CROMATOGRAFÍA

Mg. Sc. Ing. Flor de María Vásquez

Castillo
INTRODUCCIÓN
Significa "Escribir en Colores“.
 Los componentes de una mezcla pueden presentar una
tendencia diferente a permanecer en cualquiera de las
fases involucradas.
 Es la separación de dos o más compuestos químicos en
un medio.
CROMATOGRAFÍA
 Se define como un grupo de técnicas de
separación de mezclas complejas así como de
cuantificación de los constituyentes de dichas
mezclas.
 Esta técnica fue desarrollada por el botánico ruso
Milkihail Tswett en 1905, quien separó los
constituyentes colorantes de las hojas verdes:
clorofilas (verdes), caroteno (rojo) y xantófila
(amarilla) (Walton y Reyes, 1978).
NOMENCLATURA BÁSICA DE LA CROMATOGRAFÍA
DE ACUERDO CON LAS RECOMENDACIONES IUPAC

 Cromatografía:
 Es un método físico de separación en el que los
componentes a separar se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales está en reposo (fase
estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se
mueve en una dirección definida.
CROMATOGRAMA
 Una gráfica u otro tipo de presentación de la
respuesta de un detector, la concentración de un
analito en el efluente u otra magnitud usada
como medida de la concentración en el efluente,
frente al volumen de efluente o al tiempo. En la
cromatografía plana, “cromatograma” puede
referirse al papel o capa con las zonas separadas.
FASE ESTACIONARIA
 Es una de las dos fases que forman un sistema
cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un
líquido
 Si es un líquido puede estar distribuido en un
sólido, el cual puede o no contribuir en el proceso
de separación. El líquido puede también estar
químicamente unido al sólido (Fase Ligada) o
inmovilizado sobre él (Fase Inmovilizada)
FASE ESTACIONARIA
La expresión Lecho Cromatográfico o Sorbente se
puede usar como término general para designar
cualquiera de las formas diferentes en que se use la
fase estacionaria.
FASE LIGADA
 Una fase estacionaria que está unida de forma
covalente a las partículas de soporte o a la pared
interior de la columna.
FASE INMOVILIZADA
 Es una fase estacionaria que está inmovilizada
sobre las partículas del soporte o sobre la pared
interior de la columna, por ejemplo por
polimerización in situ (entrecruzamiento químico)
tras un recubrimiento.
FASE MÓVIL
 Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho
estacionario, en una dirección definida. Puede ser
un líquido (Cromatografía Líquida), un Gas
(Cromatografía de Gases) o un fluido Supercrítico
(Cromatografía con Fluido Supercrítico).
 En la Cromatografía de gases se puede usar la
expresión Gas Portador para la fase móvil.
 En la cromatografía de elución se usa también
para la fase móvil la expresión Eluyente.
ELUIR
 Es aplicar la cromatografía de elución.
 El proceso de elución se puede detener mientras
todos los componentes de la muestra están aún
en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta
que lo hayan abandonado.
 EFLUENTE
 La fase móvil que abandona la columna

Muestra
• Mezcla consiste en cierto número de
componentes, cuya separación se pretende en
el lecho cromatográfico al ser arrastrados o
eluidos por la fase móvil.
COMPONENTES DE LA MUESTRA
 Son los constituyentes químicamente puros de la
muestra.
 Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria
(es decir, no retardados), retenidos parcialmente
(es decir eluidos a tiempo diferentes) o retenidos
permanentemente.
 Se aceptan también los términos eluito y
analito para un componente de la muestra.
 Soluto
• Término que se refiere a los componentes
de la muestra en la cromatografía de
reparto
DISOLVENTE

 Término que en ocasiones se refiere a la fase

estacionaria líquida en la cromatografía de reparto.
 Nota: En la cromatografía líquida, el término
“disolvente” se ha usado a menudo para la fase móvil.
Este uso no se recomienda.
ZONA
 Región del lecho cromatográfico donde se
localizan uno o mas componentes de la muestra.
 Se puede usar para ello también el término
Banda.
1. COMPONENTES DE UN SISTEMA
CROMATOGRÁFICO
a) Fase fija o estacionaria.- Constituida
generalmente por un sólido granular finamente
dividido.
b) Fase Móvil.- Es la fase que transporta a los
solutos y puede ser un gas o un líquido.
c) Sustratos o solutos.- Son las sustancias (2 o
mas) que hay que separar.
MECANISMO DE SEPARACIÓN
 Las separaciones cromatográficas se basan en la
diferencia de la velocidad de migración entre los
componentes de las muestras (Skoog y West, 1986).
 Cuanto mas tiempo permanecen los solutos en la fase
estacionaria, más lentamente avanzan por la
columna; y si no son retenidos en absoluto por la fase
estacionaria, avanzan en forma simultanea a la
misma velocidad que las moléculas de la fase móvil.
 La fase estacionaria generalmente está contenida
dentro de una columna o tubo. Sin embargo, no
siempre es necesaria esta columna, ya que se puede
usar otros mecanismos de soporte, como papel, vidrio,
etc.
2. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
2.1. Según estructura mecánica del recorrido de
separación o de acuerdo a la forma del lecho
cromatográfico
2.1.1. En columna
a) En líquido
b) En gas
2.1.2. En capas
a) Cromatografía en papel
b) Cromatografía en capa fina
c) Cromatografía preparativa en capa
2. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
2.2. Según el estado físico de las dos fases:
2.2.1. Cromatografía líquido-líquido
2.2.2. Cromatografía gas-líquido
2.2.3. Cromatografía gas-sólido
2.2.4. Cromatografía líquido-sólido
2.3. De acuerdo al estado físico de la fase móvil
2.3.1. Cromatografía Gaseosa
2.3.2. Cromatografía líquida
2.3.3. Cromatografía de Fluido Supercrítico
2. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
2.4. Según el tipo o mecanismo de separación:
2.4.1. Cromatografía de separación o de partición
2.4.2. Cromatografía de adsorción
2.4.3. Cromatografía por tamices moleculares
2.4.4. Cromatografía en gel
2.4.5. cromatografía de intercambio iónico
2.5. Técnicas especiales
2.5.1. Cromatografía de Fase reversa
2.5.2. Cromatografía de Fase normal
2.5.3. Elución en Gradiente
2.5.4. Elución escalonada
2.5.5. Cromatografía Bi-Dimensional
2.5.6. Cromatografía Isotérmica
2.5.7. Cromatografía a Temperatura Programada
2.5.8. Cromatografía de Flujo Programado
2.5.9. Cromatografía de Presión Programada
2.5.10. Cromatografía de Reacción
2.1.1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
 Se usan tubos que, con la fase estacionaria
completa, o sus paredes interiores se encuentran
revestidas por fase estacionaria dejando una
abertura por el centro del tubo para la fase móvil
(columna capilar).
 En algunos casos el mismo material del tubo
puede constituir la fase estacionaria (en el caso de
las columnas capilares).
 Pueden ser de dos tipos:
a) Líquida.- la fase móvil es liquida
b) Gaseosa.- la fase móvil es gaseosa.
2.1.2. CROMATOGRAFÍA EN CAPAS
 Llamada también CROMATOGRAFÍA PLANA O DE
LECHO ABIERTO, la fase estacionaria está presente
sobre un plano. Puede ser:
a) Cromatografía en papel
Cuando la fase estacionaria está formada por papel
adsorbente o papel de fibra de vidrio (enriquecido en algunos
casos con sustancias adicionales, como por ejemplo
adsorbentes, intercambiadores iónicos, etc.)
b) Cromatografía en capa fina
Cuando la fase estacionaria está formada por capas de un
grosor de hasta 300 um, constituidas por partículas sólidas
esparcidas sobre un soporte (vidrio, metal o plástico)

c) Cromatografía preparativa en capa

Igual que el caso anterior, pero en la que el grosor de las
capas es mayor de 300 um.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
2.2. SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DE LAS DOS
FASES

2.2.1. Cromatografía líquido-líquido

 Fase móvil (m): Líquida
 Fase estacionaria (s): Líquida

2.2.2. Cromatografía gas-líquido

 Fase móvil (m): Gaseosa
 Fase estacionaria (s): Líquida

2.2.3. Cromatografía gas-sólido

 Fase móvil (m): Gaseosa
 Fase estacionaria (s): Sólida

2.2.4. Cromatografía líquido-sólido

 Fase móvil (m): Líquida
 Fase estacionaria (s): Sólida
2.3. DE ACUERDO AL ESTADO FÍSICO DE LA
FASE MÓVIL:

2.3.1. Cromatografía Gaseosa

 La fase móvil es un gas. Esta cromatografía
siempre se realiza en una columna.
2.3.2. Cromatografía Líquida
 La fase móvil es un líquido. Esta cromatografía
puede ser realizada en una columna o en un
plano (papel, vidrio, plástico)
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Inyección de la muestra
 La muestra se inyecta con un jeringa a través de
un septum de goma y se vaporiza. Generalmente
0.1 a 10 μL.
 Se controla la temperatura del horno de inyección.

 Sólo el 0.1 a 10 % del volumen de 0.1 a 2 μL de

muestra inyectada llega a la columna; el resto se
elimina.
CROMATOGRAFÍA DE GASES
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Transporte de la muestra por el interior de la
columna
Columnas empaquetadas.- Son de acero
inoxidable o vidrio, tienen un diámetro de 3 a 6 mm
y una longitud de 1 a 5 m. Se rellenan con la fase
estacionaria sólida o un soporte inerte recubierto
con la fase estacionaria
Columnas tubulares abiertas o capilares.- Son
de sílice fundida, son mucho más finas y mas largas
que las empaquetadas. Tienen mayor resolución y
sensibilidad. Tienen menor tiempo de análisis y se
maneja menor cantidad de muestra
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Cada pico corresponde a un componente y su área es proporcional a su
concentración
HPLC

 En la actualidad la cromatografía líquida en

columna generalmente usa partículas muy
pequeñas y una relativamente alta presión dentro
de la columna, por lo que a esta cromatografía se
le conoce como CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA PRESIÓN O DE ALTA
PERFORMANCE (HPLC, sigla en ingles: High
Performance-o High Pressure-Liquid
Chromatography).
HPLC
2.3.3. CROMATOGRAFÍA DE FLUIDO
SUPERCRÍTICO
En ésta la fase móvil (líquido o gas) es un fluido
cuya T° y P están por encima pero cerca de sus
valores críticos:
 Temperatura crítica (Tc): Máxima T° a la cual un
gas puede ser convertido a líquido por un incremento
en la P.
 Presión crítica (Pc): La mínima P que sería
suficiente para licuar un gas a su T°c. Por encima de
esta P, aun elevando la T°, el líquido no podría pasar
a la forma de vapor para dar un sistema de dos fases.
2.4. SEGÚN EL TIPO O MECANISMO DE
SEPARACIÓN

2.4.1. Cromatografía de separación o de

partición
 Cuando los componentes a separar se pueden
distribuir entre las dos formas, como en el caso de
la cromatografía líquido-líquido (CLL) y la
cromatografía de gas-líquido (CGL).
 La separación se basa en las diferencias en la
solubilidad en la fase estacionaria de los
componentes a separar (cromatografía gaseosa) o
en las diferencias en la solubilidad en las fases
móvil y estacionaria de los componentes a separar
(cromatografía líquida).
2.4.2. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
 Cuando no se puede producir una distribución
dentro de la fase estacionaria sino que lo que tiene
lugar es una adsorción, como es el caso de la
cromatografía gas-sólido (CGS) y la CLS.
 La separación se basa en las diferencias de
afinidad de los compuestos a separar por la
superficie de un sólido activo.
2.4.3. CROMATOGRAFÍA POR TAMICES
MOLECULARES
 La fase estacionaria está formada por cuerpos
inorgánicos sólidos porosos, cuyos poros se pueden
llenar con una parte de la fase móvil.
 De esta manera, los componentes a separar se
distribuyen entre la fase móvil y los poros.
 Las moléculas mas grandes no se pueden introducir
en los poros, por lo que permanecen en la fase móvil y
abandonan primero el sistema cromatográfico.
 Las moléculas pequeñas si penetran, y cuanto mas
pequeñas mas profundamente, de forma que a causa
del largo camino a recorrer, son retenidas mejor.
2.4.4. CROMATOGRAFÍA EN GEL
 Tienen el mismo fundamento que la anterior, pero
la parte sólida de la fase estacionaria (la matriz)
está formada por sustancias orgánicas, que se
hinchan en la fase móvil.
 Se forma un gel cuya parte móvil forma la parte
estacionaria (así, la mezcla con la parte móvil es
constante)
CROMATOGRAFÍA EN GEL
DESARROLLO DE LA FILTRACIÓN EN GEL
2.4.5. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IONICO
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Desarrollo de Cromatografía de Intercambio Iónico
2.5. TÉCNICAS ESPECIALES
2.5.1. Cromatografía de Fase Reversa
Técnica en la cual el procedimiento de elución en
cromatografía líquida se basa en que la fase móvil es
significativamente mas polar que la fase estacionaria.
Ejemplo: Un material microporoso a base de sílica con
cadenas de álcali químicamente ligadas.
El término “fase reversa” es una expresión incorrecta
y por lo tanto debería ser evitado.
 2.5.2. Cromatografía de Fase Normal
 Procedimiento de elución en el cual la fase estacionaria es
mas polar que la fase móvil.
 Este termino es usado para enfatizar el contraste con la
cromatografía de fase reversa

2.5.3. ELUCIÓN EN GRADIENTE

• La cromatografía usa un procedimiento de elución en
el cual se cambia continuamente la composición de la
fase móvil.
2.5.4. ELUCIÓN ESCALONADA
 Proceso en el cual la composición de la fase móvil
es cambiada en pasos o escalonadamente durante
una corrida cromatográfica simple.
2.5.5. CROMATOGRAFÍA BI-DIMENSIONAL
 En cromatografía plana, la cromatografía bi-
dimensional es referida al sistema cromatográfico
en el cual los componentes se hacen migrar primero
en una dirección y subsecuentemente en una
dirección en ángulo recto a la primera dirección; las
dos eluciones se llevan a cabo con diferentes
eluyentes.
CROMATOGRAFÍA BI-DIMENSIONAL
2.5.6. CROMATOGRAFÍA ISOTÉRMICA

• La T° de la columna se mantiene constante durante la

separación.

2.5.7. Cromatografía a Temperatura Programada

• La T° de la columna es cambiada sistemáticamente

durante parte o todo el proceso de separación.

2.5.8. Cromatografía de Flujo Programado

• La velocidad de flujo de la fase móvil es cambiada
sistemáticamente durante parte o todo el proceso de
separación.
2.5.9. CROMATOGRAFÍA DE PRESIÓN PROGRAMADA

• La presión de la fase móvil es cambiada sistemáticamente

durante parte o todo el proceso de separación.

2.5.10. Cromatografía de Reacción

• Las características (identidad) de los componentes de
la muestra son intencionalmente cambiadas en el
lapso entre la introducción de la muestra y la
detección.
B) ENSANCHAMIENTO DE LAS ZONAS
 Considerando todas las moléculas de un
sustrato, existirá una distribución de
velocidades de avance que se extenderá
alrededor de un valor medio; la
representación grafica la concentración en
función del volumen de fase móvil será una
curva en forma de campana (Fig. 4).
 En el caso ideal la forma del grafico es la de
la “Curva normal de error”, de Gauss
(Walton y Reyes, 1978).
PODER DE RESOLUCIÓN
 El poder de resolución de una columna
cromatográfica es su capacidad para separar 2 o
mas sustratos o para distinguir entre ellos.
 El poder de resolución depende de dos factores: la
separación entre los dos picos, y la definición de
las bandas.
 El modo de mejorar la resolución de una columna
es aumentando su longitud. Para conseguir una
resolución doble, hay que emplear una columna
cuatro veces mas larga.
PODER DE RESOLUCIÓN
 La resolución también se puede aumentar:
a) Disminuyendo la velocidad del flujo.
b) Empleando una fase fija constituida por
partículas de menor tamaño
c) En la cromatografía de liquido, si las partículas
son muy pequeñas no se pueden emplear el flujo
por gravedad, En esta caso, se suelen emplear
sistemas de bombeo capaces de generar
presiones de algunas decenas de atmósferas.
d) Aumentando la T°. Al aumentar la T° de un
líquido disminuye su viscosidad. Sin embargo, la
T° afecta las razones de distribución.
FORMACION DE COLAS
 El análisis de las curvas concentración-volumen de
efluente se ha hecho considerando que éstas son
simétricas en forma de campana (gaussianas).