UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE FORMACION PROFESIONAL AGRONOMIA

PROGRAMA DE ESTUDIOS AGRONOMIA-OXAPAMPA

PRACTICA:
“TECNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MANIPULACIÓN ASÉPTICA”

CURSO:
BIOTECNOLOGIA AGRICOLA

ALUMNO:
AZANIA FABIAN, Chirstian Pablo

DOCENTE:
Blgo. Mg. GONZALES ARTEAGA, Javier Justo

SEMESTRE:
X
AÑO:

2019
 I. INTRODUCCIÓN

El laboratorio de cultivo de tejidos vegetales constituye de ambientes en donde

requieren de menor a mayor grado de limpieza, así como de menor a mayor
restricción de ingreso de personal. La asepsia reside principalmente en mantener
los ambientes aislados del ambiente exterior, la limpieza se realiza con mayor
exigencia en los pisos, muebles y repisas, usando desinfectantes y evitando el
ingreso directo de áreas con posible contaminación.
Es importante la desinfección del material biológico obtenido en el campo que
van hacer utilizados como donadores de explantes, asimismo, los materiales que
se van a utilizar en la manipulación de los mismos, deben estar esterilizados,
libres de contaminantes.

La desinfección de los explantes, se inicia con un buen lavado con agua y jabón
o detergente, después del enjuague respectivo, se agregan en alcohol al 70 %
que permite eliminar burbujas de aire y disolver la capa epicuticular y después
agregar en hipoclorito de sodio (NaClO) comercial 5%, diluido de 10 a 20% (v/v),
en algunos casos los agentes contaminantes pueden aparecer días más tarde
del sembrado del explante, debido a agentes infecciosos internos de la planta
madre, por ello muchas veces se agrega germicidas.
Finalmente, es oportuno mencionar que existen muchos resultados de
investigaciones que son utilizados diferentes concentraciones y tiempos de
exposición a los desinfectantes y enjuagues dependiendo del explante a utilizar.

II. Objetivos:
1. Establecer diferencias entre desinfección y esterilización.
2. Conocer las técnicas de desinfección del material biológico y del área en
donde se va a manipular los tejidos.
3. Conocer los métodos y fundamentos de la esterilización de materiales.
III. REVISIÓN DE BIBLIOGRAFÍA

TECNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MANIPULACIÓN ASÉPTICA

La esterilización es una técnica de saneamiento cuya finalidad es la desinfección
de toda forma de vida, aniquilando todos los microorganismos, tanto patógenos
como no patógenos, incluidas sus formas de resistencia (por ejemplo las
esporas, que son formas de resistencia de los gérmenes para poder sobrevivir
en condiciones desfavorables del medio ambiente, como calor o frío excesivo,
desecación, etc. (Meneses, S. 2009).
La esterilización sólo se puede aplicar sobre objetos o material inanimado,
mientras que la desinfección se aplica sobre objetos (desinfectantes) y sobre
tejidos vivos (antisépticos). Un objeto aséptico es un objeto estéril y, al trabajar
con él, decimos que se actúa con asepsia. La piel no se esteriliza sino que se
desinfecta (Bedoya,et al. 2016).
Meneses, S. 2009. Menciona que la reproducción asexual es utilizada para
obtener una gran cantidad de plantines a partir de una única planta. Dependiendo
del caso, se aprovechan bulbos (cebolla), cormos (gladiolos), rizomas
(helechos), tubérculos (papas), tallos (banana), raíces (batata o boniato,
manzana, mora), hojas (begonia, espada de San Jorge), estacas (vid), etc. Las
plantas obtenidas por propagación asexual o vegetativa son idénticas a la planta
madre e idénticas entre sí. En otras palabras, son clones.
Se denomina totipotencia a la capacidad de una célula de generar réplicas del
organismo del cual deriva. Restringida en animales, esta propiedad
característica de las plantas permite la supervivencia en condiciones
ambientales desfavorables o luego del ataque de herbívoros, plagas y
patógenos.
Héctor, et al 2005. Hace mención que el cultivo in vitro o la micropropagación se
inicia con la extracción de pequeños fragmentos de tejido tomados de diversas
partes de la planta, tales como hojas, raíces, segmentos nodales y gemas
axilares, gemas florales y apicales. Una vez limpios y desinfectados, los
explantes son transferidos en condiciones asépticas a un medio de cultivo
adecuado. Subcultivos periódicos de dichos explantes permiten la amplificación
del material y, más tarde, su diferenciación de modo de generar una planta
completa.
PREPARACION Y DESINFECCION DE EXPLANTES
Se debe desinfectar el lugar de trabajo con alcohol 96º. También es
recomendable lavarse bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, y
finalmente, pasarse alcohol 70º. Se debe desinfectar el lugar de trabajo con
alcohol 96º. También es recomendable lavarse bien las manos y los antebrazos
con agua y jabón, y finalmente, pasarse alcohol 70º. (Hurtado, D. y M. Merino.
1994).
PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para
obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir
la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar
entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones
controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias
óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un
crecimiento vigoroso y libre de enfermedades. (Pierik, R. 1990).
RECOLECCIÓN DE EXPLANTES
Toledo et al 1998. Menciona que para la recolección de explantes se utilizó:
frasco con ácido ascórbico; tijeras de disección; plantas seleccionadas; frasco
de acero inoxidable con alcohol; frasco de acero inoxidable con agua destilada.
Se inició el corte de las ramas de cafe eliminando sus hojas, dejando yemas
axilares y yemas apicales de 3 cm de largo, segmentados en la parte superior
en forma recta y el corte en bisel por la parte inferior, estos explantes fueron
sumergidos en una solución de ácido ascórbico a concentración de 1g/l para
evitar la oxidación fenólica.
DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los
cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de
hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará
una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las
bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el
material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. (Pierik, R. 1990).
A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de
flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos
explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación
para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección
del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída
durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua
esterilizada.
TRANSFERENCIA AL MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo puede estar distribuido en tubos de ensayo, en placas de
Petri o en frascos de diverso tamaño. Transferir los explantes en condiciones
asépticas, semejantes a las utilizadas para el cultivo de microorganismos.
Debido a la composición del medio, ni la humedad ni la disponibilidad de agua
son factores limitantes. Para garantizar la aireación del cultivo y una buena
oxigenación, se sustituyen las tapas de los frascos por PVC (Pierik, R. 1990).
IV . MATERIALES Y METODOS
4.1.1. MATERIAL BIOLOGICO
- Explante de yema apical de café
4.1.2 MATERIAL
-jara medidora - Colador
- Bisturí - Probeta
- Guantes -pizeta
- Solución CaOcl2, - benomilo
- Jabon liquido -Alcohol al 70 % y 96%
- Cámara de flujo laminar
- Agitador magnético
4.2. METODOS
La metodología empleada en esta práctica es experimental y se llevo el siguiente
procedimiento:
Para todos los explantes se utilizó un tratamiento en general, mismo que consistió en:
1. corte del explantes a un tamaño mas reducido
2. Eliminación del ácido ascórbico producto de la recolección de explantes, realizando
un enjuague con agua estéril.
3. se sumergió en jabón liquido por 2 min
4. Se sumergieron los explantes en benomilo por 5min
5. se sumergió los explantes en solución Caocl2 por 15 min
6. Posteriormente se realizó tres enjuagues con agua estéril para eliminar residuos.
7. Se reservaron los explantes en agua estéril, para posteriormente realizar el respectivo
proceso dentro de la cámara del flujo laminar.

Protocolos de desinfección para explantes utilizados dentro del flujo laminar

De acuerdo con los datos presentados en la tabla 3, los tratamientos se aplicaron
como sigue: 1. En la cámara de flujo laminar se colocó acido citrico de su
concentración durante 300 s, luego se retiró el líquido realizando seis enjuagues
para descartar los desechos.
2. Se aplicó alcohol a diferentes concentraciones y tiempos según tratamientos
establecidos.
3. Eliminación de residuos, realizando tres enjuagues con agua estéril, seguido
de ello se utilizó el hipoclorito de sodio en concentraciones y tiempos de acuerdo
con los tratamientos, realizando tres enjuagues con agua estéril para eliminar
residuos.
V. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en el laboratorio fue la obtención de explantes en
total asepsia llevada a cámara de flujo lamina para su cultivo in vitro y poder
tener una nueva planta clonada

En esta fotografía podemos

observar los implantes en la
cámara de flujo laminar listos
ya desinfectados diluidos en
una solución de acido cítrico,
todo el ambiente en total
asepsia .

En esta fotografía ya podemos

observar que los implantaes
de café ya serán sembrados
en un medio de cultivo.
 VI. CONCLUSIONES

Se pudo diferenciar entre esterilización y desinfección, la esterilización va

dirigida a destruir casi toda la vida microbiana y desinfección se refiere al
proceso por el medio del cual se destruye parte de la vida microbiana, la
esterilización lleva mas tiempo que la desinfección.
La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más
generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de
un explante de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con
plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más
usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas
de las plantas.
Además hemos logrado conocer el método mas eficaz para la
micropropagación in vitro que se ha desarrollado anterior mente .

VII. Cuestionario

VII.1 Mencione las sustancias químicas que se utilizan como desinfectantes del
material biológico y de las áreas de trabajo.
-Solución CaOcl2,
-Benomilo
-Alcohol al 70%
VII.2 Cuáles son los métodos de esterilización que se utilizan en el laboratorio
de cultivo de tejidos.
-Metodos físicos. Calor húmedo (autoclave), Calor seco (horno)
-Metodo quimico. Alcoholes, Etanol.

VII.3 Qué función cumple la autoclave y la cámara de flujo laminar en el

laboratorio de cultivo de tejidos.
La autoclave de esterilizar todo los materiales
La cámara de flujo laminar de mantener un ambiente en total asepsia sin contaminantes
 VIII BIBLIOGRAFIA

Meneses, S. (2009). Uso de distintos tratamientos de desinfección en el cultivo

in vitro de Dioscorea alata L. clon caraqueño. Centro de Estudios de
Biotecnología Vegetal, Facultad de Ciencias Agríc. Colomb. Biotecnol.
Bedoya, J.; C. Sánchez; S. Bermúdez y S. Ramírez. 2016. Estandarización
de un protocolo de desinfección y establecimiento de cultivo in vitro de Aloysia
tryphilla. Biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. Vol.14 N° 2
(38-46), julio-diciembre 2016. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v14n2/v14n2a05.pdf

Héctor, E.; M. Barrón; L. Godoy; B. Díaz; M. Hernández y A. Torres. 2005.

Un método para la desinfección y el establecimiento In vitro de la menta
japonesa (Mentha arvensis L.). Rev. Cultivos tropicales, vol. 26. N° 1, 2005
(69-71). Disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/1932/193215916011.pdf

Hurtado, D. y M. Merino. 1994. Cultivo de tejidos vegetales. Edit. Trillas, S.

A. México. Malajovich, M. S/f. Biotecnología: Enseñanza y divulgación.
Disponible en:
https://bteduc.com/guias_es/90_Micropropagacion_desinfeccion_explantes.pdf.

Pierik, R. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. 3ra. Edic. Artes
Gráficos palermo. Madrid-España.
Toledo J.; Espinoza, N.; Golmirzaie, A. 1998 Cultivo de Tejidos de plántulas
in vitro en la producción de semilla de papa. Centro Internacional de la Papa
(CIP). Manual de Capacitación. Lima, Perú.