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Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO


FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE

AS
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

IC
G
LO
O
BI
Efecto de la concentración del aceite esencial de Cymbopogon

citratus sobre el crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton

rubrum in vitro.
AS
CI
EN

TESIS
CI

PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL


DE

DE BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
CA

AUTOR: Br. MARIA DE JESUS SALINAS ARANDA


TE

ASESORA: Dra. ICELA MARISSA RODRÍGUEZ HARO


IO
BL

TRUJILLO – PERU
BI

2019

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE


TRUJILLO

AS
Dr. ORLANDO MOISÉS GONZALES NIEVES

IC
Rector de la Universidad Nacional de Trujillo.

G
LO
O
BI
Dr. RUBÉN CÉSAR VERA VELIZ
Vice – rector Académico de la Universidad Nacional de Trujillo.

AS
CI
EN

Dr. WEYDER PORTOCARRERO CÁRDENAS


CI

Vice – rector de Investigación de la Universidad Nacional de


DE

Trujillo.
CA
TE

Dr. STEBAN ILICH ZERPA


Secretario General de la Universidad Nacional de Trujillo.
IO
BL
BI

I
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PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:

AS
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de
Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a vuestra

IC
consideración y claro discernimiento la tesis titulada: “Efecto de la

G
concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre el

LO
crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro”.

O
BI
Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones
cometidos en la elaboración del informe de tesis, nos sometemos a vuestro
dictamen. AS
CI
EN

Trujillo, mayo del 2019.


CI
DE
CA
TE

Br. MARÍA DE JESÚS SALINAS ARANDA


IO
BL
BI

II
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CERTIFICACIÓN DEL ASESOR

La que suscribe Dra. Icela Marissa Rodríguez Haro, asesora de la tesis


titulada:

AS
“Efecto del crecimiento del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre el
crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro”

IC
G
CERTIFICA

LO
Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con su

O
correspondiente proyecto y las orientaciones pertinentes.

BI
En cuanto al informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo las

AS
observaciones y sugerencias alcanzadas, por lo que autorizo al bachiller:
María de Jesús Salinas Aranda continúe con los procedimientos según los
CI
fines.
EN
CI
DE

Dra. Icela Marissa Rodríguez Haro


CA

ASESORA
TE
IO
BL
BI

III
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MIEMBROS DEL JURADO

AS
IC
Dra: Icela Marissa Rodríguez Haro

G
PRESIDENTE

LO
O
BI
AS
CI
Dra: Manuela Natividad Luján Velásquez
SECRETARIA
EN
CI
DE
CA

Ms.C. Eduardo José Muñoz Ganoza


TE

VOCAL
IO
BL
BI

IV
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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que
la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,

AS
siendo aprobada por UNANIMIDAD.

IC
G
LO
O
Dra: Icela Marissa Rodríguez Haro

BI
PRESIDENTE

AS
CI
EN
CI
DE

Dra: Manuela Natividad Luján Velásquez


SECRETARIA
CA
TE
IO
BL
BI

Ms.C. Eduardo José Muñoz Ganoza


VOCAL

V
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AGRADECIMIENTOS

AS
A la Dra: Icela Marissa Rodríguez Haro por su dedicada labor en la

IC
motivación, y guía en la investigación, sobre todo por la confianza brindada,

G
apoyo y asesoramiento en el desarrollo del presente trabajo de tesis.

LO
O
Al Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo por su apoyo moral, enseñanza y por

BI
los consejos brindados durante el proceso de investigación.

AS
CI
A Dios por permitirme culminar el presente trabajo de tesis al mantenerme
EN

con bienestar, salud, así como también por colocarme en el lugar adecuado y
CI

con las personas correctas que me permitieron culminar esta investigación.


DE
CA
TE
IO
BL
BI

VI
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DEDICATORIA

AS
A mis abuelos Claudina Reyes Rodríguez y Agustín Conversión Salinas Reyes

por su tiempo dedicado, amor incondicional y por ser mi fuerza y razón para lograr

IC
mis objetivos.

G
LO
A mi madre Agustina Aranda García por ser quien me enseñó a nunca rendirme,

O
por siempre confiar en mí, por toda la motivación brindada, y a mi padre Nolberto

BI
Salinas Reyes por su ayuda para seguir avanzando en mis metas trazadas.

AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

VII
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RESUMEN

Se evaluó el efecto de la concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus

sobre el crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro. Para lo

AS
cual, se preparó Agar Sabouraud conteniendo concentraciones de dicho aceite

IC
esencial de 0.1, 0.5, 1, 1.5 y 2 µL/mL, respectivamente y además del control (0

G
µL/mL). Sobre dicho medio se sembró por puntura central un fragmento de micelio

LO
de dichos hongos en estudio, provenientes de un cultivo monospórico, se incubó a

O
25 °C hasta 14 días. Se realizó tres repeticiones por triplicado por cada

BI
concentración incluyendo el control. La lectura del crecimiento micelial se realizó

AS
midiendo el diámetro de la colonia en milímetros a partir del séptimo día de siembra
CI
hasta el décimo cuarto día, se encontró que el aceite esencial de hierbaluisa a las
EN

concentraciones de 0.1, 0.5, 1, 1.5 y 2 µL/mL inhiben completamente el crecimiento

de los hongos en estudio. Concluyéndose que el aceite esencial es un fuerte


CI

inhibidor del crecimiento de M. canis y T. rubrum.


DE
CA

Palabras clave: Aceite esencial, hierbaluisa, Microsporum canis, Trichophyton

rubrum.
TE
IO
BL
BI

VIII
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ABSTRACT

This thesis work had as purpose to evaluate the effect of essential oil of

Cymbopogon citratus. “lemongrass” on the growth of Microsporum canis and

AS
Trichophyton rubrum in vitro. For which, I prepared Sabouraud Agar containing

IC
concentrations of the said essential oil, 0.1, 0.5, 1, 1.5, and 2 µL/mL, respectively,

G
and in addition to the control (0 µL/mL). On this medium was inoculated by puncture

LO
central a fragment of mycelium of these fungi in the study, coming from a culture

O
monosporic, was incubated at 25 °C up to 14 days. We performed three replicates

BI
in triplicate for each concentration including the control. The reading of mycelial

AS
growth was performed in millimeters the diameter from the seventh day of sowing
CI
until the fourteenth day, it was found that the essential oil of lemongrass from the
EN

concentration including the control.

The mycelial growth was measured by measuring the diameter of the colony in
CI

millimeters from the seventh day of sowing until the fourteenth day, it was found that
DE

the essential oil of lemon grass at the concentrations of 0.1, 0.5, 1, 1.5 and
CA

2 μL / mL completely inhibit the growth of the fungi under study. Concluding that the

essential oil is a strong growth inhibitor of M. canis and T. rubrum.


TE
IO
BL

Keywords: Essential Oil, lemongrass, Microsporum canis, Trichophyton rubrum.


BI

IX
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ÍNDICE

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO……………………………………………………….. I

PRESENTACIÓN……………………………………………………………………………………………………………………..…….. II

AS
CERTIFICACIÓN DEL ASESOR………………………………………………………………………………………………..………. III

MIEMBROS DEL JURADO…………………………………………………………………………………………………..…………. IV

IC
APROBACIÓN…………………………………………………………………………………………………………………..………….. V

G
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………………………………………………………..….. VI

LO
DEDICATORIA………………………………………………………………………………………………………………..……………. VII

O
RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………………………….. VIII

BI
ABSTRACT …………………………………………………………………………………………………………………………….…... IX

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………………………...…....1

MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………………………………………..…………..... 10AS


CI
1. Material de estudio………………………………………………………………………………………..…………..…. 10
1.1. Ubicación del área de estudio……………………………………………………………………………....... 10
EN

1.2. Ubicación del sitio de muestreo……………………………………………………………………….…..…. 10


1.3. Muestreo…………………………………………………………………………………………………………..….…. 10
CI

1.4. Obtención de plantas de Cymbopogon citratus………………………………………………….....… 11


1.5. Identificación de plantas de Cymbopogon citratus……………………………………………..….… 11
DE

2. Procedimiento……………………………………………………………………………………………………………......12
2.1. Obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus………………………………………....…12
2.2. Obtención de cultivos monospóricos de Microsporum canis y Trichophyton rubrum...13
CA

2.3. Evaluación del efecto del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre el crecimiento
de Microsporum canis y Trichophyton rubrum…………………………………………………………..13
2.4. Análisis de datos………………………………………………………………………………………………………..16
TE

RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………………………………..17
IO

DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………………………………………………22
BL

CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………………………….28

RECOMENDACIONES…………………………………………………………………………………………………………………….29
BI

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………………………………………………………..30

ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………………………..38

X
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INTRODUCCIÓN

En el Perú existen abundantes recursos naturales, el estudio de la flora

y la comprobación de sus propiedades terapéuticas resulta importante

AS
desde el punto de vista científico y cultural. La utilización de plantas

IC
medicinales tradicionalmente se ha ido perfeccionando a lo largo de

G
tiempo, tamizando hoy por el rigor científico de ensayos químicos,

LO
farmacológicos, toxicológicos y clínicos.(Nazzaro, Fratianni, Coppola, y

O
De Feo, 2017).

BI
Cymbopogon citratus, es reconocida como una de las plantas

AS
medicinales más usadas en América Latina, por sus múltiples usos
CI
terapéuticos y su agradable aroma a limón (Carbajal, 1991; Miranda,
EN

1995; Cápiro et al., 2001)


CI

Cymbopogon citratus, “hierbaluisa”, es una planta que pertenece a la


DE

familia de las gramíneas y se cultiva en casi todos los países tropicales

y subtropicales. Sus hojas miden de 20 a 100 cm de largo y uno a 1.5


CA

cm de ancho, tiene los bordes duros y el nervio central fuerte en la


TE

sección basal. Las inflorescencias son largas, hasta de 60 cm, están


IO

reunidas en panículas de espiguillas. Crece desde los 1400 msnm, se


BL

adapta a una variedad de suelos con abundante lluvia y luz solar. Su

mejor desarrollo se da en suelos franco arenosos y bien drenados


BI

(Fonnegra y Jiménez, 2007). Se utiliza para la elaboración de bebida

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aromática y se emplea en la medicina tradicional en diversas partes del

mundo (Vázquez-briones y Guerrero-beltrán, 2017).

Los aceites esenciales son productos oleosos y volátiles de los

AS
metabolitos secundarios producido por varias plantas medicinales, son

IC
líquidos aceitosos aromáticos obtenidos a partir de material vegetal

G
(flores, brotes, semillas, hojas, ramas, cortezas, hierbas, madera, frutos

LO
y raíces). Se pueden obtener por fermentación o extracción, pero el

O
método de destilación con vapor es el más comúnmente utilizado para

BI
su producción comercial (Kayode y Afolayan, 2015). A pesar de haber

AS
sido reconocido desde hace tiempo por su actividad antibacteriana,

antifúngica, antiviral, insecticida y propiedades antioxidantes, es reciente


CI
EN

el interés en las sustancias naturales que se obtiene ha dado lugar a una

nueva conciencia científica de estas sustancias. (Vázquez-briones y


CI

Guerrero-beltrán, 2017).
DE

La composición cualitativa y cuantitativa de los aceites esenciales varía


CA

significativamente entre las distintas especies de plantas incluso dentro

de la misma especie, debido a diferentes razones tales como: clima, la


TE

estación, la ubicación geográfica, la geología, la parte de la planta, ciclo


IO

vegetativo y el método utilizado para obtener el aceite esencial (Basholli,


BL

et al., 2017)
BI

Los compuestos activos de los aceites esenciales han sido divididos en

cuatro grupos de acuerdo a su estructura química; el primer grupo son

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los terpenos (los principales son los monoterpenos y sesquiterpenos); el

segundo grupo son los terpenoides ( son terpenos oxigenados y se

subdividen en alcoholes, aldehídos, cetonas, éteres, ésteres, epóxidos y

AS
fenoles) ; el tercer grupo es fenilpropenos y en el cuarto grupo están los

componentes en cantidades traza (Kayode y Afolayan, 2015).

IC
G
Los dermatofitos son hongos queratinolíticos y se puede presentar tanto

LO
en hombres como en animales, según el grado de profundidad

O
anatómica que afecte el hongo, se les clasifica en superficiales y

BI
cutáneas. Las micosis superficiales son aquellas en las que hay afección

AS
de la capa córnea de la piel y la porción suprafolicular del pelo. Las

micosis cutáneas afectan capas más profundas de la piel y sus anexos


CI
EN

como pelos y uñas; se dividen en dermatofitosis (dermatofitos de los

géneros Microsporum, Epidermophyton y Trichophyton) y candidiasis


CI

cutánea (levaduras del género Cándida). Ocasionalmente se puede


DE

encontrar hongos ambientales en estas lesiones. La aparición de estas

micosis y la frecuencia de sus agentes etiológicos depende de factores


CA

tales como áreas geográficas, sexo, edad, clima, localización de la lesión


TE

y otros (Bejar, Villanueva, Guevara y González., 2014).


IO

Las dermatofitosis se encuentran entre las infecciones de mayor


BL

prevalencia en todo el mundo con predominio en las zonas tropicales de


BI

climas cálidos y húmedos (Gräser, Scott, y Summerbell, 2008). La OMS

ha calculado una frecuencia global de micosis superficial de 20 a 25%

de la población y 5 a 10% causados por dermatofitos. El hombre puede

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afectarse de los animales infectados resaltando entre ellos los

domésticos como perros y gatos (Sánchez., Matos y Kumakawa,

2009).Trichophyton rubrum y Microsporum canis son hongos

AS
antropofílicos, cosmopolitas, que poseen ciertos factores de

patogenicidad como las proteasas que podrían encontrarse tanto in vitro

IC
como durante el proceso de infección (Weitzman, Corporis, y Favosa,

G
LO
1995) y tiene la propiedad de desarrollar resistencia a antifúngicos

(Mukherjee et al., 2003).

O
BI
El diagnóstico de una dermatofitosis por Microsporum canis se realiza

AS
por cultivo, que permite observar las características culturales

macroscópicas tales como la forma y color del micelio y microscópicas


CI
EN

como la presencia de macroconidos de 6 a 15 células, pared gruesa,

rugosa, ornamentada, con extremos más delgados, además se pueden


CI

observar microconidas. Colonia de reverso amarillo o naranja,


DE

algodonosa, abundante crecimiento en medio de arroz. Trichophyton

rubrum presenta macroconidios que no son frecuentes y si están


CA

presentes, son de pared delgada con 3 a 8 células. Presenta escasos


TE

microconidios ovoides, piriformes a lado y lado de la hifa. Son ureasa


IO

negativa hasta 7 días después de sembrada. Por otro lado, existen


BL

pruebas rápidas, basadas en la observación directa de pelos, escamas

o raspado de uñas donde se puede observar las artrosporas o hifas


BI

sobre el material infectado.

Asimismo, la biopsia de piel es un método no necesario, aunque es

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efectivo (Sandoval et al., 2012;Jul et al., 2012).

Por otro lado, el tratamiento para la dermatofitosis depende de la

extensión de las lesiones; siendo tópico y se utilizan productos

AS
antimicóticos en presentaciones de pomadas, soluciones o cremas

IC
conteniendo ketoconazol, miconazol, clotrimazol o terbinafina y para las

G
lesiones generalizadas se usan champús antimicóticos y tratamiento

LO
sistémico (Sandoval et al., 2012). La elección de la droga en particular a

O
usar para las infecciones sistémicas es la griseofulvina, sin embargo

BI
también se utiliza el ketoconazol e itraconazol, aunque estos suelen

AS
generar ciertos efectos adversos como vómitos, diarrea, y anorexia, y

son hepatotóxicos (Plumb, 2009). Un inconveniente importante de los


CI
EN

tratamientos con estas drogas es que suelen ser efectivos después de

varios meses. Por ello, la presente investigación evaluará la posibilidad


CI

de usar el aceite esencial de hierbaluisa como una alternativa natural,


DE

para el control de este tipo de infecciones.


CA

Aunque los dermatofitos tienen generalmente una localización

superficial, la relación entre el hongo y su hospedero continúa siendo


TE

poco entendida. A pesar de los múltiples estudios para tratar de dilucidar


IO

la función específica de las proteasas dermatofíticas, solo se han logrado


BL

avances muy puntuales en cuanto al mecanismo patogénico de dichos


BI

microrganismos. Dentro de los principales hallazgos se encuentran

aquellos relacionados con la adhesión e invasión de los dermatofitos a

la epidermis (Mendez-Tovar, 2010).

5
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La adherencia de los microorganismos al tejido hospedero es un paso

importante en el establecimiento de la mayoría de las infecciones y en

las dermatofitosis es un prerrequisito. Se han desarrollado múltiples

AS
modelos experimentales para el estudio de la cinética de adherencia de

los dermatofitos, estos experimentos se han llevado a cabo tanto in vitro

IC
como ex vivo (Zurita y Hay, 1987). Estos estudios han demostrado que

G
LO
la adherencia de las esporas a los tejidos del hospedero es tiempo –

dependiente, lo que es seguido por la germinación y posterior invasión

O
BI
del estrato córneo en hifas en crecimiento y en múltiples direcciones

(Baldo et al., 2012). Zurita y Hay, 1987 observaron: que la adherencia


AS
máxima de las artroconidias de Trichophyton sp a los queratinocitos
CI
humanos en suspensión ocurría entre las tres y cuatro horas.
EN

Baldo et al., 2008 realizaron un modelo de adherencia altamente


CI

eficiente de Microsporum canis, para ello utilizaron una reconstrucción


DE

de epidermis inter folicular felina. La adherencia bajo estas condiciones

también fue tiempo – dependiente iniciando a las dos horas y con un


CA

incremento a las seis horas post inoculación.


TE

La adherencia del hongo a la célula hospedera es mediada a través de


IO

adhesinas fúngicas y su interacción con los receptores de las células


BL

hospederas. Es muy poco lo que se conoce aún sobre los factores que
BI

median la adherencia de los dermatofitos (Baldo et al., 2012).

Trichophyton rubrum y T. mentagrophytes expresan en la superficie de

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sus microconididas adhesinas específicas de carbohidratos que

reconocen la manosa y la galactosa. (Esquenazi, Alviano, De Souza, &

Rozental, 2004). Se cree que éstas pueden jugar un papel importante en

AS
el proceso de adhesión (Esquenazi, De Souza, Alviano, & Rozental,

2003).

IC
G
En M. canis se ha demostrado también el papel de las proteasas, y las

LO
principales implicadas son de la familia de las subtilisinas (Monod et al.,

O
2002; Vermout et al., 2007). Aparte de las subtilisinas en M. canis se han

BI
estudiado otras proteasas, algunas de ellas son metaloproteasas (Meps)

AS
de la familia de las fungilisinas; sin embargo, al parecer estas

endoproteasas parecen tener un papel más tardío en el proceso de


CI
EN

infección, y no como parte esencial en el proceso de adhesión (Monod

et al., 2002; Vermout, Baldo, Tabart, Losson, y Mignon, 2008).


CI

Una vez el dermatofito se encuentra adherido a las células hospederas,


DE

las hifas comienzan su crecimiento y se van anclando al hospedero al


CA

proyectarse de manera longitudinal y transversal por toda la superficie.

Sin embargo, todo el proceso de invasión no se puede iniciar sin antes


TE

reducir los puentes de disulfuro que se encuentran en la red compacta


IO

de proteínas que componen los tejidos queratinizados.


BL

La degradación de proteínas por los dermatofitos a un pH neutral ocurre


BI

de manera similar en Aspergillus sp. Las subtilisinas y las fungalisinas

digieren las proteínas en péptidos de cadena larga, los cuales

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posteriormente son convertidos a aminoácidos y péptidos de cadena

corta por la acción sinérgica de las leucina aminopeptidasas (Lap 2), y

las dipeptidil peptidasas (DppIV) (Monod et al., 2002). Una vez

AS
degradadas las proteínas de la queratina, quedan como resultado

aminoácidos, dipéptidos y tripéptidos, los cuales son fuente nutricional

IC
para la supervivencia de los dermatofitos.

G
LO
Para que se lleve a cabo todo el proceso patogénico se debe

O
desencadenar un proceso de respuesta inmune cuando se ha

BI
establecido el proceso de adherencia e invasión del dermatofito en la piel

AS
(Uribe y Cardona, 2013). La cantidad de inóculo requerida para

desencadenar una infección espontánea no ha sido establecida. Algunos


CI
EN

estudios in vivo del siglo pasado, demostraron que la dosis infectante en

piel glabra es de seis conidias. En personas afectadas con una


CI

inmunidad normal, una respuesta de hipersensibilidad se desarrolla en


DE

30 días con recuperación espontánea aproximadamente a los 50 días

(Blanco y Garcia, 2008).


CA

Algunos dermatofitos, como Trichophyton rubrum y Trichophyton


TE

tonsurans, son altamente adaptables a los humanos y pueden evadir o


IO

silenciar la respuesta inmune. T. rubrum contiene manan en su pared


BL

celular, el cual está implicado en un fenómeno inmunosupresor. El


BI

manan en una forma dosis dependiente es capaz de inhibir in vitro la

respuesta linfoproliferativa de los monocitos, también inhibe el recambio

del estrato córneo, bien sea directamente o a través de la alteración de

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la función linfocitaria (Blake, Dahl, Herron, y Nelson, 1991)

Las inmunoglobulinas también participan en la respuesta inmune. En las

infecciones agudas se produce una respuesta inmune de tipo celular,

AS
mientras que en las infecciones crónicas se detectan altos niveles de Ig

IC
E e Ig G4; estas subclases de inmunoglobulina se aumentan en

G
infecciones crónicas con pobre respuesta inmune (Giddey, Favre,

LO
Quadroni, y Monod, 2007; Woodfolk, Sung, Benjamin, Lee, y Platts-Mills,

O
2000).

BI
Es necesario investigar sobre las concentraciones mínimas que inhiban

AS
el crecimiento de microorganismos, usando métodos sensibles y
CI
robustos que nos permitan reportar estos datos y valorar la capacidad
EN

antimicrobiana de los aceites esenciales. Estos aceites esenciales, son


CI

muy buenas alternativas como antimicrobianos ya que en la actualidad

alrededor del mundo estamos buscando formas de cuidar y controlar


DE

nuestros cultivos de plagas y enfermedades, sin destruir más el medio


CA

ambiente, tratando de obtener tendencia hacia los productos naturales y

dejar a un lado los productos químicos que tanto daño causan.


TE
IO
BL
BI

9
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MATERIAL Y MÉTODO

AS
1. Material de estudio

IC
1.1 Ubicación del área de estudio

G
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Tecnología

LO
Enzimática y Productos Naturales, Departamento de Química Biológica

O
y Fisiología Animal de la Universidad Nacional de Trujillo, Trujillo – Perú.

BI
1.2 Ubicación del sitio de muestreo

AS
El material biológico para este proyecto fueron las hojas de Cymbopogon
CI
citratus “hierbaluisa”, fueron recolectadas en el Centro poblado de Oscol
EN

que se localiza a 7°54’10” latitud Sur y a latitud Oeste 78°34’20” Oeste,


CI

Distrito de Sinsicap, Provincia de Otuzco, Departamento de La Libertad


DE

a 2 200 m.s.n.m.
CA

1.3 Muestreo

La recolección de las muestras de las hojas de Cymbopogon citratus.


TE

“hierbaluisa” fueron procedentes de cultivos agrícolas de Oscol en


IO

octubre de 2018 y se tomaron las muestras al azar.


BL
BI

10
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1.4 Obtención de las plantas de Cymbopogon citratus.

Las plantas de Cymbopogon citratus fueron recolectadas en el mes de

octubre del 2018 del cultivo agrícola de Oscol, Distrito de Sinsicap,

AS
Provincia de Otuzco, Departamento de La Libertad-Perú.

IC
Se seleccionó la parte aérea (hojas) de C. citratus que es donde se

G
acumula en mayor proporción y calidad el principio activo.

LO
Posteriormente, se empaqueto en bolsas de papel y se transportó a

O
temperatura de 25 °C al Laboratorio de Tecnología Enzimática y

BI
Productos Naturales, Departamento de Química Biológica y Fisiología

Animal de la Universidad Nacional de Trujillo.


AS
CI
EN

1.5 Identificación de las plantas de Cymbopogon citratus.


CI

Una muestra de la planta de Cymbopogon citratus “hierbaluisa”, se llevó


DE

al Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo


CA

para su identificación y posterior clasificación taxonómica según el

sistema filogenético de la especie. Constancia N°012-2019-HUT


TE

(ANEXO1).
IO
BL
BI

11
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2. Procedimiento

2.1 Obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus.

AS
La obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus se realizó en el

laboratorio de Farmacognosia, Departamento Académico de

IC
Farmacotécnia – Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad

G
LO
Nacional de Trujillo, mediante el Método por Destilación por arrastre con

vapor de agua. Se seleccionaron las hojas de hierbaluisa, descartando

O
BI
las deterioradas sin presencia de magulladuras, cortes o demás lesiones

y eliminando las materias extrañas orgánicas e inorgánicas.


AS
CI
Se trabajó con 20 kg de hojas frescas de C. citratus, se colocó en la
EN

cámara del equipo de extracción de aceites esenciales, en el generador


CI

de vapores se colocó el agua y se conectó a la energía eléctrica que


DE

calentó hasta ebullición por 15 - 20 min, de ésta manera el vapor de agua

generado atravesó por la cámara extractora arrastrando el aceite


CA

esencial. Al pasar por el refrigerante condensó los vapores obteniéndose


TE

el hidrolato. (Rodriguez, 2015).

Este hidrolato obtenido se vierte a un embudo de separación donde el


IO

aceite se posicionó en la fase superior, se le agregó cristales de cloruro


BL

de sodio y se procedió a separar. Finalmente, la cantidad obtenida del


BI

aceite esencial de hierbaluisa se colocó en un frasco de color ámbar con

previa rotulación y se conservó en refrigeración a 4°C hasta el momento

de su uso. (Rodriguez, 2015).


12
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2.2 Obtención de cultivos monospóricos de Microsporum canis y


Trichophyton rubrum.

AS
Los cultivos de Microsporum canis y Trichophyton rubrum fueron

IC
proporcionados por el Laboratorio del Instituto de Medicina Tropical de la

G
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo. Estos fueron

LO
sembrados en tubos de ensayo de 16 x 180 mm conteniendo Agar

O
Sabouraud (Das et al., 2011) y fueron incubados a temperatura de 25 °C

BI
± 2, durante 7 a 14 días; posteriormente, en una solución estéril de Tween

AS
80 al 0.1 % se preparó una suspensión de esporas, a partir de los tubos
CI
con el hongo en desarrollo, luego se agitó suavemente para separar las
EN

esporas (Cañedo y Ames, 2004).

A continuación, se sembró por estría 200 µL de dicha suspensión de


CI

esporas en Agar Sabouraud y se incubó a 25 °C ± 2 hasta 14 días. Se


DE

tomó un fragmento de dicha colonia en crecimiento y se transfirió a un


CA

medio de Agar Sabouraud y se incubó en las mismas condiciones

anteriormente mencionadas.
TE

2.3 Evaluación del efecto del aceite esencial de Cymbopogon citratus


IO

sobre el crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum


BL
BI

2.3.1. Evaluación del efecto del aceite esencial de Cymbopogon

citratus sobre el crecimiento de Microsporum canis.

13
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2.3.1.1. Preparación del medio de cultivo con diferentes

concentraciones del aceite esencial

Se preparó matraces de aceite esencial de hierbaluisa en Tween

AS
80 al 0,1% , luego se preparó Agar Sabouraud y el medio de

cultivo se esterilizó a 121°C y en caliente aproximadamente 50

IC
°C, se incorporó el aceite esencial para obtener concentraciones

G
LO
0.1, 0.5, 1, 1.5 y 2µL de AE/mL de medio, respectivamente.

Se utilizó un testigo, por ello no se le adicionó el aceite esencial

O
BI
de hierbaluisa. Luego, el medio de cultivo se sirvió en placa de

Petri estériles (tres placas por cada concentración, incluyendo la

placa control). AS
CI
EN

2.3.1.2. Siembra e incubación de cultivos monospóricos.


CI

A partir del cultivo puro de Microsporum canis se sembró por


DE

puntura en la parte central de las placas de Petri conteniendo

Agar Sabouraud con las diferentes concentraciones del aceite


CA

esencial de hierbaluisa previamente preparadas en el paso


TE

anterior, las cuales fueron incubadas a temperatura de 25 °C por

7 días.
IO
BL
BI

14
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2.3.1.3. Lectura

A partir del séptimo día posterior a la siembra, hasta el décimo

cuarto día de la siembra, cada 24 horas, se midió el diámetro de

AS
crecimiento radial (mm) del dermatofito en diferentes direcciones

para obtener un diámetro promedio final de crecimiento por día

IC
por cada concentración del aceite esencial y del grupo control.

G
LO
Los resultados de crecimiento de Microsporum canis se

expresaron en milímetros y en porcentaje de crecimiento (%C),

O
BI
teniendo en cuenta el crecimiento alcanzado por el grupo control

(100%), de la siguiente manera:


AS
CI
EN

𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎


𝐶= 𝑥100
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜
CI
DE
CA

2.3.2. Evaluación del efecto del aceite esencial de Cymbopogon

citratus sobre el crecimiento de Trichophyton rubrum.


TE

Se procedió de la misma manera que en la evaluación del efecto del


IO

aceite esencial sobre el crecimiento de Microsporum canis


BL

mencionadas en el punto 2.3.1. incluyendo el control.


BI

15
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2.4 Análisis de datos

La determinación de las concentraciones del efecto del aceite esencial

de Cymbopogon citratus sobre el crecimiento de Microsporum canis y

AS
Trichophyton rubrum in vitro, se realizó analizando el porcentaje de

IC
crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum, en las

G
diferentes concentraciones del aceite esencial, y no se procesó los datos

LO
en base a la prueba de Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) ya

O
que hubo una inhibición completa en todas las concentraciones

BI
evaluadas(Morales, 2011).

AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

16
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RESULTADOS

Se evaluó el efecto de la concentración del aceite esencial de Cymbopogon

citratus sobre el crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum in

AS
vitro después de 14 días de incubación.

IC
G
En la figura 1: Se presenta el porcentaje de crecimiento radial de Microsporum

LO
canis en las concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días

O
de evaluación, en condiciones de laboratorio.

BI
AS
En la figura 2 Se presenta el crecimiento radial de Microsporum canis en la
CI
concentración de 0 µL/mL y en las concentraciones 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL
EN

no se observa crecimiento a los 14 días de evaluación.


CI

En la figura 3 Se presenta el porcentaje de crecimiento radial de Trichophyton


DE

rubrum en las concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días

de evaluación.
CA
TE

En la figura 4 Se presenta el crecimiento radial de Trichophyton rubrum en la


IO

concentración de 0 µL/mL y en las concentraciones 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL
BL

no se observa crecimiento a los 14 días de evaluación.


BI

17
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AS
120

IC
G
Porcentaje de crecimiento radial de M.canis

100

LO
80

O
BI
60

40 AS
CI
EN

20
CI

0
0 0.1 0.5 1 1.5 2
Concentraciones del aceite esencial de C. citratus (DC) Stapf.
DE
CA
TE

En la figura 1 Porcentaje de crecimiento radial de Microsporum canis en las

concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días de evaluación.
IO
BL
BI

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0 µL/mL - haz 0 µL/mL – envés 0.1 µL/ mL

AS
IC
control

G
LO
0.5 µL/ mL 1.0 µL/ mL 1.5 µL/ mL

O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA

2 µL/ mL
TE
IO

En la figura 2 Crecimiento radial de Microsporum canis en concentraciones de 0, 0.1,


BL

0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días de evaluación.


BI

19
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AS
120

IC
G
100

LO
Porcentaje de Crecimiento radial de M.canis

O
80

BI
AS
60 CI
40
EN

20
CI
DE

0
0 0.1 0.5 1 1.5 2
Concentraciones del aceite esencial de C. citratus (DC) Stapf.
CA
TE

En la figura 3 Porcentaje de crecimiento radial de Trichophyton rubrum en las


IO

concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días de evaluación.
BL
BI

20
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0 µL/mL - haz 0 µL/mL – envés 0.1 µL/ mL

AS
IC
G
LO
control

O
0.5 µL/ mL 1.0 µL/ mL 1.5 µL/ mL

BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA

2.0 µL/ mL
TE
IO
BL

En la figura 4 Crecimiento radial de Trichophyton rubrum en concentraciones de 0,


BI

0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días de evaluación.

21
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DISCUSIÓN

En relación a los datos obtenidos en el crecimiento de Microsporum canis y

Trichophyton rubrum en la tabla 1, respectivamente. Se observa que, hasta los

AS
14 días de evaluación, el crecimiento de estos dermatofitos fue inhibido en las

IC
concentraciones trabajadas de 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL del aceite esencial

G
de Cymbopogon citratus lo cual se puede deber a sus propiedades

LO
antifúngicas y al componente mayoritario, el citral , alcanzando valores entre

O
65 y el 85%.(Wilson et.al, 2002) y sus isómeros, geranial (trans-citral, llamado

BI
citral A) y neral (cis-citral, llamado citral B)(García et al.,2008), componentes

AS
mencionados anteriormente son derivados primarios de monoterpenos.
CI
(Ralambindrainy et al., 2018).
EN

7Restrepo et al., 2009 hacen mención que la hierbaluisa es una planta


CI

aromática con propiedades antioxidantes, antimicrobianas (Kieling y


DE

Prudencio, 2018) y antifúngicas (García et al,2008). utilizada para la

preparación de té medicinal, en la industria cosmética, farmacéutica y


CA

para la producción de aceites esenciales siendo ésta una mezclas de


TE

compuestos orgánicos volátiles los cuales producen el aroma de muchas

de las sustancias vegetales y contiene los siguientes compuestos: citral


IO

(65-70%), acetato de geranilo (3.0%), geraniol (1.8%), metil heptanona (2.6%)


BL

y mirceno (12.7%) así como también citronelal, neral y algunas trazas de


BI

livalol y dipenteno. Estudios han demostrado que los extractos de hojas de

hierbaluisa contienen compuestos fenólicos asociados con beneficios para la

salud.
22
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Según otros estudios realizados estos componentes de este aceite esencial

varía ampliamente por sus efectos medioambientales, entre estos se

encuentran a los factores genéticos, el origen geográfico, el estado nutricional,

AS
los materiales vegetales extraídos (tallo, hoja y flor), los métodos de

extracción, entre otros (Bejar, Villanueva, Guevara y González., 2014).

IC
G
La mayor parte de la actividad antimicrobiana se encuentra en los terpenoides

LO
como en los aceites esenciales que tienen aldehídos o fenoles como

O
componentes principales a cinalamdehído, carvacrol, eugenol, timol y citral

BI
(según diversos estudios se encontró que es éste el principal componente

AS
activo de C.citratus,) son los más eficaces, seguido de los aceites esenciales

que contienen alcoholes de terpenoides. Los aceites esenciales con cetonas


CI
EN

o ésteres (B-mirceno, α-tuyona, o acetato de geranilo) poseen una actividad

inferior. Aunque los componentes esenciales son muy importantes por su


CI

actividad biológica, los componentes en cantidades trazas desempeñan un


DE

papel importante, ya que pueden potenciar los efectos de los componentes

principales (Perricone, Arace, Corbo, Sinigaglia, y Bevilacqua, 2015)


CA

Teniendo en cuenta la gran cantidad de componentes presentes en el aceite


TE

esencial de hierbaluisa, es probable que su actividad antifúngica no tenga un


IO

mecanismo específico. Por ello, el efecto inhibidor de este aceite esencial


BL

generalmente es atribuido al componente o mezcla de componentes que lo


BI

conforman (Burt, 2004). Además, estos componentes presentan carácter

lipofílico e hidrofóbico que son importantes debido a la polaridad que estos

poseen. (Goodman, Gilman, 1985)

23
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Otros estudios realizados nos muestran que fueron evaluados dieciséis aceites

dentro de los cuales estaba el aceite esencial de Cymbopogon citratus , para

AS
evaluar el efecto fungitoxico de Trichophyton rubrum y Trichophyton gypseum,

IC
los cuales dieron como resultado una fuerte actividad. Los mecanismos

G
probables de actividad antifúngica tenemos a la inhibición de la formación de

LO
la pared celular fúngica, el cuál al inhibirse la síntesis de los β-glucanos, se

O
interrumpirá la integridad de la pared celular.

BI
También está la disfunción de las mitocondrias fúngicas que al inhibirse el

AS
transporte de electrones mitocondriales se reducirá el potencial de la
CI
membrana mitocondrial, lo cual lleva a una reducción en la producción de ATP
EN

y posteriormente a la muerte celular (Miele et al, 2001). Otro posible


CI

mecanismo esta la inhibición de la división celular que puede ocurrir a través

de la inhibición de la polimerización de los microtúbulos, y por consecuencia,


DE

inhibe la formación del huso mitótico. Finalmente, tenemos a la inhibición de


CA

la síntesis de ARN /ADN o síntesis de proteínas, que al ingresar los

componentes a la célula, a través de un transporte activo en ATPasas e


TE

interfiere con el ARN, esto puede provocar una síntesis defectuosa en el ARN
IO

e inhibir la transcripción del ADN (Freisesleben, Jager, 2014).


BL

También realizaron estudios donde evaluaron la actividad antifúngica de la


BI

hierbaluisa contra diez aislamientos clínicos de dermatofitos aislados en caso

de tiña pedís, dando como resultado la inhibición de la germinación conidial;

24
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también reportaron que el aceite esencial de hierbaluisa se caracteriza por

presentar una alta cantidad de monoterpenos oxigenados en su composición.

(Dias, et al; 2017).

AS
IC
Investigadores realizaron estudios del potencial antifúngico del citral y su

G
mecanismo de acción del aceite esencial de C. citratus. en Magnaporthe

LO
grisea, el cual se encontró que el citral no sólo inhibía el crecimiento hifal sino

O
que también causaba una serie de alteraciones morfológicas y estructurales

BI
marcadas. Además el citral redujo la germinación de las esporas y la longitud

AS
del tubo germinal de una manera dependiente de la concentración. (Li, Wu,
CI
Yin, Liang, & Li, 2014)
EN

La actividad inhibitoria descrita de citral contra hongos es más probable debido


CI

a que citral es un miembro de la clase de aldehído α, β-insaturado en la que el

grupo carbonilo es adyacente a los carbonos α y β. Debido a su ubicación en


DE

la molécula, los carbonos α y β están conjugados con el grupo carbonilo, lo


CA

que hace que el carbono α polarice positivamente y sea capaz de reaccionar

fácilmente con los nucleófilos y sufrir un ataque nucleófilo


TE

(Roger, Thomas, David, Charles, Randall, Pierce., 1994).


IO

Según Witz, la naturaleza química de los aldehídos α, β-insaturados, así como


BL

algunos de sus efectos toxicológicos, se basan en su capacidad para funcionar


BI

como agentes alquilantes directos. Estos agentes alquilantes son capaces de

unirse covalentemente a grupos nucleófilos celulares, lo que significa que son

25
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capaces de modificar procesos celulares y tienen toxicidad potencial, las

células tratadas se volvieron anormales y mostraron desorganización celular

tras la exposición a citral, lo que sugiere que citral rompe la pared celular,

AS
penetra en la membrana celular e interactúa con orgánulos celulares. Estos

fenómenos observados concuerdan con (Arlorio, Ludwig,

IC
Boller, Bonfante,1994), quienes observaron la ruptura de las paredes

G
LO
celulares de los hongos al exponerse a citral. Es probable que estos

fenómenos se deban a la estructura de citral, ya que los efectos de los solutos

O
BI
en las paredes celulares podrían verse influenciados por compuestos que

poseen un grupo hidrofílico y un grupo aceptor de electrones, como un grupo

aldehído (Maoz, Neeman , 2000). AS


CI
EN

Otros estudios demostraron el efecto del citral en la actividad de la quitinasa

de M.grise, por lo tanto el citral puede aumentar significativamente la actividad


CI

de la quitinasa y, por lo tanto, causar la degradación de las paredes celulares.


DE

Las quitinasas son enzimas digestivas que descomponen los enlaces

glicosídicos en la quitina. En hongos, se ha demostrado que la quitinasa


CA

participa en la regulación de la degradación de las paredes celulares, la


TE

germinación de las esporas, el crecimiento de la punta, la ramificación de las


IO

hifas, el desprendimiento de las esporas y la autolisis de las hifas (Adams,


BL

2004).
BI

Estudios realizados en Minthostachy mollis “ muña”, que pertenecen a la

familia de las Lamineaceas, evaluaron la actividad antimicótica del aceite

esencial de las hojas, para demostrar la actividad de los componentes

26
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monoterpenicos de diversas estructuras químicas y una compleja composición

química. Estas mezclas de componentes mostraron un amplio espectro

fungicida y fungistático para dermatofitos como T. mentagrophytes, T.

AS
tonsurans y M. canis (Fuertes y Munguía, 2001).

IC
Estudios realizados determinaron la inhibición del crecimiento micelial de

G
dermatofitos y C.albicans gracias al citral, componente que se encuentra en

LO
mayor cantidad en el aceite esencial de Cymbopogon citratus (Silva, Guterres,

O
Weisheimer, & Schapoval, 2008).

BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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CONCLUSIONES

El aceite esencial de Cymbopogon citratus en concentraciones de 0.1, 0.5, 1.0,

1.5 y 2.0 µL/mL, respectivamente; inhibe completamente el crecimiento de

AS
Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro.

IC
G
LO
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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RECOMENDACIONES

Se sugiere realizar investigaciones de este aceite esencial con la finalidad de

encontrar la concentración adecuada para trabajar con Microsporum canis y

AS
Trichophyton rubrum en pacientes que padecen enfermedades de la piel.

IC
G
LO
O
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Anexo 01:

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