Guia Biotecnologia - 2019 - II

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
GUIA PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
MSc. ROBERTO VENTURA FLORES
Biólogo - Microbiólogo
LAMBAYEQUE 2019
Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

CONTENIDO
Practica 1: Bioseguridad y buenas prácticas en biotecnología
Practica 2: Uso de base de datos para investigación biotecnológica
Practica 3: Ética en la producción biotecnológica, elaboración de protocolos.
Practica 4: Construcción y funcionamiento de un biorreactor a escala de laboratorio
Practica 5: Modelamiento de proteínas por Homología
Practica 6: Aislamiento de microorganismos seguros de impacto biotecnológico
Practica 7: Presentación grafica del crecimiento microbiano
Practica 8: Determinación de coeficientes estequiométricos de reacciones biológicas
Practica 9: Obtención de ADN bacteriano y ADN levaduriforme
Practica 10: Evaluación de ADN genómico en corrida electroforética horizontal
Practica 11: Producción de yogurt (proyecto)
Practica 12: Elaboración de vino por S. cerevisiae (proyecto)
Practica 13: Elaboración de vinagre por bacterias acéticas (proyecto)
Practica14: Elaboración de amilasa empleando Aspergillus niger (proyecto).
Practica 15: Cultivo de tejido animal

MET FCCBB/UNPRG - 001
METODO Edición N0 01
BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRACTICAS Página 1 - 4
OBJETIVO: Conocer los principios de bioseguridad, equipos de protección personal y realizar buenas
prácticas en Microbiología
MATERIALES
Materiales: Mechero bunsen o de alcohol, alcohol 70%, encendedor, plumón indeleble, bolsas de
bioseguridad 36x24, bolsas amarillas, bolsas negras, botellas descartables, papel kraft, tijeras, grapas
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, respirador N-95, jabón líquido.
PROCEDIMIENTO.
 Antes de ingresar al laboratorio el alumno debe realizar el correcto lavado de manos y luego
emplear los equipos de protección personal (mandil, mascarilla, gorro lentes, guantes, etc.)
 Durante el proceso de las muestras biológicas, se deberá cerrar las puertas del laboratorio.
 Cada estudiante es responsable de cumplir las buenas prácticas de microbiología:
a. Uso adecuado de Equipos de protección personal (EPP)
b. Al iniciar y terminar cada jornada de practica el estudiante deberá limpiar las superficies
del laboratorio con alcohol al 70% o clorhexidina.
c. Ningún estudiante deberá guardar, beber o comer alimentos dentro del laboratorio.
d. Una vez concluido el proceso de muestras ambientales y biológicas (orina, heces, etc.)
deberán ser colocados en bolsas rojas para su posterior autoclavado.
e. Los residuos de orina y las reacciones de muestras heces contenidas en tubos de ensayo
deberán eliminarse directamente al desagüe con abundante agua y por ningún motivo
deberán dejarse en los depósitos donde se encuentra las láminas y las laminillas.
f. Los residuos químicos deberán ser eliminados en las bolsas de color amarillo; mientras
que los residuos comunes en el recipiente con bolsa negra.
g. Los residuos punzocortantes y materiales de vidrios rotos deben ser colocados en las
cajas o recipientes resistentes a la perforación.
h. Para evitar la liberación de aerosoles de muestras biológicas extendidos en láminas
portaobjetos deberán permanecer hasta su secado a temperatura ambiente en el mismo
lugar donde se realizó el proceso y por ningún motivo acelerar el secado con flama del
mechero.
 Al término de cada jornada práctica deberán asegurar el registro de todos los datos
observados en el cuaderno correspondiente de microbiología.

Figura 1. Infografía adaptada: ¿Cómo lavarse las manos? según recomendaciones de OMS (5).
0. Mojase las manos con agua
1. Deposite en la mano una cantidad de jabón líquido suficiente para cubrir todas las superficies
de la mano.
2. Frótese las palmas de la mano entre sí.
3. Frótese la palma de la mano derecha contra el dorso de la mano izquierda entrelazando los
dedos y viceversa
4. Frótese las palmas de las manos entre sí, con los dedos entrelazados.
5. Frótese el dorso de los dedos de una mano con la palma de la mano opuesta, agarrándose los
dedos.
6. Frótese con un movimiento de rotación el pulgar izquierdo, atrapándolo con la palma de la
mano derecha y viceversa.
7. Frótese la punta de los dedos de la mano derecha contra la palma de la mano izquierda,
haciéndose un movimiento de rotación y viceversa.
8. Enjuagase las manos con agua.
9. Séquese con una toalla desechable
10. Sírvase de la toalla para cerrar el grifo
11. Sus manos son seguras

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
a) En el siguiente cuadro describa 5 peligros de uno de sus laboratorios con su respectivo riesgo
y consecuencia
Peligro Riesgo Consecuencia

1
2
3
b) Esquematice el laboratorio donde realiza sus prácticas, mencione:

a. ¿Qué deficiencias encuentras?
b. ¿Qué nivel de bioseguridad consideras que presenta?
c. ¿Qué grupos de microorganismos manipularías conociendo el nivel de riesgo?
CUESTIONARIO
1. Enumerar 5 residuos que deberán ser eliminaos en bolsas negras, 5 en bolsas rojas y 5 en
bolsas amarillas
2. Mencione 5 diferencias entre mascarilla y respirador y esquematice el proceso de elaboración
de una bolsa de papel kraft para conservación del respirador N-95
3. Según los grupos de riesgo, mencione 5 microorganismos involucrados en cada uno.
4. En la industria alimentaria que otros EPP se debe emplear.
5. Esquematice pictogramas de obligación y advertencia en un laboratorio de nivel 2.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos bioseguridad en laboratorios de ensayo,

biomédicos clínicos. Serie de normas técnicas N° 18, Lima 2005; 107 pág.
http://www.bvs.ins.gob.pe/insprint/salud_publica/nor_tec/18.pdf
2. Ley 29783 de seguridad y salud en el trabajo. http://www.munlima.gob.pe/images/descargas/Seguridad-
Salud-en-el-
Trabajo/Ley%2029783%20_%20Ley%20de%20Seguridad%20y%20Salud%20en%20el%20Trabajo.pdf
3. OMS. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, 3ª Ed. En español. 2005.
http://www.who.int/topics/medical_waste/manual_bioseguridad_laboratorio.pdf
4. Centro de control y prevención de enfermedades. Bioseguridad en laboratorios de microbiología y
biomedicina, 4ª Ed. En español. 2005 http://www.uib.cat/digitalAssets/195/195210_cdc_bmbl_4.pdf
5. OMS. Como lavarse las manos. Infografía 2010.
https://www.who.int/gpsc/information_centre/gpsc_lavarse_manos_poster_es.pdf?ua=1

USO DE BASE DE DATOS PARA INVESTIGACIÓN Página 1 - 2
OBJETIVO:
Conocer el acceso y vinculación a diferentes bases de datos disponibles en el internet con fines de
investigación.
MATERIALES
Equipos: Laptop, retroproyector
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.
PROCEDIMIENTO:
 Base de datos: Son sitios de internet que contienen información con validación
experimental, actualizada y dinámica de datos: National Center for Biotechnology Information
(NCBI), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Uniprot BioCyc Pathway/Genome
Database Collection, Human Metabolome Database (HMDB), Argenfoods, etc.
1. Ingreso a la base de datos NCBI para búsqueda de Artículos científicos
 Ingresar al google y escribir NCBI.
 Hacer click en la base National Center for Biotechnology Information:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
 Asegurarse que en la pestaña diga “ALL Databases” y escribir una o dos palabras
claves de un tema de interés de preferencia en ingles y luego presionar search.
 Hacer click en la opción PubMed central - Full-text journal articles.
 Seleccionar el artículo de interés y guardar en una carpeta.
2. Ingreso a la base KEGG

 Ingresar al google y escribir KEGG.
 Hacer click en la base Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes:
https://www.genome.jp/kegg/
 Seleccionar la opción KEGG pathway ingresar
 Desplazar la barra y escoger el tema de interés ejemplo Metabolic pathways
 Otra opción es realizar el análisis de rutas metabólicas de dos o más
microorganismos en este caso se deberá
a) Ingresar al google y escribir KEGG
b) Hacer click en la base Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
c) Seleccionar la opción KEGG pathway Genomes [Pathogen | Virus | Plant]
Y en el recuadro, Define organism group (enter organism codes or T numbers)
escribir los códigos de dos microrganismos en minúsculas y separadas entre ellos por
un espacio ejemplo eco stc
d) Hacer click en GO
e) Buscar la opción Pathway map y hacer click en ella
f) Analizar los resultados
Tarea: analizar la ruta metabólica de dos microorganismos de impacto industrial y dos

microorganismos causante de infección por alimentos.
3. Ingreso a la base de datos BioCyc: HumanCyc
 Ingresar al google y escribir BioCyc: https://biocyc.org/
 Hacer click en la base BioCyc Pathway/Genome Database Collection
 En la opcion sites (ventana superior izquierda) hacer click en la opción HumanCyc
 Hacer click en la base en la opción Search y luego search pathway
 Escribir en la opción Search for pathway by name: glycolysis y luego click en submit
query
 Analizar los resultados desplazando la barra.
 Luego hacer click en More Detail y hacer el análisis desplazando la barra
4. Ingreso a la base de datos BioCyc: MetaCyc

 Ingresar al google y escribir BioCyc: https://biocyc.org/
 Hacer click en la base BioCyc Pathway/Genome Database Collection
 En la opcion sites (ventana superior izquierda) hacer click en la opción MetaCyc
 Hacer click en la base en la opción Search y luego search pathway
 Escribir en la opción Search for pathway by name: homolactic fermentation y en
search/filter by organism escribir Lactobacillis y luego click en submit query
 Analizar los resultados desplazando la barra.
 Luego hacer click en More Detail y hacer el análisis desplazando la barra
 Tarea: Analizar la ruta heterolactic fermentation y luego pyruvate fermentation to
ethanol I y II
5. Ingreso a la base de datos Argenfoods

 Ingresar al google y escribir Argenfoods: http://www.argenfoods.unlu.edu.ar/
 Hacer click en la base Argenfoods (de universalt protein)
 Hacer click en tabla de composición de alimentos (margen izquierdo de su pantalla)
 Hacer click en la opción Busqueda (margen izquierdo de la ventana)
 Analizar los resultados del alimento a investigar

METODO MET FCCBB/UNPRG - 003
Edición N0 01
ETICA EN BIOTECNOLOGÍA Página 1 - 3
OBJETIVO:
Elaborar protocolos de investigación, facilitando información y fundamentación de aspectos éticos en

investigación con seres humanos, muestras biológicas, animales y agentes biológicos u organismos
genéticamente modificados.
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
1. Resolución de caso ficticio: cortar y pegar información de internet para elaboración de un

producto biológico.
 Leer el contenido del caso
 Resolver el cuestionario propuesto
2. Elaboración de protocolo de investigación de un producto Biotecnológico considerando

los siguientes lineamientos:
 Información de la investigación
Título del proyecto:
Autores:
 Marco lógico
Situación problemática
Antecedentes
Formulación del problema
Hipótesis
Objetivos
Justificación e importancia
 Marco metodológico
Diseño del estudio
Población y muestra
Criterios de inclusión
Criterios de exclusión
Metodología
Procesamiento de los datos
 Gestión del proyecto
Cronograma de actividades
Recursos humanos
Presupuesto
Financiamiento
 Referencias bibliográficas

1. Resolución de caso ficticio: cortar y pegar información de internet para elaboración de un

producto biológico (texto adaptado del curso de conducta responsable en investigación -
Concytec)
En la facultad de ciencias biológicas, el profesor responsable del curso de productos biológicos
encargó a sus alumnos en forma grupal la elaboración de un proyecto de investigación titulado
“obtención de aceites esenciales de Cannabis sativa y su aplicación terapéutica versus cannabinoides
sintéticos” para la cual tenían que obtener información de la base de datos del NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/) tratados en clases anteriores.
Un mes después, cada grupo entrego su proyecto elaborado. Al revisarlo, el docente advirtió en el
texto distintos estilos de redacción: mientras que la situación problemática estaba redactada en
primera persona, en la sección siguiente se había adoptado un estilo impersonal de escritura. Esto le
generó sospechas sobre la originalidad del trabajo.
Para despejar sus dudas, el profesor decidió tomar al azar algunos segmentos del texto y los
introdujo en un buscador de Internet, encontrando que la mayor parte del trabajo provenía de dos
páginas web, las cuales no aparecían citadas como fuente de la información.
El docente citó a uno de los grupos para conversar sobre su protocolo de investigación, y se
sorprendió al notar que no parecía estar conscientes de que había procedido mal al haber copiado
grandes segmentos de texto para simplemente “pegarlos” en su proyecto, obviando además citar a
los autores y consignar las fuentes de la información. De hecho, el grupo a sola voz de fuente ovejuna
contaron a su profesor que eso era lo que ellos y sus compañeros hacían habitualmente en los
demás cursos.
El docente explicó al grupo que debía leer, entender e interpretar la información antes de emplearla
para sus trabajos, que tenía que entrecomillar los textos tomados de otras fuentes, y citar además a
los autores y trabajos consultados. También le indicó que no era apropiado tomar secciones enteras o
grandes cantidades de texto, y le dio algunos consejos sobre cómo resumir y parafrasear la
información.
Cuestionario:
a. ¿constituye plagio, aún si él grupo no era plenamente consciente de lo que estaban haciendo?
b. Si un alumno “copia y pega” contenidos de Internet para elaborar algún trabajo académico,
¿es suficiente citar las fuentes de la información?
c. En relación con el plagio, ¿qué diferencias puede haber entre “cortar y pegar” contenidos de
Internet, y tomarlos de fuentes impresas?
d. ¿Qué podrían hacer las autoridades de aquella Facultad para promover una conducta
responsable en las actividades académicas, entre los alumnos de Pregrado?
e. Que es mala conducta científica

2. Elaboración del consentimiento informado referente al protocolo de investigación
Título del estudio:
Investigadores del Estudio:
invito a Usted a participar del pr esent e estudio q ue consist e en

……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
………………………. con fines de ……………………………………………… y futuras investigaciones
el cual no involucra ningún procedimiento invasivo o peligroso. Este documento de consentimiento
contiene información que le ayudará a decidir a participar en el presente estudio. Tómese su
tiempo, lea atentamente este formulario y formule a l personal del estudio cualquier pregunta
que tenga. No debe firmar este formulario hasta tanto comprenda toda la información
presentada e n l a s páginas s ig u i e n t e s y hasta que todas sus preguntas acerca d e la
investigación hayan sido absueltas. Muchas Gracias
Objetivos del estudio
Este estudio tiene por finalidad determinar …………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………….. ……………….
Se le ha preguntado si le gustaría participar en este estudio porque a usted lo han solicitado ser
partícipe del presente proyecto que consiste en
……………………………………………………………………………………….....................................
……………………………………………………………………………………………………………………
, informándole además que se realizará algunas tomas fotográficas digitales con fines estrictos de
investigación y que redundará sobre el interés del profesional y no sobre mi persona En el caso de
que nos conceda su autorización, nos comprometemos a usarlas exclusivamente con fines
científicos y docencia respetando la confidencialidad de sus datos personales.
Por tanto; yo otorgo mi consentimiento al investigador ………………………………………………….
Identificado con DNI: ……………….. estudiante de la Universidad Nacional Pedro Ruiz gallo, para la
toma de fotografías de mi persona, familiar, y las pueda usar según lo antes mencionado
…………………………………………….. …………………………
Firma o huella del Paciente responsable Firma del Testigo
Nombre: ……..……………………………………… Nombre: ………………………………………
DNI: ……..……………………………………… DNI: …………………………………………..
Debido a que soy menor de edad por tener entre 7 y 18 años de edad, firmo mi asentimiento de que
la información me ha sido explicada y estoy de acuerdo a que mis imágenes sean utilizadas como
antes se menciona:
Testigo:
……………………………………………………
Firma o huella del menor de edad
Nombre: …………………………………………………………………
DNI: …………………………………………………………………

Edición N0 01
CONSTRUCCIÓN DE BIORREACTOR A ESCALA DE
Página 1 - 2
LABORATORIO
OBJETIVO:
Diseñar, construir y funcionar un biorreactor a escala de laboratorio.
MATERIALES
Materiales: Botellas de vidrio y de plástico de 250 mL, 500 mL y un litro de capacidad, damajuanas
de 5 litros, tapones de jebe Nº 7 y 9, bomba de aireación, sistema de esterilización por vapor, silicona
o soldimix, manguera siliconada de 0.5 mm de diámetro, tubería hueca de 8 mm de diámetro, reglas
de 30 cm, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, taladro, recipiente para punzocortantes.
PROCEDIMIENTO
1. Construcción de Biorreactor columna de burbujeo
Construir un biorreactor de material de plástico y vidrio con accesorios caseros para un volumen
de 2 litros según figura 1
Tamaño del biorreactor
 Altura del tanque (HT): 33 cm
 Altura del líquido (HL): 18 cm
 Diámetro del tanque (DT): 10 cm
 HT / DT: 3.3 cm
 HL /DT: 1.8 cm
 Volumen: 2 Litros
Figura 1: diagrama de Biorreactor

columna de burbujeo

RESULTADOS
Figura 2. Construcción Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de

de un fermentador burbujeo para producción de vinagre y vino
Practica 3: Esquematice un sistema de esterilización por vapor
Cuestionario:
1. Cuál es la utilidad del fermentador
2. Esquematice un biorreactor de escala industrial señalando sus partes.

Edición N0 01
MODELAMIENTO DE PROTEÍNAS POR HOMOLOGIA Página 1 - 2
Objetivo:
Analizar la estructuras primaria, secundaria y estructura tridimensional de una proteína.

A) Obtención de la secuencia blanco:
1. Ingresar a la página de NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. Buscar la opción Protein en la pestaña que dice “ALL Databases”
3. Colocar el nombre de la proteina blanco de interés en la ventana superior y presionar “search”.
(Ejemplo Lysozyme de Bos taurus), que para efectos de esta práctica buscar el código de
acceso AAC37312.1 Realizar el análisis desplazando la barra de la derecha de arriba hacia
abajo.
4. Hacer click en la opción FASTA.
5. Copiar la secuencia en formato fasta y pegarle en block de notas.
6. Guardar el archivo.
7. Tarea: analizar una proteína de interés
B) Modelamiento de una secuencia problema: PREDICCIÓN DE CARACTERÍSTICAS 2D
Ingresar a la página web JPred: http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/, o - PsiPred:

http://www.predictprotein.org/
1. Copiar la secuencia de interés (Lysozyme de Bos taurus) y pegarla en el espacio rectangular
superior y hacer Click en la opción make prediction.
2. Desplazar la barra de la izquierda para ver los E-value.
3. Hacer click en la opción “continue”.
4. Se abrirá la ventana con los resultados y puede demorar unos minutos.
5. Analizar los resultados desplazando la barra de izquierda a derecha.
C) Modelamiento 3D de una secuencia proteica por Homología:
1. Acceder al servidor de swiss model http://swissmodel.expasy.org/
2. Click en star modelling
3. Introducir la secuencia problema a modelar: Lysozyme de Bos taurus
4. En la opción Untitled Proyect: escribir un título ejemplo unprg Lysozyme y en la opción
Optional escribir su correo electrónico
5. Hacer click en Build Model, el proceso demora unos segundos
6. Analizar los resultados: Global y Local Quality Estimate y Comparison
7. En la opción Carton, dar movimiento a la estructura 3D y al pasar el cursor se evidencia la
secuencia. Pero además identificar la hoja beta, alfa de la proteína, etc.
8. Otra opción de visualizar más grande la estructura es haciendo click en el triángulo de color
negro
9. Hacer el análisis del precursor de la IL -8 (ingrese al NCBI con el siguiente código:
NP_001003200.1) y luego identifique la hélice alfa y beta de la proteína
10. Tarea: Realizar el modelamiento de una proteína de interés identificando y señalando la

hélice alfa, beta y también el asa y el jiro. Del mismo modo asegurarse si ha sido cristalizado
por rayos X

Figura 1. Exploración de predicción de estructura secundaria de Lysozyme de Bos taurus empleando JPRED 4.
Figura 2. Resultado del modelamiento 3D de Lysozyme de Bos taurus empleando swiss model.
Figura 3. Diferentes representaciones del modelamiento 3D de Lysozyme de Bos taurus empleando
swiss model. a: modelo cartoon, b: modelo tube, c: modelo trace, d: modelo spacefill.

METODO
Edición N0 01
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS SEGUROS DE
Página 1 - 2
IMPACTO BIOTECNOLÓGICO
OBJETIVO:
1. Aislamiento de actinomicetos con actividad antimicrobiana
2. Aislar microorganismos seguros de impacto biotecnológico de fuentes naturales
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, jeringa dispensadora, micropipetas automáticas.
Materiales: Tubos de vidrio estériles con tapa rosca, placas petri de 90 mm de diámetro, pinzas
planas estériles, reglas, hisopos estériles, gradillas para tubos 13x100 mm, mechero bunsen,
parafilm, plumón indeleble, respirador, guantes, bolsas de bioseguridad 36x24.
Medios de cultivo: agar avena, agar sabouraud, medio Lee.
Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%)
Muestra biológicas: suelo, chicha, frutas.
Otros: Solución salina estéril (SSE), agua destilada, escala de Mcfarland 0.5, asa de siembra,
discos de antibióticos (cartucho por 50).
PROCEDIMIENTO:
a. Aislamiento de actinomicetos con actividad antimicrobiana
 Para esta actividad seguir las recomendaciones de Parada Romina 2017 (8) con ciertas
modificaciones. Recolectar 5 -10 g de muestra de suelo a una profundidad entre 2 a 8 cm
y luego deberán colocar en frascos estériles y conservar a temperatura ambiente hasta su
procesamiento.
 Agregar 1 grano de suelo a un tubo de dilución conteniendo 9 mL de agua estéril (dilución

(10 -1) y someter a calentamiento a 70 ºC durante 15 minutos. Luego realizar diluciones
seriadas hasta obtener una dilución final de 1x10-3 g/mL de muestra.
 De cada dilución sembrar 100 uL en placas petri conteniendo agra avena e incubar a
temperatura ambiente durante 7 a 30 días.
 Seleccionar las colonias características de actinomicetos y conservar en medio solido de

agar avena a 4 ºC.
b. Determinación de antagonismo in vitro de Streptomyces spp por estrías

perpendiculares
 En una placa petri conteniendo agar sabouraud (SDA) sin antibiótico realizar una siembra
por estría en el diámetro central de la placa e incubar por 7 a 10 días a 30 ºC.

 Posteriormente sembrar microorganismos resistentes (S. aureus MRSA, E. coli BLEE y P.
aeruginosa) e incubar nuevamente los medios durante 24 horas a 35 ºC
 Analizar el antagonismo por determinación cualitativa de la zona de inhibición.
c. Aislamiento de Acetobacter spp y Saccharomyces spp de fuentes naturales
 Sembrar con ayuda de un asa bacteriológica 0.1 uL de una muestra de chicha en la

superficie de una placa de agar sabouraud por agotamiento y estría.
 Con otra asa bacteriológico sembrar la muestra de chicha en la superficie de una placa
conteniendo medio Lee por agotamiento y estría.
 Incubar las placas a 37º C/ 24 – 48 horas.
 Realizar coloración gram a las colonias sospechosas
 Las colonias compatibles con Acetobacter y Saccharomyces se deberán conservar.
Figura 1. Colocar fotos de aislamiento de Saccharomyces spp.
Figura 2. Colocar fotos de aislamiento de Acetobacter spp.

METODO
Edición N0 01
PRESENTACIÓN GRAFICA DEL CRECIMIENTO
Página 1 de 2
MICROBIANO
OBJETIVO:
1. Determinar la curva de crecimiento, velocidad de crecimiento y tiempo de generación de un

cultivo bacteriano
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, jeringa dispensadora, micropipetas automáticas.
Materiales: Tubos de vidrio estériles con tapa rosca, tips estériles, tuberculinas, agujas
hipodérmicas N° 21, jeringas de 5 y 10 mL, laminas portaobjetos, ligadura, gradillas para tubos
20x150 mm, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, respirador, bolsas de bioseguridad 36x24.
Medios de cultivo: Tripticasa soya, caldo nutritivo, Mueller Hinton.
Muestra biológicas: Escherichia coli
Otros: Solución salina estéril (SSE), agua destilada. Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%),
PROCEDIMIENTO:
 Sembrar una cepa de E. coli en agar nutritivo o Tripticasa soya e incubar a 37ºC por 24 horas
 Cosechar las células en 150 ml de caldo nutritivo e incubar a 37ºC/ 16 a 18 h.
 Inocular 0.02 ml del cultivo anterior en 200 ml de caldo nutritivo y extraer 1 ml para la
determinación de la población inicial. haciendo diluciones según la tabla y sembrando por el
método de siembra en superficie. Emplear 0.1ml de las dos últimas diluciones.
 Incubar el caldo nutritivo a 37°C por 11 horas en agitación constante.
 A los tiempos de 2, 4, 6, 8, 10, 11 horas tomar muestras de 1ml y realizar diluciones según la
tabla y sembrar por duplicado 0.1 ml de las 2 últimas diluciones por el método de siembra en
superficie.
 Luego incubar a 37°C por 24 horas.
 Realizar los recuentos respectivos
 Graficar en papel semilogarítmico o logarítmico los recuentos de los sobrevivientes versus
tiempo de incubación y determinar la curva de crecimiento.
 Diferenciar las fases y calcular las, velocidad de crecimiento, tiempo de generación.
 Graficar la recta de regresión, aplicando las formulas correspondientes.

Horas Diluciones de siembra N° de tubos N° de placas
0 10-3, 10-4 4 4
2 10-4, 10-5 5 4
4 10-6, 10-7 7 4
6 10-8, 10-9 9 4
8 10-12, 10-13 12 4
-14 -15
10 10 , 10 15 4
factor dilución = 0.1
Formulas
a) Numero de generaciones (n) n= 3.3 (log Nf –log N0)
b) Tiempo de generación (tg) Tg = t / n o tg = 1 / v
c) Velocidad de crecimiento (v) v= n / t
d) Constante de la velocidad de crecimiento (K)
k = 2.3 (log Nf –log N0) / t o k = ln / tg = 0.693/ tg.
e) Curva de regresión
Y = a + bx
Llenar la tabla con los valores encontrados
Tiempo Nº m.o/mL Log Y Ln Y X2 xyI
X Y (yI)
0
2
4
6
8
10
Σ= 30 Σ= Σ= Σ= Σ=

DETERMINACIÓN DE COEFICIENTES ESTEQUIOMÉTRICOS
DE REACCIONES BIOLÓGICAS
Página 1 de 2
OBJETIVO:
2. Determinar la velocidad especifica de crecimiento (µ), coeficiente de rendimiento celular (Y x/s),

rendimiento (X), concentración celular máxima (Xmax), velocidad de crecimiento (rx) y velocidad
de consumo de sustrato (rs).
MATERIALES:

Datos experimentales; se hizo crecer una cepa de moho sobre glucosa en cultivo batch
registrándose los siguientes datos experimentales:
Tiempo Densidad Concentración
(t) celular de glucosa (S) Log X Ln X
HORAS (X) (g/L) (g/L)
0 1.25 100.00 0.096 0.22
9 2.45 97.00 0.39 0.90
16 5.10 90.40 0.71 1.63
23 10.50 76.90 1.02 2.35
30 22.00 48.10 1.34 3.09
34 33.00 20.60 1.52 3.50
36 37.50 9.38 1.57 3.62
40 41.00 0.63 1.61 3.71
PROCEDIMIENTO:
1. Representaciones grafica del crecimiento microbiano

a. Representación aritmética
 Grafique los datos (X) (g/L) directamente sobre papel grafico lineal en relación al
tiempo (horas)
 Indique el tipo de curva obtenida
b. Representación Semilogarítmica
 Empleando papel grafico lineal, linearice los datos de crecimiento graficando el log de
X (g/L) versus tiempo (horas)
 Empleando papel grafico semilogaritmico, linearice los datos de X (g/L) versus tiempo
(horas)
2. Calculo de parámetros del crecimiento microbiano
a. Determinación de µ, X,Qx, Sc, Yx/s
 Determine µ (velocidad especifica de crecimiento) aplicando la ecuación
correspondiente µ= Ln Xf – Ln X0 / Tf – T0
 Determine X (rendimiento celular), donde X = Xmax – X0
 Determine Qx (Productividad en biomasa), donde Qx = (Xmax – X0 )/Tf-T0
 Determine Sc (conversión de sustrato), donde Sc= (S0-Sf) / S0
 Determine Y x/s (coeficiente de rendimiento celular) aplicando la ecuación
correspondiente Y x/s = Xmax – X0 / S0-Sf
b. Determinación de rx (velocidad de crecimiento celular) donde rx = µX
c. Determinación de rs (velocidad de consumo de sustrato) donde rs = µX / Y x/s

METODO
Edición N0 01
OBTENCIÓN DE ADN BACTERIANO Y LEVADURIFORME
POR SALTING OUT
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OBJETIVO:
1. Extraer ADN bacteriano y ADN levaduriforme empleado el método Salting Out
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, centrifuga, jeringa dispensadora, micropipetas

automáticas, vortex.
Materiales: Matraces de 250 mL, tubos de vidrio estériles con tapa rosca, taper de plástico de de
300 mL, tips estériles, tuberculinas, agujas hipodérmicas N° 21, jeringas de 5 y 10 mL, laminas
portaobjetos, ligadura, gradillas para tubos 13x100 mm, mechero bunsen, parafilm, plumón
indeleble, respirador, bolsas de bioseguridad 36x24.
Reactivos e insumos: Alcohol 70%, Isopropanol, Acetato de sodio, Dodecilsulfato de sodio (SDS)
10%, Proteinasa K.
Muestra biológicas: Escherichia coli, Saccharomyces spp.
Otros: Solución salina estéril (SSE), agua destilada.
PROCEDIMIENTO:
a. Extracción de ADN por Salting Out
Se empleará el método descrito por Miller (1988) (5) con algunas modificaciones descritas en el
procedimiento:
1. Reactivar una cepa de Escherichia coli de aislamiento clínico
2. Con la finalidad de obtener un cultivo axénico inocular en un tubo con 3 mL de caldo BHI o
caldo tripticasa soya estéril una alícuota de la colonia seleccionada e incubar a 37ºC/24 h.
otra alternativa es sembrar una alícuota por agotamiento y estría en agar TSA
3. Si se incubo en caldo, obtener el paquete celular centrifugando a 5000 rpm/5 minutos y
hacer tres lavados sucesivos con solución salina estéril y finalmente resuspender hasta
alcanzar una turbidez similar al tubo 0.5 del Nefelómetro de Mac Farland.
4. Centrifugar a 12000 rpm/5 min, la suspensión 0.5 de mac farland y eliminar el
sobrenadante
5. Agregar al pellet 360 ul de buffer lisis de glóbulos blancos + 24 ul de SDS al 10% + 6 ul de
Proteinasa K.
6. La suspensión deberá ser transferido a un tubo eppendorf de 2 mL y llevar a baño maria a
56ºC durante 1 hora, pero cada 1º minutos vortecear.
7. Agregar 90 uL de acetato de sodio (C2H3NaO2) 8M, centrifugar a 12000 rpm/ 5minutos
8. Traspasar el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf y repetir el paso 7.
9. Traspasar el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf y precipitar agregando 450 uL de
isopropanol.

10. Centrifugar a 12000 rpm/ 5minutos, eliminar el sobrenadante por inversión (observar el
pellet)
11. Agregar 450 uL de alcohol al 70%, l luego vortex y centrifugar a 12000 rpm/ 5minutos.
12. Eliminar el sobrenadante por inmersión, dejar el pellet secando en la cabina hasta el dia
siguiente o en su defecto secar en una estufa.
13. Añadir 25 uL de agua PCR para resuspender el material genético, vortex
14. Guardar a 4ºC y -70 ºC si la evaluación por PCR demandara de más tiempo.
Nota: para la extracción del ADN de Saccharomyces spp seguir el mismo procedimiento con
la salvedad de que en el paso 5 se deberá agregar perlas de vidrio de 0, 25mm siguiendo las
recomendaciones Graciele-Melo et al. 2016 (6).
Cuestionario
1. Cuáles son las desventajas del empleo del CTAB
2. Describa el procedimiento del metodo CTAB
3. Cuál es la función de la proteinasa k y del acetato
4. Porque se usa perlas en la extracción de ADN genómico de estructuras levaduras de
Cryptococcus
5. Fundamente el método Salting Out (Método de Purificación Salina)
6. Describa otros métodos para extraer ADN del Saccharomyces spp.
1. Current protocols in Molecular Biology. (2003). Recuperado de: http://www.aun.edu.eg/
molecular_biology/Proceeding_Dec2011/Current%20Protocols%20in%20Mol.%20Biol.pdf
2. Velázquez LPA, Aragón MC, Romero AC. Extracción y purificación de ADN. Herramientas
moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos. 1ª ed. México Df; 2014.
3. Wang TY, Wang L, Zhang JH, Dong WH. A simplified universal genomic DNA extraction
protocol suitable for PCR. Genet Mol Res 2011;10(1):519-25. doi: 10.4238/vol10-1gmr1055.
4. López M, Rivera MG, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Comparación de dos
protocolos de extracción de ADN de Trypanosoma cruzi cultivados en medio axénico. Rev
Peru Med Exp Salud Publica. 2014;31(2):222-7.
5. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from
human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):1215.
6. Graciele-Melo C, Rocha-Silva F, Christo PP and Caligiorne RB. Use of Polymerase chain
Reaction for Cryptococcus neoformans Genome Detection in Cerebrospinal Fluid for
Neurocryptococcosis Diagnosis. Med mycol 2016; 2(2): 13
METODO
Edición N0 01
EVALUACIÓN DE ADN GENÓMICO EN CORRIDA
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ELECTROFORÉTICA HORIZONTAL
OBJETIVO:
1. Separar las moléculas de ADN genómico de acuerdo a su peso molecular a través de geles de
agarosa.
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, centrifuga, jeringa dispensadora, micropipetas

automáticas, horno microondas, soporte de geles, cámara de corrida electroforética, fuente poder,
transluminador.
Materiales: Matraces de 250 mL, tubos de vidrio estériles con tapa rosca, taper de plástico de de
300 mL, tips estériles, tuberculinas, agujas hipodérmicas N° 21, jeringas de 5 y 10 mL, laminas
portaobjetos, ligadura, gradillas para tubos 13x100 mm, mechero bunsen, parafilm, plumón
indeleble, respirador, bolsas de bioseguridad 36x24.
Reactivos e insumos: Alcohol 70%, triz acetato EDTA 1X, loading buffer (colorante de corrida),
marcador de corrida (ladder) de 100pb, bromuro de etidio.
Muestra biológicas: ADN genómico de Escherichia coli y Saccharomyces spp.
PROCEDIMIENTO:
a. Preparación de gel de Agarosa al 1% para ADN genómico
1. Pesar 0.3 gr de agarosa, agregar a un matraz (250 mL) más 30 mL de Bufer TAE (triz acetato
EDTA) 1X. y luego añadir aproximadamente 6 a 8 mL de agua destilada.
2. Llevar al microondas hasta que desaparezca los grumos.
3. Colocar el soporte y el peine de 8 pocillos y luego agregar la agarosa.
4. Dejar solidificar y Retirar el peine
b. Corrida electroforética
1. Agregar a la cámara electroforética el buffer de corrida triz acetato EDTA 1X
2. Colocar el gel de agarosa al 1%
3. Sobre un soporte rack extender una cinta de parafilm haciendo presión hasta la formación de
pocillos y luego agregar 1ul de loading buffer (colorante de corrida) más 5ul de ADN de la
muestra extraída (ADN de Escherichia coli).
4. En el primer pocillo del gel agregar 2 uL de ladder (marcador) marca promega o invitrogen de
100 pb con el objetivo de calcular el tamaño de pb de los productos amplificados.
5. En los siguiente pocillos agregar los 6ul de la mezcla obtenida en el paso 3 ( 5 uL de ADN de
la muestra extraida más 1ul de loading buffer)
6. Empezar la corrida electroforética a 40 V por 10 minutos, luego a 90 V por 50 minutos.
7. Teñir el gel con bromuro de etidio por 15 minutos
8. Retirar el gel del bromuro de etidio
9. Leer el gel con el farox fx plus o con el trasluminador
10. De existir el farox las bandas serán fotodocumentados empleando un escáner molecular
de marca Pharos Fx Plus, para ser visualizadas con el software Quantity One BIORAD.
Figura 1: procedimiento de preparación de gel de agarosa y corrida electroforética

1. Fierro F. Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos

teóricos y prácticos. 1ª ed. México Df; 2014.
2. Peña-Castro Julián M., Gregorio-Ramírez Oscar, Barrera-Figueroa Blanca E. Los métodos
experimentales que permiten el estudio de las macromoléculas de la vida: historia,
fundamentos y perspectivas. Educ quím 2013; 24 (2): 237-246. Disponible en:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-
893X2013000200009&lng=es.
3. Ruiz V, Garrote H, Díaz C, Fernández L, Amor A. Electroforesis capilar para el análisis de
marcadores oncohematológicos en el Instituto de Hematología e Inmunología. Revista
Cubana de Hematol, Inmunol y Hemoterapia 2017;33(3): 114-6. Disponible en:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-02892017000300015&lng=es.
4. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN.
Serie de normas técnicas N° 38, Lima 2003; 61 pág.
http://www.bvs.ins.gob.pe/insprint/salud_publica/nor_tec/18.pdf

METODO
Edición N0 01
ELABORACIÓN DE YOGURT Página 1
OBJETIVO:
1. Producir yogurt como alimento probiótico.
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, incubadora de tecnoport 60x60, licuadora, cocina,

balanza analítica.
Materiales: olla, balde de plástico, probeta, táper, colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos,
vasos, botellas, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, bolsas de bioseguridad 36x24.
Medios de cultivo: Agar rugosa.
Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), ácido cítrico, bicarbonato de sodio,
bisulfito de sodio.
Muestra biológicas e insumos: fresas, cultivo de Lactobacillus, azúcar blanca, leche en polvo
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, mascarilla.
Otros: Solución salina estéril (SSE),

PROCEDIMIENTO
a) Materia prima: leche 5 litros, azúcar blanca 10% (500 gr para 5 L)

b) Pasteurización: en una olla disolver la leche con el azúcar blanca y 50 gramos de leche en
polvo. proceder a hervir por unos segundos y luego enfriar bruscamente con agua helada
hasta 42 0C.
c) Cultivo bacteriano: asegurarse que la leche pasteurizada se encuentre a 42 0C para agregar
el cultivo bacteriano y luego homogenizar.
d) Incubación: introducir la olla conteniendo la leche y el cultivo bacteriano a una caja tecnoport
que en su interior contiene 2 vasos de agua a 100 0C. y proceder a cerrar inmediatamente
junto a una bolsa negra y dejar por 4 horas.
e) Descremado: después de las 4 horas retirar de la superficie la zona coagulada (nata) y luego
hacer un batido ligero
f) Almíbar: agregar el almíbar (licuar 500 gr de fresa + 150 gramos de azúcar y proceder a
hervir a fuego lento por 30 minutos) y hacer un ligero batido.
Nota: la fruta para el almíbar debe estar entre el 10 a 12%
g) Refrigeración. Conservar en refrigeración con la finalidad de evitar la fermentación.

METODO
Edición N0 01
ELABORACIÓN DE VINO Página 1 de 4
OBJETIVO:
1. Elaborar vino tinto empleando Saccharomyces cerevisiae
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, jeringa dispensadora, biorreactor tipo tanque batch
anaerobio, autoclave, horno, cocina, balanza analítica, refractómetro, alcoholímetro.
Materiales: damajuana de 4 litros, balde de plástico, probeta, tapas de goma, cánulas de plástico
recipientes de plástico, colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos, vasos, manguera,
botellas, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, jabón líquido, bolsas de bioseguridad 36x24.
Medios de cultivo: agar sabouraud.
Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), bicarbonato de sodio, metabisulfito de
sodio, acido tartárico.
Muestra biológicas e insumos: uva, levadura de panificación, azúcar blanca
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, mascarillas.
PROCEDIMIENTO
a) Obtención del mosto

 Selección: uvas en buen estado
 Lavado y pesado: pesar aproximadamente 10kg de uva y proceder a lavar con hipoclorito
para determinar su rendimiento
 Desgranado: seleccionar y separar los granos del racimo en condiciones optimas
 Estrujado o chapeado: triturar los granos de uva procurando no dañar las pepas y luego
medir el volumen y realizar:
Medición y corrección del PH: ajustar el pH a 3.5 con ácido tartárico.
Corrección del Azúcar - determinación de 0BRIX: la escala Brix se emplea en la industria

alimentaria para medir la cantidad de azucares en zumo de frutas refractómetro para poder
iniciar la fermentación, se debe tener un máximo de 24 °Brix. Para ajustar el °Brix requerido
(24 °Brix) se adiciona la cantidad de azúcar blanca determinada, según la fórmula:

°Brix inicial = 19; ° Brix Final = 24; Peso del mosto hipotético = 5 Kg
Por tanto, deberemos agregar 329 gr de azúcar blanca a nuestro mosto como
corrección de azúcar. Asimismo, considerar que nuestro volumen final será de 5329
mL (5000 mL + 329 gr de azúcar)
b) Fermentación
 Agregar las uvas chapeadas (mosto corregido) al biorreactor previamente esterilizado
 Sulfitado: adicionar 0.20 gr de metasulfito de potasio por litro de mosto.
 Adición de levadura: agregar 0.3 gr de Saccharomyces cerevisiae por litro de mosto. En
este caso se deberá activar previamente disolviendo la levadura en agua fría temperada o
en 100 mL de mosto a 30 0C/ 10 minutos para luego agregar al fermentador primario o
biorreactor.
 Cerrar el biorreactor y dejar en fermentación anaerobia a temperatura ambiente durante 6
a 8 días. observando previamente la formación de un sombrero de orujos en la parte
superior del fermentador.
 Consideración diaria: realizar movimientos cada día tratando de sumergir el sombrero con
la finalidad de extraer el máximo colorante de la cascara y evitar desarrollo de bacterias
acéticas en los espacios de aire en el hollejo.
c) Descube
 Trasegar o separar el mosto fermentado de los residuos de levadura y solidos precipitados
empleando un colador a un recipiente de vidrio limpio. Finalmente exprimir los hollejos del
colador hasta obtener el máximo de vino con ayuda de una tela o gasa
d) Fermentación secundaria
 Transferir el vino al biorreactor para llevar a cabo la fermentación secundaria y dejar por 15
días.
e) Trasiego
 El primer trasiego se hace de 15 días después del descube (final de la fermentación
secundaria).
 El segundo y tercer trasiego se llevan a cabo luego de otros 15 días.
f) Clarificación
 para acelerar el proceso de clarificado se usa bentonita en una proporción del 0.1%
 un vino bien preparado se aclara por si solo espontáneamente después de 6 meses.
g) Embotellado
 el vino se deja en botellas debidamente llenas y cerradas; el llenado y el encorchado
realizar en forma manual.
 Se sometieron a pasteurización (80°C/15 min)

de un fermentador burbujeo para producción de vino
RESULTADOS
a) Análisis organoléptico del vino
Análisis Puntaje
Aspecto
Aroma
Color
Sabor
Muy bueno Bueno Regular Malo Muy malo
5 4 3 2 1

b) Parámetros
Parámetros Cantidad
Peso inicial de uvas ………………………………. gr
Cantidad de Mosto Puro ………………………………. mL
Acidez ………………………………. pH
Brix deseado ……………………………….
Brix inicial ……………………………….
Cantidad de Azúcar ………………………………. gr
Volumen de CO2 producido ………………………………. mL
Volumen de vino producido ………………………………. mL
Aspecto ……………………………….
Aroma ……………………………….
Color ……………………………….
Sabor ……………………………….
Grados alcohólico ……………………………….
Tarea a desarrollar:
1. colocar sus imágenes del proceso en secuencia hasta la obtención del producto final
2. realizar un flujograma de su proceso

METODO
Edición N0 01
ELABORACIÓN DE VINAGRE Página 1 de 3
OBJETIVO:
1. Producir de vinagre de plátano de seda empleando Acetobacter aceti en un biorreactor de

columna de burbujeo.
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, jeringa dispensadora, biorreactor tipo tanque batch
anaerobio, biorreactor de columna de burbujeo, autoclave, horno, cocina, licuadora, balanza
analítica, refractómetro, alcoholímetro.
Materiales: damajuana de 4 litros, balde de plástico, probeta, tapas de goma, cánulas de plástico
recipientes de plástico, colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos, vasos, manguera,
botellas, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, jabón líquido, bolsas de bioseguridad 36x24.
Medios de cultivo: medio Lee.
Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), ácido cítrico, bicarbonato de sodio,
bisulfito de sodio.
Muestra biológicas e insumos: plátano, levadura seca de panificación, azúcar blanca
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, mascarillas.
PROCEDIMIENTO
a) Obtención del mosto

 Selección: 1 kg de plátano en buen estado
 Trozado: después del pelado pesar para determinar su rendimiento
 Licuado de la pulpa: usar agua caliente ± 70 0C para evitar el ennegrecimiento y luego
medir la pulpa obtenida (ejemplo 1L)
 Mosto corregido: diluir 2L de agua hervida fría por cada litro de pulpa obtenida
obteniendo 3L y luego realizar:
Corrección del azúcar: añadir 120 gramos de azúcar por litro de mosto diluido ejemplo,
360 gramos para los 3L obtenidos hasta el momento.
Corrección de la acidez: agregar 0.75 gramos de ácido cítrico a los 3 litros de mosto
diluido
Nota. Por cada 10 litros de mosto diluido agregar 2.5 gr de ácido cítrico
b) Fermentación alcohólica
 Biorreactor estéril: Agregar el mosto corregido tibio (± 30 0C)
 Adición de levadura: agregar 1 gr de Saccharomyces cerevisiae por litro de mosto
corregido. En este caso se deberá activar previamente disolviendo la levadura en un

recipiente con agua hervida temperada, mosto y 3 cucharaditas de azúcar a 30 0C, tapar
el recipiente por 10 minutos. La activación se notará por la formación de burbujas en la
superficie y en ese estado agregar al fermentador primario o biorreactor.
 Cerrar el biorreactor y dejar en fermentación anaerobia a temperatura ambiente durante
20 días. el uso del alcoholímetro facilita un mejor control del proceso de fermentación.
observando previamente la formación de un sombrero de orujos en la parte superior del
fermentador.
 Consideración diaria: realizar movientes cada día tratando de sumergir el sombrero con
la finalidad de extraer el máximo colorante de la cascara y evitar desarrollo de bacterias
acéticas en los espacios de aire en el hollejo.
c) Descube y acondicionamiento del mosto alcohólico

 Trasegar o separar el mosto alcohólico procurando no mezclar los residuos de levadura y
solidos precipitados de la fruta abriendo la llave del biorreactor a un recipiente de vidrio
limpio y medir el volumen obtenido.
 Corrección del grado alcohólico (1:2): diluir el mosto alcohólico obtenido 140 (1 parte) con
agua hervida fría (2 partes) = mosto alcohólico 100.
 Corrección de acidez acética: Para 1L de mosto alcohólico 100 añadir 0.75 L de vinagre
iniciador (5% acidez y 00 alcohol). En este caso se activa previamente el Acetobacter aceti
en mosto de uva o cerveza.
h) Fermentación Acética.
 Transferir el mosto alcohólico corregido al biorreactor de columna de burbujeo estéril.
 para llevar a cabo la fermentación acética dejar por 60 días a 240 C. después de 10 diez
días evidenciar la aparición de un velo blanquecino en la superficie.
 Transcurrido los 15 días evaluar cada semana la producción de ácido acético por
titulación:
 Abrir el caño del biorreactor y obtener 10 mL de vinagre en un matraz Erlenmeyer y
adicionar 20 mL de agua destilada
 Adicionar 2 – 3 gotas de fenolftaleína
 Titular con NaOH 0.1 N, hasta color rosado tenue y registrar el gasto
 Calculo de la acidez acética.
 Donde
Vg: volumen de gasto de la base
N: normalidad de la base= 0.1N
Me: meliequivalentes de ácido acético= 0,06
VMx: volumen de la muestra en mL tomado para la titulación
i) Filtrado
 Filtrar la mitad del volumen del vinagre separado del biorreactor empleando una capa de
tocuyo o doble capa de gasa estéril. En la superficie de un recipiente.
 Añadir nuevo mosto alcohólico acondicionado a la mitad del vinagre que quedo en el
biorreactor. La obtención de vinagre y la adición de mosto alcohólico acondicionado se
realiza cada 20 días sucesivamente.

j) Vinagre acondicionamiento
 Adicionar al vinagre filtrado 0.15 gramos de bisulfito de sodio por cada 1.5 litros d
vinagre o 0.25 gr de sal por cada litro de vinagre para detener la fermentación
acética.
k) Envasado
 Remojar botellas de 250 – 300 cm3 de capacidad con detergente y dos cucharaditas de
soda caustica por 10 litros de agua
 Escurrir las botellas
 Llenar las botellas con un embudo limpio
 Colocar corchos o tapones de plástico más un capuchino sobre ellos
 Almacenar a temperatura ambiente en lugar fresco y seguro.

de un fermentador burbujeo para producción de vinagre

METODO
Edición N0 01
ELABORACIÓN DE AMILASA Página 1 de 4
OBJETIVO:
1. Obtener amilasas de Aspergillus niger utilizando almidón de yuca como sustrato en un

biorreactor de columna de burbujeo
MATERIALES:
Equipos: Estufa, refrigeradora, autoclave, horno, termómetros, jeringa dispensadora, biorreactor de

columna de burbujeo, cocina, balanza analítica,
Materiales: damajuana de 4 litros, balde de plástico, probeta, balón de 200 mL, micropipetas, tubos
de ensayo, cámara de neubawer, tapas de goma, cánulas de plástico recipientes de plástico,
colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos, vasos, manguera, botellas, mechero bunsen,
parafilm, plumón indeleble, jabón líquido, bolsas de bioseguridad 36x24.
Medios de cultivo: agar sabouraud, agar almidón, caldo almidón
Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), lugol, fehling A, Fehling B.
Muestra biológicas e insumos: Aspergillus niger
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, respirador N-95,
PROCEDIMIENTO
a) Obtención de Aspergillus niger

 Recolectar 5 – 10 gr de suelo agrícola en frascos estériles y transportar hasta su
procesamiento.
 Sembrar por agotamiento y estría en agar almidón 1%
 Seleccionar la cepa de A. niger mejor productora de amilasas
 Realizar una suspensión de esporas en 100 mL de solución salina estéril.
 Estandarizar la suspensión a una concentración de 108 esporas / mL. Para ello realizar el
recuento en una cámara de Neubawer.
 Inocular los 100 mL de la suspensión de esporas al biorreactor de columna de burbujeo.
b) Obtención de almidón de yuca
 Rayar la yuca y proceder a licuar
 Depositar en un recipiente y dejar sedimentar por un día
 Eliminar el sobrenadante y el sedimento extender en papel kraf
 Secar en el horno removiendo cada cierto tiempo a fin de no formar una masa
 Moler o triturar los gránulos en un mortero. La harina obtenida constituye el almidón
 Almacenar en un frasco estéril.

c) Preparación del caldo almidón
 KH2PO4 0.5 gr
 K2HPO4 0.5 gr
 MgSO4.7H2O 0.2 gr
 (NH4)2so4 0.2 gr
 Almidón de yuca 10gr
 Agua destilada 1000 mL-
 Ph 5.5.
d) Fermentación en biorreactor
 Agregar al biorreactor 900 mL de caldo almidón en condiciones de esterilidad
 Inocular 100 mL de la suspensión de esporas de A. niger al biorreactor de columna de
burbujeo. Equivalente al 10% V/V del total del caldo de fermentación.
 Asegurar que el sistema de purificación del aire tenga una solución de NaCl 20%.
 Dejar en fermentación aeróbica por 3 días o hasta el consumo total del almidón (valore con
lugol).
e) Filtración y determinación de hidrolisis de almidón
 Vaciar el caldo de fermentación hidrolizado en un matraz estéril
 Filtrar con papel wattman y separar la biomasa fúngica del caldo de fermentación
 Pesar la biomasa obtenida.
 El filtrado obtenido se valora con lugol y fehling según las siguientes recomendaciones:
Prueba de lugol: determinación de almidón
 En un tubo de ensayo agregar 0.5 mL de caldo fermentado y una gota de lugol
 Lectura; color azul= almidón positivo; incoloro=almidón negativo implica producción de
amilasas
Prueba de fehling: determinación de glucosa
 En un tubo de ensayo agregar 0.5 mL de caldo fermentado + 0,5 mL de reactivo fehling
A + 0,5 mL de reactivo fehling B (benedict)
 Lectura; precipitado rojo ladrillo = glucosa positiva, implica producción de amilasas;
color azul = glucosa negativo
f) Separación de la glucosa
 Dejar decantar en el matraz estéril
 Visualizar un sedimento blanco y dulce (glucosa)
 Pese y determine la concentración de glucosa obtenida.
Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de

burbujeo para producción de vinagre

RESULTADOS
a) Parámetros obtenidos
Análisis Resultado
Tiempo de consumo total de almidón
Concentración de la biomasa
obtenida
Concentración de glucosa obtenida
Prueba de lugol
Prueba de fehling

METODO
Edición N0 01
Página 1 de 4
CULTIVO DE TEJIDO ANIMAL
OBJETIVO
1. Realizar cultivo de tejido primario y secundario en embrión de pollo
MATERIALES
Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetro, centrifuga, jeringa dispensadora, micropipetas

automáticas, microscopio invertido, horno.
Materiales: Matraces de 250 mL, tubos de vidrio estériles con tapa rosca, placas petri, frascos de
medio de cultivo, pipetas de 10 mL estériles, tips estériles, tuberculinas, agujas hipodérmicas N° 21,
jeringas de 5 y 10 mL, laminas portaobjetos, bisturí Nº 21, tijeras, pinzas, ligadura, gradillas para
tubos 13x100 mm, tubo cónico de polipropileno estéril de 15 y 50 mL, mechero bunsen, parafilm,
plumón indeleble, bolsas de bioseguridad 36x24.
Reactivos e insumos: Alcohol 70%, azul de tripán, medio DMEN O RPMI 1640, suero fetal bovino,
antibióticos (penicilina, estreptomicina y anfotericina B), fitohemaglutinina, para cultivo de linfocitos;
colchicina, cloruro de potasio, metanol, ácido acético, giemsa.
Muestra biológicas: embrión de pollo, sangre humana.
EPP: Mandil, respirador, lentes, guantes, papel toalla, jabón líquido.
PROCEDIMIENTO
a. Preparación de cultivo primario
1. Incubar los huevos de gallina a 37 ºC durante 8 a 12 días
2. Preparar el medio de cultivo: 36 mL de medio DMEN + 4 mL suero fetal bovino + 400 uL de
antibiótico.
3. Limpiar la superficie de los huevos con alcohol de 70 % y luego con una pinza estéril romper
cuidadosamente la cascara a la altura de la cámara de aire.
4. Depositar el embrión de pollo en una placa petri estéril y seleccionar un trozo de la región de
la pierna o el pecho con un bisturí Nº 21.
5. La región seleccionada depositarlo en una nueva placa y agregar 2mL de medio de cultivo
6. Realizar el triturado y luego verter a un tubo cónico de polipropileno estéril de 15 mL
7. Agregar 3 mL de tripsina, homogenizar e Incubar a 37 º C durante 10 minutos
8. Trasferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de polipropileno de 15 mL y centrifugar a
1700 rpm durante 10 minutos
9. Eliminar el sobrenadante y al sedimento (± 2 mL) agregar 8 mL de medio de cultivo
10. Transferir los 10 mL al frasco de cultivo celular e incubar a 37 ºC/ 24 horas
11. Retirar el medio de cultivo suspendido dejando ± 1 mL y agregar 9mL de medio de cultivo e
incubar a 37 ºC/ 24 horas.
12. Observar el crecimiento celular en el frasco de cultivo en el microscopio invertido

b. Cultivo secundario
13. Retirar el medio de cultivo suspendido del día anterior.
14. Agregar 2 mL de tripsina 0.05% al frasco de cultivo celular e incubar a 37 ºC/ 10 minutos para
desprender las células de la monocapa impregnadas.
15. Agregar al frasco 7mL de medio de cultivo y transferir a un tubo cónico estéril de 15 mL
16. Centrifugar a 1700 rpm durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante
17. Al sedimento agregar 5 mL de medio de cultivo y homogenizar
18. Transferir a un tubo cónico estéril de 50 mL y nuevamente agregar 15 mL más de medio de
cultivo
19. Trasferir a frascos de cultivo nuevos la cantidad de 10 mL e incubar a 37 ºC/ 24 horas.
Figura 1. Proceso de obtención de cultivo primario y secundario en embrión de pollo

1. Renneberg R, Berkling V, Loroch V. Biotechnology for Beginners. Second Edition. Elsevier;
2016 https://www.sciencedirect.com/book/9780128012246/biotechnology-for-
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21. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: https://www.genome.jp/kegg/
22. BioCyc: https://biocyc.org/

Guia Biotecnologia - 2019 - II

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

GUIA PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

MSc. ROBERTO VENTURA FLORES

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

Practica 1: Bioseguridad y buenas prácticas en biotecnología

Practica 2: Uso de base de datos para investigación biotecnológica

Practica 3: Ética en la producción biotecnológica, elaboración de protocolos.

Practica 4: Construcción y funcionamiento de un biorreactor a escala de laboratorio

Practica 5: Modelamiento de proteínas por Homología

Practica 6: Aislamiento de microorganismos seguros de impacto biotecnológico

Practica 7: Presentación grafica del crecimiento microbiano

Practica 8: Determinación de coeficientes estequiométricos de reacciones biológicas

Practica 9: Obtención de ADN bacteriano y ADN levaduriforme

Practica 10: Evaluación de ADN genómico en corrida electroforética horizontal

Practica 11: Producción de yogurt (proyecto)

Practica 12: Elaboración de vino por S. cerevisiae (proyecto)

Practica 13: Elaboración de vinagre por bacterias acéticas (proyecto)

Practica14: Elaboración de amilasa empleando Aspergillus niger (proyecto).

Practica 15: Cultivo de tejido animal

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRACTICAS Página 1 - 4

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, respirador N-95, jabón líquido.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

Peligro Riesgo Consecuencia

b) Esquematice el laboratorio donde realiza sus prácticas, mencione:

1. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos bioseguridad en laboratorios de ensayo,

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

2. Ingreso a la base KEGG

Tarea: analizar la ruta metabólica de dos microorganismos de impacto industrial y dos

4. Ingreso a la base de datos BioCyc: MetaCyc

5. Ingreso a la base de datos Argenfoods

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

ETICA EN BIOTECNOLOGÍA Página 1 - 3

Elaborar protocolos de investigación, facilitando información y fundamentación de aspectos éticos en

Equipos: Laptop, retroproyector

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

1. Resolución de caso ficticio: cortar y pegar información de internet para elaboración de un

 Leer el contenido del caso

 Resolver el cuestionario propuesto

2. Elaboración de protocolo de investigación de un producto Biotecnológico considerando

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

1. Resolución de caso ficticio: cortar y pegar información de internet para elaboración de un

e. Que es mala conducta científica

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

Investigadores del Estudio:

invito a Usted a participar del pr esent e estudio q ue consist e en

Este estudio tiene por finalidad determinar …………………………………………………………………

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

Diseñar, construir y funcionar un biorreactor a escala de laboratorio.

Equipos: Laptop, retroproyector

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

1. Construcción de Biorreactor columna de burbujeo

Tamaño del biorreactor

 Altura del tanque (HT): 33 cm

 Altura del líquido (HL): 18 cm

 Diámetro del tanque (DT): 10 cm

Figura 1: diagrama de Biorreactor

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores

Figura 2. Construcción Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de

Practica 3: Esquematice un sistema de esterilización por vapor