Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental

MATERIAL 13

TEMA: CROMATOGRAFÍA. Generalidades

La cromatografía fue inventada por el botánico Ruso Mikhail Tswett en 1906. Él empleó
la técnica para separar diversos pigmentos vegetales, como clorofilas y xantofilas,
haciendo pasar disoluciones de estas especies a través de columnas de vidrio rellenado con
carbonato de calcio (tiza) finamente dividido. Tswett utilizó como detector del
experimento la simple observación, ya que los compuestos que separó tenían color y era
posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, lo cual
explica el nombre que eligió para este método: de las palabras griegas chroma, que
significa “color” y graphé, que significa “escribir”.

1. Definición: La cromatografía se define como un procedimiento que permite la

separación, identificación y Cuantificación de los componentes químicos en mezclas
complejas. Es una técnica en la cual los componentes de una muestra se distribuyen entre
dos fases, una fija o estacionaria y una fase móvil gaseosa o líquida.
La fase estacionaria, está fija en un lugar que puede ser una columna o una superficie
plana; y la fase móvil, se mueve sobre la fase estacionaria o a través de ella, arrastrando
consigo la mezcla de analitos, hasta que estos finalmente emergen por separado de otros
solutos que eluyen antes o después. La fase móvil puede ser un gas, un líquido o un fluido
supercrítico.
La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada
componente entre las dos fases; las sustancias individuales presentan diferentes
movilidades a causa de diferencias de adsorción, partición, solubilidad, presión de vapor,
tamaño molecular o densidad de carga iónica. En general el soluto es transportado a través
del medio de separación por medio de una corriente de disolvente líquido o gaseoso
denominado “eluyente”. En la práctica, las separaciones con frecuencia son el resultado de
una combinación de efectos de adsorción y de partición.
2. Clasificación de los métodos Cromatográficos:
Los métodos cromatográficos son de 2 tipos:
2.1. Cromatografía en columna: la fase estacionaria es un sólido finamente dividido
sostenido en un tubo estrecho de vidrio o metal y a través de él se fuerza el paso de la fase
móvil ya sea por presión o por gravedad (percolación).
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2.2. Cromatografía plana: la fase estacionaria está sostenida sobre una placa plana de
vidrio o en los poros de un papel. Aquí la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad.
Los métodos cromatográficos se dividen en tres categorías, según la naturaleza o estado
físico de la fase móvil:
- Líquido, hay 5 tipos
- Gas, hay 2 tipos,
- Fluido supercrítico. Ver Tabla: 7.1.

Tabla 7.1. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna

Clasificación Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio
general
Gas-líquido (GLC) Líquido adsorbido o Reparto entre gas y
Cromatografía unido a una superficie líquido
de gases (CG) sólida
Gas-sólido Sólido Adsorción
Líquido-líquido o Líquido adsorbido o Reparto entre
reparto unido a una superficie líquidos inmiscibles
sólida
Líquido-sólido o Sólido Adsorción
Cromatografía adsorción
líquida (CL) Intercambio iónico Resina de intercambio Intercambio iónico
iónico
Exclusión por Líquido en los Reparto/tamizado
tamaño intersticios de un sólido
polímero
Afinidad Líquido con grupo Reparto entre
específico unido a una líquido superficial y
superficie sólida líquido móvil
Cromatografía
de fluídos Especie orgánica unida a Reparto entre fluido
supercríticos una superficie sólida supercrítico y
(SFC) (Fase superficie unida
móvil: fluido
supercrítico)

3. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA:
Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en
los procedimientos cromatográficos de la USP son:

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- Cromatografía en columna,
- Cromatografía de gases,
- Cromatografía en papel,
- Cromatografía en capa delgada (incluida cromatografía en capa delgada de alta
resolución) y
- Cromatografía de líquidos presurizados (comúnmente llamada cromatografía
líquida de alta resolución o HPLC). (antes llamada, alta presión).
En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna
que contiene a la fase fija. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una
columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la
muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de
la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las
partículas de la fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual
generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta
manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere
de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la
separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:
1. Cromatografía de adsorción. La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente
sílice (sílica) y en mucha menor medida alúmina.
2. Cromatografía de reparto. En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan
compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide en
cromatografía en fase normal y fase reversa.
En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o
trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un
hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias
más polares eluyen primero.
3. Cromatografía iónica. Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico
para separar y determinar iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño. La fase fija está formada por partículas
poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un
fraccionamiento relacionado con el tamaño molecular. Las moléculas de tamaño mayor son

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excluidas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son
retenidas más tiempo.

4. CONCEPTOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:

4.1. Elución: es un proceso en el cual los solutos son arrastrados a través de una fase
estacionaria por el movimiento de una fase móvil.
4.2. Eluyente: es un disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla
a través de una fase estacionaria.
4.3. Cromatograma: es una gráfica de alguna función de la concentración de un soluto
frente al tiempo de elución o el volumen de elución.
Si un detector se coloca en el extremo final de una columna durante la elución y se
representa gráficamente su señal en función del tiempo (o del volumen de la fase móvil
añadida), se obtiene una serie de picos, diagrama conocido como cromatograma, y es útil
para el análisis cualitativo y cuantitativo. La posición de los picos sobre el eje tiempo
puede usarse para identificar los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos
proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie.
4.4. Tiempo de retención tR: es el tiempo transcurrido entre la inyección de una muestra y
la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica.
4.5. Tiempo muerto o tiempo vacío tM : es el tiempo que una especie no retenida tarda en
pasar a través de una columna cromatográfica. Todos los componentes pasan algún tiempo
muerto en la fase móvil. El analito es retenido porqué pasa un ts en la fase estacionaria.
t R = tS + tM 7.1.

4.6. Ensanchamiento de banda y eficiencia de columna:

La eficiencia de una columna cromatográfica se ve afectada por el ensanchamiento de
banda que se produce cuando los compuestos pasan a través de ella.

Cromatografía lineal, Constante de distribución:

Todas las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias en el grado en que los
solutos se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria. Para la especie de soluto A,
el equilibrio implicado se describe con la ecuación:
A(móvil) A (estacionaria)

La constante de equilibrio K de esta reacción se conoce como Constante de distribución

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(Kc), la cual se define como:

( aA) S
K 7.2
( aA) M
Donde (aA)S es la actividad del soluto A en la fase estacionaria y (aA)M es la actividad
del soluto en la fase móvil. A menudo se sustituye cS, la concentración analítica molar del
soluto en la fase estacionaria por (aA)S y cM por su concentración analítica molar en la fase
móvil (aA)M. Por tanto la ecuación 7.2 se suele escribir como:
cS
K 7.3
cM
En el caso ideal, la constante de distribución (o razón de partición) es constante en un
amplio intervalo de concentraciones de soluto; es decir cS es directamente proporcional a
cM. Pero con mayor frecuencia no hay relaciones lineales.
La constante de distribución para un soluto en cromatografía es igual a la relación entre
su concentración molar en la fase estacionaria y su concentración molar en la fase móvil.
Las concentraciones en una columna cromatográfica son por lo general bajas. “La
cromatografía quese lleva a cabo bajo condiciones tales que K es constante, se denomina
cromatografía lineal”. Aquí se considera solo este tipo de cromatografía.

Cromatografía de elución lineal:

En la cromatografía de elución, una única porción de la muestra disuelta en la fase móvil
se introduce en la parte superior de la columna, después de lo cual los componentes de la
muestra se distribuyen entre ambas fases. El agregado de una cantidad adicional de fase
móvil (eluyente) hace avanzar columna abajo al disolvente que contiene una parte de la
muestra, donde se produce un nuevo proceso de partición entre la fase móvil y las
porciones nuevas de la fase estacionaria. Simultáneamente, la partición entre el nuevo
disolvente y la fase estacionaria tiene lugar en el sitio de colocación inicial de la muestra.
Las continuas adiciones de disolvente desplazan a las moléculas de soluto a lo largo de la
columna en una serie de transiciones entre la fase móvil y la fase estacionaria. Debido a
que el movimiento del soluto puede tener lugar solo en la fase móvil, la velocidad media a
la que migra el soluto, depende de la fracción de tiempo en el que permanece en esa fase.
Esta fracción es pequeña para los solutos con relaciones de partición que favorecen la
retención en la fase estacionaria y grande para aquellos en los que la retención en la fase
móvil es más importante. En condiciones ideales las diferencias resultantes en estas

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velocidades hacen que los componentes de una mezcla se separen en bandas localizadas a
lo largo de la columna. El aislamiento puede lograse entonces haciendo pasar suficiente
fase móvil por la columna para hacer que estas distintas bandas sobrepasen el extremo,
donde pueden recogerse. Alternativamente, el contenido de la columna puede ser extraído
y dividido en porciones que contienen los distintos componentes de la mezcla.
El proceso por el cual el soluto es lavado en la columna añadiendo nuevo disolvente se
llama elución.

Teorías de la elución cromatográfica:

Teoría de la velocidad de una columna:
La forma gaussiana típica de una banda cromatográfica puede ser atribuida a la
combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las diversas moléculas cuando éstas
descienden por la columna.
Es importante comprender que las anchuras de las bandas de elución nunca pueden ser más
estrechas que la anchura de la zona de inyección.
Es instructivo considerar una sola molécula de soluto cuando es sometida a varios miles de
transferencias entre las fases estacionaria y móvil durante la elución. El tiempo de
residencia entre cualquiera de las fases es muy irregular. La transferencia de una fase a otra
requiere de energía, y la molécula debe adquirir esa energía de su entorno. Así, el tiempo
de residencia puede ser corto en algunas transferencias y relativamente largo en otras.
Recuerde que el movimiento a lo largo de la columna puede producirse solamente mientras
la molécula está en la fase móvil.

BIBLIOGRAFIA

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Edición. Editorial International Thomson Editores S.A. México. 2005.
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