ACTIVIDAD PEROXIDASA Y PSEUDOROXIDASA

David Colorado Vega 10120042; Juan Sebastián Moncaleano 08220041

Universidad Icesi
Facultad de Ciencias Naturales
Laboratorio de Bioquímica
Santiago de Cali, Colombia
15 de Septiembre de 2012

1. Objetivos: observar pequeñas coloraciones azul oscuro

Distinguir los catalizadores biológicos,
como las enzimas, de los catalizadores
químicos.
Comprender el papel de la Bencidina en la
detección de la actividad Peroxidasa
Partir de los resultados obtenidos
experimentalmente para describir el
comportamiento de la Enzima Peroxidasa y
las especies químicas con actividad
Pseudoperoxidasa.
suspendidas en la solución.
Durante la prueba realizada a las muestras
desnaturalizadas se obtuvo el mismo
comportamiento por parte de la muestra de
sangre, con una pequeña diferencia, una
disminución en la intensidad del color azul.
Por el contrario, la muestra desnaturalizada
de zanahoria no presento coloración alguna
y por lo tanto la prueba se considero
negativa; se infirió la ausencia de una
actividad Peroxidasa en esta muestra.

3. Análisis de Resultados:
2. Resultados:
Antes de discutir las razones por las cuales
Actividad Peroxidasa por Reacción de las Pruebas de Actividad de Peroxidasa a
Alder partir de la reacción de Alder corresponden
Muestra a un resultado positivo o negativo, en
Muestra nativa desnaturalizada soluciones desnaturalizadas o no; primero
(100°C) es importante aclarar algunos conceptos.
Zanahoria Sangre Zanahoria Sangre
Positiva Positiva Negativa Positiva Las enzimas son catalizadores biológicos,
la gran mayoría presenta afinidad por un
Tabla No 1: Detección de Actividad
único sustrato, dicho sustrato suele
Peroxidasa a partir de la Reacción de
participar como reactante durante una
Alder.
reacción química para obtener un producto
específico; el papel de la enzima en este
Durante la prueba de las muestras nativas se
caso es estabilizar el intermediario de la
observo un cambio de color en ambas
reacción y a su vez provocar una
soluciones objeto de estudio; en la muestra
disminución en la energía de activación
de sangre se apreció un cambio drástico del
necesaria para la reacción ocurra; lo que se
color pasando de rojo escarlata a azul
puede resumir como un incremento en la
oscuro. De manera similar se comporto la
velocidad a la que ocurre la reacción.
muestra de zanahoria, solo que esta vez el
cambio de color fue parcial, permitiendo
La enzima logra su cometido gracias a su
centro catalítico, que es el conjunto de
átomos, dentro de su composición
molecular, que permite la interacción
específica enzima-sustrato y además la
estabilización del intermediario de reacción.
Un sustrato para una enzima, en principio,
podría ser cualquier especie química, de
descendencia biológica o no.
Es importante distinguir entre el centro
catalítico de la enzima y los centros
reguladores; aunque para la discusión no
sea de especial relevancia. Debido a que los
centros reguladores también pueden llegar a
ser muy específicos pero, como su nombre
lo indica, solo regulan la actividad de la
enzima.
Como catalizador, entonces, la enzima no
se consume ni forma parte de los reactantes
y los productos durante una reacción; y
además puede catalizar la reacción en
ambos sentidos, es decir, de reactivos a
productos y viceversa. Esto último
dependerá de la Keq de los compuestos
involucrados, sus concentraciones, sus
propiedades termodinámicas y cinéticas1.
Figura No 1: función de la enzima en la
catálisis de una Rx química.
A partir de lo anterior, es entonces la
Peroxidasa una enzima que cataliza la
reacción por la cual se descompone, o de
forma mas precisamente, la reacción por la
cual se reduce el H2O2 (peróxido de
hidrogeno o agua oxigenada) a H2O. Por lo
general se define a la Peroxidasa como una
enzima ambivalente porque necesita de otro
sustrato, en el medio de reacción, que sea
capaz de oxidarse. Dicho de otra manera, la
Peroxidasa cataliza una reacción de oxido-
reducción (redox)2.
La ecuación genérica que expresa su
actividad viene dada por:
Peroxidasa
H2O2 + RH 2 2H 2O + R
Figura No 2: Rx redox catalizada por Peroxidasa2
En el cuerpo humano esta enzima esta
expresada mayoritariamente en los
leucocitos, y para nuestra especial
importancia, en los eritrocitos o glóbulos
rojos; constituyentes vitales del fluido
sanguíneo.
En los eritrocitos humanos suele
denominársele a esta enzima como
glutatión Peroxidasa2 porque reduce al
H2O2 mediante la oxidación del glutatión, el
cual se encuentra casi que exclusivamente
en su forma reducida. De hecho, la relación
entre las concentraciones de glutatión
oxidado y glutatión reducido dentro de las
células se utiliza como indicador de
toxicidad celular3.
Esto quiere decir, que en nuestro cuerpo la
Peroxidasa y el glutatión actúan como
antioxidantes biológicos protegiendo los
lípidos de la membrana celular y a la
Hemoglobina contra la oxidación.
La Prueba de Actividad Peroxidasa por
Reacción de Alder aprovecha el
comportamiento de las enzimas, descrito
anteriormente, y por lo tanto la
característica de la Peroxidasa como
catalizador de una Rx redox.
La utilidad de la Reacción de Alder radica
en el uso de un sustrato que al oxidarse,
como el glutatión, cambia de color gracias a
las “modificaciones” de su estructura
química; la reacción general de este
fenómeno viene dada por:
H2N NH2 + 1/2 O 2
Peroxidasa
HN NH + H2O
Figura No 3: Oxidación de la Bencidina
Cuando “acoplamos” esta reacción con la
figura No 1, es decir, con la presencia del
H2O2 se obtuvo:
H2N NH2 + H2O 2
Peroxidasa
HN NH + 2H 2O
Figura No 4: Reacción de Alder
Sobra decir que la forma oxidada de la
Bencidina corresponde a la de los productos;
este compuesto actúa como un indicador
gracias a que en su forma reducida es incolora
pero cuando se oxida su color vira a azul
oscuro, debido al cambio en su estructura
relacionada a su interacción con la luz.
Dentro del contexto este comportamiento se le
otorga a los denominados cromógenos. Toda
molécula de colorante lleva un grupo
cromóforo, que es el portador del color, el cual
esta integrado al grupo cromógeno, que es el
soporte y generador de los grupos cromógenos4.
Se infirió entonces que, en principio,
cualquier especie química que pudiese
oxidar a la Bencidina activara su función
como cromógeno, y por lo tanto le hará
cambiar de color; lo que durante una prueba
de actividad de Peroxidasa por reacción de
Alder significaría un falso positivo.
Por lo tanto, tiene un significado mas
contundente obtener una Reacción de Alder
negativa (es decir, que no hay reacción),
porque esto implica la ausencia agentes
oxidantes inespecíficos y de Peroxidasa que
catalice la reacción de la Figura No 4.
Sin embargo, también se puede proceder
añadiendo primero la Bencidina (sin el
peróxido) para asegurarse que no hay
agentes oxidantes inespecíficos, lo que se
traducirá en la permanencia incolora de la
bencidina. Enseguida se puede agregar el
H2O2 con el cual, de haber actividad
Peroxidasa, la solución o el sistema
evaluado debe de presentar un viraje del
color a azul intenso en 10 segundos o
menos. De lo contrario la prueba será
negativa según este caso.
Lo último para considerar consiste en los
compuestos de actividad Pseudoperoxidasa;
que a diferencia de los agentes oxidantes
inespecíficos, estos actúan como
catalizadores y no como reactantes en una
Redox. Por tanto, estos compuestos de
actividad Pseudoperoxidasa no son más que
catalizadores de reacciones Redox. Como
por ejemplo los compuestos usados en los
filtros de los automóviles, como el platino y
el rodio para catalizar la oxidación del CO a
CO2 y del NO a NO2.5
En nuestro cuerpo, y más específicamente,
en los eritrocitos, el grupo prostético hemo
de la HbA posee una actividad
Pseudoperoxidasa.
Figura No 5: Grupo Prostético Hemo
Este grupo presente en la HbA se vale de su
Ion Ferroso (Fe2+) para interaccionar con
uno de los oxígenos del H2O2 formando un
enlace salino o iónico y lograr la actividad
catalítica “facilitando” el movimiento de un
átomo de oxigeno a la molécula que se
oxida.
El ion Fe2+ se une tan fuertemente al
oxigeno molecular, que cuando conforma la
estructura de la HbA, se pude producir en
ion súper-oxido (O-); Este es un radical
libre, que como todos sus homólogos, es
nocivo para las células del cuerpo humano.
De manera que:
2+ 3+ - pequeñas coloraciones suspendidas en la
Fe O O Fe O O
Figura No 6: interacción entre el ion
ferroso y el O2
Durante la práctica se opto por agregar a la
solución problema el H2O2 y la bencidina
casi que de forma simultanea. Tanto en las
soluciones nativas como en las
desnaturalizadas.
En las muestras nativas se obtuvieron
resultados de Actividad de Peroxidasa
positivos en la sangre y en la zanahoria.
Se dedujo entonces que ambas soluciones
presentan Enzimas Peroxidasa porque el
viraje del color fue “instantáneo” sin
necesidad de agitar las muestras o aplicar
algún método físico para facilitar que
ocurriese la reacción. Lo que se traduce en
la gran eficiencia catalítica de las enzimas;
para darnos una idea esta eficiencia se
decidió citar una enzima, la
Acetilcolinesterasa, que aumenta la
velocidad de la reacción que cataliza en
orden de 108 (1/s-M).
En la sangre “nativa”, como se explico en
párrafos anteriores, la actividad Peroxidasa
se de gracias a la Glutatión Peroxidasa
presente en los eritrocitos; en donde el
sustrato que se reduce es el H2O2 y el que
se oxida es el Glutatión.
En la zanahoria “nativa” se infirió que la
actividad Peroxidasa se da gracias a la alta
composición de Beta-carotenos en la
zanahoria. Este tipo de compuesto también
actúa como antioxidantes, pero a diferencia
del glutatión este es de origen endógeno.
Pero lo que realmente resulto interesante es
que los Beta-carotenos no son enzimas, son
precursores de la vitamina A6. Es por ello
que se considero como un falso positivo en
viraje de color en la sln de zanahoria nativa;
esta conclusión se vio apoyada a la forma
en que se dio la coloración de la muestra;
sln. Ya que la oxidación no ocurrió de
forma “instantánea” ni cambio el color de
toda la sln, solo parcialmente.
En conclusión, la acción Peroxidasa de la
sln de zanahoria nativa no se debe a la
enzima Peroxidasa y tampoco a una
Pseudoperoxidasa, se debe a un compuesto
antioxidante inespecífico, el Beta-caroteno.
Por cuanto corresponde a la muestra
desnaturalizada de zanahoria, el resultado
negativo se explica por cuenta de la
estabilidad de los β-carotenos frente a la
temperatura.

Se encontró que los β-carotenos son

sensibles estructuralmente a altas
7
temperaturas , lo que para una Reacción
Alder implica la perdida de la acción como
Figura No 7: Estructura del β-Caroteno
antioxidante y por lo tanto la posibilidad de
que la oxidación de la Bencidina ocurriese.
Sus enlaces conjugados son en gran parte
responsables del color de la zanahoria.
Por ultimo, se infirió que al igual que el β-
caroteno, la bencidina oxidada es un
Durante el análisis de las muestras
colorante debido a sus enlaces π
desnaturalizadas con un baño de maría a
conjugados.
100°C, se obtuvo un resultado positivo para
la muestra de sangre y un resultado
negativo para la de zanahoria.
Conclusiones:
Con lo que compete a la muestra de sangre,
La prueba de actividad Peroxidasa por
se dedujo la obtención de un resultado
reacción de Alder depende del
positivo gracias a la acción
comportamiento de la Bencidina frente a la
Pseudoperoxidasa del grupo prostético
composición de las muestras objeto de
hemo, presente en la HbA; una enzima
estudio. Se puede oxidar mediante H2O2 y
conjugada o heteroproteina.
una Peroxidasa o Pseudoperoxidasa que
catalice la relación o también gracias a la
En pocas palabras, un grupo protético es un
acción de una gente antioxidante.
tipo de Coenzima, molecularmente es un
componente no aminoácido (no es una
La actividad catalítica de una
proteína) pero puede formar parte de la
heteroproteina puede verse reflejada en la
estructura cuaternaria de una enzima.
funcionalidad de su grupo prostético.
Entonces, si la muestra fue desnaturalizada
Poder identificar la presencia de enzimas a
se hace referencia a la inactivación de las
partir de la manipulación de la reacción que
enzimas debido a que su estructura
catalizan requiere comprender las
cuaternaria deja de ser funcional, con lo que
condiciones a las cuales se da la reacción, o
deja de tener afinidad por su grupo
durante las pruebas se obtendrán falsos
prostético Hemo. Este se libera y puede
positivos.
cumplir su función Pseudoperoxidasa a la
temperatura del sistema cerca a 100°C; y a
través de la acción explicada en Fig No 6.
Bibliografía:

1. J.M. Berg; J.L. tymoczko; L. Atryer;

“Bioquimica”; 6xta edición; Edt: Reverte;
2007; España; pp. 205 – 236.

2. J.M. Gutiérrez; “El diagnostico clínico de

las micobacterias”; Publicaciones de la
Universidad de Sevilla; España; pp. 38 –
40.

3.http://www.uv.es/acastell/1.-
Introduccion.pdf | Visitada el 15/09/2012

4. M. C. Vicent vela, S. A. Blanco, J. L

Zaragozá Carbonell; “Química industrial
orgánica”; Universidad Politécnica de
Valencia; España; pp. 179.

5.http://rb-
kwin.bosch.com/ar/es/powerconsumptione
missions/dieselsysteme/dieselsystem/comm
ercialvehiclesystems/exhaust-
gas_treatment/oxidationcatalyticconverter.h
tml | Visitada el 16/09/12

6.http://2011.elmedicointeractivo.com/Doc
umentos/doc/VITAMINAS_Y_ANTIOX_E
L_MEDICO.pdf?botsearch | Visitada el
16/09/2012

7.http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=
S0004-
06222004000200011&script=sci_arttext
Visitada el 16/07/2012