UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

ESCUELA DE POST GRADO: MAESTRIA EN

GANADERIA ANDINA
ESPECIALIDAD DE REPRODUCCION ANIMAL

PERFIL DE PROYECTO DE INVESTIGACION

I. DATOS BASICOS DEL PROYECTO

1.1. TITULO: EFECTO DEL ANTIOXIDANTE Y LA ADICION DE GLICEROL A

DIFERENTES TEMPERATURAS SOBRE LA
CRIOPRESERVACION DEL SEMEN DE ALPACA (Vicugna pacos)

1.2. Ejecutor : Julio Cesar Vilca Mamani

1.3. Resumen

La criopreservación de semen y la utilización del semen congelado mediante la

inseminación artificial (I.A.) ha causado un gran impacto sobre la reproducción animal, ya
que mediante la criopreservación es posible detener el proceso que sufre el espermatozoide
desde la eyaculación hasta la fecundación y conservarlo en el tiempo potencialmente fértil,
sin embargo, en camélidos sudamericanos aun no se tiene un protocolo ideal que nos
permita utilizar esta tecnología a gran escala. Es por ello que el objetivo del trabajo es
evaluar el efecto de la adición de antioxidantes y la adición de glicerol a diferentes
temperaturas, sobre la motilidad, viabilidad y fertilidad de semen de alpaca criopreservado,
así como la influencia de la concentración espermática en la criopreservación de semen. El
trabajo se realizara en el Laboratorio de Reproducción del CIP Chuquibambilla, ubicado en
el distrito de Umachiri, provincia de Melgar, de la región Puno. Donde en el experimento
1. Se evaluara la motilidad y viabilidad del semen congelado a diferentes concentraciones
(20 y 30 millones), y al obtener la concentración ideal, se realizara el experimento 2.
Donde se evaluara la adición de antioxidantes en el diluyente, y el efecto de la adición del
glicerol a diferentes temperaturas (22º C o 5º C). Y en el experimento 3. Se realizara la
prueba de campo mediante la inseminación artificial de 100 alpacas con semen
criopreservado de acuerdo al experimento 2, además de ello se avaluara la influencia de la
temperatura de descongelado de las pajillas (37º C en 30 seg. y 42º C en 20 seg.). Los
resultados de motilidad y viabilidad serán evaluados mediante el ANOVA y los resultados
de fertilidad serán evaluados mediante la prueba de Chi Cuadrado.

1
1.4. Director de Tesis:

1.5. Asesor (es):

1.6. Lugar de Ejecución:

El trabajo de investigación se realizara en el Mega-laboratorio de Reproducción de la

FMVZ de la UNA Puno, que se encuentra en el CIP Chuquibambilla, ubicado en el distrito
de Umachiri, Provincia de Melgar de la Región Puno.

1.7. Fecha de Inicio: Diciembre del 2008

1.8. Fecha de Finalización: Mayo del 2009

II. METODO DE LA INVESTIGACION

II.1. Planteamiento y definición del Problema

El mejoramiento genético de las alpacas es lento, debido a que las formas de

reproducción siguen siendo en forma tradicional, donde las diferentes unidades alpaqueras
no realizan un manejo técnico adecuado por cuanto los productores no cuentan con
reproductores de buena calidad genética debido al alto costo de los mismos y por ello no
renuevan su rebaño, es por ello que la tasa de consanguinidad es del 30.45% (Bustinza, V.
2001). Siendo esta una limitante que influye en los niveles productivos y reproductivos de
la alpaca, lo que nos lleva al engrosamiento de la fibra, debido a que el 80% de las alpacas
son híbridos (Wheeler, J. 2001). Es por ello que existe la necesidad de lograr un rápido
mejoramiento genético de las alpacas mediante la utilización de la biotecnología, como la
Inseminación Artificial, sin embargo, en camélidos sudamericanos hasta la fecha se tiene
problemas con esta técnica. Y uno de los problemas que se tiene es en la colección del
semen, debido a que el tiempo de copula en la alpacas es en promedio de 15 minutos y
además de ello, el semen es susceptible al shok térmico que hace que exista una mayor
mortalidad. Otro problema que se tiene es que el semen de las alpacas es muy viscoso,
dificultando así su manipulación. Así mismo existen problemas en la inseminación
artificial propiamente dicha, debido a que la ovulación de las alpacas es inducida
(Bustinza, V. 2001), y otro problema que se tiene es en la criopreservación del semen,
debido a que la perdida espermática producida durante el proceso de criopreservación es en

2
un 50% menos que el semen fresco, así como lo indica Hernández, P. y et al. (2001),
quienes además demuestran que el descongelamiento produce daño acrosomal en un 50%
de los espermatozoides y que la motilidad y viabilidad fue de 41.7% y 45.6%, siendo estos
menores al de semen fresco.
Actualmente, el empleo de semen congelado para la inseminación artificial en
alpacas esta en estudio, para mejorar la motilidad y viabilidad de los espermatozoides al
descongelado e incrementar la fertilidad en la Inseminación.

II.2. Objetivos

II.2.1. Objetivo General.

 Evaluar el efecto del antioxidante y la adición del glicerol a diferentes temperaturas

sobre la criopreservación del semen de alpaca.

II.2.2. Objetivo Específicos

 Determinar la concentración de espermatozoides (20 ó 30 millones) en la

criopreservación del semen de alpaca.
 Evaluar el efecto del antioxidante y la adición de glicerol a diferentes temperaturas
(22ºC y 5ºC), sobre la motilidad y viabilidad espermática del semen criopreservado
de alpaca.
 Evaluar el efecto de la temperatura de descongelación (37ºC/30 seg. y 42ºC/20
seg.) sobre fertilidad de alpacas inseminadas.

II.3. Justificación e Importancia

La inseminación Artificial es una herramienta muy útil para el mejoramiento genético

en las especies domesticas de interés productivo (Novoa, C. 1994), ya que nos permite
incrementar al máximo el rendimiento de los reproductores machos y de esta forma
acelerar el mejoramiento genético que se requiere con urgencia en las alpacas. Sin
embargo, la técnica de Inseminación artificial en alpacas no ha sido suficientemente
desarrollada, como para ser utilizada a mayor escala, pero algunos trabajos realizados con
semen fresco han demostrado obtener una aceptable tasa de gestación, es así que Bravo,
W. (2003) y Pérez, G. (1997), indican una tasa de fertilidad entre 25 y 32 %, por lo que
nos dan luces para seguir trabajando en esta tecnología. No obstante, la utilización del

3
semen fresco en programas de inseminación artificial en alpacas es limitado solo a algunos
productores que cuentan con instalaciones y reproductores de buena calidad, además de
ello, solo se aprovecha el semen durante la vida reproductiva de los machos. Por lo que es
necesario preservar el material genético de estos machos y una forma de ello es mediante
la criopreservación del semen, ya que es ampliamente reconocida las bondades de esta
técnica, que nos permite aprovechar al máximo el material genético de los animales, y
sobre todo que a esta tecnología pueden acceder un mayor numero de criadores que deseen
mejorar su hato alpaquero debido a que los costos son menores en relación a comprar un
reproductor, además nos permite crear bancos de semen, realizar el comercio e intercambio
de material genético (Segura, J y Montes, R. 2001).
Aunque se han implementado protocolos para la criopreservación, aun no se tienen
los ideales en la mayoría de los casos, es por ello que constantemente se modifican los
métodos de congelación, a fin de obtener mejores resultados en relación a la supervivencia
de los espermatozoides y la fertilidad del semen congelado, es así que en camélidos
sudamericanos, la metodología de la criopreservación no esta bien desarrollada, sin
embargo, Pérez, G. et al. (2006), indican que el uso del baffer tris, con 20% o 30% de
yema de huevo mas concentraciones del 2.5%, 5% o 7.5% de glicerol constituye un
protocolo nuevo para congelar espermatozoides procedentes del conducto deferente de
camélidos. Por su parte Pacheco, J. et al. (2006), menciona que encontró 13.55% de
fertilidad al diagnostico de preñez mediante ecografía y a los 22 días post inseminación
con semen criopreservado de los conductos deferentes, con una tasa de recuperación de
39.2% de viabilidad, a diferencia de Aller, J. et al (2003), quienes indican que la
criopreservación redujo significativamente los porcentajes de viabilidad y motilidad
espermática comparado con el semen fresco de llamas, indicando que esta porcentajes
fluctuó entre el 20 y 25% y obtuvo 7.9% de fertilidad.
Como se puede apreciar, hasta la fecha no existe un protocolo ideal para la
criopreservación de semen en camélidos, debido a que son diversos los factores que
afectan la sobrevivencia de los espermatozoides al congelado-descongelado, por ejemplo:
La metodología de congelado-descongelado, la concentración espermática en el diluyente,
el envasado, la composición del diluyente empleado, hasta la calidad del semen obtenido,
etc. (Stornelli, M. et al. 2005).
Una alternativa para superar el bajo numero de espermatozoides sobrevivientes al
descongelado es incrementando el número de espermatozoides al momento del congelado,
así como lo demuestra Nadir, S. et al. (1993), quienes al aumentar la dosis o concentración

4
de espermatozoides de 20 x 106 a 100 x 106, encuentra diferencia significativa entre la
dosis alta y la dosis baja, obteniendo resultados de 84% y 95% de fertilidad
respectivamente en porcinos. Esto es debido a que al existir un mayor número de
espermatozoides normales, aumenta la probabilidad de que los espermatozoides lleguen a
fecundar, de igual forma se puede mejorar la ferlidad al depositar el semen en el lugar mas
cercano al ovulo.
Es por ello que en el trabajo de investigación se incrementara el numero de
espermatozoides a congelar, de 20 millones de espermatozoides (Pacheco, J. et al. 2006) a
30 millones, y de esta forma la perdida espermática ocurrida durante la criopreservación
puede compensarse mediante la inseminación artificial de un gran numero de
espermatozoides en el lugar mas cercano a la ovulación. Ya que al colocar un número
mayor de espermatozoides totales, contaríamos con un mayor número de espermatozoides
viables que han sobrevivido luego de soportar el estrés ocurrido durante la congelación-
descongelación. Así mismo, la perdida de la motilidad y viabilidad espermática producida
durante el proceso de criopreservación podría ser consecuencia de la producción de
especies reactivas de oxigeno (ROS), las cuales poseen efectos tóxicos sobre las células
que comprometen su funcionalidad, sin embargo diferentes antioxidantes han sido usados
como parte de varios diluyentes y se ha verificado el efecto benéfico de los mismos, ya que
estos reducen la producción de ROS y la peroxidación lipidica durante la criopreservación
de semen. Es por ello, que se añadirá antioxidantes al diluyente durante el enfriamiento del
semen, así como también se evaluara el tiempo de descongelado de la pajillas en la
inseminación artificial.
De esta forma se pretende encontrar un protocolo para la criopreservación de semen,
para que nos permita utilizar esta tecnología en gran escala y a beneficio de los productores
alpaqueros.

II.4. Formulación de Hipótesis

 En la criopreservación, al existir un mayor número de espermatozoides normales,

aumenta la probabilidad de que los espermatozoides lleguen a fecundar; entonces al
incrementar la concentración de espermatozoides al momento de la
criopreservación se incrementara también el número de espermatozoides vivos al
descongelado.

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  Dado que la perdida de la motilidad y viabilidad espermática en la criopreservación
podría ser consecuencia de la producción de especies reactivas de oxigeno, y que
ello nos llevaría a una mala calidad del semen; Entonces es probable que la adición
de antioxidantes y del glicerol a los 5ºC incrementara la viabilidad y motilidad
espermática del semen.
 Dado que al descongelamiento del semen se produce daño acrosomal en un 50% de
los espermatozoides, y que esto signifique en una baja tasa de fertilidad; entonces
es probable que al descongelado rápido (42ºC en 20 s) se incremente la tasa de
fertilización de las alpacas.

II.5. Operacionalización de Variables

Variable Definición Conceptual Indicador Instrumento

Nº de espermatozoides
Numero de
contados en el
Concentración espermatozoides por Microscopio
hemocitometro de
milímetro cúbico
Neubauer
Numero de % de espermatozoides
Viabilidad Microscopio
espermatozoides vivos vivos y muertos
% de espermatozoides
Movimiento individual
Motilidad con motilidad Microscopio
de los espermatozoides
progresiva
Numero de hembras % de hembras que no
Fertilidad Ecógrafo
preñadas retornen al celo

II.6. Revisión de Literatura

II.6.1. Fisiología de la Fertilización.
Los espermatozoides son depositados en el tracto reproductivo de la hembra, ya sea
mediante monta natural o inseminación artificial, sufren una serie de cambios bioquímicos
y fisiológicos, en un proceso de preparación denominado capacitación. La capacitación es
un proceso reversible que implica la eliminación, migración y aparición de distintos
componentes de la membrana plasmática, la eliminación implica la remoción de las
glicoproteinas de la membrana plasmática adquiridas durante el paso por el epidídimo y el
contacto con el plasma seminal. Esta capacitación hace que el espermatozoide sea capaces
de fertilizar ovocitos maduros, ya que la aparición y mantenimiento de la hiperactividad de
la motilidad es importante para que el espermatozoide pueda penetrar al ovulo, es así que

6
Bedford, J. (1983), indica que la hiperactividad de la cola en conejos aumenta en 20
veces, los mismos indican que existe dos tipos de capacitación, siendo estas las de la cola y
del acrosoma.
Existen evidencias de que la capacitación es parte de un proceso oxidativo, ya que el
anion superoxido, el peroxido de hidrogeno y el oxido nítrico, a concentraciones
fisiológicas son considerados las especies reactivas mas importantes que participan en
reacciones de oxido-reducción en procesos biológicos, es por ello que Rodríguez, P. et al
(1998) indica que el oxido nitroso participa como inductor de la capacitación y de la
reacción acrosomal en espermatozoides bovinos criopreservados.
Gadea, J. et al. (1998), Mencionan que uno de los lugares de capacitación vendría a
ser el oviducto, en la parte del istmo que actúa como reservorio de espermatozoides al
adherirse estos a su epitelio; Esta unión de los espermatozoides con la célula ayuda a
mantener la viabilidad y la capacidad fertilizante, y de esta forma regula el numero de
espermatozoides que alcanzan al ovocito.
Travis, A. et al. (2004), Mencionan que durante la capacitación hay demanda de
energia, por lo que la glucosa es necesario para la capacitación y fertilización bajo
condiciones fisiológicas normales, ya que la concentración de glucosa tiene mayor efecto
en la unión del espermatozoide-ovulo para concentraciones de 1mM o mayor, además
indican que existe correlación positiva entre el aumento de la concentración de glucosa
durante la capacitación y el numero de espermatozoides en la zona pelucida.
Antes de que los espermatozoides establezcan un contacto físico requerido para la
fertilización, establecen un contacto químico a distancia (esperma-quimiotaxis), lo que se
define como el movimiento direccional de los espermatozoides, guiados por un gradiente
de concentraciones de moléculas atractantes, producidas por el ovocito o el micro ambiente
del ovulo. Aunque se desconoce la identidad de los atractantes presentes en el fluido
folicular. Giosalas, L. (1999), sugiere como posible candidato entre otros, a la
progesterona, por ser esta el principal esteroide de este fluido y que además continua
siendo secretado después de la ovulación. Además, indica que el fenómeno espermo-
quimiotactico no parece ser especifico de la especie, por lo que el atractante seria similar
para las distintas especies. Al mismo tiempo, indica que dado la compleja anatomía y
fisiología de las porciones del oviducto, es posible que el fenómeno quimiotactico ocurra
en forma secuencial donde distintos atractantes guíen al espermatozoide “paso a paso”
hacia el ovocito, este fenómeno podría ocurrir en la zona ampular del oviducto, mientras

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que el transporte entre el istmo oviductal y el sitio de fertilización podría ser mediado por
termotaxis.
La interacción entre el espermatozoide y el ovulo implica la unión del
espermatozoide con la capa extracelular del ovocito, pero antes, el espermatozoide es
sometido a la reacción acrosomal inducido por la interacción entre ligandos específicos de
la capa extracelular del ovocito y receptores de la superficie de los espermatozoides, siendo
la zona pelucida específicamente para inducir la reacción acrosomal en la fertilización.
Sien embargo, Bedford, J. (1983), indica que la zona pelucida no es necesario para que se
produzca la reacción acrosomal, si no que esta se produce cuando el espermatozoide ha
completado su capacitación e incluso en ausencia del ovulo. Además, menciona que el
inicio de la reacción acrosomal no requiere de estímulos, pero si de un nivel adecuado de
calcio y al mismo tiempo menciona que siempre hay una mínima sincronía de la reacción
acrosomal entre los espermatozoides de una misma población.
La membrana espermática se somete a una variedad de cambios biofísicos y
químicos en el epidídimo, en la capacitación y reacción acrosomal. (Saxena, D y
Toshimori, K. 2004), indican que después de la capacitación y reacción acrosomal, la
glucoproteina MC31 aparece en la cabeza y en el segmento ecuatorial del espermatozoide,
por lo que sugiere que esta glucoproteina facilita la interacción del espermatozoide y
ovulo, además menciona que esta glucoproteina MC31 fue encontrada en los flagelos de
los espermatozoides de la rata, a lo que sugiere que actúa en la dinámica molecular de esta.
La capacidad de los espermatozoides de mamíferos al pasar por la zona pelucida, a
sido atribuido a un conjunto de receptores en la superficie del espermatozoide y a proteasas
acrosomales con actividad tipo tripsina que se encuentra en el acrosoma del
espermatozoide, de las aproximadamente doce enzimas conocidas del acrosoma, las mas
importantes para la fusión espermática en la fertilización parecen ser la hialuronidasa y
acrosina. Esta ultima se acumula en su liberación durante la reacción acrosomal; la
hialuronidasa digiere la matriz intercelular de acido hialuronico que mantiene unidas a las
células de la granulosa (cúmulo), por lo que permite a los espermatozoides pasar a la ZP.
La ZP por la cual pasan los espermatozoides ayudado por la propulsión de la cola activada,
hacia el frente, sin embargo, la importancia de la acrosina en la fecundación ha sido puesta
en duda, ya que animales transgenicos cuyos espermatozoides carecen de acrosina, son tan
fértiles como los grupos controles (Hernández, C. 2003).
De igual forma, Baba, T. et al. (1994), Mencionan que la acción enzimática de la
acrosina parece insostenible para el ratón, ya que espermios en los que su acrosina tuvo

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situaciones de aminoácidos importantes, continuaron siendo fértiles in vitro e in vivo, no
obstante, estos espermatozoides fueron mas lentos para fertilizar ovocitos in vitro que los
normales, por lo que infieren que la actividad enzimática tendría un rol, aunque no
esencial.
Sutovsky, P. et al. (2004), mencionan que la penetración de los espermatozoides a la
zona pelucida en la fertilización puede ser prevenido por inhibidores proteasomales o
antiproteasomal específicos, por lo que indica que la ubiquitin-proteasoma participa en la
penetración de los espermatozoides a la zona pelucida, ya que el acrosoma contiene
ubiquitin-proteasoma y que esta se despliega durante la fertilización y degrada la zona
pelucida 3. Así mismo, Saxena, D y Toshimori, K. (2004), mencionan que el MC31 es
una molécula asociada a la integrina, y en el ovocito la integrina 6/B1 sirve como receptor
para el acoplamiento del espermatozoide con el ovulo.
Los microtubulos y microfilamentos desempeñan un papel decisivo en la dinámica
citoplasmática cromosómico y eventos durante la maduración y fecundación del ovocito.
Es por ello que Yuan, Q. et al. (2001), mencionan que la penetración de los
espermatozoides depende de los microfilamentos y que los microtubulos desempeñan un
papel en la singamia durante la fertilización.
La membrana vitelina podría tener menor especificidad que la ZP en adosar
espermatozoides extraños, no obstante, algún grado de selectividad posee puesto que la
membrana plasmática del ovocito va a unirse en forma competitiva con mayor numero de
espermatozoides homólogos, una ves que los espermatozoides penetran la zona pelucida se
inicia el contacto entre la punta del espermatozoide y la membrana del ovocito. La fusión
de membranas ocurre por la adhesión entre una integrina del ovulo y una integrina del
espermatozoide, así como otras proteínas, miembros de la familia ADAM como el Fertilin
que esta presente en la superficie de los espermatozoides (Talbot, P. 2003).
Las controversias existentes sobre la localización de los receptores, esta relacionado
con las diferentes teorías sobre la reacción acrosomica. Si la reacción acrosomal es
estimulada por la interacción de la ZP con el acrosoma, se asume que los receptores están
en la membrana plasmática; de lo contrario, si la reacción es inducida por el ambiente
uterino, luego de haber completado su capacitación (Bedford, J. 1983), los receptores
pueden estar en la membrana plasmática y acrosomal interna o membrana post acrosomal y
membrana acrosomal interna.
Manandhar, G y Toshimori, K. (2001), indican que el aspecto interior y exterior de
la membrana plasmática de la región ecuatorial permanecen intactos después de la reacción

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acrosomica y de la penetración completa de la zona pelucida. Al mismo tiempo menciona
que el equatorin entra en el citoplasma del ovulo junto con la cabeza del espermatozoide.
Demostrando así que no siempre la fusión de membranas tiene lugar en la región ecuatorial
del espermatozoide. Una vez que el espermatozoide ingresa con su flagelo y desprovisto
del acrosoma, comienza a sufrir cambios en el ooplasma, en la cabeza, después de la
ruptura de la membrana nuclear, la cromatina condensada desde la espermatogenesis es
descondensada por intermedio de proteínas de empaque (histonas), proceso inducido por el
citoplasma ovocitario que proporciona las histonas necesarias para el intercambio. A nivel
de la pieza intermedia espermática se encuentra una estructura fundamental que es
incorporada al ooplasma: el centríolo distal, este se duplicara haciendo uso del material
pericentriolar del ovocito, dando origen al centrosoma del cigoto, una estructura que
dirigirá posteriormente el desarrollo de pro núcleos y la formación del primer huso
mitótico (Talbot, P. 2003).
Cuando el flagelo espermático ingresa al ovocito disocia sus mitocondrias, las cuales
vienen marcadas con proteínas llamadas ubicuitas desde la espermatogenesis, a través de
ellas son reconocidas y degradadas el ooplasma, por un proceso mediado por proteosomas.
De la misma forma también es degradada la vaina fibrosa y así todas las estructuras
desaparecen rápidamente, es por lo mismo que Manandhar, G y Toshimori, K. (2001),
mencionan que la cola y los microtubulos del espermatozoide se mantienen hasta la
formación de 8 células o fase de blastocisto y la vaina mitocondrial en la especie bovina
hasta la formación de 4 células y el equatorin se degrada rápidamente antes de la etapa de 4
células.
El ovocito fecundado, llamado cigoto, se enfrenta con dos problemas inmediatos:
debe prevenir la entrada de otros espermatozoides (bloqueo de polispermia) y debe además
completar la segunda división meiotica (frenada en la metafase 2 en la ovulación). Es así
que, Ström, B. et al. (2000), mencionan que luego que ocurra la fertilización, la zona
pelucida presenta varios cambios en su ultra estructura, ya que después de la fecundación,
a la zona porosa de la zona pelucida se superponen varios capas de estructuras en forma de
anillos y que lo transforma en una estructura compacta, en la que las estructuras en forma
de anillos parecen haberse detenido y los poros son ocultos por material amorfo. Así
mismo, indican que el espesor de la zona pelucida varía de 3 -6 mm y el diámetro del
ovocito de 7.9 – 12 mm.
Yuan, Q. et al. 2001), mencionan que la fusión espermatozoide – ovulo, induce un
aumento de calcio intracelular libre y exocitosis del granulo cortical, lo que resulta en el

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bloqueo de la polispermia, sin embargo, Kouba, A, et al. (2000), sugieren que en porcinos
existe otro factor, como la Glicoproteina Oviductal del Porcino (pOSP), que puede
contribuir a la prevención de la polispermia en la fertilización. Menciona que la pOSP
podría ayudar en la modificación de los receptores de espermatozoides en la zona pelucida,
inmediatamente después de la fertilización en un proceso conocido como “Zona de
endurecimiento”.
La fusión también estimula la continuación de la división meiotica, una mitad de la
cromatina se va con el segundo cuerpo polar, lo que deja al ovocito en estado de haploide.
La reanudacion de la meiosis es un proceso en la que se produce por la unión de los
gametos masculinos y femeninos, en donde el numero de cromosomas haploide del ovulo
se une con los cromosomas del espermatozoide, para completar el numero de cromosomas
a diploides.
Fair, T. et al. (2001), mencionan que el núcleo y nucleolo de los ovocitos maduros
contienen numerosas proteínas, la mayoría de los cuales son fácilmente detectables
después de la fertilización, pero sin embargo, el destino de estas proteínas durante la
reanudacion de la meiosis es desconocido.
Varias horas después de la fusión de gametos, las oscilaciones de calcio cesan, se
forman los pronúcleos femenino y masculino, y comienza la síntesis de ADN. Y así
culmina el proceso de la fertilización y se inicia la transición del genoma materno hacia la
activación del genoma embrionario.
II.6.2. Criopreservación del semen
II.6.2.1. Efectos de la Criopreservación.

Cuando los espermatozoides son congelados y descongelados, se ven sometidos a

varios factores de estrés, que reducen su porcentaje de motilidad y viabilidad, además que
produce daño del acrosoma y disminución de la funcionabilidad de las mitocondrias de los
espermatozoides descongelados (Thomas, C. et al. 1998).
Hernández, P. y et al. (2001), indican que el descongelamiento produce daño
acrosomal en un 50% de los espermatozoides, esto ocurre independientemente del
momento de adición del glicerol, los mismos indican que la motilidad y viabilidad fue de
41.7% y 45.6%, siendo estos menores al de semen fresco.
La perdida de la motilidad y viabilidad espermática producida durante el proceso de
criopreservacion podría ser consecuencia de la producción de especies reactivas de
oxigeno (ROS), las cuales poseen efectos tóxicos sobre las células y comprometen su

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funcionalidad, sin embargo diferentes antioxidantes han sido usados como parte de varios
diluyentes y se ha verificado el efecto benéfico de los mismos, ya que estos reducen la
producción de ROS y la peroxidación lipidica durante la criopreservacion de semen
(Sepúlveda, N. et al. 2006), sin embargo no debe olvidarse que el daño oxidativo es solo
uno de los diferentes factores de estrés al que es sometido el espermatozoide durante el
proceso de congelación.
Además, el lento enfriamiento induce también estrés sobre la membrana del
espermatozoide, este hecho se relaciona con el cambio de la fase lipidica que alteraría el
estado funcional de la membrana, y así mismo, el proceso de congelado y descongelado
someten a los espermatozoides a varios ciclos de deshidratación e hidratación, lo que
resulta en cambios significativos en la morfología de los espermatozoides, siendo la cabeza
de los espermatozoides congelados menor que el del semen fresco (Hidalgo, M. et al
2007).
Así mismo, (Rubio, J. et al. 1993), mencionan que existe efecto de la
criopreservacion sobre las dimensiones morfometricas de las cabezas de los
espermatozoides de toros, que fueron significativamente menores al de las muestras
frescas, encontrando resultados para longitud (9.00μm vs 9.43μm), ancho (4.82μm vs
5.13μm), perímetro (32.96μm vs 33.69μm) y área (36.20μm2 vs 39.97μm2) para todos los
toros evaluados.
Fernández, J. et al. (2000), mencionan que la refrigeración como la congelación
producen la pérdida de proteínas de la membrana espermática, siendo esta fase crucial, ya
que las posteriores fases de congelación no parece incrementar dicha perdida, edemas
menciona que dicha perdidas se centra en proteínas de 10 – 30 KDa, correspondientes a las
proteínas adquiridas por el espermatozoide a partir del plasma seminal, durante el proceso
de maduración espermática. Es así que Kumaseran, A. et al. (2005), adicionaron proteínas
oviductales antes de la congelación pera reducir los niveles de peroxidacion lipidica en
espermatozoides durante la criopreservacion y para mejorar la descongelación y la calidad
del semen, encontrando que la adición de proteína NLOP tiene una motilidad de
62.50±2.89% y la viabilidad de 71.25±0.96%, mientras que los resultados para las
proteínas LOP en motilidad y viabilidad son de 52.50±5.0% y 66.75±5.85%
respectivamente, siendo estos superiores al del grupo control (40.0±4.08% y
53.35±8.84%).
Guillaume, M. et al. (2004), indican que la criopreservacion induce muchos
cambios en las células espermáticas, incluyendo transtornos de la membrana y la muerte

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celular, que es debido a que existe daño a nivel de las mitocondrias que causa una
disminución en la producción de ATP y por lo tanto la falta de energia como el agotamiento
del ATP pueden ser los responsables de la disminución de la motilidad espermática,
además indican que la criopreservación y descongelación no tuvo ningún efecto sobre el
núcleo de los espermatozoides.

II.6.2.2. Métodos de Criopreservación.

Los métodos de criopreservacion se pueden clasificar de acuerdo a la velocidad de

congelamiento y descongelamiento, por ejemplo en protocolos de congelación lenta-
descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida, en los cuales la adición del
crioprotector suele hacerse en pasos y el descenso de la temperatura se realiza rápida o
lentamente a Tº ambiental o en baño Maria a 37ºC para evitar la recristalización.
Como se aprecia, uno de los puntos críticos en el proceso de la congelación es la Tº
de descongelación, es así que Gonzálvez, L. et al. (2003), Indican que Tº de
descongelación a 42ºC en 22 segundos es mejor por que obtuvo un mayor % de motilidad
(28.8±1.2), frente a la motilidad encontrada al descongelar semen a 22ºC por 40 segundos
(24.1±1.1), sin embargo no encontró diferencia estadística respecto al descongelado a Tº de
50ºC en 10 segundos (26.7±1.1), por lo que se recomienda altas Tº de descongelación para
obtener una mejor calidad del semen. Los mismos indican que el tiempo de
almacenamiento disminuye la motilidad espermática de 28.2±1.6% a 25.8±1.0%, siendo
esta reducción sin significancia estadística, por lo que encuentran que el tiempo de
almacenamiento no afecta la calidad del semen.
Sin embargo, Haugan, T. et al. (2006), mencionan que la mayoría de los pasos
críticos en la criopreservacion se producen durante el enfriamiento y los procedimientos de
descongelación, pero que además de ellos, el tiempo de almacenamiento podría disminuir
el desempeño reproductivo, esto lo demuestra al almacenar pajillas por periodos largos en
nitrógeno liquido, es decir, mas de 1950 días de almacenamiento, aunque el porcentaje solo
disminuye en un punto porcentual frente a los almacenados por 1000 días.
Brown, D. et al. (1991), al descongelar pajillas en grupos de 20, a Tº de 36ºC,
indican que la descongelación provoca daños sobre los espermatozoides, esto lo observo
después de 4 horas de incubación de las pajillas.
Existen estudios que sugieren que la reducción de la Tº durante el enfriamiento es
donde se produce el mayor daño de la membrana, aun mas que la formación de cristales de

13
hielo durante la congelación-descongelación o que el estrés toxico del glicerol, por lo que
reconocen que los espermatozoides de mamíferos son muy susceptibles a una reducción
rápida de la Tº de 25ºC a 0ºC (Pesch, S y Hoffman, B. 2007). Es por ello importante el uso
de tris; ac. Cítrico, Fructosa, Yema de huevo y glicerol (Amoah, E y Gelaye, S. 1997). Es
así, que Gutiérrez, A. et al. (2006), utilizaron agua de coco (AC), suero fetal bovino
(SFB), aloe vera (AV) y las combinaciones de los mismos para criopreservar el semen de
ovino, obteniendo resultados satisfactorios con las combinaciones de SFB (10-70) y AV
(40-40) con 60% de motilidad progresiva, sin embargo, mencionan que la utilización en
mas del 50% del Gel AV es nocivo para la criopreservacion de las células.
Así mismo, Hernández, P. y et al. (2001), indican que la adición de glicerol al
semen a Tº de 5ºC mejora el % de motilidad (47.50±8.14), el % de viabilidad
(50.02±10.32) y el % de acrosomas normales (31.36±8.14) frente a la adición de glicerol a
los 22ºC, cuyos resultados fueron inferiores.
Hidalgo, M. et al (2007), encontró que la adición de leche descremada mejora la
fertilidad del semen (50%), en comparación con la dicción de tris (45%) que es
ligeramente inferior.
Guthrie, H. et al. (2002), indican que no hay diferencia significativa en la dicción
de glicerol, etilglicerol y DMSO en cuanto a la motilidad espermática, además indican que
la capacidad de sobrevivencia de los espermatozoides puede estar relacionado a la
tolerancia del estrés osmótico.
Si bien es cierto que la motilidad del semen congelado es menor que el de semen
fresco, debido a varios factores producidos por la criopreservacion, esto disminuye el % de
fertilidad. Es por ello que Nadir, S. et al. (1993), menciona que aumentando la dosis o
concentración de espermatozoides de 20 x 106 a 100 x 106, encuentra diferencia
significativa entre la dosis alta y la dosis baja, obteniendo resultados de 84% y 95% de
fertilidad respectivamente. Esto es debido a que al existir un mayor número de
espermatozoides normales, aumenta la probabilidad de que los espermatozoides lleguen a
fecundar. De igual forma Ake, R y Sánchez, W. (1997), quienes removieron plasma
seminal, señalan que tiene al haber una mayor concentración de espermatozoides presenta
un mayor % de muestras aptas a la descongelación en comparación al grupo testigo.
Otro factor de importancia es la forma de almacenamiento de los espermatozoides,
en congelación se conoce como geometría de congelación, se cree que la forma del envase
influye en la transferencia de la Tº y la viabilidad espermática durante el proceso de
congelado-descongelado. Las pajillas presentan ciertos problemas criobiologicos, tales

14
como la velocidad de enfriamiento y descongelación, las cuales pueden variar a través de
la pajilla misma entre la parte periférica y central. Es así que Córdova, A. et al. (2005),
menciona que la congelación del semen en pajillas de 5 ml afecta menos las características
de la fecundación in Vitro de los espermatozoides que el almacenado en pajillas de 0.5 ml.
Otro de los factores que nos lleva a obtener otros métodos de congelación es la
fisiología y morfología de los espermatozoides durante el proceso de congelado
descongelado, esto fue demostrado por Medrano, A y Holt W. (1998), quienes
encontraron diferencia significativa en el % de células motiles al congelado-descongelado
en dos grupos de individuos. Por lo que indican que la variación observada es atribuida
principalmente al factor individuo, este aspecto es importante porque permite separar el
efecto de la susceptibilidad individual del efecto ocasionado por la tasa de congelación-
descongelación, siendo este ultimo, considerado el factor más importante de la
criopreservacion.

2.6.2.3. Dilutores utilizados en la criopreservación de semen.

Diversos estudios en la criopreservación del semen, sugieren que la reducción de la

Tº durante el enfriamiento es donde se produce el mayor daño de la membrana, aun mas
que la formación de cristales de hielo durante la congelación-descongelación o que el
estrés toxico del glicerol, por lo que reconocen que los espermatozoides de mamíferos son
muy susceptibles a una reducción rápida de la Tº de 25ºC a 0ºC (Pesch, S y Hoffman, B.
2007). Es por ello importante el uso de dilutores como tris, ac. Cítrico, Fructosa, Yema de
huevo, glicerol, etc. (Amoah, E y Gelaye, S. 1997).
Chen, V. et al. (2003), manifiestan que la adición de colesterol cargados de
ciclodextrinas (CLC) mejora la supervivencia de los espermatozoides a la
criopreservación, Es así, que Phillip H. y James K. (2004), adicionan CLC en medio
TALP a los espermatozoides antes de la criopreservacion, para esto los espermatozoides a
ser analizados sin criopreservacion se diluyeron a 120 x 10 6 cel/ml en 1 ml de 10 mM
TALP que contiene 0 ó 1.5 mg de CLC y se incuba a 23ºC x 10 min, y para la
criopreservacion utilizaron yema de huevo y tris en una dilución de 1:1 (25 mM Tris, 8
mM acido cítrico, 7 mM de Glucosa y el 40% de yema de huevo) y luego del enfriado,
Nuevamente fueron diluidas en 1:1 con yema de huevo, tris y Glicerol (25 mM Tris, 8 mM
de acido cítrico, 7 mM de glucosa, 20% de yema de huevo y 14 % de Glicerol), los
resultados nos indican que no existe diferencias estadísticas entre los grupos tratados, ya

15
que la adición de colesterol no mejoro el % de fertilidad, siendo este del 59% para las
vaquillas inseminadas con semen tratado con CLC y del 50% de las novillas del grupo
control. De igual forma, Mocé, E y Graham, J. (2006), adicionaron CLC a las muestras
de semen colectados, para que luego las muestras sean incubadas durante 15 min. A 22ºC,
para después de lo cual cada una de las muestras fue diluida de 60 × 106 células/mL con
yema de huevo-diluyente Tris (Tris diluyente con 20% yema de huevo). Los
espermatozoides luego fueron enfriado lentamente hasta los 5°C durante 2 h, y luego
diluido 1:1 (vol: vol) con glycerolated (17,5% glicerol) yema de huevo-Tris diluyente (lo
que resulta al final una concentración del glicerol de 8,75%), y equilibrada para el 15 min.
los espermatozoides fueron embalados en pajillas de 0,5 ml y congelado en vapor de
nitrógeno liquido, con la pajilla suspendida a 4,5 cm por encima del nitrógeno líquido
durante 10 min. antes de ser hundido en el nitrógeno líquido. Los resultados indican que la
adición de CLC en dosis de 2 ó 4 mg hay un mayor % de espermatozoides vivos (61 y
48%) en comparación del grupo control (38%).
Por su parte, Hidalgo, M. et al (2007), encontró que la adición de leche
descremada mejora la fertilidad del semen (50%), en comparación con la adición de Tris
(45%) que es ligeramente inferior. Al igual que Karabinus, D y Everson, D. (1991),
quienes al evaluar el semen de 4 toros holstein compararon el efecto de 4 extensores:
Leche entera o 20% de Huevo Yolkcitrate, y la combinación de estos. Para luego evaluar el
semen después de la descongelación, donde los resultados indican que la adición de yema
de huevo y citrato muestra un mayor % de membranas intactas a comparación de las demás
tratamientos. Así mismo, Foote, R y Kaproth, M. (2002), al evaluar el tiempo de
congelación (4 y 28 horas de incubación), adicionaron fructosa a la leche entera mas el
glicerol antes de la criopreservación del semen y el grupo control que fue sin la adición de
fructosa y incubadas por 4 horas, para que luego ser congelados en pajillas de 0.5ml, los
resultados de los tres tratamientos fueron de 74.7, 74.3 y 73.9% de fertilidad, no existiendo
diferencias estadísticas entre los tratamientos.
La perdida de la motilidad y viabilidad espermática producida durante el proceso de
criopreservación podría ser consecuencia de la producción de especies reactivas de
oxigeno (ROS), las cuales poseen efectos tóxicos sobre las células que comprometen su
funcionalidad, sin embargo diferentes antioxidantes han sido usados como parte de varios
diluyentes y se ha verificado el efecto benéfico de los mismos, ya que estos reducen la
producción de ROS y la peroxidación lipidica durante la criopreservación de semen. Es por
ello que, Sepúlveda, N. et al. (2006), al realizar la criopreservación del semen de ovino,

16
evaluaron la adición de los antioxidantes tempo y tempol durante el enfriamiento del
semen, a los 5ºC y 10ºC y en diferentes concentraciones (0.5; 1.0 y 2.5 mM). Indicando
que la mejor concentración de antioxidantes es de 1.0 mM, y adicionado a los 10ºC, ya que
los porcentajes de motilidad y viabilidad fueron mejores. Además mencionan que el mayor
% de ROS se observo a los 5ºC. De igual forma, Anderson, W. et al. (1994), utilizaron
antioxidantes para evaluar el efecto de estos en la fertilidad de los espermatozoides, para lo
cual añadieron 0.5 mM de Hidroxitolueno butilado que es un antioxidante que tiene
propiedades antivirales, sobre el diluyente que fue la leche mas el 14% de glicerol y otro
grupo control sin antioxidantes. Los resultados indican que no existe diferencia estadísticas
en la fertilidad de los grupos tratados, ya que el % de fertilidad para el grupo tratado con el
antioxidante Hidroxitolueno butilado fue de 73.9% y del 74.1% para el grupo control; por
lo que los autores concluyen indicando que la adición del Hidroxitolueno butilado puede
ser beneficioso en el futuro, debido a sus propiedades antivirales, ya que de esta forma se
reduce el riesgo de transmisión de enfermedades virales.
En camélidos, la metodología de la criopreservación no esta bien desarrollada, sin
embargo, Pérez, G. et al. (2006), indican que el uso del baffer Tris, con 20% o 30% de
yema de huevo mas concentraciones del 2.5%, 5% o 7.5% de glicerol constituye un
protocolo nuevo para congelar espermatozoides procedentes del conducto deferente de
camélidos. Por su parte Pacheco, J. et al. (2006), al utilizar el protocolo indicado por
Pérez et al., menciona que encontró 13.55% de fertilidad al diagnostico de preñez mediante
ecografía y a los 22 días post inseminación con semen criopreservado de los conductos
deferentes, con una tasa de recuperación de 39.2% de viabilidad.
Aller, J. et al (2003), utilizaron como diluyente parea la criopreservación de semen
en llama: yema de huevo, citrato, glucosa, glicerol, DMSO y antibióticos. Además, indican
que la proporción tamponada contenía 2.92 g de citrato de sodio en 100 ml de agua
bidestilada, y que el buffer y la yema de huevo fueron combinados para obtener una
relación 85:15. El diluyente básico fue dividido en dos fracciones, A sin glicerol ni DMSO
y la fracción B que contenía dos veces la concentración final deseada de glicerol (6%) y
DMSO (8%). Los resultados obtenidos para la viabilidad fue de 32.4% y de 20.4% para la
motilidad, además obtuvieron un 7.9% de fertilidad al diagnostico mediante palpación
rectal a los 60 días post inseminación.
Niasari, A. et al. (2007), indican que el disolvente SHOTOR, mas el 6% de
glicerol puede ser una alternativa para la criopreservación del semen del camello bactriano.
Esto lo señalan al comparar diferentes % de glicerol (4, 6 y 8%), añadidos al disolvente

17
SHOTOR mas 214,6 mM de Tris, 64.2 mM de ac. Cítrico, 66.6 mM de glucosa, 49.9 mM
de fructosa y 20 % de yema de huevo mas antibióticos. Donde la motilidad progresiva para
el tratamiento con 6% de glicerol fue del 35%, que es mayor a los resultados obtenidos con
el 4 y 8% de glicerol (12.5 y 22.5% respectivamente), de igual forma el % de vivos es
mayor en el tratamiento con el 6% de glicerol (61.5%), en comparación a los tratamientos
con 4 y 8% de glicerol que obtuvieron 37 y 57.5% respectivamente.
De igual forma, Amino, D. et al. (2003), al colectar semen de camellos mediante
vagina artificial, prepararon el buffer (30.28 g de Tris, 12.5 g de Fructosa, 16.7 g de Ac.
Cítrico y 0.039 g de Cafeína diluidos en 1000 ml de agua bidestilada), para la
criopreservación del semen, además de ello prepararon los diluyentes Unglycerolated
buffer (80 ml de buffer, 20 ml de egg yolk, 1000 UI/ml de penicilina benzatidica y 1000
g/ml de estrectomisina) y el Glycerolated buffer (68 ml de buffer, 20 ml de egg yolk, 20 ml
de Glicerol, 1000 UI/ml de penicilina benzatidica y 1000 g/ml de estrectomisina).
Primeramente extendieron el semen a razón de de 1:1 con el diluyente unglycerolated y
luego a razón de 1:3 con el dilutor glycerolated, para luego criopreservarlos en Nitrógeno
liquido. Los resultados nos muestran que un 51.1% de las muestras presento motilidad
mayor al 50% antes de la congelación y de estas el 25% (4/16) fueron congelados
exitosamente. Al realizar la inseminación artificial con semen congelado, observaron que
el 7.1% (1/13) quedo preñada y que el 40% (4/10) con semen fresco fue diagnosticada
preñadas.

2.6.2.4. Tasas de Congelación y descongelación

Cuando los espermatozoides son congelados y descongelados, se ven sometidos a

varios factores de estrés, que reducen su porcentaje de motilidad y viabilidad, además que
produce daño del acrosoma y disminución de la funcionabilidad de las mitocondrias de los
espermatozoides descongelados (Thomas, C. et al. 1998).
Además, el lento enfriamiento induce también estrés sobre la membrana del
espermatozoide, este hecho se relaciona con el cambio de la fase lipidica que alteraría el
estado funcional de la membrana, y así mismo, el proceso de congelado y descongelado
someten a los espermatozoides a varios ciclos de deshidratación e hidratación, lo que
resulta en cambios significativos en la morfología de los espermatozoides, siendo la cabeza
de los espermatozoides congelados menor que el del semen fresco (Hidalgo, M. et al
2007).

18
 Como se aprecia, uno de los puntos críticos en el proceso de la congelación es la Tº
de descongelación, es así que Foote, R y Kaproth, M. (2002), indican que los porcentajes
de espermatozoides móviles congelados con leche entera y descongelados a 30 y 37°C fue
de 42,9 y 45,7 respectivamente y los congelados con leche entera mas fructosa y
descongelado a 30 y 37°C, fueron 46,3 y 45,6 respectivamente, esto indica que la
descongelación a 37°C ligeramente es mejor para los congelados con leche entera y 30ºC
para los congelados con leche entera mas fructosa. Así mismo, Dalton, J. et al. (2004), al
evaluar el efecto de la descongelación simultanea de varias pajillas de 0.5ml y la secuencia
de inseminación en las tasas de fertilización, al comparar a profesionales con técnicos,
indican que los resultados son de 45 y 27% de fertilidad para los profesionales y los
técnicos, esta diferencia se debe al tiempo transcurrido desde la descongelación hasta el
termino de la inseminación, siendo esta mas corta para los profesionales (7.6 min.) y de
10.9 min. para los técnicos.
Por su parte, Smith, J y Merilan C (1991), utilizaron vaginas artificiales donde los
conos fueron de goma ó polietileno para la colección de semen, y estas muestras fueron
diluidas con 20% yema de huevo-citrato a un pH de 6,4 o 7,2. y congelados en nitrógeno
liquido y fueron descongelados rápidamente a 46ºC durante 12 segundos. Los resultados
indican que el % de motilidad progresiva es mayor cuando el pH es de 7.2 (37.4%) en
comparación al pH de 6.4 que fue de 32.9% al igual que el % de cromosomas normales,
que fue de 91.5% para el pH de 7.2 y de 89.5 para el pH de 6.4 mediante el cono de goma,
además, los mismos indican que no hay diferencia entre el tipo de cono (goma o
polietileno).

2.6.2.5. Ventajas y desventajas de la Criopreservación

Actualmente, el empleo de semen congelado en los programas de inseminación

artificial tiene importantes limitaciones frente al semen fresco o refrigerado,
principalmente la baja fertilidad, sin embargo, la posibilidad de utilizar semen congelado
permite cubrir algunas de las limitaciones inherentes al semen fresco o congelado.
Así, entre sus ventajas podemos citar:
 Nos permite la conservación del material genético contenido en los
espermatozoides, de aquellos animales domésticos y silvestres amenazados de
extinción, y rescate de especies autóctonos.

19
  Creación de bancos de semen con dosis suficiente para abastecer las explotaciones
en situaciones de prohibición de movimiento de animales y semen.
 El uso del semen congelado puede eliminar las cuarentenas y disminuir los riesgos
de la transmisión de enfermedades.
 En transferencia de embriones y en programas de mejoramiento genético, el riesgo
y costo del transporte de semen es menor que el transporte del animal para servicio
natural.
 Mayor uniformidad de animales producidos.
 Reducción del retraso genético entre generaciones de un programa o esquema de
selección.
 Mejor aprovechamiento de los animales elite y nacionalización económica del
eyaculado.
 Recogida del semen solo en épocas reproductivas favorables.
 A esta tecnología pueden acceder un mayor número de ganaderos que deseen
animales superiores.
 Intercambio internacional de animales genéticamente superiores y la producción
comercial de dosis para exportación hacia países con esquema de selección.
 Disponibilidad de material genético.
Entre las limitaciones presentadas para la utilización de esta tecnología podemos
mencionar:
 La necesidad de contar con un laboratorio sofisticado, destinado al procesamiento
del semen.
 Manejo cuidadoso de la dosis de semen durante el almacenamiento y la
descongelación.
 Falta de personal capacitado para el manejo del semen congelado.
 Adaptación de los productores a una tecnología más sofisticada.
 Bajos niveles de fertilidad.
2.7. Marco Operativo

2.7.1. Metodología Experimental

2.7.1.1. Selección de Machos (Periodo Pre-experimental)

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 Seis alpacas machos adultos serán intervenidos quirúrgicamente para realizarles la
desviación del conducto deferente, para luego de cicatrizado la herida, durante un
periodo de 15 días, se les realizara la recolección de semen con una frecuencia de 2
veces/semana, hasta el acostumbramiento de los machos a la colección de semen y se
seleccionara aquellos que muestren características seminales deseables.

2.7.1.2. Técnica quirúrgica

Para la obtención de espermatozoides de las alpacas se realizara a través del conducto
deferente para ello se procederá a la desviación de los conductos, de la siguiente manera:

a) Pre operatorio
 Se procederá al pesado de los animales para el calculo de la dosis de
tranquilizante, se aplicara acepromazina 0.1 mg/k PV, vía intramuscular, una vez
empleado el tranquilizante, se procederá al derribo de los animales poniéndolos
en una posición de cubito lateral.
 Se realizara el rasurado de la zona de incisión, las fosas inguinales y las caras
mediales de la zona femoral interna.
 Se sujetara el animal sobre la mesa de cirugía en posición decúbito dorsal, para
efectuar la antisepsia del área de intervención quirúrgica.
 Una vez realizada la antisepsia se procederá a la insensibilización del área
operatoria con anestésico local.

b) Técnica propiamente dicha.

 Se incidirá la piel 10 a 12 cm. delante de los testículos, en una extensión de 3 a 4
cm., se seccionara la piel, tejido celular y músculo subcutáneo.
 Se descubrirá la aponeurosis superficial, y por transparencia se observara los
cordones o paquetes espermáticos.
 Con los dedos medio y pulgar se procederá a localizar el cordón espermático, este
deberá ser separado de las estructuras de sostén (aponeurosis) con el uso de una
sonda acanalada ejerciendo ligera tracción.
 Una vez separado el cordón espermático de la aponeurosis, con dos pinzas
hemostáticas mosquito se sujetara la túnica vaginalis que envuelve el cordón
espermático, se procederá a seccionar de este con una tijera metzembaun roma.

21
  Separado el conducto deferente se ubicara este con la ayuda de un estilete para su
separación de las demás estructuras que conforman el cordón espermático.
 Libre el conducto deferente se procederá a dirigir el extremo libre del conducto
deferente sobre la cara medial del muslo colocándolo este, en un ángulo de 90
grados precisando el lugar donde se realizara la implantación.
 Se tomara el extremo libre del conducto deferente con la ayuda de una pinza
hemostática mosquito, este será cogido por el extremo distal y es conducido a
través del conducto subcutáneo formado, hasta sacarlo por la cara medial del
muslo.
 Se suturara la piel de la herida inicial con puntos simples ininterrumpidos,
posteriormente se fijara el extremo libre del conducto deferente a la cara medial
del muslo con tres puntos simples interrumpidos.

c) Tratamiento post operatorio.

Después de realizada la intervención se procede al tratamiento con antibióticos
para evitar una posterior infección de la zona intervenida.
Los animales estarán en observación por un lapso de una semana y se verificara el
correcto cicatrizado de la zona de fijación del conducto deferente por el lapso de un mes
aproximadamente por ser este el tiempo de cicatrización aproximado del conducto a la
piel.

2.7.1.3. Técnica de colección.

La colección de los espermatozoides se realizara dos veces por semana y se
procederá de la siguiente manera:
 El animal será derribado y colocado en posición decúbito lateral (derecha e
izquierda), se procederá a limpiar la zona de colección usando suero fisiológico
con la ayuda de una torunda de algodón, una vez ya limpia se procederá al secado
de la zona de colección.
 Se realizara masajes, esto aproximadamente desde la zona de la cola del
epidídimo siguiendo la dirección de la desviación de los conductos deferentes,
para así poder facilitar la salida del semen a través de los conductos deferentes.
 Con una jeringa de tuberculina cargada con los predilutores (Tris), mediante
aspiración, al predilutor de la jeringa que estará en un volumen de 0.5 ml standard

22
 en cada muestreo y el que tendrá una temperatura de 37°C para Tris, esto de
acuerdo al protocolo de dilución.

2.7.1.4. Preparación del dilutor

El buffer a utilizar será el Tris, que contendrá: 2.42g de Tris (hidroximetil

aminometano), 1.34 g de Acido cítrico monohidratado y 1.0 g de Fructosa; para 100 ml de
agua bidestilada, adicionándose antibióticos: espectinomicina (33 mg), Lincomicina (16.5
mg), Gentamicina (27.5 mg) y Tilosina 5.5 mg/100 ml de buffer, a este preparado se
añadirá 20% de yema de huevo más el 5% de glicerol, a esta dilución se añadirá también el
antioxidante.
2.7.1.5. Evaluación microscópica del semen

a) Concentración.
Para la determinación de la concentración se empleara el hemocitometro con la
siguiente técnica:
 Con el empleo de una pipeta cuenta glóbulos rojos se aspirara semen hasta la
marca 0.5, seguidamente.
 Posteriormente se aspira agua destilada hasta la marca 101 para luego mezclar
ambas sustancias, cogiendo la pipeta con los dedos medio y pulgar se procederá a
mezclar el contenido de esta, por medio de movimientos de muñequeo en forma
oblicua.
 Las cuatro primeras gotas de la solución (semen mas agua destilada) son
eliminadas sobre papel absorbente.
 Luego se deja caer una gota en cada extremo de la cámara de newbauer, las
mismas que por capilaridad cubrirán el área determinada de cada cámara.
 Se dejara reposar 4min antes de proceder con el recuento, se 5 de los 25
cuadrantes de la cámara siendo estos de los cuatro extremos y del medio.
Una vez el número de espermatozoides obtenidos será multiplicado por el factor
10,000, con el cual se obtendrá el número total de espermatozoides aproximadamente de
la muestra.

b) Motilidad individual.

23
 Esta será determinado en el momento de la colección-dilución, enfriamiento o
conservación a 5°C y a la descongelación, las muestras serán observadas en el
microscopio a un aumento de 400X el procedimiento es el siguiente:
 Se colocara una pequeña muestra de semen diluido en una lamina portaobjetos
precalentada a 37 a 38 ºC aproximadamente, y será cubierta con un cubreobjetos
precalentado.
 La lectura de los espermatozoides se realizara en 3 campos ópticos como mínimo,
en los cuales se contara los espermatozoides con o sin movimiento, para así
poder determinar el % de motilidad individual inicial. a 5ºC y al descongelado.

N° de espermatozoides motiles
Formula = x 100
N° total de espermatozoides

c) Vitalidad

 El porcentaje de vitalidad será determinado por la técnica de coloración eosina –

nigrosina
 Se colocara los colorantes sobre la placa porta objetos con la ayuda de la pipeta
pasteur, la lamina porta objetos debe estar a una Tº de 37 ºC aproximadamente.
 Luego se tomara como muestra una porción de semen con pipeta pasteur, esta
se colocara en la lamina porta objetos, con la ayuda de una bagueta se mezclara la
gota de muestra con los colorantes tratando de que sea una mezcla homogénea.
 Se realizara el frotis de la mezcla del semen coloreado en una lamina
portaobjetos, se dejara que seque, posteriormente se llevara a lectura en el
microscopio para su observación a 100X.
 Posterior a ello se realizara el conteo entre 100 a 200 espermatozoides para
determinar el porcentaje de vivos y muertos.

d) Técnica de dilución

Cada muestra se procederá a la dilución con los dilutores comerciales y tris (control o
testigo) con una concentración espermática de 20 x 10 6 espermatozoides por dosis de 0.25
ml calculado según el número de espermatozoides obtenidos por colección, de acuerdo a la
siguiente formula:

24
 %Motilidad x %Vitalidad x Concentración x Volumen
Nº dosis =
20 ó 30 x 106 espermatozoides

Una vez ya calculada la cantidad de dilutor a emplear, la dilución será realizada

37°C, esta será 1:1, para posterior a esto llevar la muestra de espermatozoides
diluida a refrigeración se le adicionara 30% de yema de huevo y 5% de glicerina.

e) Criopreservación de semen.

 Enfriamiento o Refrigeración
Para la refrigeración del semen este es colocado en un recipiente con agua “baño
maría” la que será llevada a una cámara con una temperatura de 5°C aproximadamente,
para que luego la muestra obtenida 0.5 ml que fue diluida completamente con de 30% de
yema de huevo + 5% de glicerina, es llevada a refrigeración a 5°C por el lapso de 1 hora
y 30 minutos para su equilibracion.
 Empajillado
- En la preparación de las pajillas se rotulara las pajillas de semen de 0.5 ml con la
ayuda de lapiceros de tinta permanente el que considerara la clave del animal y la
fecha de congelación.
- Ya rotulada las pajillas se colocaran en bolsas de polietileno estériles.
- Se procedera al empajillado cogiendo del extremo superior del doble tapón de la
pajilla, y el extremo libre será colocado en el tubo colector que contiene el semen,
se succiona suavemente el semen del tubo colector hacia la pajilla esto por el lado
del doble tapón, teniendo cuidado de dejar un espacio de aire entre el tope de la
pajilla y el aire aspirado.
- Se sacara la pajilla del tubo colector, luego se coloca en contacto el extremo
inferior de la pajilla o del lado del espacio del aire dejado con el alcohol
polivinilico con el cual será sellado la pajilla.
- Cuando el extremo inferior ya se encuentre taponado con el alcohol polivinilico, se
introducirá la pajilla en una bandeja con agua esto con la finalidad de que se
solidifique el alcohol polivinilico para un buen sellado.

 Congelación

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La congelación se realizara de la siguiente manera:
- En una caja de tecnopor se hechara nitrógeno líquido a una altura de 4 a 5cm.
- Las pajillas serán sacadas del agua a 5ºC, se procede al secado de estas con la ayuda
de una toalla y papel toalla, estas son colocadas sobre la rejilla de congelación en
forma horizontal.
- Se colocara la rejilla que contiene las pajillas a una altura de 5 a 7cm sobre la
superficie del nitrógeno líquido de un tiempo de 6 a 8 min.
- Pasado este tiempo las pajillas serán introducidas lentamente en el nitrógeno líquido
con lo cual se culminara el proceso de congelación.
 Descongelación
Para la descongelación se realiza el siguiente procedimiento:
- Se sacara una pajilla congelada del termo criogénico con la ayuda de una pinza
larga, una vez ya extraída la pajilla esta es sumergida rápidamente al termo de
descongelamiento.
- Pasado el tiempo se sacara la pajilla del termo, se seca con papel toalla luego se
agita con el objetivo que la burbuja este en un extremo del alcohol polivinilico esto
para evitar el roseado del contenido y la facilidad del corte de la pajilla
- Luego se procederá a la evaluación microscópica de la muestra, para esto se coloca
una gota de semen en una lamina porta objetos precalentada a 37ºC, esta es cubierta
con un cubre objetos precalentado a la misma temperatura y luego se lleva a
observación la microscopio para la evaluación de motilidad y vitalidad.

f) Prueba de Fertilidad a campo (I.A.)

 Inducción de ovulación.
- Se determinara el celo de la hembra por la presencia del macho.
- Se utilizara a alpacas machos para la inducción de la ovulación, con 30 horas de
anticipación a la inseminación artificial.
- Se devolverá las hembras al rebaño hasta la hora de ser inseminadas estas que será
a las 30 horas post colocación de la hormona.
 Inseminación artificial.
- Se trasladara las hembras al brete de inseminación y sujetadas por un ayudante, se
lubricara la mano enguantada con agua jabonosa, esta será introducida por el recto
del animal para la evacuación de las heces.

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 - Se procederá a la higienización de la zona perianal, luego se secara la vulva con
toallas de papel.
- Se extraerá la pajilla del termo criogénico con una pinza para su descongelación en
baño maría.
- Se sacara la pajilla descongelada para su colocación en el aplicador calentado a una
temperatura aproximada de 37ºC.
- Se cortara la pajilla en el extremo del tapón con alcohol polivinilico con el corta
pajillas, luego se colocara una funda descartadle.
- El aplicador cargado se mantendrá caliente dentro de un deposito de metal
protegido con una funda de plástico en baño maría a 37ºC, se abrirá los labios
vulvares para la introducción del aplicador cargado.
- La mano izquierda será introducida por el recto para seguir el aplicador al sitio
escogido y la deposición del semen lentamente.
- Se sacar la mano del recto y realizada la inseminación propiamente dicha se
realizara un ligero masaje en el área perivaginal y el clítoris.
- Las hembras inseminadas serán remarcadas para su respectiva identificación.

 Diagnostico de gestación.
- Para el diagnostico de la gestación será efectuado a los 20 días después de realizada
la inseminación artificial, este será por medio de la presencia de macho.

2.7.2. Material Experimental.

Para el trabajo de investigación se utilizaran 6 alpacas machos de fertilidad probada,

además de ello se utilizaran 100 alpacas hembras vacías, que serán divididas en dos grupos
para ser inseminadas con semen congelado (Cuadro 1).

Cuadro 1. Distribución de hembras para la inseminación artificial

Tº de descongelación
37ºC/30” 42ºC/20”
Nº de animales 50 50

2.7.3. Diseño experimental

Experimento 1: Efecto de la criopreservación sobre la motilidad y viabilidad

espermática de semen congelado a diferentes concentraciones.

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 Este experimento nos determinara el número de espermatozoides necesarios para la
criopreservación de semen de alpaca. Para ello se evaluará la motilidad y viabilidad
espermática, de semen congelado a diferentes concentraciones (20 y 30 millones),
mediante el protocolo descrito anteriormente.

Experimento 2: Efecto de la adición de antioxidantes a los dilutores y la adición de

glicerol a diferentes temperaturas, sobre la motilidad y viabilidad espermática.

Obtenido los resultados del experimento 1, en este segundo experimento se añadirá

antioxidantes a los dilutores, además de ello, se evaluara la temperatura ideal para la
adición del glicerol (22ºC o 5ºC). Para ello se añadirá el glicerol a 5ºC, mediante el
siguiente procedimiento: primero las muestras serán diluidas con el diluyente A, a una
temperatura de 22º C, para luego ser enfriado a 5ºC, donde se añadirá el diluyente B, con
intervalos de 15 minutos entre ellas, obteniendo una concentración final de 5% de glicerol.
Posteriormente el semen se mantendrá en equilibrio por 2 horas a 5ºC, envasado en pajillas
y selladas con alcohol polivinilico, para luego ser congeladas en vapor de nitrógeno, según
el protocolo descrito anteriormente.
Al otro grupo en tratamiento se adicionara el glicerol a los 22ºC, la metodología es
similar, solo que, una ves agregado el diluyente A, se agregara el diluyente B a los 15
minutos, en dos fracciones con intervalos de 15 minutos entre ellas.

Experimento 3: Efecto de la temperatura de descongelación sobre la tasa de fertilidad

de alpacas inseminadas con semen criopreservado.

Se evaluara el efecto de la temperatura de descongelación del semen de alpacas

criopreservadas según el experimento 2, mediante la inseminación Artificial, para ello se
inseminara 100 alpacas en dos grupos. Donde en el 1er grupo se inseminaran 50 alpacas
hembras con semen criopreservado y descongelado a 37ºC por 30 segundos. Y el segundo
grupo se inseminara a 50 alpacas con semen criopreservado y descongelado a 42ºC en 20
segundos. En este experimento se evaluara la tasa de fertilidad en los dos grupos.

2.7.4. Análisis Estadístico.

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 Para las variables en estudio de motilidad y viabilidad espermática del 1er y 2do
experimento, serán procesados bajo un diseño completamente al azar cuyo modelo lineal
es el siguiente:

Yij = μ + τi + εij
i = 1 y 2 tratamientos,
j = 1, 2, 3… 30, repeticiones.
Donde:
Yij = Es la variable respuesta de la j-esima unidad experimental, sujeto al i-esimo
tratamiento,
μ = Es la media poblacional,
τi = Es el efecto del i-esimo tratamiento,
εij = Efecto verdadero de la j-esima unidad experimental (replica), sujeta al i-esimo
tratamiento (error experimental).

Los resultados serán analizados mediante el ANOVA en el S.A.S.

Para los resultados de la variable tasa de fertilidad, del 3er experimento, serán
analizados mediante la prueba de Chi-Cuadrado.

III. CRONOGRAMA DEL PROYECTO

Actividades Nov. Dic. Ene. Feb. Mar. Abr. May.

Elaboración del Proyecto XXXX XXXX

Aprobación del Proyecto XXXX

Ejecución del Proyecto XXXX XXXX XXXX

Análisis de Resultados XXXX

IV. PRESUPUESTO
Rubros Unidad de Cantidad Costo

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 medida
Insumos y material de laboratorio.
Dilutor ml 50 100
Nitrogeno liquido kg. 15 180
Alcohol polivinilico gr 100 45
Laminas porta objetos unidad 100 23
Laminas cubreobjetos unidad 100 15
Agua bidestilada litro 1 20
Pajillas unidad 100 50
Jeringas tuberculina unidad 100 50
Cinta para pH unidad 1 50
Coloración ml 40 ml 100
Papel toalla rollo 03-ene 6
Promazil ml 1 Fco 18
Xilonest ml 1 Fco 12
Antibiotico ml 2Fco 94
Furacin tubo 1 tubo 18
Hilo de sutura unidad 1 hilo 15
Vicril 5 cero unidad 3 hilos 36
Algodón gr 100 gr 4
Suero fisiologico litro 1 litro 9
Material de escritorio
Papel bond millar 1 8
Boligrafos unidad 5 3
Goma unidad 1 1
Folderes unidad 25 12.5
Servicio de computo
Tipeo hora 30 30
Impresión hoja 0,2 55
Fotocopiado hoja 1000 100
Rollo fotografico unidad 1 12
Revelado unidad 0,6 21,6
Cámara filmadora hora 20 20
Personal
Pastor mes 6 120
Cuidante mes 2 80
Pasajes unidad 4 200
Alimentación día 150 600
Total 2 082

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31