Actividad enzimática en procesos de transformación

Karla Fernanda Arias Muñoz (karlaarmu @unisabana.edu.co)

Gabriel Emanuel Pataquiva Bedoya (Gabrielpabe@unisabana.edu.co)

Universidad de la sabana

Presentado a: Luis Eduardo Sánchez

16 de septiembre del 2019

Resumen​: ​En la práctica de laboratorio se buscó medir la velocidad de reacción de la fosfatasa acida
extraída del germen de trigo, al igual que se busca estimar los parámetros cinéticos Km y Vmax a partir de los
datos experimentales con la ayuda de la ecuación de Michaelis-Menten y las demás ecuaciones que se derivan
de esta, para poder alcanzar estos objetivos se determinó la cantidad de fosfato producido por acción de la
fosfatasa acida, estos datos se tomaron bajo ciertas condiciones específicas, se varió la temperatura, el pH, el
tiempo de incubación, la concentración de la enzima, la concentración del sustrato así como la presencia de un
inhibidor. Con estos datos experimentales y mediante ayudas graficas fue posible determinar la Vmax así
como el Km.

Palabras clave​:​ Fosfatasa acida, Enzima, Vmax, Km, ecuación de Michaelis-Menten.

Abstract​: ​In this laboratory practice it was sought to measure the reaction rate of acid phosphatase extracted
from the wheat germ, as well as seeking to estimate the kinetic parameters Km and Vmax from the
experimental data with the help of the Michaelis-Menten equation and the other equations derived from this
one, in order to achieve these objectives the amount of phosphate produced by acid phosphatase was
determined, this data was taken under certain specific conditions, varying temperature, pH, time of
incubation, concentration of enzyme, concentration of substrate as well as the presence of an inhibitor. With
this experimental data and using graphical aids it was possible to determine the Vmax as well as the Km.

Key words​:​ Acid phosphatase, Enzyme, Vmax, Km, Michaelis-Menten equation.

Introducción​: ​Las enzimas son catalizadores biológicos. La ecuación de michaelis-Menten nos relaciona la velocidad
Aumentan la tasa de reacciones químicas que tienen lugar en inicial de una reacción enzimática con la concentración de
las células vivas sin sufrir ningún cambio general. Los sustrato:
reactivos de las reacciones catalizadas por enzimas se
denominan sustratos. Cada enzima tiene un carácter bastante Vo= V max*[S]
Km+[S]
específico, actuando sobre un sustrato o sustratos particulares
para producir un producto o productos particulares. (T Palmer, Ecuación 2. Michaelis-Menten
2007) (The extraction and purification of wheat germ acid
phosphatase) Donde:

El modelo más simple para explicar la acción enzimática es el ● Vo: velocidad de reacción a cierta concentración
modelo de Michaelis-Menten, donde: especifica de sustrato

E + S →ES→E + P ● Vmax: velocidad máxima alcanzable a cierta

concentración especifica de enzima dada.
Ecuación 1. Acción enzimática

En donde la Enzima (E) se liga al Sustrato (S), formando así ● Km: constante de disociación aparente
Enzima-Sustrato (k2+k3)/k1
un complejo Enzima-Sustrato (ES), este paso es reversible y
consecuentemente se puede separar nuevamente en enzima (E)
● [S]: concentración de sustrato
y sustrato libre (S) o se puede transformar el sustrato en
producto (P).

1
Al realizar la gráfica de la velocidad máxima en función de la obteniendo un sobrenadante (extracto enzimático crudo).El
concentración de sustrato obtenemos el siguiente gráfico: sobrenadante se deja en un baño de hielo.

Donde La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la 2. Preparación de curva de calibración de fósforo
curva experimental, y el Km corresponde a la concentración inorgánico:
de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de Se realizaron seis soluciones de acuerdo a la siguiente tabla​:
la Vmax. (Mañas, s.f.)
Patrón de fósforo
Tubo Agua (ml) Ácido molíbdico (ml)
0.04 mg/ml (ml)

B – 4.0 0.5

1 0.1 3.9 0.5

2 0.2 3.8 0.5

3 0.3 3.7 0.5

4 0.4 3.6 0.5

Grafico 1. Velocidad máxima en función de la concentración de
sustrato.
5 0.5 3.5 0.5
Imagen tomada de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#kv Tabla 1. ​Volúmenes y reactivos para la preparación de la curva de
calibración.
Al derivar la ecuación de Michaelis-Menten nos encontramos
con la ecuación de lineweaver-Burk: Agitar bien cada solución y dejar en reposo ​durante 3 minutos.
Posteriormente, se adicionaron 0.5 mL de una solución de
1
= Km
*
1
+ 1 ácido ascórbico. Nuevamente, cada tubo se agitó y se dejó en
Vo V max [S ] V max
reposo durante 10 minutos. Finalmente, se determinó la
Ecuación 3. lineweaver-Burk absorbancia a 660 nm.

3. A1 Procedimiento para determinación de cantidad

Así como también con la ecuación de Eadie-Hofstee​:
de fósforo producido por acción de fosfatasa
Vo ácida:
V o =− K m * [S ]
+ V max
Se preparó una mezcla de reacción basada en la siguiente tabla
Ecuación 4. Eadie-Hofstee y teniendo en cuenta que el orden de arriba a abajo es como se
debían agregar los reactivos:
Una fosfatasa es una enzima que cataliza la eliminación de
grupos fosfatos de algunos sustratos, dando lugar a la Sobrenadante de la reacción enzimática 0.5 ml
liberación de una molécula de ion fosfato y la aparición de un
grupo hidroxilo. Las fosfatasas acidas tienen la propiedad de
Agua destilada 3.5 ml
hidrolizar fosfomonoésteres, liberando como producto de la
reacción un alcohol y fosfato inorgánico. (Emilio Gija, 2007)
Ácido molíbdico 0.5 ml
Procedimiento​:
Tabla 2. ​Volúmenes de las sustancias para hacer la mezcla de
1. Extracción de la fosfatasa ácida (extracto determinación de fósforo
enzimático crudo: Después de preparada la mezcla, se agitó bien y se dejó
reposar durante tres minutos. Pasado el tiempo, se adicionaron
Se pesaron 10 gramos de germen de trigo, a los cuales se les
0.5 mL de ácido ascórbico, se agitó bien y se dejó en reposo
agregaron 50 mL de agua fría. La anterior mezcla, se agitó
durante diez minutos. Finalmente, se determinó la absorbancia
constantemente hasta obtener una suspensión uniforme. Se
a 660nm.
dejó en reposo durante 30 minutos, luego se decantó durante
15 minutos y finalmente se filtró con un embudo y algodón, 4. Determinación del tiempo óptimo de incubación:

2
 Se prepararon las siguientes mezclas de ​reacción: Enzima
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
(ml)
Buffer citráto β-​glicero M Extracto
Agua
Tubo 0.1 M de pH fosfato de sodio e enzimático
5.3 (ml) (ml)
(ml)
z (ml) ​ olúmenes de reactivos para la determinación del pH
Tabla 4. V
c óptimo
l
e
Blanco buffer
b Se mezcló el contenido de cada tubo y se dejó incubando a
(BB)
5.6 – 2.4 i
e
– temperatura ambiente durante 10 minutos. Es importante que
n los 10 minutos se le cuenten a cada tubo, es decir, después de
l
o agregada la enzima al tubo, se empiezan a contar los 10
Blanco sustrato s
(BS) t
minutos y pasado este tiempo​, ​se le agregan 2 ml de ATA10%
5.6 1.6 0.8 –
u a cada tubo. Se mezcló y se centrifugo a 4000rpm durante 3
b
o minutos. El precipitado se descartó y en el sobrenadante de
s
y todos los tubos se determinó la concentración de fósforo
Blanco enzima
(BE)
5.6 – 1.6
a
g 0.8
inorgánico, por medio del procedimiento A1​.
r
e 6. Efecto de la temperatura, determinación de la
g
u temperatura óptima:
e

a Se prepararon determinadas reacciones de acuerdo con la

c siguiente tabla:
o
n
Tiempo reacción
t Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
(TR)
5.6 1.6 – i 0.8
n
u
a Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
c
i
ó
n Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Tabla 3. ​Volúmenes de reactivos para determinación del tiempo Agua (ml) 0.6 0.2 0.4 – – – – –
óptimo

Cada tubo se agitó muy bien y se incubó a temperatura Temperatura

18 18 18 0 18 37 60 92
°C
ambiente. El BB y el BS se dejaron reaccionar durante 30
minutos aproximadamente y pasado dicho tiempo, se tomaron
alícuotas de 1 mL que se recibieron sobre ATA (Ácido Enzima (ml) – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
tricloroacético) al 10%. Por otro lado, a los 2, 5, 10,15,20 y 30
minutos, se tomaron muestras de 1 mL de BE y TR, las cuales ​ olúmenes de reactivos necesarios para la determinación de
Tabla 5. V
fueron trasladas a tubos que contenían 1 mL de ATA al 10 %. temperatura óptima:
Finalmente se agitaron bien y se centrifugaron 4000 rpm
Mezclar bien cada tubo y dejar incubando durante 10 minutos
durante 3 minutos.
(contados para cada uno de los tubos) y pasado dicho tiempo,
En el sobrenadante que quedó, se determinó la concentración se agregaron 2 mL de ATA al 10% a cada tubo. Luego, se
de fósforo inorgánico ajustando el 100% de T con el tubo BB mezclaron muy bien y se dejaron en la centrifugadora a 4000
y aplicando el procedimiento ​A1​ explicado anteriormente. rpm durante 3 minutos.

5. Efecto del ph, determinación del pH óptimo Finalmente, al sobrenadante de cada tubo se le determinó la
concentración de fósforo inorgánico aplicando el
Se prepararon las reacciones de acuerdo con la siguiente tabla: procedimiento ​A1​.

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7. Efecto de la concentración de la enzima en la

velocidad de reacción​:
Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Se prepararon determinadas reacciones de acuerdo con la
siguiente tabla:
Buffer (ml) 2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
pH del
5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2
buffer

3
 Buffer (ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 Se prepararon determinadas reacciones de acuerdo con la
siguiente tabla:
Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
B B
Tubo BS 1 2 3 4 5 6 7 8
B E

Agua (ml) 0.8 0.4 0.4 0.35 0.30 0.25 0.10 –

Buffer 1. 1.
1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 0.8
(ml) 2 2
Enzima (µl) – – 400 50 100 150 300 400

Tabla 6. Volúmenes de reactivos usados en la determinación del Sustrat

– 0.8 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
efecto de la concentración de la enzima o (ml)

Se agito y se dejó en incubación durante 10 minutos

[S]
exactamente. Al final se adiciono a todos los tubos 2 ml de mM
– 100 – 5 10 20 40 60 80 100 100

ATA al 10% y se centrifugo a 4000rpm durante 3 minutos.

(Tener en cuenta la misma recomendación hecha en el
Agua 1. 0.
procedimiento de pH para los 10 minutos). El precipitado se (ml) 0
–
4
– – – – – – – –

descartó y en el sobrenadante de todos los tubos se determinó

la concentración de fósforo inorgánico, por medio del
Inhibid 0.
procedimiento A1. – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
or (ml) 2

8. Efecto de la concentración de sustrato,

​ olúmenes de reactivos para la determinación del efecto de
Tabla 8. V
determinación de la constante de Michaelis (Km): la presencia de inhibidor
Se prepararon determinadas reacciones de acuerdo con la Agitar y dejar en incubación durante 10 minutos exactamente.
siguiente tabla: Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se
centrifugar a 2500rpm durante 5 minutos. (Tener en cuenta la
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
misma recomendación hecha en el procedimiento de pH para
los 10 minutos)
Buffer
1.4 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.0
(ml) El precipitado se descarta y en el sobrenadante de todos los
tubos se determina la concentración de fósforo inorgánico, por
Sustrato
– 0.8 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8 medio del procedimiento A1.
(ml)

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS:

{S} mM – 100 – 5 10 20 40 60 80 100 100

Curva de calibración:
Agua
0.6 – 0.4 – – – – – – – –
(ml)
Tubo Patrón de Agu Ácido Ácido V
fosfato a molíbdico Ascórbico total
Enzima
(ml)
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 mg/ml (ml) (ml) (ml) (ml) (mL)

B 0 4 0,5 0,5 5
Tabla 7. Volúmenes de reactivos utilizados para la determinación de
la constante de Michaelis (Km)
1 0,1 3,9 0,5 0,5 5
Agitar y dejar en incubación durante 10 minutos exactamente.
Al final adicionar a todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se 2 0,2 3,8 0,5 0,5 5
centrifugar a 4000rpm durante 3 minutos. (Tener en cuenta la
3 0,3 3,7 0,5 0,5 5
misma recomendación hecha en el procedimiento de pH para
los 10 minutos). El precipitado se descarta y en el 4 0,4 3,6 0,5 0,5 5
sobrenadante de todos los tubos se determina la concentración
de fósforo inorgánico, por medio del procedimiento A1. 5 0,5 3,5 0,5 0,5 5

9. Efecto de la presencia de un inhibidor en la

velocidad de reacción: Tabla 9: Volúmenes de reactivos utilizados en la preparación de la
curva de calibración

4
 donde y= Absorbancia (Abs) y X= concentración de fosfato
𝑉​1​𝐶1​ =​𝑉​2​𝐶2​ inorgánico ([S]).

Ecuación 5. Concentraciones a diferentes volúmenes. Tiempo óptimo.

En donde para este caso:

t (min) BE TR
V1= volumen añadido de fósforo inorgánico mL.
2 0,389 0,44
C1= 0,04 mg/mL.
5 0,419 0,524
V2= 4,5mL.
10 0,485 0,618
C2= Es la variable desconocida
15 0,515 0,519

Tubo Vol, (mL) Concentración Abs a 660 nm 20 0,53 0,477

mg/mL

30 0,442 0,87
B 0 0 0
Tabla 11. Datos obtenidos de absorbancia para el BE Y TR.
1 0,1 0,0008 0,09

Lo primero que se hará es restar las absorbancias BS y cada

2 0,2 0,0016 0,19
uno de los BE, para obtener las absorbancia únicamente del
3 0,3 0,0024 0,285 fósforo inorgánico presente en cada una de las muestras.

4 0,4 0,0032 0,381 Luego se procede a hallar la diferencia entre TR y BE para

determinar la verdadera absorbancia que permite realizar el
5 0,5 0,004 0,467 cálculo de la concentración de fosfato en cada tiempo y así
concluir en que tiempo se genera un mayor rendimiento.
Tabla 10: concentraciones y absorbancia obtenida para curva de
calibración Nota: la absorbancia real = |Absorbancia de TR
-Absorbancia de BE|

Después de calculada la absorbancia real, se establece la

concentración de fosfato mediante la ecuación de la recta de
calibrado y después, se divide la concentración entre el tiempo
empleado para el experimento el cual es el mismo para todos
(10 minutos), esto se realiza con el fin de hallar la velocidad
de reacción.

Tiempo Absorbancia Concentración Vo

(min) Real (mg/mL)

Gráfica 2. Curva patrón para el fósforo inorgánico a 660 nm.​ 2 0,054 0,000461173 4,6117E-05

La curva de calibración del fosfato inorgánico se realizó con el 5 0,108 0,000918956 9,1896E-05
fin de calcular las concentraciones iniciales de la enzima y el
sustrato, esto debido a que se parte de muestras patrón o 10 0,136 0,001156324 0,00011563

estándar (en este caso realizamos 5 soluciones patrón con

15 0,007 6,27331E-05 6,2733E-06
diferentes concentraciones del patrón de fosfato), se mide la
absorbancia de cada muestra y sabiendo que la absorbancia es 20 -0,05 -0,000420482 -4,2048E-05
proporcional a la concentración de fosfato inorgánico se puede
usar la ecuación de la recta de calibrado ( y=117,96x - 0,0004) 30 0,431 0,003657172 0,00036572

5
Tabla 12. Cálculo del tiempo óptimo de incubación​.

Gráfica 4. Determinación efecto de la concentración de la enzima

Gráfica 3. Tiempo óptimo de incubación.​
Tras analizar la gráfica se puede determinar el efecto de la
Debido a la carencia de sentido de algunos puntos mostrados concentración de la enzima, siendo esta de tipo proporcional,
en la gráfica se decide rechazar dichos datos, al aumentar la concentración de la enzima la velocidad
consecuentemente se tienen en cuenta solo los primeros cuatro también aumenta, esto gracias a que a medida que aumenta la
datos, tras analizar estos datos se obtiene como tiempo óptimo concentración de la enzima hay mayor disponibilidad de
de incubación un tiempo de 10 minutos, puesto que a este fosfatasa ácida que puede reaccionar con el sustrato.
tiempo se presenta la mayor concentración de fosfato. Es decir (Universidad de Texas)
que en este tiempo se presenta la mayor actividad enzimática.
Determinación del pH óptimo
Al analizar más detalladamente la gráfica nos podemos dar
Para la determinación de la concentración de cada solución, se
cuenta que antes de los 10 minutos la concentración de fosfato
mide la absorbancia de cada solución con un medio de pH
va aumentando, pero después de los 10 minutos la
distinto y se reemplaza en la ecuación resultante tras realizar
concentración empieza a disminuir; esto se debe a que a
la recta de calibrado, arrojando los siguientes resultados:
mayor tiempo de incubación se va perdiendo la actividad
enzimática.
Tub pH Abs Abs [s] ​(mg/mL)
o Corregida
Contracción de la enzima:
BS 5.3 0,006 0 0
Tubo Enzima Abs Abs [s] Vo [Enzima]
(µl) Corregida (​ mg/mL) (mg/mL) BE 5.3 0,647 0 0

BS 0 0,008 0 0 0 0 1 3.0 0,584 -0,069 -0,000581553

BE 50 0,11 0 0 0 0
2 4.0 0,667 0,014 0,000122075

1 50 0,148 0,03 0,0002577 2,57714 0,025

3 5.0 0,693 0,04 0,000342489
14 E-05

2 100 0,291 0,173 0,0014699 0,00014 0,05 4 5.3 0,768 0,115 0,000978298
9 6999
5 5.6 0,706 0,053 0,000452696
3 150 0,503 0,385 0,0032672 0,00032 0,075
09 6721 6 6.2 0,762 0,109 0,000927433

4 300 0,853 0,735 0,0062343 0,00062 0,15 Tabla 14. pH óptimo.

17 3432

Es necesario restar la absorbancia del BS (Blanco sustrato)

5 400 1,047 0,929 0,0078789 0,00078 0,2
42 7894 como la del BE (Blanco enzima), esto con el fin de obtener la
absorbancia del fosfato; después se utiliza la curva de
Tabla 13. Concentración de la enzima
calibración para determinar la concentración y mediante esta,
la velocidad.

6
 Tabla 15. Concentración a distintas temperaturas.

Gráfica 5. Determinación del pH óptimo. Gráfica 6. Velocidad de reacción a distintas temperaturas​.

Debido a lo incoherente del primer dato, este se descarta y se Teniendo en cuenta la gráfica anterior la temperatura a la cual
plantea como pH óptimo para la reacción un valor de pH= 4, se presenta la mayor velocidad es una temperatura de 60°C,
teniendo en cuenta que a este pH se presenta la mayor gracias a esto esta temperatura es nuestra temperatura óptima,
velocidad y consecuentemente la mayor actividad enzimática. ya que representa la mayor actividad enzimática; además de
Teóricamente se encontró que la fosfatasa ácida tiene un pH esto hay que tener en cuenta que la relación entre la
óptimo entre 4.0-5.5. (Department of Chemistry, Chelsea temperatura y la actividad enzimática es directamente
College of Science and Technology) proporcional, lo que quiere decir que al aumentar una la otra
necesariamente también tiene que aumentar.
Teniendo en cuenta lo registrado teóricamente la máxima
actividad enzimática de la fosfatasa ácida se encuentra entre La fosfatasa ácida es una enzima, pero también es una proteína
un pH= 4.0-5.5, por lo tanto, el valor de pH determinado en el y las proteínas a temperaturas altas tienden a desnaturalizarse,
laboratorio es coherente con la teoría. disminuyendo así su actividad enzimática. Es por esto que al
llegar a la temperatura óptima, a medida que sigue
Temperatura óptima. aumentando la temperatura la velocidad de la reacción
empieza a disminuir.
Al igual que se ha venido haciendo, se restan los blancos, se
halla la concentración y se divide entre el tiempo de la
reacción. Después de esto se evalúa la velocidad con respecto La temperatura registrada por la teoría se encuentra entre los
a la temperatura. 30-37°C (GRISOLIA), en la grafica se puede ver que entre los
37-60°C se presenta la mayor actividad enzimática,entre estos
Tubo Tempe Abs Abs [s] ​(mg/mL) Vo dos puntos se desarrolla la reacción.
ratura Corregida
°C Efecto de la concentración del Sustrato y determinación de
la constante de Michaelis (Km)
BS 18 0,009 0 0 0

BE 18 0 0 0 0 Se conoce que, sí se tiene una cantidad fija de la enzima, la

velocidad de reacción aumenta proporcional a la
1 0 0,488 0,479 0,00406409 0,0004064 concentración de sustrato, la velocidad máxima de reacción
09
será alcanzada cuando la enzima se encuentre saturada por el
2 18 0,519 0,51 0,00432689 0,0004326
sustrato.
89

3 37 0,549 0,54 0,00458121 0,0004581

4 21
[S]1 v1 V2 [S]2
4 60 0,651 0,642 0,00544591 0,0005445
5 2,31439E-05 0,4 2,2 4,20797E-06
4 91

5 92 0,63 0,621 0,00526788 0,0005267 10 4,62877E-05 0,4 2,2 8,41595E-06

7 89

7
 20 9,25754E-05 0,4 2,2 1,68319E-05
Para tener mejor apreciación de los datos se grafica la inversa de
cada eje.
40 0,000185151 0,4 2,2 3,36638E-05

60 0,000277726 0,4 2,2 5,04957E-05

80 0,000370302 0,4 2,2 6,73276E-05

100 0,000462877 0,4 2,2 8,41595E-05

100 0,000462877 0,8 2,2 0,000168319

Tabla 17. Concentración real del inhibidor.

Tubo Concentraci Absorbancia Concentración V0

ón del de fosfato
sustrato Gráfica 8. Inversas
(mg/ml)

1 4,21E-06 0,382 0,003241777 0,000324178 Al linealizar la gráfica anterior, se sabe que el intercepto con
el eje es 1 dividido la velocidad máxima, como se ve en la
2 8,41595E-06 0,38 0,003224822 0,000322482 gráfica es de 2651,6, al sacar su inversa determinamos que la
Vmax es igual a 3,77130 x10-4; siguiendo el mismo
3 1,68319E-05 0,409 0,003470668 0,000347067 procedimiento para hallar Km extrayendola de la pendiente, se
obtiene 8.674 x10-​7.​
4 3,36638E-05 0,395 0,003351984 0,000335198
Efecto del inhibidor.
5 5,04957E-05 0,425 0,003606307 0,000360631
Para este procedimiento se utilizó MgCl2, de igual forma que
en el de concentración de sustrato se restan los blancos BE y
6 6,73276E-05 0,498 0,004225161 0,000422516 BS a las absorbancias de cada muestra con inhibidor.También
es necesario tener los datos del item anterior así que se
7 8,41595E-05 0,451 0,003826721 0,000382672 graficaron las dos velocidades contra la concentración de
sustrato; una sin y otra con inhibidor, para después calcular el
8 0,000168319 0,458 0,003886063 0,000388606 Km y el Vmax y determinar qué clase de inhibición es
(competitiva, no competitiva o mixta).
Tabla 16. Cálculo de las Velocidades.
Concentració Concentrac V0 sin Absor Concentra V0 con
n del sustrato ión inhibido bancia ción inhibidor
(mg/ml) de fosfato r de fosfato
sin con inhibi
inhibidor

4,21E-06 0,382 0,00324 0,419 0,003552 0,0003553

1777 5

8,41595E-06 0,38 0,00322 0,439 0,003719 0,0003719

4822

1,68319E-05 0,409 0,00347 0,464 0,003927 0,0003928

0668 9

Gráfica 1 7. [s] vs Vo 3,36638E-05 0,395 0,00335 0,549 0,004638 0,0004638

1984 5

8
 5,04957E-05 0,425 0,00360 0,501 0,004237 0,0004237 óptimo debe estar entre 5.4 y 5.8, no sobrepasar los 5
6307 2 min de la preparación enzimática, y manejar la
preparación con enzima en exceso. De este modo, se
6,73276E-05 0,498 0,00422 0,507 0,004287 0,0004287 garantiza un buen desempeño de la actividad
5161 4
enzimática para la reacción fosfatasa-glicerofosfato
8,41595E-05 0,451 0,00382 0,656 0,005532 0,0005533 de sodio.
6721 9 ● Se establece una Inhibición irreversible
● Es evidente como la temperatura es un factor esencial
0,000168319 0,458 0,00388 0,514 0,004345 0,0004346 en el comportamiento de una enzima y entre mayor
6063 9
temperatura, menor actividad debido a su
Tabla 18. Cálculo de las Velocidades. desnaturalización pero también a bajas temperaturas
su desempeño es limitado​.
● El pH óptimo para este tipo de reacción es de carácter
ácido, al momento en que aumenta el pH y se
convierte en un medio alcalino, la reacción tiende a
inhibirse y el producto no es el deseado.

Cuestionario.

1. ​¿Mediante qué código se identifica la fosfatasa

ácida y qué indica cada número? R/ EC 3.1.3.2

● 3, este indica que le enzima corresponde al grupo de

Gráfica 9. concentración de sustrato vs velocidad de reacción, con y
sin inhibición.
Debido a que no es evidente el comportamiento de las
gráficas, se trata de linealizar para tener un comportamiento
más oportuno para su análisis.
de trigo?
las hidrolasas.
● 1, es un indicativo de que la enzima lleva a cabo la
hidrólisis sobre un enlace tipo éster.
● 3, Indica que la hidrólisis se lleva a cabo en ésteres de
monofosfato.
● 2, este es el número que le corresponde a la fosfatasa
ácida.
2. ​¿Cómo podría purificar la fosfatasa ácida del germen

Se puede adicionar una cierta cantidad de en solución el cual

va actuar como cofactor de la enzima y permitirá que
actividad de la misma sea alta durante todo el proceso,lo cual
cobra importancia a la hora de hacer la reacción y medir la
cantidad de fosfato liberado

3.​ ​ ¿Cómo se define la unidad de actividad?

La unidad de actividad se define como la cantidad de sustrato

transformado, y es utilizada para medir la eficiencia de la
enzima.

4. ¿En qué condiciones se logra la mejor extracción de la

Gráfica 10. Gráfica linealizada de concentración de sustrato vs fosfatasa ácida de levadura?
velocidad de reacción, con y sin inhibición.
Mantener un pH de 8 y agregar tolueno la cual mejora la
Conclusiones. extracción a 37°C

● En primer lugar, se concluyen las variables óptimas a 5. Para la fosfatasa ácida de levadura en qué condiciones
tener en cuenta para la reacción de la fosfatasa, así la se logra la máxima estabilidad en soluciones de etanol?
temperatura óptima ronda los 47 – 53 °C, el pH
9
Temperatura aproximada a los 0°C o menos, con unos valores
de pH entre 7-8,5.

6. ​¿Cuál es la constante de sedimentación de la

enzima de levadura purificada?

1.4 Svedberg.

7. ​¿Cuáles son las características de estabilidad térmica

de la fosfatasa ácida de levadura y las características de
inactivación por agitación?

La enzima presenta diferente estabilidad a una temperatura

relativamente alta (50°C), dependiendo del pH

Referencias
Department of Chemistry, Chelsea College of Science and
Technology. (s.f.). ​Isolation of Three Acid Phosphatases from
Wheat Germ ​. Londres, Inglaterra: Chelsea College of Science
and Technology.

Emilio Gija, M. S. (12 de 2007). Scielo. ​Mecanismo de acción

de las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular ​. Lima, Perú:
Scielo.

GRISOLIA, B. K. (n.d.). THE JOURNAL OF BIOLOQICAL

CHEMISTRY. ​Purification and Properties of a Nonspecific
Acid Phosphatase​. Kansas , Estados unidos : Mcllvain
Laboratories, Department of Medicine.

Mañas, J. M. (s.f.). ​Universidad del País Vasco.​ Obtenido de

Universidad del País Vasco:

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.ht

The extraction and purification of wheat germ acid

phosphatase. (n.d.).

T Palmer, P. L. (2007). En P. L. T Palmer, ​Enzymes:

Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry​ (pág. 2).
Elsevier.

Universidad de Texas. (n.d.). The journal of Biological

Chemistry. ​Substrate Selectivity in the Action of Alkaline​.
Texas, Estados Unidos : Department of Biochemistry and
Biophysics.

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