan el diagnóstico final
del paciente.
b) Que a través del diagnóstico molecular se llega a explicar el perfil de sensibilización de este
paciente mediante las positividades a profilina y pr10 y la justificación de su cuadro clínico de
saO
c) la negatividad del marcador de reactividad cruzada del látex (profilina del látex) apoya el
juicio clínico de este paciente de sensibilización al látex.
d) a y b son ciertas

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NOTAS

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