UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE QUIMICA

CURSO: QUIMICA ANALITICA – LABORATORIO

INFORME DE LA PRACTICA N°9

TITULO: Espectroscopía de absorción molecular UV-VIS
Alumno Código Firma

FACULTAD Y ESPECIALIDAD: PESQUERIA

HORARIO DE PRACTICA (DIA Y HORA):)
APELLIDOS Y NOMBRES DEL PROFESOR DE LABORATORIO:
TATIANA ROJAS

FECHA DEL EXPERIMENTO:

FECHA DEL INFORME:

LA MOLINA – LIMA – PERU

 1. INTRODUCCIÓN
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y
estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la
espectrofotometría son relativamente sencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el
de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz
está compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:
Efotón = h⋅ν = h⋅c/λ,
donde c es la velocidad de la luz, ν es su frecuencia, λ su longitud de onda y
h= 6.6*10 -34 J⋅s es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia
química absorbe luz de longitud de onda λ, esto significa que las moléculas de esa
sustancia absorben fotones de esa longitud de onda.

1.1. JUSTIFICACIÓN
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia
con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del
medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica
constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de
biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en
plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una
molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un
estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que
permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados
excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas.

1.2. OBJETIVOS

- Calcular la absortividad molar y longitud de máxima absorbancia de un

cromóforo a partir de un espectro de absorción.

- Construir una curva de calibración.

1.3. HIPÓTESIS

- La absortividad molar y la longitud de onda de máxima absorbancia depende

de cada sustancia y varía con la longitud de onda.
- La absorbancia varía en forma directamente proporcional con la concentración
de la sustancia absorbente a una determinada longitud de onda

1.4. MARCO TEORICO

 SUSTANCIAS ABSORBENTES

La absorción de radiación ultravioleta y visible por una especie M, puede

considerarse como un proceso en dos etapas, la primera de las cuales
corresponde a la excitación según:

M+h.v→M*

Donde M* representa la partícula atómica o molecular en su estado electrónico

excitado que se produce como resultado de la absorción del fotón h v. Este
estado excitado tiene un breve tiempo de existencia (10-8 a 10-9 s) y desaparece a
través de través de algunos de los diferentes procesos de relajación (calor).

M*→M+calor

La absorción de la radiación ultravioleta o visible, se produce por lo general

como consecuencia de la excitación de los electrones de enlace; debido a esto, la
longitud de onda de los picos de absorción se puede correlacionar con los tipos
de enlace existentes en la especie que se estudia.

Son consideradas especies químicas absorbentes aquellas que:

a) contienen electrones π, σ y η

La absorción de radiación ultravioleta y visible (200–800 nm) se restringe a un

número limitado de grupos funcionales, llamados cromóforos, que contienen
electrones de valencia con energías de excitación relativamente bajos.
Características de absorción de algunos cromóforos
comunes

Cromóforo Ejemplo Disolvente λmáx (nm) εmáx Tipo de

transición
Alqueno C6H13CH = CH2 n-Heptano 177 13,000 π→π*

Alquino C5H11C=C— n-Hexano 178 10,000 π→π*

CH3 196 2,000 -
225 160 -

Carbonilo n-Heptano 186 1,000 π→σ*

280 16 π→π*

π→σ*
n-Hexano 180 larga π→π*

Carboxilo Etanol 204 41 π→π*

Amido Agua 214 60 π→π*

Azo CH3N=NCH3 Etanol 339 5 π→π*

Nitro CH3NO2 Isooctano 280 22 π→π*

Nitroso C4H9NO Éter etílico 300 100 -

665 20 π→π*

Nitrato C2H5ONO2 Dioxano 270 12 π→π*

b) Absorción en la que participan los electrones d y f

 Iones de los metales de transición

 Serie de los lantánidos y actínidos

Los iones y complejos de los 18 elementos de las dos primeras series de

transición son coloreados en uno de sus estados de oxidación o en todos ellos.
Dependiendo las características colorimétricas del complejo; del tipo de ligando
(agente complejante) y del estado de oxidación.
Efecto de los ligandos sobre los máximos de absorción asociados con
transiciones
d-d

λmáx (nm) para los ligandos indicados

Ion central Aumento de fuerza del campo de unión
6CI 6H2O 6NH3 3en(1) 6CN-
Cr (III) 736 573 462 456 380

Co (III) - 538 435 428 294

Co (II) - 1345 980 909 -

Ni (II) 1370 1279 925 863 -

Cu (II) - 794 663 610 -

(1) en = etilendiamina, un ligante bidentado.

c) Absorción por transferencia de carga

Para fines analíticos es el tipo más importante de absorción por especies

inorgánicas, debido a que las absortividades molares de los picos son muy
grandes (ξ < 105). Esta es una particular característica de los complejos
inorgánicos denominados también, complejos de transferencia de carga.

Ejemplos:

 Hierro III- ion tiocianato

 Hierro II - (o-Fenantrolina)
 Ion triyoduro I3
 LEY DE LAMBERT Y BEER

 Medidas cuantitativas de la radiación - Ley de Beer

Se esquematiza a continuación el fenómeno de absorción, aquí un haz de radiación

monocromático, pasa a través de una capa de solución de b cm de espesor y que
contiene una especie molecular absorbente cuya concentración es c.

Fenómeno de absorción

Como consecuencia de las interacciones entre los fotones y las partículas

absorbentes, la potencia del haz disminuye de Po a P. Por lo tanto la transmitancia T
de la solución es la fracción de radiación incidente transmitida (o no absorbida) por la
solución según:

Según la Ley de Beer, entonces, la absorción A estará determinada por:

donde: ξ absortividad molar

b longitud de paso óptico

c concentración en moles/l

Medición experimental de la absorción

Según vimos en el esquema anterior la absorción es directamente proporcional a la

longitud (b) de la trayectoria de la radiación a través de la solución y a la concentración
(c) de la especie absorbente: A = a .b . c (con a: cte. de proporcionalidad).

Si c se expresa en moles por litro y b en cm, entonces la absortividad se

denomina absortividad molar (ξ): A=ξ.b.c.

La Ley de Beer se cumple igualmente en soluciones que contienen más de una

especie absorbente, siempre que no haya interacción entre dichas especies. Por tanto,
para un sistema multicomponente la relación será:
 AT = A1+A2+………+An
AT = ξ1bc1+ξ2bc2+………+ξnbcn

Limitaciones a la aplicabilidad de la Ley de Beer

Se observan frecuentemente desviaciones de la proporcionalidad entre A y c (cuando

b es constante). Algunas de estas desviaciones son importantes y representan
limitaciones reales de la ley. Estas son de tipo:

 químico;
 instrumental.

La Ley de Beer es sólo aplicable a soluciones en las que las interacciones

dependientes de la concentración de las moléculas o iones son mínimas.
Concentraciones “alts” alteran las absortividades molares y por lo tanto conducen a
una relación no lineal entre A y c.

Desviaciones químicas

Cuando las especies absorbentes experimentan asociación, disociación o reacción

con el solvente originan productos con características absorbentes distintas de las del
analito.

Un ejemplo típico se observa con soluciones de dicromato potásico no amortiguadas,

en las que existen los siguientes equilibrios:

Cr2O7+H2O ↔ 2HCrO4 ↔ 2H+ + 2CrO4-2

A casi todas las longitudes de onda los valores de ξ del ion dicromato y las dos
especies de cromatos son muy diferentes.

Desviaciones instrumentales

El requisito básico para el cumplimiento de la Ley de Beer es que la

radiación incidente sea monocromática. Dependiendo de las
Radiación
características tecnológicas del sistema óptico del instrumento será
policromática
más o menos accesible poder utilizar en forma práctica una radiación
una radiación limitada a una sola longitud de onda.

Radiación La radiación dispersa suele diferir considerablemente en longitud de

dispersa onda con respecto a la radiación principal; además puede alcanzar el
detector sin haber pasado a través de la muestra.
4.3 RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA (R.E.)

La radiación electromagnética es un tipo de energía que se transmite por el espacio a

enormes velocidades. Muchas de las propiedades de la R.E. se explican
convenientemente mediante la teoría ondulatoria clásica con parámetros como
velocidad, frecuencia, longitud de onda y amplitud. En contraste con otros fenómenos
ondulatorios, como el sonido, la R.E. no requiere un medio de transporte para su
transmisión, por lo tanto se transmite fácilmente en el vacío.

La teoría ondulatoria para la R.E. no explica completamente los fenómenos asociados

con la absorción o la emisión de energia radiante, para estos procesos es necesario
considerar la energía radiante como un flujo de partículas discretas de energía
llamados fotones o cuantos.

Estos dos conceptos se complementan muy bien (dualidad, onda partícula) y se

aplican tanto al flujo de electrones como al de otras partículas elementales.

Se ha representado el haz de radiación electromagnética

4.4 INTERACCIONES ENTRE LA MATERIA Y LA ENERGÍA RADIANTE (E.R.)

Cuando la radiación pasa desde el vacío a la superficie de una porción de materia, el

vector eléctrico de la radiación interacciona con los átomos y moléculas del medio. La
naturaleza de esta interacción depende de las propiedades de la materia y puede dar
lugar a la transmisión, la absorción o la dispersión de la radiación.

FENÓMENO EXPLOTACIÓN ANALÍTICA

Transmisión Indice de refracción

Dispersión Reflexión. Efecto Tyndal. Nefelometria

Absorción Molecular, atómica

ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN

Al pasar R.E. por una capa transparente de un sólido, líquido o gas, pueden eliminarse
selectivamente ciertas frecuencias como consecuencia del proceso llamado absorción.
En este caso la E.R. se transfiere a los átomos o moléculas que constituyen la
muestra, como resultado de ello estas partículas pasan del estado de menor energía a
estados de mayor energia o estados excitados.

Absorción molecular

La absorción por moléculas poliatómicas, es un proceso considerablemente más

complejo que la absorción atómica, ya que el número de estados de energía está muy
aumentado. Aquí la energia total de una molécula está dada por:

E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

Para cada estado de energía electrónica de la molécula hay normalmente varios

estados vibratorios posibles y a su vez, para cada uno de éstos existen numerosos
estados rotatorios. Como consecuencia el número de posibles niveles de energía de
una molécula es mucho mayor que el de una partícula atómica. Es por ello que los
espectros de absorción aparecen como anchas bandas.

Espectro de absorción

Tanto las moléculas como los átomos tienen un número limitado de niveles o estados
energéticos cuantizados. Para que se produzca absorción de radiación, la energía del
fotón excitante (incidente) debe igualar a la diferencia de energía entre el estado
fundamental y uno de los estados excitados de la especie absorbente. Estas
diferencias de energía (ΔE) son únicas, por lo tanto permiten caracterizar los
constituyentes de una muestra. Para este objeto se obtiene experimentalmente una
representación gráfica de la variación de la absorbancia en función de la longitud de
onda.
Espectros de absorción molecular característicos
4.5 CURVA DE CALIBRACIÓN

« No es conveniente suponer que para una determinada concentración se cumple la

Ley de Beer y por ello utilizar un patrón único como referencia ».

Una vez obtenidos los distintos puntos (o niveles de calibración) se debe determinar la
ecuación de la recta mediante análisis de regresión lineal (o ajuste de la curva por
mínimos cuadrados). Los instrumentos automatizados traen estas funciones ya
incorporadas en su sistema de cálculo, lo cual permite obtener el resultado final
directamente.

La ecuación que relaciona la absorbancia con la concentración más común es del tipo:

Donde:
Y = Ax + B
A = pendiente (ξ)

B = intercepto

R es un parámetro estadístico que da cuenta de la “calidad” de la curva de calibración

y se denomina coeficiente de regresión. En análisis cuantitativo se considera buena
una curva cuando su valor de r es mayor que 0.99.

1.5 MATERIALES

Materiales

 Vaso precipitado de 50 y 100mL

 Pipetas volumétricas de 1, 2 ,5, 10 mL
 Pipeta graduada de 10 mL
 Piceta con agua destilada
 Matraz volumétrico o fiolas de 25,50 y 100 mL
Reactivos

 Disolución estandarizada de KMnO4 0.002M

 Disolución estandarizada de K2Cr2O4 0.03 M
 Solución de complejo hierro-ortofenantrolina

Equipos

 Balanza analítica
 Espectrofotómetro UV-VIS
 Cubetas de plástico o vidrio y cuarzo
Discusiones
La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las
investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite
comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene
una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida
de la misma sustancia, es el caso para esta práctica donde realizamos las
lecturas de las absorbancias estándares a 5 concentraciones diferentes, para
luego realizar la medida de absorbancia de una muestra. El Hierro (símbolo
químico: Fe, del latín ferrum) es un elemento metálico, se lo puede encontrar
en la naturaleza presentando dos estados de oxidación que son, 2+ (ferroso) y
3+(férrico), aunque pueden ocurrir otros estados de oxidación más altos, como
intermediarios transitorios en algunas reacciones de tipo redox. El hierro forma
parte de los llamados “metales pesados”. Se denomina metales pesados a
aquellos elementos químicos que poseen un peso atómico comprendido entre
63.55 (Cu) y 200.59 (Hg), y tienen un peso específico superior a 4 (g cm-3).
(Caroli, 1996)
La mayoría de los metales pesados son tóxicos, en general, y lo que los hace
tóxicos no son sus características esenciales, sino las concentraciones en las
que pueden presentarse y el tipo de especie que forman en un determinado
medio. Sin embargo, el Hierro solo es tóxico a muy elevada concentración, ya
que el hierro se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y es uno de
los elementos más importantes para los sistemas biológicos. Su importancia
biológica se encuentra influenciada por sus propiedades químicas, tales como
valencia, solubilidad y grado de quelación o de complejación en la muestra en
la que se encuentre. La interconversión entre Fe2+ y Fe3+ es una propiedad
química esencial del hierro, que es utilizada por los microorganismos, plantas y
animales, para sus metabolismos oxidativos y para la asimilación del metal. El
agua químicamente pura no existe en la naturaleza, las aguas naturales
contienen la mayoría de los metales pesados disueltos en ella, aunque sus
concentraciones son muy bajas al hierro se lo puede encontrar en las aguas
formando diferentes especies: coloides, partículas minerales (sólidos en
suspensión), o fases disueltas (cationes o iones complejos). (Abu, 1997)

Conclusiones
 El espectrofotómetro nos permite comparar la radiación absorbida o
transmitida.
 La espectrometría UV-Vis es una técnica eficaz para identificar o asignar
una estructura a los compuestos químicos (orgánicos o inorgánicos) y
medir sus concentraciones
 La espectrometría UV-Vis nos permite identificar los diferentes
compuestos cuánticamente y cualitativamente.
Cuestionario:

1. ¿Cuál es el propósito e hipótesis de la practica 9?

Propósito:
- Calcular la absortividad molar y longitud de máxima absorbancia de un
cromóforo a partir de un espectro de absorción.

- Construir una curva de calibración.

Hipótesis:
- La absortividad molar y la longitud de onda de máxima absorbancia depende
de cada sustancia y varía con la longitud de onda.

- La absorbancia varía en forma directamente proporcional con la concentración

de la sustancia absorbente a una determinada longitud de onda

2. ¿Cree usted que ha logrado esa competencia?

- En el experimento se logró con el propósito de la práctica, pero se debe tener

cuidado al momento de colocar las cubetas de cuarzo, ya que, una mala
colocación de éstas produciría un error y no se podría leer en el
espectrofotómetro la absorbancia y tramitancia.

3. Explique la espectroscopia de absorción molecular UV-VIS.

Aplicaciones

El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorción

de radiación ultravioleta – visible por una molécula, causando la promoción de
un electrón de un estado basal a un estado excitado, liberándose el exceso de
energía en forma de calor. La longitud de onda comprende entre 190 y 800 nm.

La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, éstos son

promovidos a estados excitados (de energía mayor). Al absorber radiación
electromagnética de una frecuencia correcta, ocurre una transición desde uno
de estos orbitales a un orbital vacío. Las diferencias entre energías varían entre
los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan coloración
en las moléculas ya que absorben energía en el visible así como en el UV,
como es el caso del β-caroteno.

Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una disolución conteniendo

un analito absorbente, la intensidad incidente del haz (Io) es atenuada hasta I.
Esta fracción de radiación que ha logrado traspasar la muestra es
denominada transmitancia (T) (T = I/Io). Por aspectos prácticos, se utilizará
la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia (A = -logT), por estar
 relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente según
la Ley de Beer-Lambert: A = {\displaystyle \epsilon }·l·c ({\displaystyle \epsilon }:
coeficiente de absortividad molar, l: camino óptico, c: concentración de la
especie absorbente).

 ANALISIS DE MEZCLAS

En una mezcla de sustancias absorbentes, a una misma longitud de onda las

absorbancias son aditivas. Considerando esto, es posible determinar
componentes en una mezcla determinando las respectivas absorbancias a
diferentes longitudes de onda.

Así tendremos:

A1 = Cxξx + Cyξy a λ1
A2 = Cxξx + Cyξy a ι2

A partir de estándares puros de las especies X e Y se obtienen, por separado

los respectivos valores de las absortividades molares de X e Y. Luego quedan
como incógnitas las concentraciones de X e Y a ambas longitudes de onda y se
resuelve el sistema de ecuaciones.
 SOLUCIONES DE IONES METALICOS DE TRANSICIÓN

Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es

decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los átomos de
metal se pueden excitar desde un estado electrónico a otro. El color de las
soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la presencia de otras
especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una
solución diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se
intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorción máxima.

 COMPUESTOS ORGÁNICOS

Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de

conjugación, también absorben luz en las regiones del espectro
electromagnético visible o ultravioleta. Los disolventes para estas
determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en
agua, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes
orgánicos pueden tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos
los disolventes son adecuados para su uso en espectrometría UV. El etanol
absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La polaridad y
el pH del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto
orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su
coeficiente de extinción molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando
disminuye la polaridad de los disolventes.
Aunque los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores,
éstos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones
cuantitativas.

4. ¿Qué son los colores complementarios? Explique

La región UV está definida en el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm.

Es una región de energía muy alta, por lo que provoca daño al ojo humano, así
como quemaduras comunes en la piel y en algunos casos puede producir
cáncer.

En la región VIS, la cual se encuentra comprendida entre 400 y 700 nm,

apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes
de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de
absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la
solución coloreada. Cuando la materia absorbe energía de la región UV-VIS se
producen transiciones de tipo electrónico.
 Porción de la representación gráfica del espectro electromagnético de la región
del UV hasta la región del microondas.

La absorción molecular de la radiación en la región UV-VIS del espectro

Electromagnético, depende de la estructura electrónica de la especie
absorbente, como por ejemplo átomos, moléculas, iones o complejos. Esta se
da cuando se hace incidir un haz de luz ultravioleta o visible sobre la molécula
absorbente aumentando su energía hasta la energía (hν) del fotón incidente, lo
cual produce una transición electrónica desde un estado energéticamente
menor a otro mayor. Luego de esto, emite un fotón con la misma cantidad de
energía absorbida. La unión de todas las transiciones se representa por medio
de un conjunto de bandas llamado espectro de absorción molecular.

5. ¿Qué se entiende por transferencia de carga y cómo se usa en la

espectroscopia UV-VIS?

La absorción por transferencia de carga para fines analíticos es el tipo más

importante de absorción por especies inorgánicas, debido a que las
absortividades molares de los picos son muy grandes (ξ < 105). Esta es una
particular característica de los complejos inorgánicos denominados también,
complejos de transferencia de carga.

Ejemplos:

 Hierro III- ion tiocianato

 Hierro II - (o-Fenantrolina)
 Ion triyoduro I3-

BIBLIOGRAFIA
 A.Skoog,
SKOOG. Fundamentos de Química Analítica, Octava Edición. Douglas
 Skoog, D.A. y West, D.M. 1984. Análisis Instrumental. 2a edición. Ed.
Interamericana.