MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS ALIMENTARIOS.

VENTAJAS Y
LIMITACIONES

Vidal N.P., Yusta A.M., Manzanos M.J., Goicoechea E., Guillén M.D.*

Tecnología de los Alimentos. Facultad de Farmacia. Centro de Investigación Lascaray.

Universidad del País Vasco (UPV/EHU). Paseo de la Universidad 7, 01006 Vitoria
*E-mail: mariadolores.guillen@ehu.es

Palabras clave:
Matrices alimentarias; Bligh & Dyer; disulfuro de carbono; RMN de 1H

RESUMEN

Los lípidos alimentarios son una familia muy heterogénea de compuestos que cumplen
funciones muy importantes en los alimentos. Presentan como característica común su
hidrofobicidad y se suelen definir como los compuestos que se disuelven en disolventes
orgánicos. Este grupo de compuestos, además de contribuir a las propiedades organolépticas
(aroma, textura) de los alimentos, tiene gran influencia en sus propiedades nutritivas y a
veces también en su seguridad. Es por ello que el estudio cualitativo y cuantitativo de los
lípidos de los alimentos es imprescindible para conocer la calidad y seguridad de éstos. El
primer paso para su estudio exige su extracción de la matriz alimentaria. Se han propuesto
diferentes métodos de extracción basados en el empleo de mezclas de disolventes orgánicos
de diferente polaridad. En la mayoría de los estudios de alimentos se siguen empleando los
métodos propuestos por Folch et al. (1957) y por Bligh & Dyer (1959). En este trabajo se
compara el método de Bligh & Dyer con otro que emplea disulfuro de carbono en la
extracción de lípidos de origen animal; esta comparación se refiere no sólo a las
características del método, sino también al rendimiento de extracción y a la
representatividad de los lípidos extraídos en relación a los contenidos en el alimento. La
caracterización de los lípidos extraídos se llevó a cabo mediante Resonancia Magnética
Nuclear de Protón (RMN de 1H). Asimismo, se comentan las ventajas y limitaciones de ambos
métodos.

INTRODUCCIÓN

Para llevar a cabo la extracción de lípidos de matrices alimentarias se han propuesto diversos
métodos, la mayoría basados en el uso de mezclas de disolventes orgánicos de diferente
polaridad. Los más usados son los de Folch et al. (1957) y Bligh & Dyer (1959), en los que
se emplea una mezcla de cloroformo, metanol y agua. Puede decirse que en las últimas cinco
décadas el método Bligh & Dyer (1959) ha sido el más utilizado para la extracción de lípidos
de muestras de pescado y de alimentos variados (Iverson et al, 2001; Manirakiza et al,
2001). Sin embargo, estos métodos son muy laboriosos, requieren mucho tiempo para
eliminar los disolventes y a veces presentan problemas de reproducibilidad.
Asimismo y dado que los disolventes cloroformo y metanol tienen cierta toxicidad (Potts &
Johnson, 1952; Weisburger, 1977), se han propuesto otros métodos que emplean
disolventes menos tóxicos o libres de toxicidad, tales como: hexano, isopropanol y agua
(Hara & Radin, 1978); heptano, etanol y agua (Burton et al, 1985); y hexano, acetona y
agua (Honeycutt et al, 1995).
En este contexto, en este estudio se compara el método clásico de Bligh & Dyer con otro que
emplea disulfuro de carbono (CS2) y hace uso de ultrasonidos para la extracción de los
lípidos de algunas matrices alimentarias de origen animal; esta comparación se refiere no
sólo a las características del método, sino también al rendimiento de extracción, a la
representatividad de los lípidos extraídos en relación a los contenidos en el alimento y a los
efectos degradativos que el método de extracción puede provocar en los lípidos objeto de
estudio.
MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras

Las matrices de origen animal empleadas en este estudio fueron tejido adiposo de cerdo y
lubina cultivada que poseen una composición lipídica muy diferente. Las muestras de tejido
adiposo de cerdo (n=6), denominadas T1-T6, y las muestras de lubina (n=6), denominadas
L1-L6, fueron adquiridas en supermercados locales. La piel del tejido adiposo de cerdo fue
eliminada por completo. Las lubinas fueron evisceradas, lavadas, fileteadas y peladas.

Extracción de lípidos

La extracción de los lípidos de las diferentes muestras (n=12) se realizó mediante dos
métodos: el método clásico de Bligh & Dyer (1959) (B&D) y otro basado en el empleo de
disulfuro de carbono (CS2) que hace uso de ultrasonidos; este último se ha venido utilizando
en algunos estudios previos (Guillén & Ruiz, 2004; Vidal et al, 2012). La extracción de lípidos
mediante cada uno de los dos métodos se realizó por duplicado en todos los casos.

Adquisición del espectro de Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN de 1H)

Los lípidos extraídos se caracterizaron mediante la información obtenida de su espectro de

RMN de 1H. Los espectros se obtuvieron en un espectrómetro Bruker Avance 400 operando
a 400 MHz. La preparación de la muestra se realizó como en estudios previos y lo mismo
puede decirse en relación a los parámetros de adquisición del espectro (Guillén et al, 2004;
2008). Tanto los porcentajes molares de ciertos grupos acilo, como la concentración de
colesterol y fosfatidilcolina se determinaron utilizando aproximaciones desarrolladas
previamente (Guillén et al, 2008; Guillén & Uriarte, 2012; Vidal et al, 2012). Cada muestra
fue analizada por duplicado.

Análisis estadístico

El análisis del grado de significación estadística de las diferencias encontradas en los

parámetros de composición obtenidos por RMN de 1H de los lípidos extraídos mediante
ambos métodos fue realizado mediante el test t de Student con un nivel de confianza del 95
% (p<0.05). Para realizar este análisis estadístico se empleó el paquete Statgraphics Plus
(versión 5.1). Las diferencias de los datos mostrados en la Tabla 1, señalados con letras
distintas, son estadísticamente significativas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Aspectos metodológicos

Como se ha mencionado anteriormente, a pesar de ser ampliamente utilizado, el método

B&D presenta ciertos inconvenientes. Entre ellos cabe destacar por un lado, que se trata de
un método largo, que implica numerosas etapas, lo cual provoca que gran parte del éxito y
repetibilidad de los resultados recaiga en la pericia del personal que lo realiza, y por otro,
que se emplean elevados volúmenes de disolventes (por cada 20 g de muestra 60 ml de
cloroformo, 40 ml de metanol y 20 ml de agua, mientras que en el método alternativo aquí
propuesto por cada 20 g de muestra se emplean sólo 40 ml de CS2). El empleo de tanta
cantidad de disolventes, además de ser poco recomendable desde el punto de vista
medioambiental, complica el proceso de extracción, ya que se necesita más tiempo para
poder eliminar todos los restos de disolventes.
Por todo ello el método de extracción aquí propuesto basado en el empleo de disulfuro de
carbono podría resultar una alternativa interesante, ya que al implicar menos etapas es
mucho más rápido y sencillo; además, utiliza un volumen de disolvente tres veces menor (40
ml vs. 120 ml) que el de B&D, lo cual facilita su posterior eliminación, que por otra parte es
sencilla debido al bajo punto de ebullición del disolvente. A estas ventajas se suman otras,
como que no se generan señales en RMN de 1H.

2. Rendimientos de extracción

La Tabla 1 muestra los rendimientos promedio de extracción de lípidos, expresados en peso

húmedo (g/100 g), obtenidos a partir de las muestras de tejido adiposo de cerdo (n=6) y
lubina (n=6) mediante los métodos B&D y CS2. En ambos tipos de muestras los rendimientos
obtenidos son significativamente diferentes para cada uno de los métodos empleados.
Extracción de los lípidos de tejido adiposo de cerdo. Los rendimientos de extracción de
las muestras de tejido adiposo (T1-T6) empleando el método B&D (66,6±7,9 %) son
significativamente menores a los obtenidos por el método que emplea CS2 (79,7±1,7 %).
Estos resultados ponen de manifiesto que para este tipo de matriz lipídica el segundo método
tiene mayor capacidad extractiva que el primero y refuerzan los resultados de estudios
previos, referidos a extracción de lípidos en carne y derivados cárnicos, en los que también
se ha evidenciado que el método B&D subestima el contenido total de lípidos en muestras de
alto contenido graso (Pérez-Palacios et al, 2008) o lo que es lo mismo, que este método no
tiene capacidad para extraer todos los lípidos presentes en la matriz objeto de estudio.
Esto podría ser debido a que en este tipo de matriz la cantidad de lípidos es muy elevada y
además se trata fundamentalmente de lípidos no polares cuya extracción sería quizá más
eficiente con el empleo de disolventes de muy baja polaridad o no polares.
Por otra parte se observa que aunque se han tomado para extraer muestras similares en
todos los casos, la desviación entre muestras en el caso del método de B&D es muy superior
a la que se ha obtenido empleando CS2; esto indica que el segundo método proporciona una
reproducibilidad mayor que el primero en este tipo de matriz.

Tabla 1. Rendimientos promedio de extracción de

lípidos, expresados como porcentaje en peso húmedo
(%), de las muestras de tejido adiposo de cerdo (T) y
de lubina (L), obtenidos mediante los métodos Bligh &
Dyer (B&D) y empleando CS2.

Muestras B&D (%) CS2 (%)

Tejido adiposo (T1-T6) 66,6±7,9a 79,7±1,7b
Lubina (L1-L6) 8,1±2,6a 5,1±1,6b
Datos con letra diferente en la misma fila son significativamente
diferentes (p<0.05).

Extracción de los lípidos de lubina. Por el contrario, los rendimientos de extracción

obtenidos de las muestras de lubina por el método B&D son significativamente mayores
(8,1±2,6 %) que los obtenidos empleando CS2 (5,1±1,6 %). A este resultado pueden
contribuir diferentes factores.
Por una parte y aunque la lubina cultivada tiene un contenido mucho más alto en lípidos que
la lubina salvaje, su contenido en lípidos es mucho más bajo que en el tejido adiposo de
cerdo; algunos autores cifran el porcentaje de lípidos en lubina cultivada en un intervalo
entre 5 y 10% (Alasavar et al, 2002; Fuentes et al, 2010) en concordancia con los resultados
obtenidos en este estudio por cualquiera de los dos métodos. Debido a que el contenido en
lípidos en lubina es muy inferior al contenido del tejido adiposo de cerdo, sería de esperar
que el método de B&D fuera más eficiente en la extracción de los primeros; sin embargo,
algunos autores indican que en muestras de pescado el método de B&D se considera
adecuado cuando el porcentaje de lípidos es menor del 2% (Iverson et al, 2001) y no es este
el caso.
Por otra parte, la naturaleza de los lípidos de lubina cultivada es muy diferente de la
naturaleza de los lípidos de tejido adiposo de cerdo, siendo los primeros más polares y ricos
en fosfolípidos (Mannina et al, 2008; Vidal et al, 2012); debido a esto, los disolventes
empleados en el método B&D podrían mostrar una mayor eficiencia en la extracción de estos
lípidos que el CS2, lo que podría explicar el mayor rendimiento obtenido mediante el método
B&D.
Sin embargo, también hay que tener en cuenta que la dificultad para eliminar totalmente los
disolventes en el método de B&D de los extractos de matrices pobres en lípidos, como es el
caso, puede conducir a una sobreestimación del rendimiento de extracción y podría explicar
en parte el resultado obtenido.
Por último, únicamente queda comentar que, al igual que en la extracción de tejido adiposo
de cerdo, en la extracción de lubina cultivada se observa mayor variación en los
rendimientos obtenidos con el método B&D que empleando CS2, lo que podría interpretarse
como que el segundo método proporciona una reproducibilidad mayor que el primero
también en esta matriz.

3. Representatividad de los lípidos extraídos

Con objeto de tener información sobre la naturaleza de los lípidos extraídos por ambos
métodos en las dos matrices estudiadas, éstos se estudiaron mediante Resonancia Magnética
Nuclear de Protón (RMN de 1H). En las Figuras 1-3 se recogen los valores promedio de los
porcentajes molares de los principales grupos acilo y la concentración de colesterol y
fosfolípidos en los lípidos extraídos de tejido adiposo de cerdo y de lubina mediante ambos
métodos. Estos datos han sido obtenidos a partir de sus espectros de RMN de 1H. Esta
determinación se realizó tal y como se ha descrito en estudios previos (Guillén et al, 2008;
Guillén & Uriarte 2012; Vidal et al, 2012).
Lípidos extraídos por ambos métodos del tejido adiposo de cerdo. Los espectros de
RMN de 1H de los lípidos obtenidos por ambos métodos son muy similares, lo que indica que
cualquiera de ellos proporciona extractos representativos del conjunto de lípidos del tejido
adiposo. A la misma conclusión se llega tras la determinación cuantitativa de los porcentajes
molares de los distintos tipos de grupos acilo de los lípidos extraídos que se ha representado
en la Figura 1a.

Figura 1. a) Porcentajes molares promedio y desviaciones estándar, determinados mediante

RMN de 1H, de los grupos acilo de los lípidos de tejido adiposo de cerdo extraídos mediante el
método de B&D y empleando CS2. L: Linoleico; MU: Monoinsaturados; S: Saturados; Ln:
Linolénico. b) Contenido promedio de colesterol expresado en mmol/mol de triglicérido,
determinado mediante RMN de 1H, en los lípidos de tejido adiposo de cerdo mediante el método
de B&D y empleando CS2. TG: triglicérido.

Puede observarse que las proporciones molares de los distintos tipos de grupos acilo de los
extractos obtenidos por ambos métodos son muy parecidas y están también en total
concordancia con los resultados de otros autores que han estudiado este tipo de matrices
empleando otros métodos (Monziols et al, 2007). Aunque la eficiencia en la extracción
empleando CS2 es superior a la del método B&D, la determinación de porcentajes molares no
viene afectada por el rendimiento de la extracción.
En la Figura 1b se muestra el contenido en colesterol, expresado en mmol/mol de
triglicérido, de los lípidos extraídos por ambos métodos, observándose que apenas existe
diferencia entre las concentraciones encontradas en ambos extractos.
Asimismo, se aplicó el test t de Student, para analizar si existían diferencias significativas
entre los datos que caracterizan a los lípidos obtenidos por ambos métodos con resultados
negativos reiterando lo ya comentado, es decir, que los lípidos extraídos del tejido adiposo
de cerdo con cualquiera de los dos métodos son representativos del conjunto de lípidos
contenidos en esta matriz aunque el rendimiento de extracción sea diferente con ambos
métodos. De hecho hay que señalar que las desviaciones en los resultados promedio
obtenidos por ambos métodos son menores que las desviaciones entre muestras dentro del
mismo método.
Lípidos extraídos por ambos métodos de lubina cultivada. En este caso aunque los
espectros de RMN de 1H de los lípidos obtenidos por ambos métodos son muy similares, una
ampliación de los mismos permite observar algunas diferencias que se aprecian en las
determinaciones que se comentan a continuación.

Figura 2. a) Porcentajes molares promedio y desviaciones estándar, determinados mediante RMN de

1
H, de los principales grupos acilo de los lípidos de lubina cultivada extraídos mediante el método de
B&D y empleando CS2. ω-3: Omega-3; Di-ω6: Diinsaturados Omega-6; S: Saturados. b) Contenido
promedio de colesterol expresado en mmol/mol de triglicérido, determinado mediante RMN de 1H, en los
lípidos de lubina cultivada mediante el método de B&D y empleando CS2. (TG: triglicérido).

Tal y como se observa en la Figura 2a los valores promedio de los porcentajes molares de
algunos de los principales grupos acilo presentes en los lípidos extraídos por ambos métodos
son muy parecidos; de hecho las desviaciones en los resultados promedio obtenidos por
ambos métodos son menores que las desviaciones entre muestras dentro del mismo método.
Asimismo, el test t de Student no encuentra diferencias significativas entre los resultados
obtenidos por ambos métodos.

Figura 3. Concentración de fosfatidilcolina expresada en mmol/L de aceite, determinada mediante RMN

de 1H de los lípidos de lubina obtenidos mediante B&D y empleando CS2.

Sin embargo, sí se observaron diferencias en cuanto a la concentración de componentes

minoritarios presentes en los lípidos de lubina extraídos por ambos métodos. Como se puede
observar en la Figura 2b, se encontraron concentraciones significativamente superiores de
colesterol en los extractos obtenidos mediante el método B&D que en los obtenidos mediante
CS2.
También se encontraron concentraciones significativamente superiores de fosfatidilcolina,
como se puede observar en la Figura 3, en los extractos obtenidos mediante el método
B&D. La diferente eficiencia de ambos métodos para extraer estos componentes minoritarios
se puede deber a la polaridad de los disolventes empleados en ambos métodos.
En resumen, independientemente de los rendimientos de extracción, ambos métodos extraen
lípidos representativos del conjunto de lípidos de cada matriz. Sin embargo hay que señalar
que el método de B&D es más eficiente en la extracción de los lípidos minoritarios de lubina
que el que emplea CS2, aunque éste ultimo también es capaz de extraer esos compuestos si
bien en una proporción inferior.

4. Capacidad de ambos métodos para degradar por oxidación las muestras objeto
de extracción

Hay que destacar que algunos extractos de lípidos de lubina obtenidos mediante el método
de B&D contienen presumiblemente hidroperóxidos.
Este hecho se puso de manifiesto por la aparición en el espectro de RMN de 1H de estos
lípidos de una señal centrada a 8.7 ppm asignable a grupos hidroperóxido (-OOH) de
compuestos primarios de oxidación (Guillén & Ruiz, 2005).
En la Figura 4 se muestra la citada región de los espectros de los lípidos extraídos de la
misma lubina mediante ambos métodos. Puede observarse que la señal a 8,7 ppm solamente
está presente en el espectro de los lípidos extraídos mediante el método de B&D. Esto indica
que el proceso de extracción de B&D puede provocar la oxidación de los lípidos de lubina,
que por otra parte son muy susceptibles de sufrir oxidación. Este hecho ha sido también
observado en estudios previos por otros autores (Undeland et a, 1998). En cambio, en
ninguno de los espectros de los extractos lipídicos de lubina obtenidos mediante el empleo de
CS2 se detectó esta señal, de lo que se infiere que este segundo método no provoca
degradaciones oxidativas.

Figura 4. Región comprendida entre 8.3 y 9.3 ppm del espectro de RMN de 1H de los extractos lipídicos
de la muestra de lubina L1, obtenidos mediante los métodos B&D (L1BD) y empleando CS2 (L1CS).

CONCLUSIONES

El rendimiento de extracción de lípidos de matrices alimentarias ricas en lípidos no polares es

superior cuando se emplea el método que usa disulfuro de carbono que cuando se usa el
método clásico de Bligh & Dyer. Sin embargo el rendimiento obtenido por este último método
es superior al primero en la extracción de lípidos con polaridad intermedia o alta presentes
en matrices con bajo contenido en lípidos.
Independientemente de los rendimientos de extracción, los porcentajes molares de los
grupos acilo de los lípidos, extraídos con ambos métodos, de las dos matrices estudiadas y
determinados a partir de sus espectros de RMN de 1H, son muy parecidos, lo que significa
que estos lípidos son representativos del conjunto.
Sin embargo, el rendimiento de extracción de colesterol y de fosfatidilcolina es superior con
el método de Bligh & Dyer que con el que emplea disulfuro de carbono.
No obstante, hay que destacar que el método de extracción Bligh & Dyer puede provocar la
oxidación de los lípidos extraídos cuando se trata de lípidos susceptibles de sufrir este
proceso.
En definitiva, el método de extracción de lípidos que emplea disulfuro de carbono es más
sencillo, rápido y práctico que el de Bligh & Dyer y se considera de gran interés
especialmente para muestras alimentarias ricas en lípidos y para todas aquellas cuyos lípidos
se oxidan con facilidad.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (MCINN, AGL2009-
09904), por el Gobierno Vasco (EJ-GV, GIC10/IT-463-10) y por la Universidad el País Vasco
(UPV/EHU, UFI-11/21- Calidad y Seguridad Alimentaria). A.M. Yusta y N.P. Vidal agradecen
al EJ-GV y MICINN respectivamente la concesión de una beca predoctoral.

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