UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y ALIMENTARIAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

INFORME DE PRÁCTICA: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: TIROSINASA

Docente: Karent Bravo
Semestre 2019-1

1. Determine la actividad enzimática, expresada en UPPO, de la enzima polifenol oxidasa de

banano y de papa. Analice el efecto de la concentración de enzima, del pH y de
temperatura sobre la actividad de cada una de las enzimas. Utilice los datos de las
siguientes tablas:

Tiempo Mililitros de extracto enzimático (mL)

(segundos) 1.0 1.5 2.0 2.5
Banano Papa Banano Papa Banano Papa Banano Papa
0.0 0,296 0,264 0,564 0,428 0,579 0,825 0,750 0,938
20 0,347 0,289 0,536 0,463 0,626 0,874 0,804 1,050
40 0,361 0,303 0,598 0,488 0,701 0,926 0,848 1,132
60 0,453 0,313 0,617 0,500 0,762 0,965 0,993 1,170
80 0,472 0,329 0,671 0,512 0,870 0,992 1,027 1,194
100 0,477 0,335 0,690 0,520 0,962 1.009 1,107 1,203
120 0,534 0,341 0,705 0,522 1,042 1,015 1,232 1,198
140 0,568 0,343 0,722 0,522 1,061 1,024 1,308 1,198
160 0,577 0,344 0,745 0,522 1,118 1,025 1,355 1,198
180 0,577 0,344 0,743 0,522 1,182 1,025 1,389 1,198

Tiempo pH
(segundos) 3.0 7.2 10.0
Banano Papa Banano Papa Banano Papa
0.0 0,228 0,504 0,243 0,470 0,303 0,546
20 0,246 0,515 0,404 0,499 0,341 0,603
40 0,234 0,524 0,359 0,540 0,378 0,655
60 0,261 0,535 0,377 0,582 0,421 0,696
80 0,244 0,546 0,438 0,619 0,438 0,732
100 0,266 0,559 0,450 0,650 0,449 0,760
120 0,237 0,566 0,489 0,673 0,506 0,784
140 0,254 0,574 0,535 0,693 0,553 0,798
160 0,270 0,583 0,585 0,708 0,569 0,807
180 0,280 0,592 0,666 0,718 0,596 0,815
 Tiempo Temperatura (°C)
(segundos) 0.0 25 37
Banano Papa Banano Papa Banano Papa
0.0 0,286 0,471 0,318 0,580 0,254 0,595
20 0,357 0,535 0,353 0,640 0,290 0,727
40 0,398 0,572 0,390 0,696 0,327 0,800
60 0,408 0,602 0,413 0,748 0,357 0,812
80 0,466 0,630 0,455 0,784 0,370 0,803
100 0,527 0,657 0,546 0,810 0,384 0,819
120 0,556 0,672 0,523 0,840 0,457 0,846
140 0,704 0,687 0,560 0,850 0,444 0,869
160 0,683 0,701 0,577 0,862 0,448 0,890
180 0,691 0,709 0,583 0,869 0,440 0,901

2. Exprese los resultados del punto 1 en las siguientes tablas y haga un análisis de los
resultados obtenidos en cada uno de los factores evaluados y para cada una de las dos
fuentes vegetales. Qué pH y temperatura podría ser cercana a los óptimos en cada
fuente vegetal. ¿Se presentan diferencias en estos factores entre las dos fuentes
vegetales? Recuerde que en los análisis de regresión lineal se aceptan valores de
R2≥0.98. Para calcular las unidades de PPO omita los valores que considere necesario
hacerlo para que la cinética se ajuste al modelo de regresión lineal.

Efecto de la concentración de enzima

Concentración Actividad enzimático

de enzima Banano Papa
(mL) UPPO 2
R UPPO R2
1.0 98,6 0,9471 25,3636 0,8596
1.5 72,3 0,9344 27,3272 0,7456
2.0 211 0,9861 63,8909 0,8286
2.5 231,1 0,9861 69,0727 0,6285

Se puede observar que a mayor concentración de enzima aumenta el uppo, el cual refleja la
porción de conversión de sustrato a producto por unidad de tiempo. Al haber más cantidad de
enzima, respecto a la misma cantidad de sustrato y tiempo ,más producto se formará.
Debido a que esta enzima se puede oxidar y se saca de una fuente natural donde esta presente
tanto la enzima como el sustrato, es muy difícil inhibir o aislar la reacción , lo que significa una
distorsión de absorbancia diferente del producto de la reacción enzimática evaluado. Las
gráficas tienden a un comportamiento exponencial, siendo más pertinente usar esta función en
vez de mínimos cuadrados

Efecto del pH
 Actividad enzimática
pH Banano Papa
UPPO R2 UPPO R2
3.0 12,5 0,5452 29,5272 0,9961
7.2 114,6 0,9107 86,6181 0,9667
10.0 97,7 0,988 88,2909 0,9246
Se encuentra la mayor actividad enzimática a ph casi neutro, debido a que no hay interacción y
distorsión , pues se presentan casi las mismas concentraciones de hidrogeniones e hidruros,
permitiendo una actividad óptima de a enzima. Por otro lado, si hay PH muy ácido, la actividad
cae significativamente debido a que los hidrogeniones presentes en el medio a bajo PH,
protonan la enzima disminuyendo significativamente su actividad. Ahora bien, si hay PH muy
elevado, la reacción cesa pero no tan significativamente ya que la reacción de desprotonación
del OH se puede dar de manera instantánea por el alto PH.

En en análisis del banano a pH 3 se presenta un R2 por posibles errores experimentales, lo que

conllevo a que la ecuación lineal no fuera la mejor representación de los datos.

Efecto de la temperatura

Actividad enzimática
Temperatura Banano Papa
UPPO R2 UPPO R2
0 °C 144,8 0,9546 74,8363 0,9323
25 °C 95 0,944 95,0363 0,9171
37 °C 66,9 0,8996 79,2363 0,7921
Se esperaba encontrar en ambos casos que la temperatura ideal para la mayor actividad
enzimática fuera 25°C, y una temperatura más baja disminuiría la actividad. Esto se adapta a
los resultados obtenidos en la papa, sin embargo en el análisis de banano se encuentran
resultados distintos , hallándose la mayor actividad enzimática a 0°C. Este error fue debido a la
consistencia gelatinosa que se observó en la solución enzimática , generando grandes errores
como los evidenciados.

La temperatura es uno de los factores que puede desnaturalizar una enzima, por lo tanto al
alejar la temperatura de la ideal, se disminuiría la actividad enzimática

3. Según los resultados, cuál factor afecta mayormente la actividad de la enzima PPO en
cada una de las fuentes vegetales. ¿A qué puede atribuir este comportamiento?

4. ¿Si se emplea un sustrato diferente a 4-metildopa, qué resultados esperaría? ¿Se

presentaría el mismo comportamiento? ¿El pH y la temperatura óptima dependen del
sustrato?

5. Responda las preguntas del manual.

5.1 La enzima actúa mejor a pH ácido, básico, neutro?

5.2 Explique cómo afecta la concentración de enzima la actividad enzimática?

 5.3 La enzima actúa mejor a temperaturas bajas, ambiente o fisiológicas?

5.4 Documéntese sobre el mecanismos catalítico de la tirosinasa y responda lo

siguiente: cómo pueden los pH ácidos y básicos influenciar sobre la actividad
enzimática?

SOLUCIÓN

5.1 las reacciones de pardeamiento enzimático resultan de la oxidación enzimática de la L-DOPA

por la PPO, y su máxima actividad se obtiene a un pH entre 6.0 y 7.0, por la tanto la enzima actúa
mejor a pH neutro y ligeramente ácido.

5.2 La concentración de la enzima afecta la actividad enzimática positivamente, ya que a mayor

concentración, mayores serán los parámetros enzimáticos (Vmax Y km). Es decir que la cantidad
de producto que se forma por unidad de tiempo será más alta y se podrá cuantificar con mayor
facilidad.

5.3 La temperatura óptima de la enzima es de 30 grados Celsius, por lo que actúa mejor a
temperatura ambiente. Ya que los tratamientos por calor y frío (excesivos) además de producir
inhibición enzimática causan sobre las frutas y hortalizas efectos adversos tales como la pérdida
de color, alteraciones en su sabor olor y pérdida de su valor nutricional.

5.4 Los pH ácidos y básicos pueden influenciar sobre la actividad enzimática disminuyendola por
desnaturalización enzimática, ya que el mecanismo catalítico de la enzima es óptimo en un
rango de pH 6.0-7.0 y valores por fuera del rango donde ocurre la reacción pueden provocar que
las cadenas laterales de los aminoácidos del sitio activo de protonen o desprotonen lo que
provocaría una pérdida en la capacidad de la enzima para llevar a cabo la reacción.

6. Lea el artículo “Characterization of polyphenol oxidase from Cape gooseberry (Physalis

peruviana L.) fruit” y responda las siguientes preguntas:

6.1 Describa la importancia de la enzima PPO en el procesamiento de frutas y vegetales.

6.2 Compra el procedimiento de extracción de la enzima empleado en el laboratorio
con el descrito en el artículo. Según ello, proponga acciones para mejorar la
extracción en el laboratorio.
6.3 En el artículo se describen diferencias en el pH y temperatura óptimos de la enzima
dependientes del sustrato? Describa los resultados en este aspecto.
6.4 Compare el comportamiento de la enzima PPO de uchuva respecto al pH y la
temperatura, con el comportamiento de las enzimas PPO extraídas de banano y de
papa.
Los datos se ajustan mejor a una regresión logarítmica
Efecto de concentración del sustrato
Para disminuir el R se pueden eliminar algunos puntos
o usar una regresión cuadrática
Para obtener un R más ajustado se pueden eliminar algunos puntos

o realizar un ajuste logarítmico

6.1 Las PPO juegan un papel importante ya que son las encargadas de realizar
procesos metabólicos en presencia de oxigeno molecular y sustratos fenólicos,
como son las o-hidroxilacion de monofenoles a o-difenoles (actividad
monofenolasa y cresolasa) y luego la oxidación de o-difenoles a o-quinonas
(actividad difenolasa y catecolasa), produciendo un pardeamiento enzimático.

6.2 Al comparar los procedimientos de extracción de la enzima podemos

observar que el procedimiento en el documento es mucho más complejo, se
pueden observar cambios en el pH utilizado (en el documento se utiliza un pH
de 6 y en el laboratorio se usó un pH de 7.2), también se observa que en el
documento se realizan dos centrifugaciones en cambio en la sección
experimental solo se realiza una, la temperatura se tiene en consideración en el
documento siendo especifica (4°C y -20°C) en el experimento no se controla la
temperatura (se realiza un baño en hielo sin temperatura definida), en el
documento se purifica luego de extraer la enzima.

Para lograr una mejora en el procedimiento se deben tener los equipos

adecuados para cumplir características específicas de la extracción, también se
debería realizar una purificación al extraer para poder ser exactos y no tener
errores.

6.3 En el documento nos indica que le pH y la temperatura pueden afectar la

actividad enzimática de la tirosinasa. Pudimos comprobar que la enzima en el
banano tiene una mayor absorbancia (actividad enzimática) en un pH de 7.2, la
enzima en la papa presenta mayor absorbancia en un pH de 10 (básico),
ambas sufren una baja absorbancia en un pH de 3 (acido), en un pH de 7.2 la
enzima en la papa disminuye levemente su absorbancia y en un pH de 10 la
del banano disminuye levemente. El efecto de la temperatura genera en la
enzima un cambio en la absorbancia a 2°C la enzima del banano presenta su
mayor absorbancia y la enzima de la papa su menor absorbancia, en una
temperatura de 25°C ambas enzimas disminuyen levemente su absorbancia, a
37°C la enzima de la papa presenta la mayor absorbancia y la enzima del
banano su menor absorbancia.

6.4 El comportamiento de la enzima de la uchuva con respecto al pH nos indica

que el pH óptimo de esta enzima se encuentra entre 5.4 y 6.4 si se disminuye o
aumenta el pH con respecto a este rango se observan un cambio en la
actividad (se disminuye), si observamos el pH óptimo de la enzima del banano
es de 7.2 en la cual presenta mayor actividad si disminuimos o aumentamos
observamos un cambio en la actividad (se disminuye), en la enzima de la papa
el pH con mayor actividad es de 10 variando si se disminuye siendo menor la
actividad. Con respecto a la temperatura la actividad de la enzima de la uchuva
presenta una actividad mayor en temperaturas entre 20°C y 40°C al disminuir a
aumentar este rango se sufren variaciones en la actividad enzimática, en la
enzima de la papa a los 37°C podemos observar la mayor actividad
disminuyendo si subimos o bajamos la temperatura, en la enzima del banano la
temperatura en la cual la actividad es mayores a 2°C disminuyendo si
aumentamos la temperatura.