FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA

MICHELLY CRISTINA MONTENOTE

AVALIAÇÃO DO FITOTERÁPICO DE Morus nigra NA EVOLUÇÃO DA

DOENÇA DE CHAGAS EM MODELO MURINO.

MARÍLIA
2016
 Michelly Cristina Montenote

Avaliação do fitoterápico de Morus nigra na evolução da doença de Chagas em modelo

murino.

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado

Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento”, da
Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Saúde e
Envelhecimento.

Orientadora: Profª. Drª. Luciamáre Perinetti Alves

Martins
Co-orientadora: Profª. Drª. Luciana Pereira Silva

Marília
2016
Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa, desde
que citada a fonte.

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília

M777a Montenote, Michelly Cristina.

Avaliação do fitoterápico de Morus nigra na evolução da
doença de Chagas em modelo murino / Michelly Cristina
Montenote. - - Marília, 2016.
72 f.

Orientador: Prof.ª Dr.ª Luciamáre Perinetti Alves Martins.

Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Luciana Pereira Silva
Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e
Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.

1. Amora. 2. Antioxidantes. 3. Estresse Oxidativo. 4.

Parasitemia. 5. Trypanosoma cruzi.
Michelly Cristina Montenote

Avaliação do fitoterápico de Morus nigra na evolução da doença de Chagas em modelo

murino.

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado

Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento”, da
Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Saúde e
Envelhecimento.

Comissão Examinadora:

____________________________________
Profª. Drª. Luciamáre Perinetti Alves Martins
Faculdade de Medicina de Marília

____________________________________
Prof. Dr. Rinaldo Henrique Aguilar da Silva
Faculdade de Medicina de Marília

____________________________________
Prof. Dr. Regildo Márcio Gonçalves da Silva
Universidade Estadual Paulista

Data da aprovação: ____________________

Dedico este trabalho primeiramente a Deus e
aos meus pais Aparecido e Zilda, a minha
irmã Grazieli e ao meu namorado Gustavo,
que sempre me deram apoio, amor e carinho
tornando tudo isso possível...
 AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, minha irmã e namorado, por sempre estarem ao meu lado. Sem vocês,
nada disso seria possível, amo vocês.

Em primeiro lugar, quero dirigir os meus agradecimentos especialmente a minha

orientadora Drª. Luciamáre Perineti Alves Martins e a minha co-orientadora Drª Luciana
Pereira Silva pela disponibilidade, pelo acompanhamento exercido durante a execução do
trabalho e ainda por acreditarem no meu potencial, me dando liberdade para que eu pudesse
aprender processos/métodos que tornaram esse trabalho de mestrado possível. Agradeço pelas
discussões/orientações que me fizeram não somente conquistar um sonho, mas que também
me fizeram ser a pessoa que sou hoje.

A Professora Dra. Elane de Fátima Taipeiro (in memoriam), por todos os momentos
dispensados, pelas contribuições importantes, conhecimentos repassados, gentileza e
dedicação na realização deste trabalho. E por ter disponibilizado seu laboratório para
realização de experimentos desta pesquisa. Será sempre para mim um exemplo de ética e
serenidade e profissionalismo.

Ao Professores Dr. Rinaldo Henrique Aguilar da Silva e Dr. Zamir Calamita, pela
valiosa colaboração no desenvolvimento deste trabalho, pelo apoio e críticas construtivas.

Ao professor Dr. Agnaldo Bruno Chies, por abrir as portas de seu laboratório para a
realização dos experimentos, bem como a Técnica Priscilla Ledo por todo carisma, dedicação
e auxílio aos experimentos.

Ao professor Dr. Regildo Márcio Gonçalves da Silva pelos conhecimentos

transmitidos e por abrir as portas de seu laboratório permitindo que parte dos experimentos
deste estudo pudessem ser realizados.

Ao Professor Dr. Altino Luiz Silva Therezo pelo auxílio e colaboração nas análises
histopatológicas.
 Ao Professor Dr. Sebastião Carvalho pelo auxílio prestado na pesquisa, através do
tratamento estatístico dos dados.

Aos queridos Vithor Zucarro Wajsman e Yoichi Konno pelo auxílio durante as
primeiras fases primordiais deste projeto, em especial pelas incansáveis horas de tratamento
dos animais e contagem parasitêmica. Vocês foram essenciais!

A todos os professores deste Programa, pelos valiosos conhecimentos que me foram

transmitidos.

Aos funcionários, Professor Dr. Roberto Castanho, Andréia, Rosângela, Maurício e

Léo do Departamento de Parasitologia da Faculdade de Medicina de Marília, que muito
colaboraram tornando possível a realização deste trabalho.

Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, em especial ao Amauri e Fabrício, pela

dedicação e gentileza no atendimento aos alunos.

Aos membros da banca examinadora que, gentilmente, se dispuseram a contribuir para

a análise, discussão e conclusão deste trabalho.

À bibliotecária Cláudia Lima Cabral Plate por toda sua gentileza e presteza no auxílio
na formatação do trabalho.

Aos grandes amigos do mestrado, em especial ao Arthur, Alessandra, Daniela, Elaine,

Marcus, Naira, Patrícia, Renata, Rosana, Ricardo e Stephanie que sempre tiveram uma
palavra amiga nos momentos difíceis me proporcionando motivação para tornar possível a
realização deste trabalho. Os levarei para vida! E ao meu grande amigo Lucas (in memoriam)
que infelizmente não pôde concluir esta jornada conosco, mas as histórias e lembranças e seu
exemplo de caráter permanecerão vivos em minha memória.

A todas as pessoas que de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste
trabalho, deixo o meu sincero reconhecimento.
 RESUMO

A doença de Chagas é uma infecção parasitária e inflamatória, causada pelo protozoário

Trypanosoma cruzi a qual apresenta duas fases características: aguda e crônica, sendo que a
fase crônica pode ser manifestada nas formas indeterminada, cardíaca ou digestiva. Estudos
recentes demonstram o aumento do estresse oxidativo associado com a progressão da doença
de Chagas e que o uso de elementos antioxidantes tem sido eficaz em diminuir o mesmo.
Terapias alternativas e/ou complementares têm sido estudadas e avaliadas, sendo que entre
elas destacam-se preparações à base de plantas, denominadas de fitoterápicos. Esta pesquisa
teve por objetivo avaliar o efeito do fitoterápico à base de Morus nigra na parasitemia durante
a fase aguda e seu potencial efeito antioxidante na evolução da fase crônica da doença de
Chagas, em camundongos “Swiss” infectados com a cepa QM2 de T. cruzi por meio de testes
in vitro. Foram realizados no fitoterápico os testes de sequestro de radical livre estável DPPH
(2,2-difenil-1-picrilhidrazil), teste FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), avaliação da
capacidade antioxidante contra a produção de óxido nítrico e a quantificação de fenóis e
flavonoides. Para determinar o efeito do fitoterápico sobre o dano oxidativo foi realizada
análise das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) e os testes de FRAP,
grupamentos sulfidrilas no plasma e glutationa eritrocitária para determinar o efeito de
diferentes concentrações do fitoterápico sobre a defesa antioxidante. Desta forma,
constatamos que o fitoterápico apresentou potencial antioxidante no estudo fitoquímico do
mesmo e que quando aplicado ao tratamento dos animais as diferentes dosagens atuaram de
forma distintas, onde a dosagem de 25 µL atuou mais significativamente na fase aguda e a
dosagem de 50 µL atuou na fase crônica melhorando a atividade de algumas defesas
antioxidantes e minimizando o processo inflamatório tecidual. Porém, os efeitos do álcool,
veículo de solução, representados pelo grupo controle, precisam ser melhor investigados uma
vez que podem ter tido influência sobre alguns dos resultados encontrados. Assim, podemos
considerar promissores os resultados encontrados neste estudo, no contexto de que um
limitado número de produtos naturais vem sendo testados como terapia complementar da
doença de Chagas, demonstrando importante atividade sobre o T. cruzi. Estudos mais
minuciosos são necessários principalmente em relação aos mecanismos de ação e
biodisponibilidade do fitoterápico, afim de colaborar com possíveis empregos farmacológicos
desta espécie.

Palavras-chave: Amora. Antioxidantes. Estresse oxidativo. Parasitemia. Trypanosoma cruzi.

 ABSTRACT

Chagas disease is a parasitic and inflammatory infection caused by Trypanosoma cruzi a

protozoan that has two characteristic phases: acute and chronic, and chronic phase can be
manifested in the indeterminate, cardiac and digestive forms. Recent studies show increased
oxidative stress associated with the progression of Chagas’ disease and the use of antioxidants
elements have been effective in decreasing this signs. Alternative and/or complementary
therapies have been studied and evaluated, and among them stand out herbal preparations,
called phytotherapics. This research aimed to evaluate the effect of Morus nigra phytotherapic
in parasitemia during the acute phase and its potential antioxidant effect in the evolution of
the chronic phase of Chagas’ disease in mice "Swiss" infected with T. cruzi QM2 strain, by
means of in vitro tests. The tets stable free radical sequestration tests DPPH (2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl), FRAP test (Ferric Reducing Antioxidant Power), evaluation of the
antioxidant capacity against nitric oxide production and quantification of phenols and
flavonoids were performed in the phytotherapic. To determine the effect of the herbal on
oxidative damage in mice was performed thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and to
determine the effect of different concentrations of the herbal on the antioxidant defense was
performed FRAP test, sulfhydryl groups in plasma and erythrocyte glutathione. Thus, we find
that the phytotherapic has the potential antioxidant of its phytochemical study and that when
applied to the treatment of animals different dosages acted in a different way, where the
dosage of 25 µL acted more significantly in the acute phase and the dosage of 50 µL acted in
the chronic phase improving the activity of some antioxidant defenses and minimizing tissue
inflammation. However, the effects of alcohol, the solution vehicle, represented by the control
group, need to be better investigated, since they have influenced on some results. So we can
consider the results of this study promising in the context of a limited number of natural
products has been tested as an adjunct therapy for Chagas’ disease, demonstrating significant
activity against T. cruzi. More detailed studies are needed especially regarding the
mechanisms of action and bioavailability of phytotherapic in order to collaborate with
potential pharmacological jobs of this kind.

Keywords: Blackberry. Antioxidants. Oxidative stress. Parasitemia. Trypanosoma cruzi.

 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Ciclo biológico da doença de Chagas ....................................................... 15

Figura 2 – Morus nigra em frutificação ..................................................................... 19

Figura 3 - Aspectos das folhas de Morus nigra ......................................................... 20

Figura 4 – Média logarítmica da parasitemia durante a fase aguda da doença de

Chagas do 7º ao 60º dia da infecção ........................................................................... 36

Figura 5 - Atividade sequestradora do radical livre (DPPH) ..................................... 40

Figura 6 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes

concentrações sobre o ensaio antioxidante teste FRAP expressos em média e
desvio padrão............................................................................................................... 42

Figura 7 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre a

peroxidação lipídica (teste TBARS), expressa em média e desvio-padrão ................ 43

Figura 8 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre os

grupamentos sulfidrilas expressa em média e desvio-padrão ................................... 45

Figura 9 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre a defesa

antioxidante glutationa reduzida, expressas em média e desvio-padrão ............... 46

Figura 10 - Preparação histológica corada pelo método hematoxilina-eosina

demonstrando presença de inflamação de intensidade leve “+” em cólon de animal
infectado com a cepa QM2 de T. cruzi pertencente ao grupo controle ...................... 50

Figura 11 - Preparação histológica corada pelo método hematoxilina-eosina

demonstrando a presença de ninho de amastigotas em musculatura esquelética de
camundongo tratado com 50μL/animal/dia do fitoterápico ....................................... 51

Figura 12 - Preparação histológica corada pelo método hematoxilina-eosina

demonstrando necrose miocárdica de intensidade leve “+” em animal infectado
com a cepa QM2 de T. cruzi pertencente ao grupo que recebeu 25μL/animal/dia do
fitoterápico ................................................................................................................. 52

Quadro 1 - Distribuição e tratamento dos animais de acordo com o delineamento

experimental ............................................................................................................... 30

Quadro 2 – Taxa de mortalidade dos animais ............................................................ 38

 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Parasitemia expressa por meio da média e desvio-padrão, durante a fase
aguda da doença de Chagas .......................................................................................... 36

Tabela 2. Atividade sequestradora de radicais livres (DPPH) e de NO, determinação

de fenóis, flavonoides totais e teste FRAP no fitoterápico de M. nigra ....................... 39

Tabela 3 – Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes

dosagens sobre o ensaio antioxidante teste FRAP em plasma (µM/L) na fase
crônica. Os dados estão expressos por meio da média, desvio padrão ......................... 41

Tabela 4 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes

dosagens sobre a peroxidação lipídica (µM/L) pelo teste TBARS em plasma na fase
crônica. Os dados estão expressos por meio da média, desvio-padrão ........................ 42

Tabela 5 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes

dosagens sobre grupamentos sulfidrilas (µM/L) em plasma na fase crônica, expresso
por meio da média, desvio-padrão ................................................................................ 44

Tabela 6 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre a GSH

(µM/gHb) reduzida na fase crônica, expressos por meio da média, desvio padrão... 46

Tabela 7 - Análise histopatológica realizada no músculo esquelético, músculo

cardíaco e cólon durante a fase crônica em camundongos experimentalmente
infectados pelo Trypanosoma cruzi cepa QM2 tratados com solução alcóolica
(controle) 25, 50 e 75 µL do fitoterápico de Morus nigra ............................................ 49
 LISTA DE ABREVIATURAS

AlCl3 Cloreto de alumínio

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CAT Catalase

DNA Ácido desoxirribonucleico

DO Densidade óptica

DPPH Radical livre estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

DTNB 2-ácido nitrobenzoico

EC50 Concentração efetiva em 50%

ERN Espécies reativas de nitrogênio

ERO Espécies reativas de oxigênio

FeCl3 Cloreto férrico

FeCl3.6H2O Cloreto férrico hexahidratado

FeII Sulfato ferroso

FRAP Poder antioxidante de redução do ferro

GPx Glutationa peroxidase

GS Grupamento sulfidrila

GSH Glutationa reduzida

Hb Hemoglobina

HCL Ácido clorídrico

iNOS Óxido nítrico-sintase induzida

IL-6 Interleucina 6

M nigra Morus nigra

MDA Malondialdehyde

NO Óxido nítrico

NPS Nitroprussiato de sódio

QM2 Quaraí Macarrão 2

SDS lauryl sulfate

SOD Superóxido dismutase

T. cruzi Trypanosoma cruzi

TBA Ácido tiobarbitúrico

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TPTZ 2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine

TPTZ Tripiridiltriazina

UV-Vis Espectroscopia no ultravioleta-visível

γ-GCS Sintetase γ-glutamilcisteína

 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 14
1.1 Doença de Chagas .......................................................................................................... 14
1.2 Ação pró-oxidante da doença de Chagas ..................................................................... 16
1.3 Morus nigra com potencial antioxidante ...................................................................... 19
2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 22
3 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 23
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 24
4.1 Obtenção e preparo do fitoterápico ........................................................................... 24
4.2 Determinações “in vitro” da atividade antioxidante ................................................... 24
4.2.1 Avaliação do sequestro do radical livre estável DPPH do fitoterápico ................. 24
4.2.2 Avaliação da atividade antioxidante do fitoterápico pelo método FRAP .............. 25
4.2.3 Determinação da capacidade antioxidante de captura do óxido nítrico ............... 26
4.2.4 Determinação de polifenóis totais do fitoterápico .................................................... 27
4.2.5 Determinação de flavonoides totais do fitoterápico ................................................ 27
4.3 Aprovação do comissão de ética ................................................................................... 29
4.4 Infecção dos camundongos ........................................................................................... 29
4.5 Forma de tratamento .................................................................................................... 30
4.6 Estudo da parasitemia ................................................................................................... 30
4.7 Eutanásia, obtenção e preparo do material ................................................................. 31
4.8 Estudo histopatológico ................................................................................................... 31
4.9 Determinações “in vitro” da atividade antioxidante e do estresse oxidativo ............ 32
4.9.1 Determinação da glutationa reduzida (GSH) ........................................................... 32
4.9.2 Determinação da capacidade antioxidante plasmática pelo método FRAP........... 33
4.9.3 Grupamentos sulfidrila totais no plasma ................................................................. 34
4.9.4 Espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) ............................................... 34
4.10 Análise estatística ......................................................................................................... 35
5 RESULTADOS ................................................................................................................. 36
5.1 Determinação da parasitemia na fase aguda ............................................................... 36
5.2 Taxa de mortalidade dos animais no estudo ............................................................... 37
5.3 Determinação in vitro da atividade antioxidante do fitoterápico .............................. 38
5.3.1 Quantificação de fenóis e flavonoides e avaliação antioxidante do fitoterápico
pelo método do sequestro do radical livre estável DPPH e NO e teste FRAP................ 38
5.4 Determinações bioquímicas in vitro da atividade antioxidante ................................ 40
5.4.1 Determinação da capacidade antioxidante plasmática pelo método FRAP........... 40
5.4.2 Espécies reativas do ácido tiobarbitúrico no plasma (TBARS) .............................. 42
5.4.3 Determinação dos grupamentos sulfidrila (GS) totais no plasma .......................... 44
5.4.4 Determinação da glutationa reduzida (GSH) ........................................................... 45
5.4.5 Histopatológico ............................................................................................................ 47
6 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 53
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 60
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 61
Anexo A - Laudo de qualidade da matéria prima do fornecedor da tintura ................. 70
Anexo B - Carta de aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais ..................... 71
Anexo C - Composição da ração padronizada para alimentação dos animais ............. 72
 14

1 INTRODUÇÃO

1.1 Doença de Chagas

A doença de Chagas é uma infecção parasitária e inflamatória, causada

pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi) descoberta em 1909(1) pelo médico sanitarista
Dr. Carlos Justiniano Ribeiro das Chagas, durante as pesquisas realizadas em uma campanha
contra a malária no Estado de Minas Gerais. Trata-se de uma zoonose, que inclui inúmeros
vertebrados como reservatórios e insetos triatomíneos que participam da cadeia de
transmissão. Estima-se que na América Latina cerca de 9,8 a 15 milhões de indivíduos
encontram-se infectados e destes cerca 3,5 milhões ocorrem no Brasil(2). Entre os indivíduos
infectados, 20 a 30% manifestam a doença, grande parte destes casos são observados em
idosos, pois estes pacientes encontram-se na fase crônica da doença.(3,4)
A infecção humana pelo vetor ocorre quando o barbeiro realiza a hematofagia e
elimina os tripomastigotas metacíclicos em suas fezes. Após a penetração na pele ou mucosas,
o T. cruzi penetra nas células do hospedeiro e o parasita se transforma na forma amastigota,
inicia o processo de multiplicação por meio de divisão binária, que dura aproximadamente 5
dias, quando então se transforma novamente em tripomastigotas. Sabe-se que o parasita, neste
processo, dependendo da cepa, leva menos de 20 minutos para adentrar a célula hospedeira e
desenvolve cerca de 2 a 9 ciclos até preencher o citoplasma, ocasionando assim a ruptura e
liberação dos novos tripomastigotas. Assim, com esta ruptura das células do hospedeiro,
diversos parasitas se disseminam pela corrente sanguínea e linfática, em busca de novas
células de diferentes tecidos e órgãos. Após a invasão destas novas células, em cerca de 2
horas, o parasita rompe sua membrana que o envolve inicialmente, levando cerca de 2 à 3
horas para se transformar em amastigota e de 24 a 44 horas para sintetizar DNA. Esta fase de
intensa multiplicação e invasão de células caracteriza a fase aguda da doença. Após, os
leucócitos acumulam-se em torno, desencadeado a primeira resposta imune do hospedeiro,
que depende da intensidade do parasitismo.(5-7)
O período de incubação pode variar de uma a três semanas e as principais regiões
atingidas são o coração, trato gastrointestinal e plexos nervosos, entretanto, no coração a
inflamação costuma atingir extensas áreas, quando fatores imunológicos assumem
participação relevante.(8)
 15

Figura 1 - Ciclo biológico da doença de Chaga

Fonte: World Health Organization.(9)

A doença de Chagas é caracterizada por duas fases, aguda e crônica, que na ausência
de tratamento específico, persiste ao longo da vida do indivíduo, podendo manifestar-se nas
formas indeterminadas, cardíacas ou digestivas. Na fase aguda, o elevado parasitismo
sanguíneo e tecidual, pode durar de 30 a 90 dias e é caracterizada pela insuficiência de sinais
e sintomas clínicos que passam despercebidos na maioria dos indivíduos infectados, embora,
em alguns casos, sinais e sintomas inespecíficos possam ser observados tais como febre,
taquicardia, linfadenopatia, esplenomegalia e edema. Tais manifestações ocorrem
principalmente em indivíduos imunossuprimidos e crianças, podendo ainda evoluir para uma
forma aguda mais grave com comprometimento cardíaco e encefalomielite.(1, 10)
Já na fase crônica a doença pode manifestar-se sintomática, desenvolvendo
manifestações clínicas cardíacas e digestivas ou, na forma indeterminada ou inaparente,
caracterizando-se por baixo nível de parasitemia e alto nível de anticorpos. O diagnóstico
laboratorial nesta fase pode ser realizado por diversas técnicas, porém todas com limitações.
Os exames parasitológicos indiretos são exames com 100% de especificidade, mas que não
podem ser considerados como padrão por terem sensibilidade limitada nessa fase da doença,
decorrente da parasitemia baixa e transitória(11). Assim, a doença na fase crônica quando
sintomática pode, por exemplo, apresentar sorologia reagente e/ou xenodiagnóstico positivo
na ausência de manifestações clínicas, cardíacas, digestivas ou nervosas, bem como
inexistência de alterações eletrocardiográficas e radiológicas do coração e do tubo digestivo.(9,
12, 13)

Portanto, ao mesmo tempo em que a infecção aguda abrange mais células de

diferentes tecidos e a parasitemia aumenta, ocorre intensa atividade celular e a produção de
 16

anticorpos começa a ser ativada pela resposta imune. Como consequência o número de
parasitas circulantes cai progressivamente, a ponto do indivíduo não apresentar qualquer
sintomatologia clínica, e os protozoários que não foram eliminados pela resposta imune ao
fim da primeira fase poderão permanecer viáveis no interior das células infectadas,
caracterizando a fase crônica da doença. Apesar de ter ou não apresentado forma aguda,
podem ou não evoluir para a forma sintomática da doença, onde geralmente ocorre um
equilíbrio entre parasita e hospedeiro, sem sintomatologia clínica, denominada de fase
indeterminada.(5, 7)
Cerca de 30% dos indivíduos infectados que adquiriram a infecção na infância
desenvolvem a fase crônica sintomática após a infecção antes dos 30 anos de idade(14). Por sua
evolução crônica com diferentes perfis de morbimortalidade nas formas cardíaca e digestiva,
destaca-se o elevado impacto econômico devido a gastos decorrentes de internação,
absenteísmo, licença saúde e óbitos precoces.(15)
O controle vetorial da transmissão da doença de Chagas tem resultado em queda
acentuada da incidência de novos casos nos últimos anos. Porém, isto não significa o fim das
repercussões de uma doença crônica. Avanços no tratamento específico para os pacientes
crônicos adultos e idosos, os quais refletem a grande maioria dos chagásicos brasileiros,
devem superar as dificuldades do diagnóstico precoce e da erradicação do vetor. Isto pode
resultar em cada vez mais chagásicos idosos, caracterizando um grande desafio para as
pesquisas e serviços de saúde, principalmente em termos da assistência médica para os
indivíduos já infectados e da manutenção da vigilância epidemiológica. Esta ausência de
investigações sobre a doença em indivíduos idosos contrasta com a importância da
enfermidade nessa faixa etária para a compreensão de diversos fatores ainda não
esclarecidos.(16-18)

1.2 Estresse oxidativo na doença de Chagas

Os radicais livres são conhecidos mediadores da sinalização intracelular. Sua

produção excessiva, no entanto, pode levar a um estresse oxidativo, a perda de funções
celulares, podendo ocasionar ainda, apoptose ou necrose celular. Um equilíbrio entre os
sistemas oxidantes e antioxidantes intracelulares é, portanto, vital para o funcionamento
celular, regulação e adaptação a diversas condições de crescimento.(19)
 17

Alguns dos produtos das espécies reativas de oxigênio (ERO) e das espécies reativas
de nitrogênio (ERN) como o superóxido (O2•-) e o óxido nítrico (NO), que são produzidos por
enzimas durante o metabolismo celular normal, têm um papel importante na sinalização
celular e regulação destes radicais livres no controle fisiológico. No entanto, condições
inflamatórias podem conduzir ao aumento das concentrações destes produtos de maneira
drástica, resultando na formação de outros oxidantes mais reativos. Assim, sob estas
condições, as defesas antioxidantes podem tornar-se sobrecarregadas causando danos
biológicos aos lipídios, proteínas, DNA e ainda interferir nos mecanismos normais de
sinalização celular comprometendo, assim, a viabilidade celular.(20-22)
Os sistemas de defesas antioxidante uma vez responsáveis por inibir e reduzir os
danos causados pelos radicais livres atuam impedindo a formação e ação dos radicais livres
ou espécies reativas ou ainda favorecendo o reparo e a reconstituição das estruturas biológicas
lesadas, seja desde a remoção do oxigênio do meio, varredura dos radicais livres, sequestro
dos metais catalizadores em sua formação, aumento da geração de antioxidantes endógenos
ou por interação de mais de um mecanismo(23, 24). Estes sistemas são divididos em enzimático
e não-enzimático.
O sistema de defesa antioxidante não-enzimático é constituído por grande variedade
de substâncias antioxidantes, especialmente, os compostos antioxidantes de origem dietética
tais como: ácido úrico, carotenoides, flavonoides, fitoestrogênios, polifenóis, terpenos e
vitaminas A, C e E, que podem ter origem endógena ou dietética(25). Já o sistema enzimático é
formado por diversas enzimas, destacando-se a superóxido dismutase (SOD), a catalase
(CAT), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa reduzida (GSH).(23, 26)
O estresse oxidativo também está presente em doenças inflamatórias, incluindo a
doença de Chagas que é caracterizada por uma inflamação crônica(27). Estudos demonstram
que o aumento do estresse oxidativo está associado com a progressão da doença(27, 28) e que o
uso de elementos antioxidantes tem sido eficaz em diminuir o mesmo, podendo influenciar no
curso da doença de Chagas.(29, 30)
Apesar dos avanços no sentido de elucidar os mecanismos moleculares que regulam
a patogenidade do T. cruzi, este parece ser um processo envolvendo diversas etapas ainda não
completamente esclarecidas.(31, 32)
De acordo com Maçao(29) e Oliveira(28) o aumento do estresse oxidativo está
diretamente associado com a progressão da doença de Chagas e a utilização de intervenções
antioxidantes tem sido eficaz em atenuar os danos oxidativo causados pela doença. Resultados
 18

estes que confirmam o demostrado por Budni(27) que avaliou o efeito do carvedilol; fármaco
com potencial ação antioxidante; sobre marcadores de estresse oxidativo na doença de Chagas
na fase crônica em pacientes portadores de cardiopatia chagásica crônica. Foram dosados
diferentes marcadores do estresse oxidativo, antes e após o tratamento com o fármaco
antioxidante, revelando uma atenuação significativa do dano oxidativo, um efeito que pode
ser particularmente importante na doença de Chagas crônica.
Dentro deste contexto, estudos têm demonstrado a eficácia de diferentes fitoterápicos
na ação antioxidante de diferentes doenças. El-Sayyad(33) destacou a atuação de alguns
suplementos fitoterápicos na melhoria dos distúrbios oculares, entre eles um proveniente do
gênero Morus. Allkanjari(34) descreveu quanto a utilização da fitoterapia em pacientes
portadores de hiperplasia de próstata benigna, alguns de seus ensaios clínicos randomizados
indicaram eficácia significativa na melhora dos sintomas urinários e originando efeitos
adversos leves nos pacientes que receberam a fitoterapia, demonstrando que ela pode ser útil
em pacientes com sintomas leves e moderados.
Vários estudos utilizando plantas medicinais para o tratamento de doenças associadas
a infecções por protozoários e outros microrganismos estão sendo descritos, seja
demonstrando atividade citotóxica de espécies de plantas contra as formas de T. cruzi(35), seja
por meio da inibição do desenvolvimento das diferentes formas de T. cruzi(36, 37), ou ainda por
meio da utilização de plantas com potencial tripanocida(38). De acordo com estes resultados,
podemos considerar que plantas medicinais podem representar uma valiosa fonte de novos
compostos bioativos para o tratamento terapêutico da tripanossomíase.
Sabe-se que os fitoterápicos atuam em função dos princípios ativos que as plantas
possuem como resultado do seu metabolismo secundário; são medicamentos preparados
exclusivamente com plantas ou partes de plantas medicinais como raízes, cascas, folhas,
flores, frutos ou sementes, que possuem propriedades reconhecidas de cura, prevenção ou
tratamento sintomático de doenças, como estabelecido na normativa da Resolução-RDC nº10
da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).

1.3 Morus nigra com potencial antioxidante

De acordo com Yunes(39), os princípios ativos presentes na planta como um todo, ou

em parte dela, na forma de extrato absoluto ou processado é o que origina o medicamento
 19

fitoterápico. E quando se procura obter estes princípios ativos, um dos principais aspectos a
ser observado consiste nas informações da etnomedicina, ou seja, da medicina popular, onde a
atividade farmacológica da planta, é resultado da ação de um ou mais princípios ativos
presentes. Assim, as plantas medicinais podem ser utilizadas contendo todos os constituintes
presentes no vegetal sob a forma de infusão, óleos essenciais e tinturas, ou podem ainda ser
utilizadas também para fornecer os princípios ativos isolados.(40)
Morus nigra, conhecida popularmente como amoreira, amoreira-negra ou amora-
preta, destaca-se por seus frutos comestíveis de sabor agridoce e ainda pela ampla utilização
popular de suas folhas na terapia complementar para o diabetes mellitus como
hipoglicemiante(41, 42)
, para reposição hormonal durante a menopausa e também para
atenuação dos sintomas do climatério(43). Estudos ainda destacam sua utilização como
analgésico, antiinflamatório, antitérmico, antisséptico, cicatrizante, depurativo e diurético,
anti-helmíntico e emético.(44-46)

Figura 2 – Morus nigra em frutificação

Fonte: Base de dados nacional de espécies exóticas invasoras.(47)

Freitas(48) utilizando extrato de folhas de Morus nigra avaliou o potencial inibitório

da tirosinase, bem como caracterizou o perfil cromatográfico e citotoxicidade do extrato com
o intuito de avaliar a viabilidade de incorporação em produtos cosméticos, a fim de se tornar
uma nova opção terapêutica de origem natural. Com os resultados obtidos puderam considerar
um agente de clareamento promissor de fonte natural contra hiperpigmentação cutânea, uma
vez que controlou a produção de melanina (melanogênese).
Morus nigra pertence à família Moraceae e caracteriza-se por ser uma árvore
caducifólia, podendo atingir de 5 a 20 metros de altura. As folhas são grossas, cordiformes,
simples e alternas. As flores são unissexuais; as masculinas monoclamídeas, isostêmones e as
 20

femininas aclamídeas, com ovário súpero, bi ou unicarpelar, unilocular e uniovulado, com

estigmas bífidos. Ocorrem na Ásia em áreas de clima tropical, subtropical e zonas temperadas
da Europa, América do Norte e do Sul e África, estando plenamente aclimatada no Brasil.(44,
49 - 51)

Figura 3 – Aspectos das folhas de Morus nigra

Os metabólitos secundários são substâncias naturais com potenciais antioxidantes,

antimicrobianos e imunomoduladores produzidos pelas plantas na tentativa de se adaptarem
às agressões do meio ambiente. Entre essas substâncias estão presentes distintos grupos de
compostos químicos, como compostos fenólicos.(52)
Diferentes grupos de compostos químicos têm sido investigados no gênero Morus,
tais como alcaloides, cumarinas, flavonoides, triterpenos e esteroides. Pesquisas vêm sendo
realizadas para a comprovação da ação destes compostos em receptores específicos, com
destaque aos compostos fenólicos presentes nas folhas e frutos de Morus nigra por
apresentam amplo espectro de atividade bioquímica, tais como propriedades antioxidantes,
antimicrobianas, antimutagênicas e imunoreguladoras.(44, 50, 52)
A atividade antioxidante da Morus nigra deve-se à presença de estruturas químicas
denominadas compostos fenólicos. A principal atividade antioxidante dos compostos
fenólicos é devida às suas propriedades de óxido-redução, as quais podem desempenhar um
importante papel na absorção e neutralização de radicais livres(53, 54)
. Os flavonoides,
metabolitos secundários da classe dos polifenóis, possuem diferentes categorias com
múltiplos efeitos biológico de acordo com os estados de oxidação de sua cadeia, tais como
atividade antioxidante, antiinflamatória, antitumoral, entre outros.(54)
Neste contexto, considerando o seu difundido uso popular e o número de
informações cientificas sobre a atividade antioxidante, antiinflamatória e antienvelhecimento
 21

da Morus nigra, a realização desta pesquisa permitirá o aumento do conhecimento sobre a

utilização do seu fitoterápico na evolução da doença de Chagas, elucidar relatos etnobotânicos
de sua utilização e enriquecer o conhecimento científico desta espécie amplamente empregada
como planta medicinal.
 22

2 JUSTIFICATIVA
As investigações de compostos naturais, principalmente de origem vegetal, já
consagrados na medicina popular, podem auxiliar significativamente no processo de
descoberta de novos compostos e elucidação de suas atividades terapêuticas. Assim, por
possuírem compostos com atividade antioxidante e antiinflamatória, os fitoterápicos a base de
Morus nigra poderiam influenciar na progressão da doença de Chagas; apesar da atividade
antioxidante de diversos compostos ativos e potenciais nutricionais desta espécie já terem sido
descritas em estudos anteriores; estas funções do fitoterápico na doença de Chagas, não tem
sido explorado. Desta forma, este trabalho se justifica por aumentar o conhecimento científico
sobre a atividade do fitoterápico e possível benefício de sua utilização nesta e em outras
patologias.
 23

3 OBJETIVOS

Objetivo geral

Avaliar o efeito antioxidante e antiinflamatório do fitoterápico na progressão da

doença de Chagas.

Objetivos específicos

Quantificar os polifenóis e flavonoides totais do fitoterápico e determinar a atividade

antioxidante do fitoterápico por meio de determinações in vitro de sequestro de radical livre
estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), Teste FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
e determinação da capacidade antioxidante de captura do óxido nítrico (NO).
Determinar o efeito do fitoterápico na progressão da parasitemia em modelo murino
durante a fase aguda da doença de Chagas.
Determinar a influência do fitoterápico no desenvolvimento do processo inflamatório
na fase crônica da doença de Chagas.
Determinar o efeito do fitoterápico sobre o dano oxidativo oriundo da infecção no
plasma, por meio da determinação da peroxidação lipídica e o efeito das diferentes dosagens
do fitoterápico sobre a defesa antioxidante no plasma determinada pela capacidade
antioxidante total (FRAP), grupamentos sulfidrilas e glutationa reduzida.
 24

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Obtenção e preparo do fitoterápico

O fitoterápico na forma de tintura a base das folhas de Morus nigra, foi adquirido de
uma farmácia de manipulação do município de Assis – SP, bem como o laudo de qualidade da
matéria prima do fornecedor da mesma (Anexo A). A tintura foi armazenada de acordo com
recomendações farmacotécnicas informadas em seu laudo de qualidade. O fitoterápico foi
diluído em diferentes concentrações, as quais, posteriormente, foram empregadas nos testes in
vitro de atividade antioxidante, bem como na determinação de polifenóis e flavonoides. Já
para o tratamento dos animais, foi administrado o fitoterápico puro em diferentes dosagens
conforme a distribuição dos grupos de estudo.

4.2 Determinações “in vitro” da atividade antioxidante do fitoterápico

Para a determinação da atividade antioxidante do fitoterápico, contamos com a

colaboração do Laboratório de Fitoterápicos, do Departamento de Ciências Biológicas,
Faculdade de Ciências e Letras, da Universidade Estadual Paulista, Campus Assis-SP.

4.2.1 Determinação do sequestro do radical livre estável DPPH do fitoterápico

Originalmente foi proposto para descobrir doadores de hidrogênio em produtos

naturais e atualmente é uma dos métodos mais utilizados para verificação da atividade
antioxidante(55). Este método baseia-se na inibição de radicais DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazil) na transferência de elétrons de um composto antioxidante para um oxidante,
assim um radical estável de coloração violeta, aceita um elétron ou um radical hidrogênio
(H+) para tornar-se uma molécula estável, sendo reduzido na presença de um antioxidante e
adquirindo coloração amarela, possuindo uma absorção máxima característica a 517 nm(55-57).
Normalmente é expresso em valor EC50, concentração de antioxidante necessária para captar
50% dos radicais de DPPH num período de tempo determinado.(58)
Para esta determinação o fitoterápico foi diluído nas concentrações de 25, 50, 75,
100, 250, 500 μL/mL e tintura pura. Os experimentos foram realizados em triplicata para fins
estatísticos, utilizando a solução de 1mL de tampão acetato (pH 5,5 e 100 mM), 1 mL de
 25

etanol P.A., 500 μL de solução de DPPH (250 μM) e de 50 a 100 μL das amostras. O
fitoterápico reagiu com o radical DPPH por um período de 30 minutos em ambiente de pouca
luminosidade e, em seguida, realizou-se a leitura em espectrofotômetro UV-Vis em
comprimento de onda de 517 nm(59). O cálculo da atividade antioxidante foi realizado de
acordo com a fórmula:

Atividade antioxidante (%) = [(Acontrole – Aamostra) / Acontrole] x 100

Aamostra = absorbância das amostras após 30 minutos

Acontrole = absorbância do DPPH.

4.2.2 Determinação da atividade antioxidante do fitoterápico pelo método FRAP

O teste FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) é um método simples,

permitindo ser vastamente utilizado em diferentes estudos(60-63), com intuito de medir a
capacidade de redução férrica, sendo também utilizado para avaliação da capacidade
antioxidante. Para a determinação da atividade antioxidante por meio da redução do ferro, foi
utilizado a metodologia descrita por Pulido e Rufino(64, 65) com algumas modificações. Este
ensaio utiliza um sistema com o íon de ferro que, em baixo pH, forma um complexo
Fe3+/tripiridiltriazina (TPTZ) de cor acastanhada; a presença de antioxidantes na amostra
reduz o ferro à forma ferrosa (Fe2+), de intensa cor azul, cuja absorbância é lida a 593 nm.
O reagente FRAP foi preparado no momento da análise, por meio da mistura de 25
ml de tampão acetato (300 mM, pH 3,6), 2,5 ml= de solução TPTZ (10 mM TPTZ em 40 mM
de ácido clorídrico - HCL) e 2,5 ml de cloreto férrico (FeCl3) a 20 mM em solução aquosa.
Uma alíquota de 100 µl da solução de extrato foi adicionado a 3 ml do reagente FRAP e a
mistura foi incubada a 37°C em banho-maria por 30 minutos. As absorbâncias foram medidas
após o período de incubação e o espectrofotômetro foi zerado com a solução FRAP. A curva
de calibração foi obtida com sulfato ferroso (100-2000 µM), e os resultados expressos em
µmol Fe2+/mL amostra.
Uma curva Padrão de Trolox 1000 µM e álcool etílico absoluto, foi preparada a
partir da solução padrão de Trolox 1000 µM, nas concentrações de 30 µM, 50 µM, 100 µM,
250 µM e 500 µM. Em ambiente escuro, foi transferida uma alíquota de 90 µL de cada
solução de Trolox para tubos de ensaio. Foi acrescentado 270 µL de água destilada e
 26

misturado com 2,7 mL do reagente FRAP. Após, foi homogeneizado e mantido em banho-
maria a 37ºC por 30 minutos. A leitura procedeu-se em espectrofotômetro a 595 nm. O
reagente FRAP foi utilizado como branco para calibrar o espectrofotômetro. A partir das
absorbâncias obtidas foi calculado a concentração em µM equivalente Trolox presente na
amostra na equação da reta da curva-padrão de Trolox (y = 0,0018x+0,1278).

4.2.3 Determinação da capacidade antioxidante de captura do óxido nítrico

O óxido nítrico é uma importante molécula envolvida na resposta imune além de

outros sistemas. Substâncias que sequestrem o radical NO podem desempenhar um
importante papel modulando os processos inflamatórios, diminuindo o estado de estresses
oxidativo, podendo apresentar-se como alternativa terapêutica para algumas dessas
desordens.(66)
O método utilizado para determinação desta capacidade do fitoterápico, foi baseado
na metodologia de Griess(67) com adaptações. O nitroprussiato de sódio (NPS) libera o óxido
nítrico que ao reagir com o oxigênio forma o nitrito. Assim, o extrato com atividade
antioxidante deve ser capaz de impedir que o óxido nítrico se ligue ao oxigênio. O reagente de
Griess por sua vez cora o nitrito formado. Assim, quanto menor as absorbâncias, menos
nitrito foi formado, logo o extrato foi capaz de sequestrar o NO (68). Objetivou assim, avaliar a
concentração de compostos presentes no fitoterápico que sejam capazes de sequestrar o
radical NO.
O experimento foi realizado em triplicata, no qual foi transferido uma alíquota de
320 µL de cada diluição dos extratos para tubos de ensaio e acrescentado 360 µL de solução
de NPS 25 mM e 215 µL de reagente de Griess. Após, foi preparado um controle negativo,
com 320 µL de solução tampão e 360µL de NPS 25 mM e um controle positivo com ácido
gálico 1000 µg/mL. Os tubos foram cobertos com papel alumínio e levado em banho-maria
durante 150 minutos a temperatura de 37°C. Após a retirada do banho os tubos foram
deixados em repouso por mais 60 minutos.
Para o preparo da curva padrão, a partir da solução padrão de nitrito de sódio de 500
µM/mL, foram preparadas soluções variando a concentração de 5 a 60 µM/mL. Após, foi
transferido uma alíquota de 320 µL de cada solução de nitrito de sódio (5, 10, 20, 30, 40, 50 e
60 µM/mL) para tubos de ensaio, acrescentado 360 µL de solução tampão fosfato e 200 µL de
Reagente de Griess. Os tubos foram cobertos com papel alumínio e levados em banho-maria
 27

durante 30 minutos a temperatura de 37°C e, depois de retirado do banho, ficaram em repouso

por mais 10 minutos. Para o branco foi utilizado apenas solução tampão fosfato.
A reação produz uma coloração rósea possuindo intensidade de cor em proporção
direta com a concentração de nitrito na amostra.
As leituras das absorbâncias foram realizadas em espectrofotômetro UV-Vis a 540
nm e, a partir das absorbâncias obtidas, foram calculadas a média e a concentração de nitrito
formado em µM/mL na amostra por meio da equação da reta: y = 0,0052x + 0,0349 obtida da
curva padrão.

4.2.4 Determinação de polifenóis totais do fitoterápico

Conforme descrito por Singleton(69) o método utilizado para a determinação dos

polifenóis totais foi o de Folin-Ciocalteu utilizando-se ácido gálico como padrão de
comparação. O ensaio baseia-se numa mistura de ácidos fosfotunguístico e fosfomolibídico de
coloração amarelada em um meio básico. Assim, os polifenóis contidos nas amostras são
energeticamente oxidados em meio básico, resultando na formação do O2 -, que reage com os
ácidos formando compostos de coloração verde com uma intensa absorção em 750 nm.
O experimento foi realizado em triplicata e com auxílio de micropipeta foi
transferida uma alíquota de 0,1 mL do fitoterápico, em seguida foi acrescido 5 mL de água
deionizada e 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteu. Para o branco, foram utilizados 5,1 mL de
água deionizada com 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteu. Depois de homogeneizadas e em
repouso por 3 minutos em temperatura ambiente foi adicionado 1,4 mL de solução de
carbonato de sódio 25% e 3 mL de água deionizada. Novamente as soluções foram
homogeneizadas em agitador de tubos e mantidas no escuro em temperatura ambiente por 1
hora. A leitura da absorbância foi feita em espectrofotômetro UV-Vis 765 nm.
Uma curva padrão foi preparada a partir de 0,1 mL de cada solução de ácido gálico
(25, 50, 75, 100, 250 e 500 µg/mL) pipetada em tubos de ensaio, após foi adicionado 5 mL de
água deionizada e misturado com 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteu. Para o branco foi
utilizado 5,1 mL de água deionizada e 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteu. Após 3 minutos
em temperatura ambiente foi acrescido 1,4 mL de solução de carbonato de sódio 25% e 3 mL
de água deionizada. As soluções foram homogeneizadas em agitador de tubos e mantidas no
escuro em temperatura ambiente por 1 hora. A leitura foi realizada a 765 nm.
 28

A partir das absorbâncias obtidas do extrato, foram calculadas a média e a

concentração de polifenóis totais em µg/mL equivalente ácido gálico presente na amostra por
meio da equação da reta da curva-padrão de ácido gálico (y=0,0012x+0,0003). Os resultados
presente nas amostras foram expressos em polifenóis totais equivalentes de ácido gálico
(µg/mL).
O padrão ácido gálico (pureza≥ 98%) foi obtido da Sigma (EUA).

4.2.5 Determinação de flavonoides totais do fitoterápico

A dosagem dos flavonoides totais do fitoterápico foi quantificada por

espectrofotômetro UV-Vis e as amostras foram preparadas segundo a metodologia de
Zhishen(57) baseado na complexação dos flavonoides com AlCl3 (cloreto de alumínio),
ocorrendo o deslocamento das bandas de absorção para maiores comprimentos de onda.
Uma alíquota de 1 mL da amostra do fitoterápico, foi misturada a 4 mL de álcool
70% e 0,5 mL de solução de nitrito de sódio 5%. Depois de 6 minutos foi adicionado 0,5 mL
de solução de cloreto de alumínio 10% e 3 mL de solução de hidróxido de sódio 1 M. Após,
foi acrescido 1mL de água destilada e a solução em seguida homogeneizada em agitador de
tubos e mantida em repouso por 15 minutos à temperatura ambiente.
Para a curva padrão foi utilizado de 1 mL de cada solução de rutina (25, 50, 75, 100,
250 e 500 (µg/mL)), acrescida de 4 mL de álcool 70% e 0,5 mL de solução de nitrito de sódio
5%. Após 6 minutos foi adicionado 0,5 mL de solução de cloreto de alumínio 10%, 3 mL de
solução de hidróxido de sódio 1M e 1 mL de água destilada. Em seguida as substâncias foram
homogeneizadas em agitador de tubos e mantidas em repouso por 15 minutos em temperatura
ambiente. A leitura das absorbâncias foi feita em espectrofotômetro UV-Vis a 510 nm. Já para
o branco foram adicionados todos os reagentes exceto a solução de rutina.
A partir das absorbâncias obtidas, foram calculadas a média e a concentração de
flavonoides totais em µg/mL equivalente de rutina presente na amostra por meio da equação
da reta da curva-padrão de rutina (y=0,0012x+0,0168). Os resultados presentes nas amostras
foram expressos em flavonoides totais equivalentes a rutina (µg/mL).
O padrão rutina (pureza ≥ 97%) foi obtidos da Sigma (EUA).
 29

4.3. Aprovação da comissão de ética

A Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina de

Marília/CEUA-FAMEMA aprovou o uso dos animais para experimentação nesta pesquisa sob
protocolo de estudo nº178/14 em 30 de abril de 2014 (Anexo B)
Nesta pesquisa foram utilizados 96 camundongos “Swiss” machos de 20 dias de
idade, pesando aproximadamente 23 g. Esses animais foram divididos em oito grupos de 12
camundongos cada e mantidos em 12 gaiolas do tipo caixa de polipropileno medindo
33x40x16,5cm com tampa superior, comedouro e bebedouro, armazenados no Biotério de
Manutenção do Laboratório de Parasitologia onde receberam ração padrão Nuvilab® (Anexo
C), e água ad libitum. Foram aclimatados em temperatura de 25ºC com fotoperíodo
claro/escuro de 12 horas. A forma de tratamento, cuidados e eutanásia dos camundongos
seguiu as normas da CEUA.

4.3 Infecção dos camundongos

Foram utilizados 96 camundongos “Swiss” machos de 20 dias de idade, que foram

separados aleatoriamente em oito grupos de 12 camundongos cada, os quais foram
denominados A, B, C, D, E, F, G, H e conforme discriminado no Quadro 1.
Para os grupos infectados (B, D, F e H) os animais foram infectados com 5,0 x 104
formas tripomastigotas por via intraperitoneal, da cepa QM2 (Quaraí Macarrão 2) de T. cruzi,
caracterizada por Martins(70), com sangue proveniente de outro camundongo previamente
infectado.
 30

Quadro 1 - Distribuição e tratamento dos animais de acordo com o delineamento

experimental.

Grupo Condição Tratamento

Controle – 50 μL/animal/dia de solução alcóolica à 70% (0,00122 g
A* Não infectado álcool/g peso do animal), baseado na concentração alcóolica
(veículo) do fitoterápico.
Controle – 50 μL/animal/dia de solução alcóolica à 70% (0,00122 g
B* Infectado
álcool/g peso).
C Não infectado 25 μL/animal/dia de fitoterápico a base de Morus nigra.
D Infectado 25 μL/animal/dia de fitoterápico a base de Morus nigra.
E Não infectado 50 μL/animal/dia de fitoterápico a base de Morus nigra.
F Infectado 50 μL/animal/dia de fitoterápico a base de Morus nigra.
G Não infectado 75 μL/animal/dia de fitoterápico a base de Morus nigra.
H Infectado 75 μL/animal/dia de fitoterápico a base de Morus nigra.
* Foi utilizado para cálculo desta concentração a dose do grupo / média ponderal dos animais (23 g) obtidos
antes da infecção.

4.4 Forma de tratamento

Os animais foram mantidos em gaiolas individuais no Biotério de Manutenção do

Laboratório de Parasitologia e alimentados com ração (Nuvilab®) padronizada pelo Biotério
Central da FAMEMA para alimentação dos animais e água mineral ad libitum. A forma de
tratamento, cuidados e eutanásia dos camundongos seguiu as normas do CEUA.
Os grupos receberam o tratamento por 180 dias e a administração do fitoterápico, ou
do veículo, foi realizada por meio de pipetagem do medicamento diretamente na boca dos
camundongos, utilizando pipeta automática da seguinte forma: o grupo A e B foram
considerados “controle de comparação” e receberam 50 μL/animal/dia de solução alcóolica
70%, tendo em vista que fitoterápico encontra-se nesta concentração alcóolica. Para os
camundongos dos grupos C e D foram pipetados 25 μL/animal/dia do fitoterápico de Morus
nigra. Para os grupos E e F foram pipetados 50 μL/animal/dia do fitoterápico e para os grupos
G e H foram pipetados 75 μL/animal/dia do fitoterápico.

4.5 Estudo da parasitemia

Foi realizado durante a fase aguda da infecção. Desta forma, durante 60 dias foi
determinada, duas vezes por semana, a parasitemia de cinco camundongos de cada grupo
 31

infectado, utilizando sangue periférico caudal de acordo com o método de Brener(71),

iniciando no 7º dia após a infecção, totalizando-se 17 contagens para cada animal. Esses
animais foram escolhidos aleatoriamente e mantidos em gaiolas isoladas até o final do estudo
parasitêmico, sendo mantido normalmente o tratamento até o fim da fase crônica.

4.7 Eutanásia, obtenção e preparo do material

Para o estudo histopatológico e bioquímico os animais foram eutanasiados com CO2

(100% de CO2) no 180º dia para o estudo da fase crônica.
O sangue de cada camundongo foi coletado por punção cardíaca em heparina, sendo
imediatamente realizado o hemolisado para determinação da glutationa reduzida conforme
determina a metodologia utilizada. O restante do sangue foi centrifugado a 3.000 rpm, por 5
minutos a 4ºC e o plasma coletado foi armazenado à -20°C para uso nas demais
determinações bioquímicas.
Foram coletados fragmentos de coração, cólon e músculo esquelético da coxa, de
todos os camundongos para a análise histopatológica do nível de inflamação, os quais foram
conservados e fixados em frascos plásticos contendo formol 10%. Após, os tecidos foram
embebidos em parafina e cortados em seções de 5 µm de espessura e corados pela
hematoxilina-eosina para análise.

4.8 Estudo histopatológico

As análises histológicas procederam-se em microscópio óptico binocular Olympus®

modelo CX31 em esquema cego.
Foi utilizada uma escala semiquantitativa de zero a três cruzes, para graduar o
processo inflamatório, ninhos de amastigotas e necrose, sendo considerado: “zero” - ausência
de inflamação, ninhos de amastigotas e necrose; “+” - inflamação discreta, raros ninhos de
amastigotas e necrose; “++” - inflamação moderada, moderado número de ninhos de
amastigotas e necrose; e “+++” - inflamação intensa, frequentes ninhos de amastigotas e
necrose.
 32

4.9 Determinações “in vitro” da atividade antioxidante e do estresse oxidativo

Todos os testes bioquímicos foram realizados em duplicata e procedeu-se a leitura em

espectrofotômetro leitor de microplaca PowerWave HT® da BioTek com Software de Análise
de Dados Gen5 integrado.

4.9.1 Determinação da glutationa reduzida (GSH)

A concentração de glutationa foi determinada pelo método colorimétrico

desenvolvido por Beutler(72) que se baseia na redução do ácido 5,5´-dithiobis (2-ácido
nitrobenzoico) (DTNB) que, na presença de glutationa, origina um composto amarelo, íon
tiolato, cuja densidade óptica é medida em 412 nm.
Imediatamente após a coleta do sangue, foi realizada a adição de 50 µL de sangue em
500 µL de água destilada. Deste hemolisado foram utilizados 200 µL para a determinação da
concentração de hemoglobina (Hb) pelo método do reagente da solução de Drabkin. Ao
volume restante foi adicionado 3,0 mL de solução precipitante (1,67 g de HPO3, 0,2 g de Na2-
EDTA e 30 g NaCl em 100 mL de água deionizada) seguida da centrifugação. Um branco foi
preparado pela adição de 2,0 mL de água em 3,0 mL de solução precipitante.
Para a leitura no espectrofotômetro, em uma microplaca, foram colocados 145 µL de
fosfato de sódio 0,3 M seguidos de 40 µL do hemolisado e registrada a primeira leitura (DO
1). O mesmo procedimento foi realizado no para o branco. Em seguida foi adicionado 20µL
de DTNB e a segunda leitura foi registrada (DO 2).

A concentração de GSH foi expressa em µmol/g de Hb considerando o coeficiente de

absorção molar para o DTNB Ɛ ==13,600 cm-1 M-1 56.

C= [(DO2 – DO 1)/Ɛ* x Hb] x D1 x D2

Onde:

C= concentração de GSH (µmol/g de Hb)

DO1= primeira leitura (antes da adição do DTNB)

DO2= segunda leitura (após adição do DTNB)

 33

Ɛ* =coeficiente de absorção molar para o DTNB considerando a correção do caminho

óptico para a microplaca.

Hb= concentração de hemoglobina do hemolisado

D1= diluição do hemolisado

D2= diluição do ensaio

4.9.2 Determinação da capacidade antioxidante plasmática pelo método FRAP

Foi utilizado o método de Benzie e Strain(73), e a variação da densidade óptica para

cada amostra foi utilizada para determinação da capacidade antioxidante do plasma por
comparação da absorbância do teste com a absorbância da curva padrão com concentrações
conhecidas do íon Fe++.
Para o preparo da curva padrão foi realizada uma diluição seriada a partir de uma
solução contendo FeII (sulfato ferroso) 1 mM, obtendo as concentrações de 1000 µM; 500
µM; 250 µM; 125 µM; 62,5 µM; 31,25 µM e 0 µM. O branco foi preparado com 330 μL de
água destilada adicionado a 2,4 mL do reagente FRAP e submetido às mesmas condições do
ensaio.
Para o preparo da reação utilizou-se uma solução (A) composta por tampão acetato
300 mM pH 3,6; uma solução (B) composta por TPTZ 10 mM (2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine)
e uma solução (C) composta por FeIII 20 mM (FeCl3.6H2O - cloreto férrico hexahidratado). A
mistura destas três soluções nas proporções de 10:1:1 (A: B: C) originou o reagente de
trabalho.
Para o ensaio das amostras e dos padrões, foi pipetado 80 µL do plasma, ou padrão,
em 250 μL de água destilada e agitado. Em seguida foram adicionados 2,4 mL do reagente de
trabalho FRAP. A reação foi levada a banho-maria 37ºC, no escuro, por 15 minutos. Após, as
amostras que apresentaram turbidez foram centrifugadas 2000 rpm por 3 minutos antes de
realizar a leitura de absorbância em 546 nm. Para cálculo da capacidade antioxidante do
plasma, a absorbância do teste foi comparada à absorbância das soluções de Fe++ de
concentrações conhecidas (0-1000 µmol/l) que foram testadas em paralelo na curva padrão.
 34

4.9.3 Grupamentos sulfidrilas (GS) totais no plasma

Foi utilizada a metodologia proposta por Sedlak e Lindsay(74) utilizando o reagente

de Ellman DTNB (ácido 5,5´- ditio-bis 2-nitrobenzoico). Os grupamentos tióis da amostra
reagem com o DTNB, formando um complexo que absorve a luz a 412 nm. Uma alíquota de
20 µL do plasma foi misturada em 230 µL de tampão Tris-EDTA (1 mM, pH 8.0), sendo feita
uma primeira leitura a 412 nm (absorbância 1). Em seguida, foi adicionado 10 µL de DTNB
10 mM, diluído em metanol, a mistura foi mantida em repouso 15 minutos à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz, e após foi feita nova leitura (absorbância 2). O branco foi feito
somente com DTNB e tampão Tris-EDTA. A concentração (C) dos grupamentos sulfidrilas
totais foram calculados usando-se o coeficiente de absorção molar para o DTNB Ɛ=13,600
cm-1 M-1. (75)
C= {[(Absorbância2 – Absorbância1] – Branco)/ Ɛ* DTNB} x diluição x 1000. Os
valores obtidos para a concentração das amostras foram expressos em µM.
Ɛ* =coeficiente de absorção molar para o DTNB considerando a correção do
caminho óptico para a microplaca.

4.9.4 Espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS)

O TBARS, utilizado como biomarcador de peroxidação lipídica, foi determinado no

plasma pelo método adaptado de Yagi(76). O princípio deste método consiste na reação do
Malondialdehyde (MDA) com o ácido tiobarbitúrico (TBA), formando como produto um
cromógeno de cor rosa capaz de ser detectado por meio de leitura espectrofotométrica e cuja
absorção ocorre em λ de 532 nm.
Para o ensaio, a 100 μL do plasma (aos quais foram adicionados 10 µL de BHT 29,5
mM), foram adicionados100 μL de lauryl sulfate (SDS) 8,1%, 300 μL de água destilada, 750
μL de ácido acético e, por último, 750 μL de TBA 0,8%. Um branco foi preparado da mesma
maneira substituindo-se o volume da amostra por água destilada.
Uma curva padrão com concentrações variando de 0 a 100 μM foi obtida por meio da
solução estoque preparada com Tetramethoxipropane (TMP) 500 mM.
Os tubos das amostras, branco e curva padrão foram colocados em banho-maria 90ºC
por 60 minutos tampados para evitar evaporação. Após, foram esfriados em banho de gelo por
10 minutos para interromper a reação. Posteriormente todos os tubos foram centrifugados por
 35

2500 rpm por 5 minutos a 4ºC. A leitura do cromóforo rosa foi medida num comprimento de
onda (λ)de 532 nm num período máximo de 20 minutos.
A concentração total de TBARS foi determinada pela comparação de absorbância
entre as amostras e a curva padrão (0 a 100 µM).

4.10 Análise estatística

Foi utilizado o software IBM SPSS 21, 2012, da IBM Corporation para análise dos
dados. Devido à natureza das variáveis em estudo, utilizou-se número de animais em estudo
em cada grupo, média, desvio-padrão, mediana, valor mínimo e valor máximo.(77)
A normalidade dos dados foi verificada por meio do teste de Shapiro-Wilk (W). Para
as comparações entre três ou mais grupos utilizou-se o teste de análise de variância
paramétrica um fator (ANOVA), complementada pelo teste de Tukey, e quando não se
verificou a homogeneidade das variâncias utilizou-se o teste de Games-Howell; quando em ao
menos um dos grupos em comparação não se verificou a normalidade dos dados, utilizou-se a
análise de variância não-paramétrica de Kruskal-Wallis(KW), com valor p calculado pelo
método de Monte Carlo, complementada pelo teste de comparações múltiplas de Dunn.(77)
Adotou-se o nível de significância de 5% de probabilidade para a rejeição da
hipótese de nulidade em todos os testes. Os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão da média considerando-se o número de animais para cada grupo controle e
experimental.
 36

5 RESULTADOS

5.1 Determinação da parasitemia na fase aguda

O estudo da parasitemia iniciou-se no sétimo dia pós-infecção conforme mostra a

Figura 4. É possível observar que, desde a primeira contagem, o grupo controle apresenta
parasitemia mais elevada quando comparado aos grupos tratados com o fitoterápico,
mantendo-se superior durante todo o período analisado.

Figura 4 – Média logarítmica da parasitemia durante a fase aguda da doença de Chagas do 7º

ao 60º dia da infecção.

Na Tabela 1 está expresso a análise da parasitemia durante os 60 dias de pós-

infecção, demonstrando que todas as propagações nas diferentes concentrações se mostram
estatisticamente diferentes em relação ao grupo controle que exibiu maiores níveis de
parasitemia.
Os animais que receberam 25 µL/animal/dia do fitoterápico exibiram uma menor
parasitemia (Tabela 1), estatisticamente significativa, quando comparados aos demais grupos
que receberam a tintura e ao grupo controle confirmando-se os dados da curva parasitemia na
Figura 2. Já entre os grupos de que receberam 50 e 75 µL/animal/dia da tintura existiu
diferença estatisticamente significante quando comparados ao grupo controle que recebeu a
solução alcóolica.
 37

O grupo que recebeu 25 μL da tintura apresentou pico no 13º dia pós-infecção, assim
como o grupo que receberam 50 μL, entretanto observou-se neste último grupo que a partir do
30º dia a parasitemia manteve-se estável, mas com níveis parasitêmicos superiores ao grupo
25 μL e inferiores ao grupo que recebeu 75 μL.
Observou-se que o grupo que recebeu 75 μL apresentou oscilações durante todo o
período de estudo, apresentando os maiores picos de parasitemia em comparação aos outros
grupos tratados.
Quando comparados os grupos controle que recebeu a 50 μL da solução alcoólica e o
grupo que recebeu 50 μL do fitoterápico, é possível observar no último, menores níveis
parasitêmicos durante todo período de análise.
Na Tabela 1 está expresso a análise da parasitemia média e desvio padrão, durante os
60 dias de pós-infecção, demonstrando que todas as propagações nas diferentes concentrações
se mostram estatisticamente diferentes em relação ao grupo controle que exibiu maiores
níveis de parasitemia.

Tabela 1 – Parasitemia expressa por meio da média e desvio-padrão, durante a fase aguda da
doença de Chagas.
Média / Desvio
Grupo
Padrão
Controle 7844,4±5904,9(c)
25µL 803,4±547,3(a)
50µL 1546,3±952,2(b)
75µL 1450,0±774,0(b)
* As médias dos postos seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo Teste de Dunn, ao nível de 5% de
probabilidade.

5.2 Taxa de mortalidade dos animais utilizados no estudo

Durante o período experimental existiu o total de 16 animais mortos, todas as mortes
descritas ocorreram na fase crônica da doença, ou seja, após os 60 dias inicias de tratamento.
 38

Quadro 2 - Taxa de mortalidade dos animais durante o período experimental

Número de
Condição Grupo
Animais Mortos*
Controle 01
Não 25 µl 01
Infectados 50 µl 01
75 µl 03
Controle 04
Infectados 25 µl 02
50 µl 04
75 µl -
*Número de animais mortos na fase crônica da doença. Não foi observado o evento na fase aguda.

Martins(70) ao isolar e caracterizar a cepa QM2 observou que entre as cepas isoladas
em seu estudo, esta foi a que apresentou comportamento peculiar mais agressivo e níveis
parasitêmicos elevados causando a morte dos animais no pico da parasitemia, evento este que
não foi observado com a mesma magnitude neste estudo.

5.3 Determinações in vitro da atividade antioxidante do fitoterápico

Como a capacidade antioxidante é ditada por diferentes mecanismos de ação, devido

aos diversos tipos de radicais e aos diferentes alvos de oxidação, isso justifica a realização de
diferentes métodos, amplamente difundidos, para caracterização ou quantificação destes
compostos, pois dificilmente haverá um único método capaz de representar de forma precisa a
real atividade antioxidante de um composto.

5.3.1 Quantificação de polifenóis e flavonoides totais e avaliação da atividade

antioxidante do fitoterápico pelo método do sequestro do radical livre estável DPPH e
NO e pelo método FRAP

Diferentes grupos de compostos químicos têm sido investigados no gênero Morus,

que são notáveis por suas diversificadas ações biológicas e que são amplamente distribuídos
pelo reino vegetal. Na Tabela 2 estão expressos os resultados de polifenóis e flavonoides
totais, FRAP, DPPH e NO do fitoterápico de Morus nigra.
 39

Tabela 2 - Atividade sequestradora de radicais livres (DPPH) e de NO, determinação de

polifenóis, flavonoides totais e teste FRAP no fitoterápico de M. nigra.
Polifenóis Flavonoides FRAPc DPPH Óxido Nítricod
a b
totais totais EC50% (µl/mL) Controle: 10,11e

Fitoterápico 261,66 361,83 32,09 72,2 13,64

a
µg de ácido gálico equivalente/mg do fitoterápico, bµg de rutina equivalente/mg do fitoterápico. cµM
equivalente de trolox/g do fitoterápico. dµM/mL de concentração de nitrito formado pela capacidade
antioxidante de captura do NO. e µM/mL de ácido gálico.

Para a determinação da concentração de polifenóis totais do fitoterápico de Morus

nigra pode-se verificar 261,66 µg de ácido gálico equivalente/mg do fitoterápico.
Para a determinação da atividade antioxidante por meio da redução do ferro pelo
método FRAP foi observado 32,09 µM equivalente de trolox/g do fitoterápico. Este teste não
se baseia na capacidade de capturar radicais livres, mas sim, na capacidade de redução do ferro, ou
seja, na medida direta da habilidade dos antioxidantes (redutores) da amostra em reduzirem,
em meio ácido (pH 3,6), o complexo Fe3+/tripiridiltriazina (TPTZ), para sua forma ferrosa
Fe2+, de intensa cor azul.
Na Figura 5 estão expressos os resultados obtidos por meio do método DPPH para a
determinação da atividade antioxidante, em diferentes concentrações, do fitoterápico. O
DPPH possui cor púrpura, ele é reduzido por meio da transferência de elétrons devido a
presença de um antioxidante, formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, que não
é capturado no comprimento de onda do teste. Este método é considerado, do ponto de vista
metodológico, um dos mais fáceis, precisos e reprodutivos na avaliação da atividade
antioxidante de extratos vegetais e substâncias puras, tais como flavonoides(78). A partir dos
resultados obtidos determinou-se a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora
de radicais livres.
Os resultados foram expressos de acordo com a porcentagem de inibição de
oxidação, ou seja, a porcentagem de atividade antioxidante é correspondente à quantidade de
DPPH consumida pelo antioxidante. Assim, pode-se constatar que uma vez utilizado
diferentes diluições e o fitoterápico puro para esta determinação, a atividade antioxidante foi
progressivamente maior com o aumento das concentrações, sendo a maior atividade
observada para a concentração de 250 µL/mL apresentando 81% de inibição da oxidação e
conforme a Tabela 1 EC50 = 72,28 µL/mL.
Geralmente esta atividade é correlacionada com a presença de flavonoides, classe
este presente na tintura, conforme demostrado na Tabela 2.
 40

Figura 5 - Atividade sequestradora do radical livre (DPPH)

A determinação da Morus nigra como substância sequestradora de NO também foi

testada. Para esta determinação, foi possível verificar uma concentração de 13,64 µM/mL de
nitrito formado, valores estes próximos aos obtidos com o controle de ácido gálico utilizado
que apresentou 10,11 µM/mL, sendo capaz de sequestrar o NO e consequentemente diminuir
o conteúdo de nitrito formado. Como o ácido gálico possui sua atividade antioxidante
comprovada cientificamente(79) sendo um potente antioxidante e inibidor das peroxidases
sobre processos oxidativos in vitro e ex vivo, os resultados encontrados demonstram o
potencial do fitoterápico como fonte de moléculas antioxidantes.

5.4 Determinações bioquímicas in vitro da atividade antioxidante

5.4.1 Determinação da capacidade antioxidante plasmática pelo método FRAP

O aumento da capacidade antioxidante no plasma após a administração da tintura,

mensurada por meio do teste FRAP, pode indicar aumento das substancias antioxidantes
disponibilizadas ao organismo como defesa. Os dados apresentados na Tabela 3 apresentam
os efeitos da administração de diferentes dosagens do fitoterápico sobre a capacidade
antioxidante plasmática.
 41

Tabela 3 – Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes dosagens

sobre o ensaio antioxidante teste FRAP em plasma (µM/L) na fase crônica. Os dados estão
expressos por meio da média e desvio padrão.

Número Média±Desvio
Grupo
de animais Padrão
Controle(-) 11 786,8±157,6(a)(b)
Não 25μL(-) 11 630,0±186,1(a)
Infectados 50μL(-) 11 932,2±224,9(b)
75μL(-) 9 938,5±149,1(b)
Controle(+) 8 624,4±206,3(a)
Infectados 25μL(+) 10 530,5±134,1(a)
50μL(+) 8 648,2±189,9(a)
75μL(+) 12 729,2±194,3(a)(b)
Médias seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Dunn, ao nível de 5% de probabilidade

Considerando a situação de ausência de infecção, a administração do fitoterápico

aumentou as concentrações do FRAP nas dosagens de 50 e 75 µL de maneira similar
(p≥0,05), porém estas diferiram das de 25 µL (p<0,05).
No entanto, na ausência de infecção, ao compararmos as concentrações de FRAP nas
diferentes dosagens com o controle, embora possam ser observados aumentos, estas
diferenças não atingiram significância estatística (p>0.05). Isto pode sugerir um efeito do
veículo alcoólico atuando de maneira dose dependente, com efeito máximo em 50 µL.
Na situação de infeção, as diferentes concentrações de FRAP em todas as dosagens
comparadas com o grupo controle infectado, também não atingiram significância estatística
(p>0.05).
Ao compararmos o efeito das diferentes dosagens de cada grupo não infectado com o
seu correspondente infectado, observamos diferenças (p<0,05) no grupo que ingeriu 50 µL, o
qual quando sob infeção, teve seus valores de FRAP diminuídos.
Na Figura 6 está expresso o efeito da administração nos diferentes tratamentos. Ao
compararmos os controles com seus correspondentes infectados, o grupo de 50 µL exibiu uma
redução de, aproximadamente, 30% quando sob a condição de infecção (p<0.05), enquanto o
grupo de 75 µL reduziu sua capacidade antioxidante em 22% e o grupo de 25 µL apresentou a
menor redução (16%) na presença de infecção.
 42

Figura 6 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes concentrações

sobre o ensaio antioxidante teste FRAP expressos em média e desvio padrão.

Ao compararmos os grupos infectados entre si não foram observadas diferenças

estatisticamente significantes entre os diferentes tratamentos.

5.4.2 Determinação das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) no plasma

O malondialdeído (MDA) é um biomarcador, produto secundário da peroxidação

lipídica, derivado da β-ruptura de endociclização de ácidos graxos polinsaturado, tais como
ácido linoleico, araquidônico e docosahexaenóico. Na Tabela 4 está expresso a contribuição
do tratamento nas diferentes dosagens para esta determinação da peroxidação lipídica no
plasma.
Tabela 4 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes dosagens
sobre a peroxidação lipídica (µM/L) pelo teste TBARS em plasma na fase crônica. Os dados
estão expressos por meio da média, desvio-padrão.
Número Média±Desvio
Grupo
de animais Padrão
Não Controle(-) 11 18,6±6,6(c)
Infectados 25μL(-) 11 15,1±2,8(c)
50μL(-) 11 3,9±0,9(a)
75μL(-) 9 3,5±1,2(a)
Controle(+) 8 9,4±3,1(b)
Infectados 25μL(+) 10 5,4±1,5(a)(b)
50μL(+) 8 8,4±3,9(a)(b)
75μL(+) 12 9,9±5,9(b)(c)
Médias seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Games-Howell, ao nível de 5% de
probabilidade
 43

É possível observar que no controle não infectado, que recebeu o tratamento com o
veículo alcóolico produziu níveis de TBARS relativamente maiores que os obtidos nos
demais grupos com ou sem infecção, não diferindo apenas do grupo não infectado que
recebeu 25 µL do fitoterápico, sendo esta dosagem a que apresentou o maior nível de
peroxidação na ausência de infecção.
Porém, em relação aos grupos não infectados que receberam 50 e 75 µL, quando
comparados ao controle não infectado, houve uma redução nos níveis de TBARS de,
aproximadamente, 80% estatisticamente significante. Isto pode indicar que a presença do
fitoterápico nestas concentrações minimiza a possível peroxidação lipídica induzida pelo
álcool.
Entre os animais infectados, o grupo controle não diferiu estatisticamente dos demais
grupos tratados. Os animais infectados que receberam 75 µL apresentaram maiores níveis de
TBARS quando comparados ao controle infectado, porém sem significância estatística. Já
entre os grupos infectados que receberam 25 e 50 µL também não houve diferença
estatisticamente significante.

Figura 7 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre a peroxidação lipídica
(teste TBARS), expressa em média e desvio-padrão.

Inesperadamente, a presença de infecção também parece diminuir os níveis de

TBARS, como pode ser observado pela redução, em cerca de 50%, observada no controle
infectado quando comparado ao não infectado (p<0.05)
Possivelmente, as defesas antioxidantes mobilizadas pela infecção combatam a
peroxidação induzida pela presença do veículo alcoólico.
 44

Ao analisarmos se, na presença de infecção, as diferentes dosagens do fitoterápico

produziram efeitos favoráveis nos níveis de TBARS, constatamos que as reduções não foram
estatisticamente significativas quando comparadas ao controle infectado.
Porém, ao compararmos os grupos não infectados com seus correspondentes
infectados, evidenciou-se que a dosagem de 25 µL propiciou uma redução estatisticamente
significante (aproximadamente de 64%). Considerando que este grupo apresentou, na
ausência de infecção, uma alta concentração de TBARS, tal redução expressiva na presença
de infecção pode sugerir, novamente, que as defesas mobilizadas durante a infecção tenham
atuado também nesta situação. Para a dosagem de 75 µL houve aumento da peroxidação
lipídica na presença de infecção (p<0.05) e para a dosagem de 50 µL, apesar do aparente
aumento do TBARS na presença de infecção, as diferenças não foram significativas.

5.4.3 Determinação dos grupamentos sulfidrilas (GS) totais no plasma

Em relação a esta defesa antioxidante, na Tabela 5 e Figura 8, podemos observar que

na situação de ausência de infecção, a dosagem de 25 µL diminuiu esta defesa em relação à
dosagem de 50 µL (p<0.05). Esta dosagem, porém, não foi diferente da concentração
observada na dosagem de 75 µL, mas foi diferente do controle (p<0.05). Isto pode evidenciar
um possível efeito do fitoterápico nesta concentração em aumentar esta defesa.
Entre os animais dos grupos infectados não foi observada diferença estatisticamente
significante, fato este que também ocorreu quando comparado ao controle infectado (p≥0.05).
Ao compararmos os grupos não infectados com os seus respectivos grupos infectados, as
diferenças também não foram estatisticamente significativas.
Tabela 5 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra em diferentes dosagens
sobre grupamentos sulfidrilas (µM/L) em plasma na fase crônica, expresso por meio da
média, desvio-padrão.
Número
Média±Desvio
Grupo de
Padrão
animais
Controle(-) 11 92,5±114,1(a)
Não 25μL(-) 11 78,3±30,8(a)
Infectados 50μL(-) 11 189,1±33,9(b)
75μL(-) 9 134,7±28,4(a)(b)
Controle(+) 8 144,9±36,3(a)(b)
25μL(+) 10 138,0±57,4(a)(b)
Infectados 50μL(+) 8 125,3±50,1(a)(b)
75μL(+) 12 166,9±113,8(a)(b)
Médias seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Dunn, ao nível de 5% de probabilidade.
 45

Figura 8 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre os grupamentos

sulfidrilas expressa em média e desvio-padrão.

5.4.4 Determinação da glutationa reduzida (GSH)

A GSH exerce um papel central na manutenção do equilíbrio redox. Nas células

participam de importantes sistemas de defesa cujas funções incluem a manutenção de
grupamentos sulfidrilas de proteínas, proteção da célula contra danos induzidos por radiação,
detoxificação de metabólitos altamente reativos ou peróxidos e regeneração de vitaminas
antioxidantes. Com a inativação da GSH por um agente oxidante ocorre produção da sua
forma oxidada (GSSG) e depleção da forma reduzida. Porém se o sistema de óxido-redução
está íntegro, ocorre a recuperação da GSH. Entretanto, situações em que haja a presença de
agentes oxidantes em excesso e/ou deficiência deste sistema, resultará em um desequilíbrio
entre o consumo de GSH e a produção de GSSG, o que caracteriza o estresse oxidativo(56, 57).
A seguir (Tabela 6 e Figura 9) estão apresentados os resultados das concentrações de
GSH em µmol/g de Hb encontradas na análise realizada.
 46

Tabela 6 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre a GSH (µM/gHb) na
fase crônica, expressos por meio da média, desvio padrão.
Número Média±Desvio
Grupo
de animais Padrão
Controle(-) 11 2,7±0,5(a)(c)
Não 25μL(-) 11 6,7±2,4(b)(d)
Infectado 50μL(-) 11 14,1±4,5(b)(d)
75μL(-) 9 14,0±9,1(b)(d)
Controle(+) 8 2,0±0,7(a)
Infectados 25μL(+) 10 4,1±0,7(a)(c)(d)
50μL(+) 8 2,0±0,7(a)(c)
75μL(+) 12 2,9±1,2(a)(c)
Médias seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Games-Howell, ao nível de 5% de
probabilidade

Como verificado na Tabela 6 e Figura 9, os grupos não infectados que receberam 25,
50 e 75 µL do fitoterápico apresentaram maiores concentrações de GSH quando comparados
ao controle não infectado que recebeu a solução alcóolica, indicando um efeito indutor do
fitoterápico principalmente entre os animais que receberam 50 e 75µL.
Ao compararmos o controle não infectado ao controle infectado, não houve diferença
estatisticamente significativa, evidenciando que na fase crônica, a infecção não está atuando
como indutora da síntese de GSH.
É possível ainda observar que entre os grupos infectados, as diferenças não foram
estatisticamente significantes entre si, nem quando as comparamos ao controle infectado,
sugerindo que fitoterápico não aumenta a glutationa na infecção da fase crônica.
Na Figura 9 foi possível observar que entre os grupos infectados não houve diferença
estatisticamente significante.

Figura 9 - Efeito da administração oral da tintura de Morus nigra sobre a defesa antioxidante
determinada pela GSH, expressas em média e desvio-padrão.
 47

Porém, para os grupos que receberam 50 µL e 75 µL, os valores são relevantes

quando comparados ao respectivos grupos não infectados, pois existe uma diminuição
estatisticamente significativa, sugerindo que esta diminuição seja inerente ao consumo desta
defesa durante o processo de infecção. Como ao compararmos os grupos não infectados que
receberam 50µL e 75 µL entre si, estes não foram diferentes estatisticamente, isto sugere um
efeito indutor máximo na dosagem de 50 µL.

5.4.5. Estudo histopatológico

O estudo histopatológico da fase crônica pode ser observado na Tabela 7 e nas

Figuras 10, 11 e 12, que demonstram, respectivamente, eventos de necrose miocárdica em
animal pertencente ao grupo que recebeu 25 µl, presença de ninhos de amastigota em
musculatura /esquelética em animal do grupo 50 µl e presença de inflamação no cólon de
animal pertencente ao grupo controle.
Para os animais não infectados que receberam a tintura, não foi observado nenhum
evento de inflamação, necrose ou ninhos de amastigota na análise histopatológica, desta
forma a Tabela 7 demonstra exclusivamente nos animais que apresentaram qualquer alteração
em um ou mais eventos.
 49

Tabela 7 - Análise histopatológica realizada no músculo esquelético, músculo cardíaco e cólon durante a fase crônica em camundongos
experimentalmente infectados pelo Trypanosoma cruzi cepa QM2 tratados com solução alcóolica (controle) 25, 50 e 75 µL do fitoterápico de
Morus nigra. “%” indicam a porcentagem de camundongos com inflamação, necrose ou ninhos de amastigota em cada grupo e ( )* indica o número
absoluto de animais em cada grupo.

Controle 25 µl 50 µL 75 µL
%(08)* %(10)* %(8)* %(12)*
Inf.1 Nec.2 Ama.3 Inf.1 Nec.2 Ama.3 Inf.1 Nec.2 Ama.3 Inf.1 Nec.2 Ama.3
+ 50%(04) 25%(02) -- 90%(09) 20%(02) -- 62,5%(05) 12,5%(01) 12,5%(01) 83,3%(10) 16,6%(02) 8,3%(01)
Músc.
++ 37,5% (03) -- -- 10%(01) -- -- 12,5%(01) 12,5%(01) -- -- -- --
Esquel.
+++ -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
+ 87,5%(07) -- 25%(02) 40%(04) -- -- 25%(02) -- -- 58,3%(07) -- --
Coração ++ -- -- -- 40%(04) -- -- 12,5%(01) -- -- -- -- --
+++ -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
+ 62,5%(05) -- 12,5%(01) 10%(01) -- 30%(03) 37,5%(03) -- -- 24,9%(03) -- --
Cólon ++ -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
+++ -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
“+” inflamação discreta, raros ninhos de amastigota e necrose; “++” inflamação moderada, moderado número de ninhos de amastigota e necrose; “+++” inflamação intensa,
frequentes ninhos de amastigota e necrose. 1 Presença de infecção; 2 presença de necrose e 3 presença de ninhos de amastigota.
 50

Observou-se que os maiores níveis de inflamação foram encontrados no músculo

esquelético, coração e cólon (Figura 8), respectivamente, para todos os grupos do estudo.

Figura 10 - Preparação histológica corada pelo método hematoxilina-eosina demonstrando

presença de inflamação de intensidade leve “+” em cólon de animal infectado com a cepa
QM2 de T. cruzi pertencente ao grupo controle.

Em musculo esquelético, observou-se que todos os animais do grupo 25 µl

apresentaram processo inflamatório, sendo 90% discreto e 10% moderado, entretanto, 37,5%
dos animais do grupo controle apresentaram inflamação moderada. Em relação ao coração,
embora o grupo controle tenha apresentado maior número de animais (87,5%) com processo
inflamatório discreto em coração, no grupo tratado com 25 µl da tintura 40% dos animais
apresentaram inflamação moderada. Quanto ao cólon, o grupo controle apresentou maior
número de animais com processo inflamatório.
Entretanto, conforme a Figura 9, o grupo 25 µl apresentou maior número de animais
com ninhos de amastigotas.
 51

Figura 11 - Preparação histológica corada pelo método hematoxilina-eosina demonstrando a

presença de ninho de amastigotas em musculatura esquelética de camundongo tratado com
50μL/animal/dia do fitoterápico.

Já tratando de necrose, todos os grupos apresentaram no tecido esquelético processo

necrótico em 2 animais de cada grupo, como exemplificado na Figura 10.
 52

Figura 12 - Preparação histológica corada pelo método hematoxilina-eosina demonstrando

necrose miocárdica de intensidade leve “+” em animal infectado com a cepa QM2 de T. cruzi
pertencente ao grupo que recebeu 25μL/animal/dia do fitoterápico.
 53

6 DISCUSSÃO

Diversos estudos têm demostrado a relação entre o estresse oxidativo e as defesas

antioxidantes durante o curso da infecção e progressão da doença de Chagas em humanos e
modelos experimentais(27, 29, 80).
Os flavonoides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural, concentrando-se predominantemente nas
partes aéreas das plantas, ocorrendo em menor proporção nas raízes e rizomas(81). Delazar(82),
refere que a atividade antioxidante de produtos naturais fenólicos é predominantemente
devido a sua capacidade para atuar como agentes redutores de ERO, além de reduzirem ou
quelarem íons férrico que catalisam a peroxidação lipídica.
Assim, o fitoterápico em estudo composto pelas folhas da Morus nigra apresentou
361,83 µg de rutina equivalente/mg do fitoterápico para a análise de flavonoides,
concentração que demonstrou a presença do mesmo na tintura. Estudos relatam forte potencial
farmacológico destes, e que a presença de flavonoides pode resultar na capacidade de agir
sobre a inflamação e sobre o sistema imunológico.(83)
Estes resultados confirmam o que diversos estudos apontam quanto às folhas de
Morus nigra, pois constituem uma rica fonte de compostos fenólicos capazes de impactar
positivamente na saúde humana(84 - 87). Além de apresentar maior teor de compostos fenólicos
e atividade antioxidante quando comparadas aos frutos.(88)
Nesta pesquisa, os animais que receberam 25 µL/animal/dia do fitoterápico exibiram
uma menor parasitemia, estatisticamente significativa, quando comparados aos demais grupos
que receberam a tintura e ao grupo controle no qual recebeu a solução alcóolica. Num
estudo(89) com ratos no qual foi avaliado a atividade antiinflamatória das folhas de Morus
nigra e isolado o composto “germanicol” pertencente a classe dos triterpenos, concluiu-se que
este composto é uma importante fonte de antiinflamatório natural, podendo sugerir que os
extratos das folhas possui potencial efeito anti-inflamatório, efeito este que sugere a atuação
deste potencial observado na parasitemia.
Em relação à curva parasitêmica apresentada pelos animais que receberam a solução
alcóolica, Gomes e Pereira(90) analisaram os efeitos da intoxicação crônica com o uso de
etanol na evolução da doença de Chagas, demostrando que o aumento da parasitemia, pode ter
sido consequências de alterações dos mecanismos inespecíficos de defesa ou da resposta
imunitária induzidos pelo uso crônico do etanol. Isto poderia ser uma provável justificativa do
 54

por que os animais do grupo controle apresentaram parasitemia patente por um maior período,
retardando sua queda, quando comparado aos animais do estudo de Gusmão.(91)
Apesar dos estudos de Gomes e Pereira(90) mostrarem um aumento da parasitemia
corroborado pelos resultados encontrados no grupo controle desta pesquisa, ao final da fase
crônica observou-se que todos os grupos acabam entrando na fase crônica com nível de
parasitemia semelhante.
Os menores níveis parasitêmicos dos animais que receberam o fitoterápico podem ser
reflexos dos compostos antioxidantes da Morus nigra presentes no fitoterápico como
demonstrado pelas determinações deste e de outros estudos(50, 84, 85). E ainda, estar associado à
atividade antiinflamatória, uma vez que os flavonoides atuam modulando células envolvidas
com a inflamação.(89)
Gusmão(91), utilizou animais aclimatados sobre as mesmas condições, infectados
também com a cepa QM2 de T. cruzi. Em um dos grupos no qual os animais receberam
apenas água, foi possível verificar parâmetros semelhantes desde a primeira avaliação
parasitêmica. Foi realizada a contagem das formas do parasita do 8º ao 43º dia pós-infecção e
o pico da parasitemia foi semelhante, expresso no 18º dia pós-infecção, acompanhado de um
decréscimo após 22º dia até o fim do estudo parasitêmico. Isto pode expressar uma tendência
na diminuição da parasitemia marcando o provável início da fase crônica, evento este que não
foi observado no mesmo período em nossas análises.
Em relação a atividade antiinflamatória, estudos destacam que, os flavonoides atuam
modulando células envolvidas com a inflamação, podendo ser por meio da diminuição da
proliferação de linfócitos T e da produção de citocinas pró-inflamatórias, bem como por meio
da regulação da atividade de enzimas da via do ácido araquidônico, tais como fosfolipase,
ciclo-oxigenase e lipooxigenase, e da enzima óxido nítrico sintase induzida.(83, 92)
LoPresti(93) demonstrou claramente em seu estudo que a diminuição de parasitas
influenciou significativamente na redução do dano cardíaco e no aumento da sobrevivência
dos animais. Estes resultados indicam que o nível parasitêmico é um preditivo das
complicações posteriores.
Durante o estudo verificou-se que os camundongos submetidos à ingestão de 25 µL
do fitoterápico apresentaram uma redução significativa do número de parasitas circulantes no
sangue, os valores encontrados confirmam a interferência do fitoterápico sobre a curva
parasitêmica com redução do número de parasitas, porém o mesmo não foi observado no
estudo histológico, uma vez que esta dosagem mostrou-se menos protetiva aos tecidos na
 55

evolução para a fase crônica da doença, onde os processos inflamatórios foram mais
controlados na dosagem de 50 µL. Estas diferenças podem estar relacionadas aos teores de
compostos secundários e ao veículo presentes nas diferentes dosagens administradas. Os
compostos ativos presentes podem inibir os processos da oxidação em certos sistemas, mas
isso não significa que eles possam proteger as células e os tecidos de todos os tipos de danos
oxidativos, já que podem apresentar atividade pró-oxidante em determinadas condições(94).
Seria necessário elucidar as vias de interação destes compostos presentes no fitoterápico para
confirmar os mecanismos de interação com os radicais livres.
Borges(95) demonstrou que animais submetidos a deficiência da produção de NO
através da inibição de iNOS, apresentaram aumento significativo de ninhos de T. cruzi em
tecido cardíaco quando comparados aos animais que não estavam submetidos a estas
condições, e que a maior inflamação, seria provavelmente derivada do maior parasitismo
tissular, sugerindo que a inflamação da fase aguda é dependente e proporcional ao parasitismo
tissular. Apesar da análise histológica desta pesquisa ter sido realizada apenas na fase crônica
da doença, o mesmo não foi observado, uma vez que os animais que apresentaram o maior
número de danos teciduais foram as animais provenientes de uma menor parasitemia na fase
aguda.
A menor parasitemia apresentada pelos animais que receberam 25µL da tintura pode
estar relacionada a disponibilidade de NO. Já é descrito na literatura(96) a capacidade de
inibição da síntese de NO por extratos de folhas do gênero Morus, de maneira dose
dependente. Assim, poderíamos indicar que a menor dose da tintura utilizada no tratamento
obteve maior controle da parasitemia por permitir maior disponibilidade do óxido nítrico, o
qual exerce importante papel no sistema de defesa para combater o parasita.
Além disto, a cepa QM2 de T. cruzi utilizada neste estudo foi caracterizada como de
maior virulência entre as cepas estudadas por Martins(97), com tropismo para tecidos de
coração, músculo esquelético, fígado e cólon. Isto poderia justificar intensa infiltração
inflamatória identificada no estudo histopatológico.
Os autores Ribeiro(98) e Maçao(29) utilizaram suplementação com vitaminas
antioxidantes na fase crônica da infecção da doença de Chagas e demostraram atenuações do
dano cardíaco em alguns pacientes. Outro estudo(99) obteve resultados similares com ratos
infectados pelo T. cruzi, onde a atividade de enzimas antioxidantes como catalase e glutationa
foram aumentados em resposta à infecção, enquanto ocorria o acometimento do miocárdio
desses animais.
 56

Quanto à avaliação do efeito do fitoterápico nas defesas antioxidantes que atuam no

organismo, nossos resultados evidenciam interações complexas nos sistemas de defesa frente
à condição de infecção, bem como o possível efeito do próprio veículo de administração do
fitoterápico sobre os parâmetros avaliados.
Desta forma, a administração do fitoterápico mostrou um efeito máximo sobre o
FRAP na dosagem de 50 µL, com consumo deste arsenal de defesas quando sob processo
infeccioso na fase crônica da doença de Chagas em nosso modelo. Tal aumento da capacidade
antioxidante poderia traduzir um efeito benéfico do fitoterápico, uma vez que as propriedades
de redução inerentes às medidas do FRAP são geralmente associadas com a presença de
redutores, que exercem sua ação antioxidante pela quebra da reação em cadeia dos radicais
livres por doação de um átomo de hidrogênio. Sabe-se que os compostos fenólicos podem
inibir os processos de oxidação em certos sistemas, protegendo as células e os tecidos de
danos oxidativo em determinadas situações e que o método FRAP reflete principalmente a
ação redutora destes compostos fenólicos.(25, 100)
A dosagem de 50 µL mostrou-se ainda efetiva em aumentar outra defesa,
representada pelos grupamentos sulfidrilas totais do plasma. Os grupamentos sulfidrilas são a
primeira linha de defesa, e a mais pronta fonte de antioxidantes do plasma(101), podendo atuar
em situações em que as vitaminas C e E não são eficazes. Portanto, atuam como “poupadores”
destas vitaminas, o que possui importantes implicações nos sistemas de defesa antioxidante
que estejam sob continuo estresse mediado pelos radicais livres. Esse parâmetro relaciona-se a
todos os tiois encontrados na GSH e em proteínas plasmáticas, como a albumina, e compostos
de baixo peso molecular constituídos pelas sulfidrilas livres, principalmente os resíduos de
cisteína reduzidos, cistenil-glicina e outros presentes, que são alvos durante o ataque
oxidativo.(75, 102, 103)
A diminuição da concentração dos grupamentos sulfidrilas poderia refletir a
alteração oxidativa das proteínas resultando na diminuição do arsenal das defesas
antioxidantes, podendo ser observado no resultado do FRAP dos infectados, as quais estariam
sendo usadas para neutralizar os radicais livres gerados, minimizando seus danos sobre as
estruturas celulares. Estudos com humanos em processo de envelhecimento, evidenciaram que
idosos saudáveis possuem níveis mais altos de GSH do que indivíduos com traços de
envelhecimento biológico prematuro ou doenças, uma vez que estes níveis de GSH são
considerados protetor notável para estruturas biológicas no organismo e refletem um dos
 57

eficientes marcadores de saúde ou de estresse oxidativo, onde sua redução leva a várias
doenças e ao envelhecimento biológico.(104)
Por outro lado, a presença de infecção parece aumentar esta defesa, independente da
presença do fitoterápico. Uma provável explicação para este evento seria o aumento,
desencadeado pela infecção pelo T. cruzi(105) na concentração da proteína metalotioneina. Esta
proteína possui diversas funções, participando na absorção, armazenamento e homeostase de
metais essenciais como zinco e cobre. Sua síntese é induzida por fatores inflamatórios, IL-6 e
mediadores reativos de oxigênio produzidos durante a resposta inflamatória(106). Ela possui
um alto conteúdo de cisteina, podendo atuar como um antioxidante.(107)
No entanto, nossos resultados podem indicar um possível efeito do veículo sobre a
modulação das defesas, atuando como um estressor, podendo ser constatado pelo aumento da
peroxidação lipídica no grupo que tomou apenas o álcool (controles que ingeriram 50 µL de
álcool 70%), mesmo na ausência de infecção e dos valores de FRAP que não diferiram do
controle não infectado.
O álcool pode ainda atuar com indutor do estresse oxidativo seja de forma direta,
pela geração de radicais livres em sua metabolização pelo citocromo P450, ou indireta ao
reduzir os níveis plasmáticos dos antioxidantes, levando ao aumento dos danos oriundos da
peroxidação lipídica.(108)
Apoiado a esta possibilidade do próprio álcool ser um promotor de danos,
inusitadamente, a presença de infecção diminuiu a peroxidação lipídica no grupo controle sem
infecção, demonstrando que as defesas mobilizadas pela infecção também debelaram o dano
induzido pelo álcool, independentemente da ação do fitoterápico. Corroborando esta hipótese,
o trabalho de Chandramathi(109) observou, em estudo que avaliou marcadores do estresse
oxidativo em indivíduos com câncer colo-retal e/ou infecção parasitária, que ambas as
patologias contribuíram para o estresse oxidativo de forma independente, mas quando
presentes em conjunto, o estresse oxidativo imposto pelos parasitas foi atenuado, verificando-
se para o teste FRAP níveis de 66% mais elevados que quando comparado aos outros grupos
da pesquisa.
Possivelmente, a infecção pelo T cruzi em nossa pesquisa pode ter minimizado o
estresse oxidativo, ao mobilizar um arsenal de defesa que combateu também o dano
produzido pelo álcool.
Para a dosagem de GSH deste estudo, como destacado nos resultados, o fitoterápico
mostrou-se capaz de aumentar as concentrações de glutationa na ausência de infecção na
 58

dosagem também de 50 µl, o que proporcionou uma possível defesa para enfrentar o estresse
oxidativo oriundo da infecção, como pode ser observado pela redução de sua concentração
nos grupos infectados.
Hayes(110), descreve que a glutationa fornece a célula múltiplas defesas não só contra
as espécies reativas de oxigênio, mas também contra os seus produtos tóxicos. A capacidade
de regular sua síntese pode ser um dos mecanismos que evoluíram nas células para montar
uma defesa contra as diversas condições de agressão, uma vez que ela pode ser eficiente
contra diversos acometimentos, seja por meio da participação da desintoxicação em vários
níveis diferentes, na eliminação dos radicais livres, na redução de peróxidos ou na conjugação
com compostos eletrofílicos.
(111)
Estudos de Myhrstad investigaram o possível papel regulador de alguns
flavonoides sobre o nível de glutationa γ-GCS (sintetase γ-glutamilcisteína) em células
incubadas que receberam diferentes tratamentos. A γ-GCS é a enzima que limita a taxa de
síntese proteica da GSH e é importante para regulação dos níveis intracelulares da GSH,
sendo demonstrado que os flavonoides são importantes na regulação dos níveis de glutationa
intracelular, uma vez que foram capazes de aumentar a concentração intracelular de glutationa
γ-GCS, em aproximadamente 50%, onde o nível de glutationa oxidada (GSSG), constituiu
menos de 0,2% de GSH tanto nas células tratadas como nas não tratadas com concentrações
de flavonoides.
O metabolismo da glutationa e a interação com o uso crônico de etanol não está bem
definido, podendo estar relacionados ao tempo de exposição ao mesmo. Da mesma forma em
que os níveis de glutationa podem aumentar devido à ingestão crônica do etanol, podem
decrescer ou ainda não serem alterados. Já se referindo ao metabolismo das enzimas
relacionadas ao GSH, estudos relataram que a administração crônica de etanol pode aumentar
a atividade das enzimas glutationa peroxidase em 45% como consequência de sua atividade
em situações de peroxidação e da glutationa redutase em 15% de sua atividade como
resultado da maior demanda do GSH, para sua forma oxidada.(112, 113)
Este estudo(112) utilizou antioxidantes nutricionais frente à ingestão crônica de etanol,
corroborando que o etanol pode diminuir as concentrações hepáticas de vitamina E e de
glutationa reduzida. Alteração nos níveis de peroxidação lipídica e nos níveis de
antioxidantes, depende, fundamentalmente, do tempo de exposição podendo explicar, em
parte, discrepantes estudos da relação ao envolvimento dos antioxidantes e dos radicais livres
no metabolismo do álcool.(112)
 59

Jordão(114), identificou que após a ingestão crônica do álcool, os animais

apresentaram níveis de peroxidação lipídica hepática normal depois e um período de 24 horas
da retirada do álcool. Por outro lado, ocorreu o aumento da glutationa, podendo representar
uma resposta frente à produção dos radicais livres provenientes da peroxidação, no sentido de
proteger contra o dano hepático, refletindo na evidência de que a peroxidação lipídica é um
dos mecanismos de dano tecidual, provocado pelo etanol.
Assim, seria necessária a realização de dosagem de marcadores do estresse oxidativo
de enzimas hepáticas dos animais do nosso estudo para possíveis correlações aos achados de
Jordão.(114)
Mollina(115), relata que o etanol ou seus metabólitos favorecerem a oxidação de
biomoléculas, atuando diretamente como oxidantes reduzindo os níveis antioxidantes ou pela
combinação de ambos os fenômenos, fazendo com que moléculas com propriedades
antioxidantes como os flavonoides sejam cada vez mais investigados como possíveis agentes
terapêuticos para os processos de injúria tecidual decorrentes da ingestão excessiva de etanol,
demostrando assim, o efeito protetor destas substâncias frente ao estresse oxidativo provocado
pelo excesso de etanol consumido.
Bilici(116) relaciona ainda, a diminuição dos níveis de GSH com a oxidação por
metabólitos tóxicos do álcool, por uma diminuição na síntese de glutationa, ou ainda por sua
ligação ao acetaldeído, sintetizado pela enzima álcool desidrogenase.
Em nosso estudo, o aumento da glutationa observado na dosagem de 50µL pode ser
benéfico para os tecidos animais sob processo de infecção pelo T. cruzi, mais especificamente
quanto ao nível de inflamação e seu controle. Aparentemente o fitoterápico pôde induzir uma
resposta e esta resposta pode ter sido relevante no contexto da infecção, contudo apenas até a
dosagem de 50 µL, pois acima desta dosagem (75 µL) não se mostrou tão eficiente.
A presença desta resposta à administração do fitoterápico pode ser importante, uma
vez que pesquisas anteriores(99, 117)
relataram que na fase crônica da doença, há um
esgotamento do sistema de defesa antioxidante envolvendo a glutationa, que não responde
mais aos mecanismos de “upregulation” como ocorre na fase aguda.
 60

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Baseado em conhecimento fitoquímico, popular e de outras pesquisas bibliográficas,

este estudo procurou analisar o potencial antioxidante contido no fitoterápico de folhas da
espécie vegetal Morus nigra sobre a evolução da doença de Chagas.
Constatamos que o fitoterápico apresentou potencial antioxidante como demonstrado
nos valores significativos para as determinações realizadas. Tomando em conjunto os
resultados deste estudo e de outras pesquisas, torna-se evidente que as folhas de Morus nigra
são uma fonte promissora de ativos naturais que devem ser considerados para explorações
futuras.
Observamos que diferentes dosagens atuaram de forma diferenciada: a parasitemia
na fase aguda foi significativamente mais controlada pela dosagem de 25 µL, após o
tratamento com o fitoterápico na fase crônica a dosagem de 50 µL atuou sobre algumas
defesas antioxidantes que apresentaram atividades melhoradas, bem como a mesma dosagem
minimizou o processo inflamatório tecidual. Porém, os efeitos do veículo de administração
(álcool 70%) precisam ser melhor investigados pois podem ter tido influência sobre alguns
dos resultados encontrados que podem ter relevância fisiológica na doença de Chagas.
Os resultados descritos podem ser considerados promissores no contexto de que
esforços para melhorar a terapia de doenças, produtos naturais podem ser uma fonte de novas
drogas com alta atividade e baixa toxicidade devido aos seus metabólitos secundários. Um
limitado número de produtos naturais vem sendo testados, porém demonstram importante
atividade sobre o T. cruzi. Diversos estudos com extratos de plantas, bem como, seus
princípios ativos isolados confirmam a atividade tripanocida o que poderia proporcionar
alternativas para o tratamento.
Estudos mais minuciosos são necessários principalmente em relação aos mecanismos
de ação e biodisponibilidade, bem como para isolamento e identificação dos compostos do
fitoterápico detectados ou não neste trabalho, afim de colaborar com possíveis aplicações
farmacológicos deste fitoterápico.
 61

REFERENCIAS

1 - Chagas C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfologia e o ciclo evolutivo

do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., agente etiológico de nova entidade mórbida do
homem. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1909;1(2):159-218.

2 - Massad DE. The elimination of Chagas disease from Brazil. Epidemiol Infect.
2008;136(9):1153-64.

3 - Word Health Organization. Control of Chagas disease (Technical Report Series 905).
Geneva: Word Health Organization; 2002.

4 - Guariento ME, Carrijo CM, Almeida EA, Magna LAA. Perfil clínico de idosos portadores
de doença de Chagas atendidos em serviço de referência. Rev Bras Clin Med. 2011;9:20-4.

5 - Aguilar HM, Abad-Franch F, Dias JCP, Junqueira ACV, Coura JR. Doença de Chagas na
Amazônia. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002;102 (Supl):47-55.

6 – Jorge TCA. Resposta do hospedeiro à infecção. In: Jorge TCA, Castro SL, organizadores.
Doença de Chagas: manual para experimentação animal [Internet]. Rio de Janeiro (RJ):
FIOCRUZ; 2000. p.39-86 [citado 12 set. 2014]. Disponível em:
http://static.scielo.org/scielobooks/cdbjg/pdf/araujo-9788575413937.pdf

7 - Andrade ZA. Anatomia patológica da doença de Chagas. Rev Goiana Med.1958;4:103-19.

8 - Urbina UJ, Payares G, Sanoja C, Molina J, Renee Lira R, Brener Z, Romanha AJ.
Parasitological cure of a cute and chronic experimental Chagas disease using the long-acting
experimental triazole TAK-187. Activity again stdrug- resistant Trypanosoma cruzi strains.
Int. J. Antimicrob. Agents. 2003;21:39-48.

9 - World Health Organization: Special programme for research and training in tropical
diseases – Chagas [internet]. Geneva (Switzerland): WHO; [date unknown]. [citado 01 jun
2014]. Disponível em: http://www.who.int/tdr/diseases-topics/chagas/chagas_f1.jpg?ua=1

10 - Prata A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet infect dis. 2001;
1(2):92-100.

11 - Portela-Lindoso AAB e Shikanai-Yasuda MA. Doença de Chagas crônica: do

xenodiagnóstico e hemocultura à reação em cadeia da polimerase. Rev Saúde Pública. 2003;
37(1):107-1

12 - Macêdo VO. Forma indeterminada da doença de chagas. In: Dias JCP, Coura JR.
organizadores. Clínica e terapêutica da doença de Chagas: uma abordagem prática para o
clínico geral [Internet]. Rio de Janeiro (RJ): FIOCRUZ, 1997.135-151p.

13 - Dias JC. The indeterminate form of human chronic Chagas disease: a clinical
epidemiological review. Rev Soc Bras Med Trop 1989; 22(3):147-56
 62

14 - Francisco AF. Estresse oxidativo, defesas antioxidantes e processo inflamatório na fase

aguda da doença de Chagas experimental [tese]. Ouro Preto (MG): Universidade Federal de
Ouro Preto; 2011. 97p.

15 - World Health Organization. Chagas disease, Brazil. Wkly Epidemiol Rec 2000;75(19):
153-5.

16 - Silva EM, Rocha MOC, Silva Rian RC, Paixão GC, Buzzati H, Santos NA, Nogueira
AN, Pereira MC. Estudo clínico-epidemiológico da doença de Chagas no distrito de Serra
Azul, Mateus Leme, centro-oeste do Estado de Minas Gerais. Rev Soc Bras Med Trop. 2010;
43(2):178-81.

17 - Dias JCP. Globalization, inequityand Chagas disease. Cad Saúde Pública. 2007;23(1):
13-22.

18 - Silveira AC. Situação do controle da transmissão vetorial da doença de Chagas nas

Américas. Cad Saúde Pública. 2000, 16(2):35-42.

19 - Nordberg J, Arner ESJ. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian
thioredoxin system. Free Radic Biol Med. 2001;31(11):1287–1312.

20 - Koskenkorva-Franka TS, Weissb G, Koppenolc WH, Burckhardt S. The complex

interplay of iron metabolism, reactive oxygen species, and reactive nitrogen species: Insights
in to the potential of various iron therapies to induce oxidative and nitrosative stress. Free
Radic Biol Med. 2013;65:1174–1194.

21 - Barbosa KBF, Costa NMB, Alfenas RCG, Paula SO, Minim VPR. Bressan J. Estresse
oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Rev Nutr. 2010;23(4):629-643.

22 - Reis JS, Veloso CA, Mattos RT, Purish S, Nogueira-Machado JA. Estresse oxidativo:
revisão da sinalização metabólica no diabetes tipo 1. Arq Bras Endocrinol Metab. 2008;52(7):
1096-1105.

23 - Barbosa KBF, Costa NMB, Alfenas RCG, De Paula SO, Minim VPR, Bressan. Estresse
oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Rev Nutri. 2010;23(4):629-643.

24 - Koury JC, Donangelo CM. Zinc, oxidative stress and physical activity. Rev. Nutri.
2003;16(4):433-441.

25 - Bianchi MLP, Antunes LMG. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Rev
Nutr. 1999;12(2):123-130.

26 - Schneider CD, Oliveira AR. Radicais livres de oxigênio e exercício: mecanismos de

formação e adaptação ao treinamento físico. RBME. 2004;10(10):308-13.

27 - Budni P, Pedrosa RC, Garlet TR, Dalmarco EM, Dalmarco JB, Lino MRO, Simionato
EL, Amara JÁ, Frode TS, Wilhelm D. Carvedilol atenua o estresse oxidativo na cardiopatia
chagásica crônica. Arq Bras Cardiol. 2012;98(3):218-224.
 63

28 - Oliveira TB, Pedrosa RC, Wilhelm D. Oxidative stress in chronic cardiopathy associated
with Chagas disease. Int J Cardiol. 2007;123:43–49.

29 - Maçao LB, Wilhelm D, Pedrosa RC, Pereira A, Backes P, Torres MA. Antioxidant
therapy attenuates oxidative stress in chronic cardiopathy associated with Chagas disease. Int
J Cardiol. 2007;123(1): 43-9.

30 - Marim RG, Gusmão AS, Castanho REP, Deminice R, Therezo ALS, Júnior AAJ, Martins
LPA. Effects of vitamin C supplementation on acute phase Chagas disease in experimentally
infected mice with Trypanosoma cruzi QM1 strain. Rev Inst Med Trop São Paulo. 2012;
54(6):319-323.

31 - Jorge TCA, Sampaio EP, Souza W, Meirelles MN. Trypanosoma cruzi: the effect of
variations in experimental conditions on the levels of macrophage infection in vitro. Parasitol
Res.1989;75:257-263.

32 - Burleigh BA, Andrews NW. The mechanism of Trypanosoma cruzi invasion of

mammaliancells. Ann Rev Microbiol. 1995;49:175-200.

33 - El-Sayyad HIH, Elmansi, Bakr EHM. Hypercholesterolemia-induced ocular disorder:

Ameliorating role of phytotherapy. Nutrition. 2015;31(11-12):1307-16.

34 - Allkanjari O, Vitalone A. What do we know about phytotherapy of benign prostatic

hyperplasia? Life Scie. 2015;126:42-56.

35 - Mafezoli J, PC Vieira, Fernandes JB, da Silva MFGF, Albuquerque S. In vitro activity of

Rutaceae species against the trypomastigote form of Trypanonosma cruzi. J. Ethnopharmacol.
2000;73:335–340.

36 - Abe F, Nagafuji S, Yamauchi T, Okabe H, Maki J, Higo H, Akahane H, Aguilar A,

Jiménez-Estrada M, Reyes-Chilpa R. Trypanocidal constituents in plants. 1. Evaluation of
some Mexican plants for their trypanocidal activity and active constituents in Guaco, roots
of Aristolochia taliscana. Biol Pharm Bull. 2002;25:1118–91.

37 - Saude-Guimarães DA, Faria AR. Substâncias da natureza com atividade anti-

Trypanosoma cruzi. Rev. bras. farmacogn. 2007;17(3):455-65.

38 - Molina-Garzaa ZJ, Bazaldúa-Rodríguezb AF, Quintanilla-Liceab R, Galaviz-Silvaa L.

Anti-Trypanosoma cruzi activity of 10 medicinal plants used in northeast Mexico. Acta Trop.
2014;136:14–18.

39 - Yunes RA, Pedrosa RC, Cechinel Filho V. Fármacos e fitoterápicos: a necessidade do

desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Quím. Nova.
2001;24(1):147-152.

40 - Silva RAH. Estudo da ação do extrato bruto de Morus nigra L. (Moreaceae) e frações
fenólicas sobre a atividade antimicrobiana e geração de espécies reativas do oxigênio e
nitrogênio: in vitro com ensaios químicos, enzimáticos e celular. [tese na internet].
Araraquara(SP): Universidade Estadual Paulista; 2012. 178. [acesso 17 maio 2015].
Disponível em: http://acervodigital.unesp.br/handle/11449/100720?mode=full
 64

41 - Feijó AM, Bueno MEN, Ceolin T, Linck CL, Schwartz E, Lange C, Meincke SMK,
Heck, RM, Barbieri RL, Heiden G. Plantas medicinais utilizadas por idosos com diagnóstico
de Diabetes mellitus no tratamento dos sintomas da doença. Rev Bras Plantas Med. 2012;
14(1):50-56.

42 - Araujo CM. Análise da eficácia da polpa do fruto e do extrato das folhas de amoreira
(Morus nigra l.) sobre a modulação de marcadores metabólicos e marcadores do estado redox
celular em um modelo experimental de diabetes tipo 1. Ouro Preto [Tese], 2015. 131p.

43 - Miranda MA, Vieira GDV, Alves MA, Yamamoto CH, Pinho JJRG, Sousa OV. Uso
etnomedicinal do chá de Morus nigra L. no tratamento dos sintomas do climatério de
mulheres de Muriaé, Minas Gerais, Brasil. HU rev. 2010;36(1):61-68.

44 - Padilha MM, Moreira LQ, Morais FF, Araújo TH, Silva GA. Estudo farmacobotânico
das folhas de amoreira-preta, Morus nigra L., Moraceae. Rev Bras Farmacogn.
2010;20(4):621-6.

45 - Naderi, GA, Asgay S. Antioxidant activity of three extract of Morus nigra. Phyt Res.
2004; 18(5):365-369.

46 - Quer PF. Plantas medicinales: el discórides renovado. 6ª. Ed. Barcelona: Editorial Labor.
2007. p.117-121.

47 - Base de dados nacional de espécies exóticas invasoras I3N Brasil: Instituto Hórus de
Desenvolvimento e Conservação Ambiental. Florianópolis(SC): [date unknown]. [citado 13
mar 2014]. Disponível em: http://i3n.institutohorus.org.br/www/?p=PjI7eChgPWxsYz5%2Fc
hUORBYEVQAHV0VKTxlbPGtueDlqbA%3D%3D
48 - Freitas M, Souza PM, Fonseca-Bazzo YM, Silveira D, Simeoni LA Mello HM, Fagg C,
Magalhães P. Tyrosinase inhibition and cytotoxicity of Morus nigra leaves for cosmetic
application. Toxicol Lett. 2015;238(2):357.

49 - Marques CV, Teixeira VA. Efeitos do extrato aquoso de Morus nigra L. (amora-preta)
sobre níveis plasmáticos de colesterol total, HDL e glicose de ratos wistar. In: XVIII CIC, XI
ENPOS, I Mostra Científica da Universidade Federal de Pelotas. 22-23 out 2009.; [internet]
Pelotas, RS, 2009. [citado 17 jan 2015]. Disponível em: http://www.doc-developpement-
durable.org/file/Arbres-Bois-de-Rapport-Reforestation/FICHES_ARBRES/Murier-morus%20
nigra/CB_01065.pdf

50 - Ozgen M, Serce S, Kaya C. Phytochemical and antioxidant properties of anthocyanin-

rich Morus nigra and Morus rubra fruits. Scien Horticul. 2009;119(3):275–279.

51 - Agarez FV, Cézio P, Cecília MR. Botânica: Taxonomia, morfologia e reprodução das
angiospermas. 2ª ed. Rio de Janeiro (RJ): Âmbito Cultural; 1994.

52 - Simões CAM, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR.
Farmacognosia da planta ao medicamento. 6ed. Porto Alegre (RS): UFRGS;
Florianópolis(SC): UFSC, 1102p, 2007.
 65

53 - Degáspari CH, Waszczynskyj N. Propriedades antioxidantes de compostos fenólicos.

Visão Acadêm. 2004;5:33-40.

54 - Pereira RJ, Cardoso MG. Metabólitos secundários vegetais e benefícios antioxidantes. J.

Biotec Biodivers. 2012;3(4):146-152.

55 - Mensor LL, Menezes FS, Leitão GG, Reis AS, Santos TC, Coube CS, Leitão SG.
Screening of brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical
method. Phytot Research. 2001;15(2):127-130.

56 - Manian R, Anusuya N, Siddhuraju P, Manian S. The antioxidante activity and free

radical scavenging potencial of two different solvent extracts os Camellia sinensis (L) O.
Kuntz, Ficus bengalensis L. and Ficus racemosa L. Food Chem. 2008;107(3):1000-1007.

57 - Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. Research on antioxidant activity of flavonoids

from natural materials. Food Chem. 1999;64:555-559.

58 - Tiveron AP. Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e verduras

comsumidos no Brasil [dissertação na internet]. Piracicaba (SP): Universidade de São Paulo;
2010. 102 p. [citado 30 out 2014]. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/
11/11141/tde-20102010-101541/pt-br.php

59 - Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of free radical method to evaluate

antioxidant activity. Lebensmit Wissen Techonol. 1995;28(1):25-30.

60 - Kukic J, Popovic S, Petrovic P, Mucaji A, Dcstojkovic C, Sokovic M. Antioxidant and

antimicrobial activity of Cynara cardunculus extracts. Food Chem. 2008;107(2):861-8.

61 - Infante J, Selani MM, Toledo NMV, Silveira-Diniz MF, Alencar SM de, Spoto MHF.
Atividade antioxidante de resíduos agroindustriais de frutas tropicais. Alim Nutr Braz J Food
Nutr. 2013;24(1):87-91.

62 - Thaipong K, Boonprakob U, Crosby K, Cisneroszevallos L, Byrne DH. Comparison of

ABTS, DPPH, FRAP and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit
extracts. J Food Compos Anal. 2006;19:669-675.

63 - Farias CC, Bonifácio KL, Matsumoto AK, Higachi L, Casagrande R, Moreira EG,
Barbosa DS. Comparison of the antioxidant potential of antiparkinsonian drugs in different in
vitro models. Braz J Pharm Sci. 2014;50(4):819-826.

64 - Pulido R, Bravo L, Saura-Calixto, F. Antioxidant activity of dietary as determined by a

modified ferric reducing/antioxidant power assay. J Agri Food Chem. 2000;48:3396-3402.

65 - Rufino M do SM, Alves RE, Brito ES, Morais SM de, Sampaio CG; Pérez-Jiménez J,
Saura-Calixto FD. Metodologia Científica: Determinação da Atividade Antioxidante Total em
Frutas pelo Método de Redução do Ferro (FRAP). Fortaleza: Embrapa Agroindústria
Tropical, 2006. 4p. [acesso 05 abr 2014]. Disponível em: http://www.cnpat.embrapa.br/down
load_publicacao.php?id=202
 66

66 - Saha RN. Signals for the induction of nitric oxide synthase in astrocytes. Neurochem Int.
2006;49:154-63.

67 - Griess P. Bemerkungen zu der, Abhandlung Der HH, Weselsky und Benedikt. Ueber
einige azoverbindungen. Chem Ber. 1879;12;426-8.

68 - Basu S, Hazra B. Evaluation of nitric oxide scavenging activity, in vitro and ex vivo, of
selected medicinal plants traditionally used in inflammatory diseases. Phytother Res. 2006;
20(10): 896-900.

69 - Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other
oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteau reagent. Methods
enzymol. 1999;299:152-78.

70 - Martins LPA. Isolamento e caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi Chagas, 1909

(Kinetoplastida, Trypanosomatidae) a partir de triatomíneos silvestres do Estado do Rio
Grande do Sul. Araraquara [Tese na internet]. Araraquara (SP): Universidade Estadual
Paulista; 2005. 152p. [citado 21 junho 2014]. Disponível em:
http://livros01.livrosgratis.com.br/ cp000793.pdf

71 - Brener Z. Contribuição ao estudo da terapêutica experimental da doença de Chagas.

[Tese]. Belo Horizonte (MG): Universidade Federal de Minas Gerais; 1961. 77p.

72 - Beutler, E. Red Cell Metabolism: A Manual of Biochemical Methods, 3 ed. New York
(NY): Grune & Stratton; 1984.

73 - Benzie IFF, Strain JJ. The reducing hability of plasma (FRAP) as a measure of
“antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem. 1996;239(1):70-6.

74 - Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhy dry
groups in tissue with Ellman's reagent. Anal biochem. 1968;25(1):192-205.

75 - Faure P, Lafond JL. Measurement of plasma sulphy dry land carbony groups as a
possible indicator of protein oxidation. In: Favier AE. Cadet J, Kalyanaraman B, Fontecave
M, Pierre JL. Anal of Free Radic in Biol Syst. Baseleia: Birkhäuser Verlag; 1995. p. 237-48.

76 - Yagi K. Simple assay for the level of total lipid peroxides in serum or plasma. Methods
Mol Biol. 1998;108:101-6.

77 - Armitage P, Berry G. Estadística para la investigación biomédica. 3ª ed. Madrid:

Harcourt Brace; 1997.

78 - Alves CQ, David JM, David JP, Bahia MV, Aguiar RM. Métodos para determinação de
atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Quím Nova. 2010;33(10):2202-2210.

79 - Barbosa VF. Caracterização do perfil da ação do ácido gálico e seus derivados sobre
processos oxidativos in vitro e ex vivo [Tese]: Araraquara (SP). Universidade Estadual
Paulista; 2010. 89p.
 67

80 - Dias LC, Dessoy MA. Quimioterapia da doença de chagas: estado da arte e perspectivas
no desenvolvimento de novos fármacos. Quim. Nova. 2009;32(9):2444-57.

81 - Dewich, PM. Medicinal natural products: a biosynthetic approach. Psycho-oncol.

(Chichester). 2001,135(2):145-9.

82 – Delazar A, Talischi B, Nazemiyeh H, Rezazadeh H, Nahar L, Sarker SD. Chrozophorin:

a new acylated flavone glucoside from Chrozophora tinctoria (Euphorbiaceae). Rev
Farmacogn. 2006; 16:286-290.

83 – Coutinho MAS, Muzitano MF, Costa SS. Flavonoides: potenciais agentes terapêuticos
para o processo inflamatório. Rev. Virtual Quim. 2009;1(3):241-256.

84 - Sánchez-Salcedoa EM, Menab P, García-Viguerac C, Hernándeza F, Martíneza JJ. The

(Poly)phenolic compounds and antioxidant activity of white (Morus alba) and black (Morus
nigra) mulberryleaves: Theirpotential for new productsrich in phytochemicals. Jour of Funct
Foods. 2015;18:1039-1046.

85 - Sánchez-Salcedoa EM, Menab P, García-Viguerac C, Martíneza JJ, Hernándeza F.

Phytochemical evaluation of white (Morus alba L.) and black (Morus nigra L.) mulberry
fruits, a starting point for theassessment of their beneficial properties. Jour of Funct Foods.
2015;12:399–408.

86 - Chung HI, Kim J, Kim JY, Kwon O. Acute in take of mulberry leaf aqueous extract
affects post prandial glucose response after maltose loading: Randomized double-blind
placebo-controlled pilot study. Jour of Funct Foods. 2013;5:1502–1506.

87 - Tallinia LR, Graziele PR, Pedrazzaa SAL, Bordignonb ACO, Costac MS, Fuentefriae A,
Zuanazzia JAS. Analysis of flavonoids in Rubusery throcladus and Morus nigra leaves
extracts by liquid chromatography and capillary electrophoresis. Rev Bras Farmacogn. 2015;
25(3):219–227.

88 - Yiğit D, Mavi A, Aktaş E. Antioxidant activities of black mulberry (Morus nigra) - Fen
Bilimleri Enstitüsü Dergisi 2008;1(2):223-32.

89 - Padilha MM, Vilela FC, Dias MJ, Rocha CQ, Giusti-Paiva A, Santos MH, Alves-da-
Silva G. Anti-inflammatory activity and isolation of pentacyclic triterpene from Morus nigra
leaves. Alfenas [Dissertação]. Alfenas(MG): Universidade Federal de Alfenas, 2009. 63p.
[citado em 02 fev de 2014]. Disponível em: https://bdtd.unifal-mg.edu.br:8443/bitstream/tede/
311/5/Disserta%C3%A7%C3%A3o%20Marina%20de%20Mesquita%20Padilha.pdf

90 - Gomes NGL, Pereira FEL. Efeitos da intoxicação crônica com o etanol na evolução da
trípanosomíase cruzi experimental no camundongo. Rev Soc Bras Med Trop. 1989;22:191-
197.

91 - Gusmão AS, Castanho REP, Andrade RFA, Farsetti CM, Mathias ABT, Altino LS,
Martins LPA. Vitamin C effects in mice experimentally infected with Trypanosoma cruzi
QM2 strain. Rev Soc Bras Med Trop 2012;45(1):51-54.
 68

92 - Suh N, Honda T, Finlay HJ. Novel triterpenoids suppress inducible nitric oxide synthase
(iNOS) and inducible cyclooxygenase (COX-2) in mouse macrophages. Cancer Res.
1998;58(4):717–723.

93 - LoPresti MS, Bazán C, Strauss M, Báez AL, Rivarola W, Paglini-Oliva PA.

Trypanothione reductase inhibitors: Overview of the action of thioridazine in different stages
of Chagas disease. Acta trop. 2015;145:79–87.

94 - Decker, E A. Phenolics: prooxidants or antioxidants? Nutrition Rev. 1997;55(11):396-

407.

95 - Borges CRB, Rodrigues JV, Reis MA, Castellano LR, Chica JEL, Pereira SAL. Papel do
óxido nítrico no desenvolvimento de lesões cardíacas na fase aguda da infecção experimental
pelo Trypanosoma cruzi. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. [Internet]. 2009;42(2): 170-174.

96 - Dkhil MA, Bauomy AA, Diab MSM, Al-Quraishy S. The antioxidant effect of Morus
nigra leaves extract on kidney, testes, spleen and intestine of mice.Pakistan J. Zool. 2015;
47(2):393-397.

97 - Martins LPA, Marcili A, Castanho REP, Therezo, ALS, Oliveira JCP DE, Suzuki RB,
Teixeira MMG, Rosa JA da, Sperança MA. Rural Triatoma rubrovaria from Southern Brazil
Harbors Trypanosoma cruzi of Lineage IIc. Am J Trop Med Hyg. 2008; 79(3):427–434.

98 - Ribeiro CM, Budni P, Pedrosa RC, Farias MS, Parisotto EB, Dalmarco EM, Frode TD,
Oliveira-Silva D, Colepicolo P, Filho DW. Antioxidant therapy attenuates oxidative insult
caused by benzonidazole in chronic Chagas heart disease. Int J Cardiol. 2009;145(1):27-33.

99 - Wen JJ, Vyatkina G, GARG N. Oxidative damage during chagasic cardiomyopathy

development: Role of mitochondrial oxidant release and inefficient antioxidant defense. Free
Radic Biol Med 2004;37:1821–1833.

100 - Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant
capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric Food Cham. 2005;53,4290-
4302.

101 - Wayner DDM, Burton GW, Ingold KU. The relative contributions of vitamin E, urate,
ascorbate and proeinsto the total peroxyl radical-trapping antioxidante activity of human
blood plasma. Biochim Biophys Acta. 1987;924:408-419.

102 – SILVA RA. Avaliação do quadro de estresse metabólico em ratos Wistar expostos à
aflatoxina B1. Rev Inst Adolfo Lutz. 2007;66(3):311-11.

103 - Wisdom S, Wilson K, Mckillop JH, Walker JJ. Antioxidant system in normal pregnancy
and in pregnancy-induced hypertension. Am J Obstet Ginecol. 1991;165:170-174.

104 - Arrick BA; Nathan CF; Griffith OW; Cohn ZA. Glutathione depletion sensitizes tumor
cells to oxidative cytolysis. J Biol Chem. 1982;257:1231-7.

105 - Gonzalez-Mejia ME, Torres-Rasgado E, Porchia LM, Salgado HR, Totolhua JL, Ortega
A, Hernández-Kelly LCR, Ruiz-Vivanco G, Báez-Duarte BG, Pérez-Fuentes R.
 69

Metallothionein-1 and nitric oxide expression are inversely correlated in a murine model of
Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2014;109(2):174-181.

106 - Waeytens A, De Vos M, Laukens D. Evidence for a potential role of metallothioneins in

inflammatory bowel diseases. Hindawi Publishg Corporation. Mediators of Inflammation. Vol
2009;2009:1-9.

107 - Sato M, Bremner I. Oxygen free radicals and metallothionein. Free Rad Biol Med.
1993;14:325-337.

108 - Nordmann R, Rouach H, Polonovsk J, Hillemand B, Bourel M, Larcan A, et al. Alcool

et radicaux libres: De la recherché fondamentale aux espoirs clinics. Annales de
Gastroenterologie et d'Hepatologie 1996;32(3):128-33.

109 - Chandramathi S, Suresh KG, Anita ZB, Kuppusamy UR. Attenuation of Hydrogen
Peroxide and Ferric Reducing/Antioxidant Power Serum Levels in Colorectal Cancer Patients
with Intestinal Parasitic Infection. Malays J Med Sci. 2009,16(2):15-20.

110 - Hayes JD, McLellan LI. Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-
ordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic Res. 1999;31:273–300.

111 - Myhrstad MCW, Carlsen HA, Nordstrom o, Blomhoff R, Moskaug JO. Flavonoids
increase the intracellular glutathione level by transactivation of the γ-glutamylcysteine
synthetase catalytical subunit promoter. Free Rad Biol and Med.2002;32(5):386-393.

112 - Jordão JR AA et al. Lipid peroxidation and ethanol: role of vitamin-E and glutathione.
Medicina (Ribeirão Preto). 1998;31:434-449.

113 - MacDonald CM. The effects of ethanol on hepatic lipid peroxidation and on the
activities of glutathione reductase and peroxidase. Febs Lett. 1973;35:227-230.

114 - Jordão JR AA, Meirelles MSS, Chiarello PG, Vannucchi H. Effect of chronic ethanol
administration on lipid peroxidation in rats. Medicina (Ribeirão Preto). 2002;35:48-52.

115 - Molina MF, Sanchez-Reus I, Iglesias I, Benedi J. Quercetin. A flavonoid antioxidante,

prevents and protects agaist etanol-induced oxidative stress in mouse liver. Biol Pharm
Bulletin. 2003;26:1398-1402.

116 - Bilici D, Suleyman H, Banoglu ZN, Kiziltunc A., Avci B, Ciftcioglu A, Bilici S.
Melatonin prevents ethanol-induced gastric mucosal damage possibly due to its antioxidant
effect. Dig Dis Sci. 2002;47:856-861.

117 - Wen JJ, Garg N. Oxidative modification of mitochondrial respiratory complexes in

response to the stress of Trypanosoma cruzi infection. Free Rad Biol Med. 2004;37(12):2072–
2081.
 70

ANEXO A
Laudo de qualidade da matéria prima do fornecedor da tintura
 71

ANEXO B
Carta de aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA
 72

ANEXO C
Composição da ração padronizada para alimentação dos animais