ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ADA Y PANCA

1. OBJETIVO

Describir la técnica de los anticuerpos antinucleares para la cuantificación de

anticuerpos antinucleares.

2. INTRODUCCION

Paul Ehrlich, a comienzos del siglo XX se refirió a la posibilidad de que el sistema

inmunitario reaccionara contra los tejidos del mismo individuo y creó el término
autoinmunidad.
Una de las características más notoria de las enfermedades que resultan de
procesos autoinmunitarios es la presencia de auto anticuerpos, es decir,
inmunoglobulinas con especificidad para componentes antigénicos de nuestros
propios tejidos. Algunos de estos anticuerpos participan directamente en la
génesis de las reacciones que producen el daño tisular, pero en algunos casos
el papel que representan es incierto y en otros su significado es desconocido.
Sin embargo, la detección de estos anticuerpos en el suero de las personas es
de utilidad como marcadores de procesos autoinmunes. Algunos
autoanticuerpos reaccionan contra componentes presentes en todas las células.
Otros con antígenos particulares de tejidos y órganos. Los anticuerpos contra
antígenos de distribución general usualmente se asocian con enfermedades de
carácter sistémico.
Existen muchos métodos de laboratorio para la detección de autoanticuerpos, la
especificidad y sensibilidad de los mismos son diferentes. En los laboratorios se
deben usar aquellos métodos que son suficientemente sensibles sin sacrificar la
especificidad del examen.

Anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), detectados por primera vez

en 1982 por Davies, están fundamentalmente asociados a las vasculitis inmunes,
y se caracterizan por presentar dos tipos de imagine de inmunofluorescencia,
una perinuclear a nuclear (pANCA), asociadas a vasculitis inmunes como
poliarteritis microscópicas, panarteritis nodosa y glomerulonefritis idiopáticas, y
otra citoplasmática (cANCA), asociadas a anticuerpos anti PR3 (proteína 3).

Los ANCA son autoanticuerpos dirigidos contra proteínas de los gránulos

citoplasmáticos de neutrófilos y monocitos. Se determinan mediante
inmunofluorescencia indirecta y por el método de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA). Para un mejor diagnóstico se realiza primero la
inmunofluorescencia indirecta y después el ELISA, por lo que se logra la máxima
sensibilidad y especificidad.

Existen dos patrones principales de fluorescencia en la determinación de ANCA

mediante inmunofluorescencia indirecta. El patrón perinuclear (pANCA) ocurre
solamente cuando los neutrófilos son fijados en etanol, el cual permeabiliza la
membrana de los gránulos citoplasmáticos y permite que la mieloperoxidasa,
antígeno principal del pANCA, salga y se una a la membrana nuclear. Cuando
los neutrófilos son fijados en formalina el patrón pANCA se observa como
cANCA, ya que la mieloperoxidasa se mantiene en los gránulos. El patrón
 pANCA se observa de 70% a 80% de pacientes con poliangeítis microscópica y
en la granulomatosis eosinofílica.

ADA
La ADA es una enzima muy ubicua, fundamentalmente en aquellos tejidos con
gran participación linfoide (timo, bazo), en los hematíes y en la línea celular
monocito-macrófago. Una concentración elevada de ADA orienta hacia un
diagnóstico de pleuritis tuberculosa, concomitante con recuento celular de
predominio linfocitario.
La presencia de ADA está asociada en gran medida con la diferenciación y
proliferación linfocítica, y se considera un marcador de inmunidad mediada por
células. La determinación de ADA en LCR se ha encontrado útil en la predicción
de mal pronóstico neurológico en casos pediátricos de meningitis tuberculosa.
La medición de la actividad de la ADA en líquido de derrame pericárdico es de
utilidad en el diagnóstico de pericarditis tuberculosa.

3. IMPORTANCIA CLINICA

pANCA
Los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) son autoanticuerpos
producidos por el sistema inmune del organismo dirigidos erróneamente contra
proteínas de los neutrófilos (tipo de leucocito). La prueba ANCA detecta y mide
la cantidad de estos autoanticuerpos en sangre. Los autoanticuerpos dirigidos
contras las proteínas mieloperoxidasa (MPO) pANCA y proteinasa 3 (PR3)
cANCA constituyen dos de los tipos más comunes de ANCA.

Los ANCA pueden estar presentes en varios tipos de enfermedades

autoinmunes que ocasionan inflamación, lesión o daño tisular y fallo orgánico:

- Vasculitis sistémica: Conjunto de trastornos asociados a lesión y

debilitamiento de los vasos sanguíneos. Puede ocasionar lesión tisular y fallo
orgánico debido al estrechamiento de los vasos sanguíneos, con la
subsiguiente disminución del aporte de sangre hacia órganos y tejidos.
También puede producir un debilitamiento de las paredes de los vasos
sanguíneos que se traduce en aneurismas, y estos potencialmente pueden
romperse. Los signos y síntomas que presenta una persona con vasculitis
sistémica dependen del grado de actividad autoinmune y de las zonas del
organismo afectadas. Algunos tipos de vasculitis sistémicas se asocian a la
presencia de ANCA:

- Granulomatosis con poliangeítis (granulomatosis de Wegener)

- Poliangeítis microscópica

- Granulomatosis eosinofílica con poliangeítis (síndrome de Churg Strauss)

- Poliarteritis nodosa (PAN)

- Granulomatosis con poliangeítis se suelen encontrar con más frecuencia los

anticuerpos cANCA/PR3, mientras que en la poliangeítis microscópica es
más frecuente hallar anticuerpos pANCA/MPO. No obstante, ambos tipos de
 anticuerpos se pueden encontrar en los distintos tipos de vasculitis y con
distintos grados de reactividad.

- Colitis ulcerosa: constituye un tipo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII)

que se asocia a inflamación y lesión del tejido del revestimiento interno del
colon (intestino grueso). Puede resultar difícil distinguir entre CU y
enfermedad de Crohn (EC), que es otro tipo de EII que puede afectar a
cualquier tramo del tracto gastrointestinal. La presencia de ANCA atípicos
suele asociarse a CU (80% de los afectados), mientras que tan solo un 20%
de personas con EC presenta este tipo de anticuerpos.

ADA
La mayor parte de la actividad ADA se encuentra en los linfocitos y los monocitos,
siendo en ellos unas diez veces superior a la de los otros tejidos.
El interés por profundizar en el estudio de la ADA se inició al demostrarse la
asociación del déficit de esta con una inmunodeficiencia.
Parece evidente que las células más afectadas por un déficit de este enzima son,
por diversas circunstancias, los linfocitos T, que son mayormente dependientes
de la actividad ADA en comparación con el resto de las células del organismo;
por ello, no es de extrañar que en enfermedades que comporten una respuesta
inmune fundamentalmente de tipo celular, se haya encontrado una elevada
actividad de este enzima.

4. FUNDAMENTO TEORICO DE LA DETERMINACION

pANCA
En esta prueba se mezclan la sangre de la persona en cuestión con neutrófilos,
y la mezcla se trata con un colorante fluorescente (tinción fluorescente). En caso
de que existan ANCA se observará al microscopio un patrón de fluorescencia
determinado. El patrón puede ser de tipo citoplasmático (cANCA), perinuclear
(pANCA), o atípico (X-ANCA). El laboratorio puede además evaluar los
anticuerpos mieloperoxidasa o los anticuerpos proteinasa 3 directamente
empleando un ensayo de tipo ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a
enzimas). Cuando se sospecha la existencia de una vasculitis, a menudo se
combinan ambos tipos de pruebas, fluorescencia y ELISA.

ADA
El proceso de degradación de la adenosina es una desaminación
hidrolítica,catalizada por la ADA, en cuya reacción la adenosina es transformada
en inosina, al propio tiempo que se libera amoniaco unido al carbono 6 del núcleo
purínico transformándolo en grupo alcohólico (-OH), con lo que la adenosina es
degradada a inosina, al propio tiempo que libera amoniaco.

5. METODOLOGIA Y TECNICAS

Determinación de pANCA
Para la detección de ANCA se utiliza como sustrato neutrófilos humanos
adheridos en forma natural al vidrio. Fijación de los neutrófilos se realiza de la
siguiente manera: sumergir las improntas según corresponda 5 min en etanol
absoluto a 4 ºC o en formaldehido al 5% en PBS.
 La sensibilidad y especificidad de las técnicas ELISA para a-MPO y a-PR3 ha
ido aumentando desde los ELISA directos, técnicas de primera generación en
las que los antígenos se fijan directamente a la placa, a los ELISA de captura,
en los que se evitan cambios conformacionales, en PR3 o MPO, utilizando un
anticuerpo fijado a la placa que une el antígeno por epítopos distintos a los de
los autoanticuerpos (técnicas de segunda generación).
Los ELISA de tercera generación o de alta sensibilidad (hsELISA:
“highsensitivity” ELISA), utilizan una proteína como “anchor” o puente entre el
antígeno y la placa. Éstos últimos se postulan como un sistema que aún preserva
mejor las características antigénicas de PR3 y MPO, aunque existen estudios
que les atribuyen una sensibilidad similar a los ELISA de captura (13). Algunos
trabajos han detectado incluso una mejor capacidad diagnóstica de las técnicas
de primera generación para a-MPO, mientras que las de segunda o tercera
generación siguen siendo consideradas las más adecuadas para aPR3.

Recientemente han aparecido técnicas de quimioluminiscencia que, en algunos

casos, combinan técnicas con antígenos unidos directamente a la placa con
otras tipo “anchor”. Estas técnicas se han descrito equiparables a las técnicas
ELISA de última generación y presentan, junto a los ELISA fluorescente de
pocillo individual, la ventaja de la rapidez en la obtención de resultados y de
permitir carga contínua de muestras. De todas formas, su implantación es muy
reciente y se requieren más estudios para confirmar su utilidad.
Existen también en el mercado distintos métodos cualitativos como dot-blot o
inmunofluorescencia para el cribaje de a-MPO y a-PR3 .

Determinacion de ADA
La actividad de ADA se puede medir mediante métodos espectrofotométricos
basados en el diferente espectro de absorción de la adenosina y de la inosina, a
265 nanometros, pero estos métodos son poco prácticos para su uso en química
clínica. Ello ha hecho que se desarrollen métodos más sencillos, basados en la
medición del amoníaco liberado en la reacción catalizada por el ADA. En este
sentido los dos métodos más extendidos son los propuestos por Giusti y por
Blake y Berman.
El método de Giusti data del año 1974 y se basa en una modificación de la
reacción de Berthelot, en la que el amoniaco reacciona con hipoclorito sódico y
fenol en medio alcalino para formar el indofenol, un compuesto de color azul
cuya densidad óptica se lee a 628 nm. Como catalizador de la reacción se utiliza
el nitroprusiato de sodio. La reacción que cataliza la ADA se detiene tras un
período de incubación por la adición de fenol-nitroprusiato.
El método de Blake y Berman es más reciente, año 1982, y se basa en la
reacción del amoníaco con el α-cetoglutarato y NADPH para dar glutamato y
NADP.
Esta reacción es catalizada por la glutamato deshidrogenasa, midiéndose la
variación de absorción a 340 nm, debida a la desaparición de NADPH.

6. INTERPRETACION

pANCA
Los resultados de ANCA deben interpretarse cuidadosamente, considerando
múltiples variables. Se tendrán en cuenta los signos y los síntomas así como el
resultado de otras pruebas del laboratorio y de pruebas de imagen.
Vasculitis: Un resultado positivo a ANCA, PR3 y/o MPO va a favor de que el
proceso que afecta al individuo sea una vasculitis autoinmune sistémica; además
en función de los resultados, se podrá pensar en un tipo de vasculitis o en otro.
Sin embargo, el diagnóstico debe confirmarse con una biopsia de una zona del
organismo afectada.

Si el resultado a los ANCA es negativo, será poco probable que los signos y
síntomas sean debidos a una vasculitis.

Cuando el resultado de la prueba de microscopía con inmunofluorescencia

indirecta (IFI) es positivo, pueden observarse varios patrones de ANCA:

Perinuclear (pANCA) - la fluorescencia se produce esencialmente alrededor del

núcleo. En cerca del 90% de muestras con un patrón pANCA se detectan
anticuerpos MPO.
Citoplasmático (cANCA) - la fluorescencia se produce esencialmente en el
citoplasma. En cerca del 90% de muestras con un patrón cANCA se detectan
anticuerpos PR3.

Los ANCA pueden ser negativos - en estos casos no existe fluorescencia o muy
poca.
Si la prueba de los ANCA resulta positiva, se realizan pruebas adicionales para
determinar la cantidad de anticuerpo presente; es lo que se conoce como título
de anticuerpos. Para determinar el título de anticuerpos, se diluye de manera
seriada la muestra de suero y en cada dilución obtenida se verifica si se produce
o no reactividad. La mayor dilución en la que se siguen detectando anticuerpos
se corresponde con el título de anticuerpos. Por ejemplo, si el suero es positivo
después de haberlo diluido 64 veces, el título será 1:64. Cuanto más alto sea el
título, más cantidad de anticuerpo habrá en sangre.

Los niveles de ANCA pueden ir variando con el tiempo, y por este motivo pueden
emplearse a veces para la monitorización de la actividad de la enfermedad, y/o
para evaluar la respuesta al tratamiento; no obstante, en algunas ocasiones, los
títulos de anticuerpos pueden ser inconsistentes y no reflejar correctamente los
estados de remisión/ recaída.

Además, pueden realizarse pruebas específicas para anticuerpos MPO y PR3:

En más de un 80% de personas con granulomatosis con poliangeítis activa

(granulomatosis de Wegener) existen anticuerpos PR3 y un patrón cANCA o
pANCA.
Un resultado positivo para anticuerpos MPO junto con pANCA positivo es
consistente con poliangeítis microscópica, glomerulonefritis, granulomatosis
eosinofílica con poliangeítis (síndrome de Churg Strauss) y síndrome de
Goodpasture. En otras enfermedades autoinmunes también se pueden detectar
MPO y pANCA, por ejemplo en lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide
y síndrome de Sjögren.
ADA
Es probable que exista una infección tuberculosa de la pleura cuando una
persona con signos y síntomas sugerentes de tuberculosis tiene un aumento
marcado de los niveles de ADA en líquido pleural. Esto es especialmente cierto
si la persona afectada vive en un área geográfica en la que la prevalencia de la
tuberculosis es elevada.

Si la prevalencia de la tuberculosis es baja, el aumento de ADA en líquido pleural

puede ser atribuible a alguna otra causa como cáncer (linfomas), embolia
pulmonar, sarcoidosis o lupus eritematoso sistémico. Estos diagnósticos son
más probables cuando los niveles de ADA solo están moderadamente elevados.

Es poco probable que una persona tenga tuberculosis pleural si los niveles de
ADA en líquido pleural son bajos. Sin embargo, esto no descarta que no exista
una infección tuberculosa en alguna otra parte del organismo.

De manera similar, si al medir el ADA de algún otro fluido biológico (como líquido
peritoneal o liquido cefalorraquídeo) el resultado indica un aumento de sus
niveles, es probable que exista una infección tuberculosa en el área en cuestión.
7. BIBLIOGRAFIA
 Carlos A. Javier-Zepeda. Anticuerpos anti-nucleares Una familia diversa
http://www.bvs.hn/RMH/pdf/2002/pdf/Vol70-4-2002-8.pdf
 Revista Cubana de Reumatología. Importancia diagnóstica de los anticuerpos
antinucleares. http://scielo.sld.cu/pdf/rcur/v18s1/rcur04s16.pdf
 Prevalencia de marcadores serológicos ANCA y ASCA en una población con
colitis ulcerosa. Teresa Vergara A1,5, Pamela Cofré L1, Soledad Cifuentes A2,
Ursula Pulgar A2, Claudio Puebla A3, Susana Velasco P4
https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-
98872006000800003