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AS
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
IC
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LO
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BI
Efecto de la concentración del aceite esencial de Cymbopogon
rubrum in vitro.
AS
CI
EN
TESIS
CI
DE BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
CA
TRUJILLO – PERU
BI
2019
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AS
Dr. ORLANDO MOISÉS GONZALES NIEVES
IC
Rector de la Universidad Nacional de Trujillo.
G
LO
O
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Dr. RUBÉN CÉSAR VERA VELIZ
Vice – rector Académico de la Universidad Nacional de Trujillo.
AS
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EN
Trujillo.
CA
TE
I
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PRESENTACIÓN
AS
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de
Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a vuestra
IC
consideración y claro discernimiento la tesis titulada: “Efecto de la
G
concentración del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre el
LO
crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro”.
O
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Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones
cometidos en la elaboración del informe de tesis, nos sometemos a vuestro
dictamen. AS
CI
EN
II
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AS
“Efecto del crecimiento del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre el
crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro”
IC
G
CERTIFICA
LO
Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con su
O
correspondiente proyecto y las orientaciones pertinentes.
BI
En cuanto al informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, acogiendo las
AS
observaciones y sugerencias alcanzadas, por lo que autorizo al bachiller:
María de Jesús Salinas Aranda continúe con los procedimientos según los
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fines.
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DE
ASESORA
TE
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III
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AS
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Dra: Icela Marissa Rodríguez Haro
G
PRESIDENTE
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Dra: Manuela Natividad Luján Velásquez
SECRETARIA
EN
CI
DE
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VOCAL
IO
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IV
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que
la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,
AS
siendo aprobada por UNANIMIDAD.
IC
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Dra: Icela Marissa Rodríguez Haro
BI
PRESIDENTE
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DE
V
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AGRADECIMIENTOS
AS
A la Dra: Icela Marissa Rodríguez Haro por su dedicada labor en la
IC
motivación, y guía en la investigación, sobre todo por la confianza brindada,
G
apoyo y asesoramiento en el desarrollo del presente trabajo de tesis.
LO
O
Al Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo por su apoyo moral, enseñanza y por
BI
los consejos brindados durante el proceso de investigación.
AS
CI
A Dios por permitirme culminar el presente trabajo de tesis al mantenerme
EN
con bienestar, salud, así como también por colocarme en el lugar adecuado y
CI
VI
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DEDICATORIA
AS
A mis abuelos Claudina Reyes Rodríguez y Agustín Conversión Salinas Reyes
por su tiempo dedicado, amor incondicional y por ser mi fuerza y razón para lograr
IC
mis objetivos.
G
LO
A mi madre Agustina Aranda García por ser quien me enseñó a nunca rendirme,
O
por siempre confiar en mí, por toda la motivación brindada, y a mi padre Nolberto
BI
Salinas Reyes por su ayuda para seguir avanzando en mis metas trazadas.
AS
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EN
CI
DE
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TE
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VII
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RESUMEN
AS
cual, se preparó Agar Sabouraud conteniendo concentraciones de dicho aceite
IC
esencial de 0.1, 0.5, 1, 1.5 y 2 µL/mL, respectivamente y además del control (0
G
µL/mL). Sobre dicho medio se sembró por puntura central un fragmento de micelio
LO
de dichos hongos en estudio, provenientes de un cultivo monospórico, se incubó a
O
25 °C hasta 14 días. Se realizó tres repeticiones por triplicado por cada
BI
concentración incluyendo el control. La lectura del crecimiento micelial se realizó
AS
midiendo el diámetro de la colonia en milímetros a partir del séptimo día de siembra
CI
hasta el décimo cuarto día, se encontró que el aceite esencial de hierbaluisa a las
EN
rubrum.
TE
IO
BL
BI
VIII
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ABSTRACT
This thesis work had as purpose to evaluate the effect of essential oil of
AS
Trichophyton rubrum in vitro. For which, I prepared Sabouraud Agar containing
IC
concentrations of the said essential oil, 0.1, 0.5, 1, 1.5, and 2 µL/mL, respectively,
G
and in addition to the control (0 µL/mL). On this medium was inoculated by puncture
LO
central a fragment of mycelium of these fungi in the study, coming from a culture
O
monosporic, was incubated at 25 °C up to 14 days. We performed three replicates
BI
in triplicate for each concentration including the control. The reading of mycelial
AS
growth was performed in millimeters the diameter from the seventh day of sowing
CI
until the fourteenth day, it was found that the essential oil of lemongrass from the
EN
The mycelial growth was measured by measuring the diameter of the colony in
CI
millimeters from the seventh day of sowing until the fourteenth day, it was found that
DE
the essential oil of lemon grass at the concentrations of 0.1, 0.5, 1, 1.5 and
CA
2 μL / mL completely inhibit the growth of the fungi under study. Concluding that the
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ÍNDICE
PRESENTACIÓN……………………………………………………………………………………………………………………..…….. II
AS
CERTIFICACIÓN DEL ASESOR………………………………………………………………………………………………..………. III
IC
APROBACIÓN…………………………………………………………………………………………………………………..………….. V
G
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………………………………………………………..….. VI
LO
DEDICATORIA………………………………………………………………………………………………………………..……………. VII
O
RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………………………….. VIII
BI
ABSTRACT …………………………………………………………………………………………………………………………….…... IX
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………………………………...…....1
2. Procedimiento……………………………………………………………………………………………………………......12
2.1. Obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus………………………………………....…12
2.2. Obtención de cultivos monospóricos de Microsporum canis y Trichophyton rubrum...13
CA
2.3. Evaluación del efecto del aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre el crecimiento
de Microsporum canis y Trichophyton rubrum…………………………………………………………..13
2.4. Análisis de datos………………………………………………………………………………………………………..16
TE
RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………………………………..17
IO
DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………………………………………………22
BL
CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………………………….28
RECOMENDACIONES…………………………………………………………………………………………………………………….29
BI
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………………………………………………………..30
ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
X
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INTRODUCCIÓN
AS
desde el punto de vista científico y cultural. La utilización de plantas
IC
medicinales tradicionalmente se ha ido perfeccionando a lo largo de
G
tiempo, tamizando hoy por el rigor científico de ensayos químicos,
LO
farmacológicos, toxicológicos y clínicos.(Nazzaro, Fratianni, Coppola, y
O
De Feo, 2017).
BI
Cymbopogon citratus, es reconocida como una de las plantas
AS
medicinales más usadas en América Latina, por sus múltiples usos
CI
terapéuticos y su agradable aroma a limón (Carbajal, 1991; Miranda,
EN
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metabolitos secundarios producido por varias plantas medicinales, son
IC
líquidos aceitosos aromáticos obtenidos a partir de material vegetal
G
(flores, brotes, semillas, hojas, ramas, cortezas, hierbas, madera, frutos
LO
y raíces). Se pueden obtener por fermentación o extracción, pero el
O
método de destilación con vapor es el más comúnmente utilizado para
BI
su producción comercial (Kayode y Afolayan, 2015). A pesar de haber
AS
sido reconocido desde hace tiempo por su actividad antibacteriana,
Guerrero-beltrán, 2017).
DE
et al., 2017)
BI
2
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AS
fenoles) ; el tercer grupo es fenilpropenos y en el cuarto grupo están los
IC
G
Los dermatofitos son hongos queratinolíticos y se puede presentar tanto
LO
en hombres como en animales, según el grado de profundidad
O
anatómica que afecte el hongo, se les clasifica en superficiales y
BI
cutáneas. Las micosis superficiales son aquellas en las que hay afección
AS
de la capa córnea de la piel y la porción suprafolicular del pelo. Las
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antropofílicos, cosmopolitas, que poseen ciertos factores de
IC
como durante el proceso de infección (Weitzman, Corporis, y Favosa,
G
LO
1995) y tiene la propiedad de desarrollar resistencia a antifúngicos
O
BI
El diagnóstico de una dermatofitosis por Microsporum canis se realiza
AS
por cultivo, que permite observar las características culturales
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antimicóticos en presentaciones de pomadas, soluciones o cremas
IC
conteniendo ketoconazol, miconazol, clotrimazol o terbinafina y para las
G
lesiones generalizadas se usan champús antimicóticos y tratamiento
LO
sistémico (Sandoval et al., 2012). La elección de la droga en particular a
O
usar para las infecciones sistémicas es la griseofulvina, sin embargo
BI
también se utiliza el ketoconazol e itraconazol, aunque estos suelen
AS
generar ciertos efectos adversos como vómitos, diarrea, y anorexia, y
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AS
modelos experimentales para el estudio de la cinética de adherencia de
IC
como ex vivo (Zurita y Hay, 1987). Estos estudios han demostrado que
G
LO
la adherencia de las esporas a los tejidos del hospedero es tiempo –
O
BI
del estrato córneo en hifas en crecimiento y en múltiples direcciones
hospederas. Es muy poco lo que se conoce aún sobre los factores que
BI
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AS
el proceso de adhesión (Esquenazi, De Souza, Alviano, & Rozental,
2003).
IC
G
En M. canis se ha demostrado también el papel de las proteasas, y las
LO
principales implicadas son de la familia de las subtilisinas (Monod et al.,
O
2002; Vermout et al., 2007). Aparte de las subtilisinas en M. canis se han
BI
estudiado otras proteasas, algunas de ellas son metaloproteasas (Meps)
AS
de la familia de las fungilisinas; sin embargo, al parecer estas
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AS
degradadas las proteínas de la queratina, quedan como resultado
IC
para la supervivencia de los dermatofitos.
G
LO
Para que se lleve a cabo todo el proceso patogénico se debe
O
desencadenar un proceso de respuesta inmune cuando se ha
BI
establecido el proceso de adherencia e invasión del dermatofito en la piel
AS
(Uribe y Cardona, 2013). La cantidad de inóculo requerida para
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AS
mientras que en las infecciones crónicas se detectan altos niveles de Ig
IC
E e Ig G4; estas subclases de inmunoglobulina se aumentan en
G
infecciones crónicas con pobre respuesta inmune (Giddey, Favre,
LO
Quadroni, y Monod, 2007; Woodfolk, Sung, Benjamin, Lee, y Platts-Mills,
O
2000).
BI
Es necesario investigar sobre las concentraciones mínimas que inhiban
AS
el crecimiento de microorganismos, usando métodos sensibles y
CI
robustos que nos permitan reportar estos datos y valorar la capacidad
EN
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MATERIAL Y MÉTODO
AS
1. Material de estudio
IC
1.1 Ubicación del área de estudio
G
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Tecnología
LO
Enzimática y Productos Naturales, Departamento de Química Biológica
O
y Fisiología Animal de la Universidad Nacional de Trujillo, Trujillo – Perú.
BI
1.2 Ubicación del sitio de muestreo
AS
El material biológico para este proyecto fueron las hojas de Cymbopogon
CI
citratus “hierbaluisa”, fueron recolectadas en el Centro poblado de Oscol
EN
a 2 200 m.s.n.m.
CA
1.3 Muestreo
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AS
Provincia de Otuzco, Departamento de La Libertad-Perú.
IC
Se seleccionó la parte aérea (hojas) de C. citratus que es donde se
G
acumula en mayor proporción y calidad el principio activo.
LO
Posteriormente, se empaqueto en bolsas de papel y se transportó a
O
temperatura de 25 °C al Laboratorio de Tecnología Enzimática y
BI
Productos Naturales, Departamento de Química Biológica y Fisiología
(ANEXO1).
IO
BL
BI
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2. Procedimiento
AS
La obtención del aceite esencial de Cymbopogon citratus se realizó en el
IC
Farmacotécnia – Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
G
LO
Nacional de Trujillo, mediante el Método por Destilación por arrastre con
O
BI
las deterioradas sin presencia de magulladuras, cortes o demás lesiones
AS
Los cultivos de Microsporum canis y Trichophyton rubrum fueron
IC
proporcionados por el Laboratorio del Instituto de Medicina Tropical de la
G
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo. Estos fueron
LO
sembrados en tubos de ensayo de 16 x 180 mm conteniendo Agar
O
Sabouraud (Das et al., 2011) y fueron incubados a temperatura de 25 °C
BI
± 2, durante 7 a 14 días; posteriormente, en una solución estéril de Tween
AS
80 al 0.1 % se preparó una suspensión de esporas, a partir de los tubos
CI
con el hongo en desarrollo, luego se agitó suavemente para separar las
EN
anteriormente mencionadas.
TE
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AS
80 al 0,1% , luego se preparó Agar Sabouraud y el medio de
IC
°C, se incorporó el aceite esencial para obtener concentraciones
G
LO
0.1, 0.5, 1, 1.5 y 2µL de AE/mL de medio, respectivamente.
O
BI
de hierbaluisa. Luego, el medio de cultivo se sirvió en placa de
placa control). AS
CI
EN
7 días.
IO
BL
BI
14
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2.3.1.3. Lectura
AS
crecimiento radial (mm) del dermatofito en diferentes direcciones
IC
por cada concentración del aceite esencial y del grupo control.
G
LO
Los resultados de crecimiento de Microsporum canis se
O
BI
teniendo en cuenta el crecimiento alcanzado por el grupo control
15
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AS
Trichophyton rubrum in vitro, se realizó analizando el porcentaje de
IC
crecimiento de Microsporum canis y Trichophyton rubrum, en las
G
diferentes concentraciones del aceite esencial, y no se procesó los datos
LO
en base a la prueba de Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) ya
O
que hubo una inhibición completa en todas las concentraciones
BI
evaluadas(Morales, 2011).
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI
16
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RESULTADOS
AS
vitro después de 14 días de incubación.
IC
G
En la figura 1: Se presenta el porcentaje de crecimiento radial de Microsporum
LO
canis en las concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días
O
de evaluación, en condiciones de laboratorio.
BI
AS
En la figura 2 Se presenta el crecimiento radial de Microsporum canis en la
CI
concentración de 0 µL/mL y en las concentraciones 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL
EN
rubrum en las concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días
de evaluación.
CA
TE
concentración de 0 µL/mL y en las concentraciones 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL
BL
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AS
120
IC
G
Porcentaje de crecimiento radial de M.canis
100
LO
80
O
BI
60
40 AS
CI
EN
20
CI
0
0 0.1 0.5 1 1.5 2
Concentraciones del aceite esencial de C. citratus (DC) Stapf.
DE
CA
TE
concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días de evaluación.
IO
BL
BI
18
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AS
IC
control
G
LO
0.5 µL/ mL 1.0 µL/ mL 1.5 µL/ mL
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
2 µL/ mL
TE
IO
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AS
120
IC
G
100
LO
Porcentaje de Crecimiento radial de M.canis
O
80
BI
AS
60 CI
40
EN
20
CI
DE
0
0 0.1 0.5 1 1.5 2
Concentraciones del aceite esencial de C. citratus (DC) Stapf.
CA
TE
concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL a los 14 días de evaluación.
BL
BI
20
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AS
IC
G
LO
control
O
0.5 µL/ mL 1.0 µL/ mL 1.5 µL/ mL
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
2.0 µL/ mL
TE
IO
BL
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DISCUSIÓN
AS
14 días de evaluación, el crecimiento de estos dermatofitos fue inhibido en las
IC
concentraciones trabajadas de 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µL/mL del aceite esencial
G
de Cymbopogon citratus lo cual se puede deber a sus propiedades
LO
antifúngicas y al componente mayoritario, el citral , alcanzando valores entre
O
65 y el 85%.(Wilson et.al, 2002) y sus isómeros, geranial (trans-citral, llamado
BI
citral A) y neral (cis-citral, llamado citral B)(García et al.,2008), componentes
AS
mencionados anteriormente son derivados primarios de monoterpenos.
CI
(Ralambindrainy et al., 2018).
EN
salud.
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AS
los materiales vegetales extraídos (tallo, hoja y flor), los métodos de
IC
G
La mayor parte de la actividad antimicrobiana se encuentra en los terpenoides
LO
como en los aceites esenciales que tienen aldehídos o fenoles como
O
componentes principales a cinalamdehído, carvacrol, eugenol, timol y citral
BI
(según diversos estudios se encontró que es éste el principal componente
AS
activo de C.citratus,) son los más eficaces, seguido de los aceites esenciales
23
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Otros estudios realizados nos muestran que fueron evaluados dieciséis aceites
AS
evaluar el efecto fungitoxico de Trichophyton rubrum y Trichophyton gypseum,
IC
los cuales dieron como resultado una fuerte actividad. Los mecanismos
G
probables de actividad antifúngica tenemos a la inhibición de la formación de
LO
la pared celular fúngica, el cuál al inhibirse la síntesis de los β-glucanos, se
O
interrumpirá la integridad de la pared celular.
BI
También está la disfunción de las mitocondrias fúngicas que al inhibirse el
AS
transporte de electrones mitocondriales se reducirá el potencial de la
CI
membrana mitocondrial, lo cual lleva a una reducción en la producción de ATP
EN
interfiere con el ARN, esto puede provocar una síntesis defectuosa en el ARN
IO
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AS
IC
Investigadores realizaron estudios del potencial antifúngico del citral y su
G
mecanismo de acción del aceite esencial de C. citratus. en Magnaporthe
LO
grisea, el cual se encontró que el citral no sólo inhibía el crecimiento hifal sino
O
que también causaba una serie de alteraciones morfológicas y estructurales
BI
marcadas. Además el citral redujo la germinación de las esporas y la longitud
AS
del tubo germinal de una manera dependiente de la concentración. (Li, Wu,
CI
Yin, Liang, & Li, 2014)
EN
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tras la exposición a citral, lo que sugiere que citral rompe la pared celular,
AS
penetra en la membrana celular e interactúa con orgánulos celulares. Estos
IC
Boller, Bonfante,1994), quienes observaron la ruptura de las paredes
G
LO
celulares de los hongos al exponerse a citral. Es probable que estos
O
BI
en las paredes celulares podrían verse influenciados por compuestos que
2004).
BI
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AS
tonsurans y M. canis (Fuertes y Munguía, 2001).
IC
Estudios realizados determinaron la inhibición del crecimiento micelial de
G
dermatofitos y C.albicans gracias al citral, componente que se encuentra en
LO
mayor cantidad en el aceite esencial de Cymbopogon citratus (Silva, Guterres,
O
Weisheimer, & Schapoval, 2008).
BI
AS
CI
EN
CI
DE
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CONCLUSIONES
AS
Microsporum canis y Trichophyton rubrum in vitro.
IC
G
LO
O
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CI
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RECOMENDACIONES
AS
Trichophyton rubrum en pacientes que padecen enfermedades de la piel.
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G
LO
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BI
AS
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EN
CI
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BL
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ANEXOS
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Anexo 01:
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