MICOLOGIA

1. LOS HONGOS
Micología
La micología es la rama de la biología que tiene por objetivo el estudio de los
hongos.

Los hongos constituyen un grupo de organismos muy diverso y heterogéneo, hasta tal punto
que su clasificación taxonómica experimenta continuas variaciones. Así, el reino de los
hongos incluye desde setas comestibles hasta hongos microscópicos patógenos, pasando por
levaduras que se usan en la elaboración de alimentos y por hongos que degradan materia
orgánica en la naturaleza.

1.1. Morfología

Los hongos patógenos incluyen especies unicelulares y pluricelulares. Por ello, su estudio
morfológico se debe hacer en tres niveles: el celular, el de organización pluricelular (en las
especies pluricelulares) y el que concierne al aspecto de la colonia sobre medios de cultivo in
vitro.

Las células
Las células fúngicas son eucariotas; es decir, presentan núcleo definido rodeado de una
membrana nuclear, citoesqueleto y distintos tipos de orgánulos.

Como característica diferencial cabe destacar que tienen pared celular, formada por capas
constituidas por:

• Polímeros fibrilares, principalmente quitina, un polisacárido que forma también parte

importante del exoesqueleto de los artrópodos. Están situados sobre la cara exterior
de la membrana plasmática.
• Estructuras amorfas, como glucanos y mananos, que contienen los principales
antígenos de la pared y se sitúan externamente a la capa de polisacáridos.

Las unidades anatómicas

Son unidades anatómicas y de crecimiento: las células levaduriformes de los hongos
unicelulares o levaduras, y el micelio de los hongos pluricelulares, formado por un conjunto
de hifas. También existen hongos denominados dimórficos, que presentan ambas formas de
crecimiento.

Las células levaduriformes

Las levaduras son hongos unicelulares cuyas células presentan formas diversas, generalmente
esféricas u ovoides. Algunas forman cadenas, estructuras a las que se denomina pseudohifas.

El micelio y las hifas

Los hongos filamentosos o mohos están constituidos por células alargadas que se disponen
linealmente y forman largos filamentos denominados hifas. Las hifas pueden ser:

• Tabicadas: existen particiones denominadas septos que compartimentan la hifa.

Suelen ser multinucleadas.
• Cenocíticas: no tienen septos y el citoplasma es continuo en toda la hifa.

Las colonias
Las colonias de levaduras y de hongos filamentosos presentan ciertas características
macroscópicas:

• Levaduras. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son poco elevadas,

húmedas, opacas, cremosas o pastosas y algo mucosas. Suelen ser de color
blanquecino, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Algunas colonias
cambian poco de aspecto cuando envejecen, mientras que otras se secan y se
vuelven rugosas.
• Hongos filamentosos o mohos. Forman colonias de aspecto algodonoso, que se van
elevando a medida que crecen las hifas.

Ejemplo del aspecto de colonias de levaduras (a) y de hongos filamentosos (b)

Fuente: Altamar

1.2. Funciones vitales

El medio en que se desarrollan los hongos debe proporcionarles los nutrientes necesarios
(carbohidratos, lípidos, etc.) y mantener unas condiciones ambientales adecuadas:

• Oxígeno. Los hongos son aerobios y, por tanto, requieren oxígeno para su
metabolismo. Pero algunos de ellos son anaerobios facultativos, y ante niveles bajos
de oxígeno pueden recurrir a vías metabólicas fermentativas alternativas.
• Temperatura. Según sus necesidades en cuanto a temperatura distinguimos entre:
Hongos mesófilos. Resisten un amplio margen de temperaturas, entre 0 ºC y 50 °C,
con un óptimo entre 20 ºC y 30 ºC. Son hongos de importancia médica. Hongos
termófilos. Resisten hasta 55 °C. Hongos anemófilos. Solo sobreviven a temperaturas
ambientales.
• PH. Los hongos toleran un gran intervalo de pH (2,5-7,5). Por lo general soportan
mejor el medio ácido que el alcalino.

Nutrición y metabolismo
Los hongos se alimentan de materia orgánica, que puede proceder de organismos vivos
(hongos parásitos) o de restos de organismos (hongos saprófitos). También existen hongos
que viven en simbiosis con otros organismos, aunque no tienen importancia desde un punto
de vista clínico.

Los hongos sintetizan enzimas digestivas (lipasas, celulasas, etc.) que vierten al medio
extracelular, donde degradan las biomoléculas presentes para obtener partículas de menor
tamaño capaces de atravesar su membrana plasmática (por difusión pasiva o por transporte
activo). La pared celular evita que la célula sea digerida por sus propias enzimas.

Un aspecto característico de los hongos es que sintetizan glucógeno como molécula de

almacenamiento de glucosa (de energía), igual que ocurre con las células de los animales.

Reproducción

La reproducción de los hongos puede ser:

• De forma asexual
• Puede ser de distintos tipos: LevadurasHongos formadores de hifas De
forma sexual.
Este tipo de reproducción es poco frecuente entre los hongos que producen patologías
humanas. Los hongos que se reproducen de esta forma se denominan hongos perfectos, y lo
hacen cuando el medio es pobre en nutrientes.
La reproducción sexual de los hongos consiste en la formación de esporas mediante un
proceso en el que se fusionan dos células, el cual implica una recombinación de material
genético.
 Principales tipos de esporas
Fuente: Altamar

2. LAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS

Los hongos pueden causar en el ser humano diversas patologías, del tipo de infecciones,
reacciones de hipersensibilidad e intoxicaciones.

• Infecciones. Las infecciones de origen fúngico se denominan micosis. A continuación

explicaremos las más habituales.
• Hipersensibilidad. Las alergias por hongos se deben a una reacción de
hipersensibilidad hacia alérgenos fúngicos, que suelen ser esporas o fragmentos de
hifas. Los cuadros clínicos pueden ser cutáneos o gástricos, aunque los más comunes
son de tipo respiratorio.

• Intoxicaciones. Pueden ser: Micotoxicosis. En general, se deben a la ingestión de

alimentos contaminados con micotoxinas o con metabolitos tóxicos formados por
hongos. Los alimentos que más fácilmente pueden producir micotoxicosis son las
semillas y granos de plantas leguminosas y oleaginosas. Micetismo. Se deben a la
ingestión, generalmente accidental, de setas tóxicas.

2.1. Tipos de micosis

Micosis superficiales
Las micosis superficiales afectan a la capa córnea de la piel y la porción suprafolicular del
pelo.

No afectan a células vivas. La pitiriasis versicolor es la micosis superficial más frecuente en

nuestro entorno, en el cual otras micosis superficiales son muy raras. Se trata de una
enfermedad crónica que provoca manchas en la piel y que está causada por especies del
género Malassezia.
Micosis cutáneas
Las micosis cutáneas afectan a la piel y sus anejos (pelos y uñas). Pueden corresponder a una
infección primaria o ser manifestaciones de una micosis sistémica.

Entre las micosis cutáneas podemos distinguir las dermatofitosis, las dermatomicosis
provocadas por Scytalidium y las candidiasis cutaneomucosa.

Micosis subcutáneas
Las micosis subcutáneas son infecciones crónicas causadas por hongos que se han
introducido en forma directa en la dermis o en el tejido celular subcutáneo por medio de una
lesión penetrante.

Los hongos que provocan estas micosis penetran a través de lesiones cutáneas, generalmente
pinchazos.

Micosis profundas
Las micosis profundas son infecciones causadas por hongos patógenos con capacidad de
invadir tejidos profundos e incluso vísceras.

Micosis sistémicas
La expresión micosis sistémicas se reserva para micosis invasoras o que afecten a dos o más
órganos no adyacentes, producidas por especies patógenas oportunistas.

El agente etiológico de las micosis sistémicas puede ser cualquier hongo capaz de crecer a
37°C y cuyos requerimientos nutricionales se vean cubiertos con los tejidos del hospedador.

3. LA PREPARACIO N Y EL CULTIVO DE MUESTRAS

La identificación del hongo responsable de una micosis permite establecer un tratamiento

específico.

Para conseguirlo es necesario tomar muestras representativas para la detección del hongo y
aplicar procedimientos de recogida, conservación y transporte adecuados para garantizar su
supervivencia hasta la llegada al laboratorio.

Recepción de las muestras

Las muestras destinadas al estudio de hongos deben cumplir algunos requisitos básicos en
cuanto a su obtención, conservación y transporte, que detallamos a continuación.

El incumplimiento de alguno de ellos supondrá el rechazo de la muestra:

• Es necesario recoger las muestras asépticamente y utilizando instrumental

estéril.
 • No se deben usar hisopos para la recogida y transporte de las muestras, salvo
que no haya una opción mejor, ya que al microscopio los filamentos del
hisopo se pueden confundir con hifas.
• Las muestras se deben transportar preferiblemente en un recipiente estéril,
humidificado y a prueba de vertidos.

Las muestras dermatológicas se pueden transportar en seco (placa de Petri, entre dos portas,
etc.) o, de forma ideal, sembradas en un medio de cultivo adecuado.

Los raspados corneales y hemocultivos se deben sembrar directamente tras su obtención.

• No se deben utilizar medios de transporte, a no ser que sea fácil retirar la

muestra del medio.
• No se debe añadir ningún conservante a las muestras.
• Las muestras que no se siembran inmediatamente tras su obtención se deben
llevar rápidamente al laboratorio, para que se pueda proceder a la siembra en
un máximo de dos horas tras la obtención.
• Excepto en los casos en que los protocolos establezcan otros criterios, lo
habitual es transportar las muestras a temperatura ambiente.

Preparación de las muestras

Antes de llevar a cabo la observación microscópica y el cultivo, es necesario preparar las

muestras.

El primer paso es la observación macroscópica, para detectar la presencia de gránulos,

material caseoso, purulento, hemorrágico o necrótico. A partir de esta observación se
selecciona una parte representativa; en muestras como esputo y tejidos, deben buscarse las
zonas de pus, caseificación o necrosis.

Seguidamente se prepara la muestra para la posterior observación al microscopio y siembra

en medios de cultivo:

• Los tejidos se trocean con tijeras o bisturí, y los pequeños trozos se inoculan
en el medio de cultivo.
• Los fragmentos ungueales se trocean progresivamente con un bisturí y se
pulverizan.
• Las muestras altamente viscosas, como el esputo, deben fluidificarse, pero sin
diluirlas excesivamente.
• Los líquidos orgánicos (LCR, pleural, peritoneal, etc.) u otras muestras muy
diluidas se pueden concentrar por centrifugación (1.500-2.500 g durante diez
minutos) o filtración (0,2 µm de poro). En algunos casos se pueden inocular
directamente en el medio de cultivo.
3.1. Observación microscópica

El diagnóstico definitivo de las infecciones por hongos se basa en el aislamiento e

identificación del hongo a partir de un cultivo, lo cual suele requerir varios días o semanas.

Para obtener de forma más rápida un diagnóstico de sospecha o, en algún

caso puntual, incluso un diagnóstico definitivo, se realiza una observación de
la muestra al microscopio para identificar ciertas estructuras fúngicas.

Examen en fresco
El examen microscópico en fresco es útil en muestras de piel y material ungueal. Para llevarlo
a efecto se deposita una pequeña cantidad de muestra sobre un portaobjetos y se le
adicionan unas gotas de una solución de hidróxido potásico (KOH) al 10%. Se cubre el
conjunto con un cubreobjetos y se observa al microscopio.

El KOH disuelve la queratina y digiere parcialmente el componente proteico celular, pero no

ataca la pared de polisacáridos de los hongos, por lo que facilita la visualización de las
estructuras fúngicas (hifas y esporas).

Tinciones
Las tinciones que se utilizan para detectar la presencia de hongos en muestras biológicas
dependen del tipo de muestra que se vaya a estudiar.

Muestras de tejidos
En muestras tisulares se emplean tinciones histológicas que marcan algún componente
específico de los hongos. Las de uso más frecuente son estas:

• Tinción de Giemsa. Se basa en una mezcla de colorantes básicos y ácidos que tiñen de
colores diferentes las estructuras celulares. Uno de esos colorantes, el azul de
metileno, tiene propiedades metacromáticas, de manera que las hifas de algunos
hongos se tiñen de púrpura.
Es una tinción útil cuando se sospecha que hay micetoma, histoplasmosis,
coccidioidomicosis, neumocistosis y micosis cutáneas con exudado o pus.
• Tinción de PAS. Es específica para polisacáridos y glucógeno, por lo que tiñe de rosa
intenso las hifas y esporas de los hongos.
Es útil cuando se sospecha que hay micetoma, coccidioidomicosis y onicomicosis.
• Tinciones argénticas, como las de Gomori-Grocott y Fontana de Masson. Se basan en
el empleo de sales de plata que se depositan sobre la pared de las células fúngicas,
tiñéndolas de marrón oscuro o negro.
Son especialmente útiles para identificar neumocistosis por Pneumocystis jirovecii.
• Técnicas de inmunofluorescencia. Se basan en el uso de anticuerpos específicos
marcados con fluorocromos. Para visualizarlos se requiere un microscopio de
fluorescencia.
Muestras líquidas
Las muestras líquidas, como el esputo o el líquido cefalorraquídeo, se pueden teñir con
tinciones microbiológicas clásicas, como las de Gram o Giemsa, previa obtención de
extensiones fijadas por calor.

Una tinción que permite detectar esporas y levaduras encapsuladas es la tinción de tinta
china o nigrosina. Se lleva a cabo mezclando la muestra con la tinta china o la nigrosina, se
coloca una alícuota de la mezcla entre porta y cubre y se observa directamente al
microscopio. La cápsula que rodea las levaduras impide el paso del colorante, por lo que se
observan como burbujas brillantes en un fondo negro. Es una técnica especialmente útil en
sospechas de infección por Crytococcus neoformans.

Al igual que en las muestras tisulares, se pueden utilizar también técnicas de

inmunofluorescencia sobre extensiones fijadas.

Interpretación de los resultados

La observación de estructuras fúngicas permite orientar sobre el tipo de hongo presente en
una muestra y ayuda a escoger el medio de cultivo más adecuado. Esto es debido a que
ciertos elementos observables al microscopio pueden asociarse con ciertos géneros o
especies.

Sin embargo, hay que tener presente que:

• Un resultado negativo en esta fase no excluye que pueda haber una infección.
• Algunos elementos presentes en las muestras se pueden confundir con estructuras
fúngicas. Por ejemplo, fibras de colágeno o fibras procedentes de un hisopo se
pueden confundir con hifas, o gotas de grasa con células levaduriformes.

Microfotografía de una biopsia pulmonar con una tinción argéntica que permite reconocer una
infección por Pneumocystis jirovecii (células negras).
Fuente: Altamar
3.2. El cultivo de las muestras

Las muestras, previamente preparadas, se siembran en un medio de cultivo adecuado y se

incuban. El tiempo de incubación es mucho más largo que el que necesitan las bacterias,
sobre las tres semanas.

En los medios de cultivo para el aislamiento de hongos, además de los

nutrientes necesarios, se suelen incorporar agentes antimicrobianos para
inhibir tanto el crecimiento bacteriano como el de otros hongos ambientales.

Medios de cultivo para aislamiento

Para el aislamiento de hongos, la utilización de tres o cuatro medios cubre prácticamente
todas las necesidades.

Los medios más empleados para conseguir aislamientos son los siguientes:

• SDA sin antimicrobianos. El agar glucosado de Sabouraud o agar dextrosa Sabouraud

modificado es el medio estándar para el aislamiento, esporulación y conservación de
muchos hongos.
• SDA con antimicrobianos. Es un agar dextrosa Sabouraud al que se añaden
antimicrobianos, generalmente cloranfenicol o bien cloranfenicol y gentamicina.
• Medio con cicloheximida, que inhibe muchos hongos contaminantes. Este tipo de
medio ayuda especialmente para cultivar muestras cutáneas, ya que se inhiben
muchos hongos saprófitos de la piel.

• BHIA (agar infusión cerebro corazón) Este agar está indicado para el aislamiento de
una gran variedad de patógenos, incluyendo levaduras, mohos y algunas bacterias.

Se usa a menudo adicionado con sangre de carnero al 10%, para el aislamiento de todo tipo
de hongos, incluidos los dimórficos. También se le pueden incorporar antibacterianos. Sin
embargo, en ciertas situaciones es recomendable recurrir a otros medios:

• En infecciones mixtas por levaduras se suele usar algún medio cromogénico.

• En muestras en las que se sospeche –por ser frecuente– la presencia de varias
levaduras, como las muestras respiratorias, se puede usar un medio selectivo para
Cryptococcus.

Medios de cultivo para la identificación

Cuando no se puede establecer una identificación a partir del aislamiento, se recurre a la
siembra en otros medios.

La selección de los medios se realiza a partir de los resultados del aislamiento, que, aunque
no hayan permitido una identificación definitiva, sí habrán proporcionado una aproximación
al tipo de hongo presente (mediante la observación de la colonia, viendo en qué medios ha
crecido y en cuáles no, etc.).
Preparación de los medios de cultivo
Al igual que los medios para bacterias, la mayoría de los medios de cultivo para hongos que se
utilizan son productos comercializados, que se presentan en forma de polvo (deshidratados).
Se deben conservar en condiciones adecuadas y es necesario controlar su fecha de caducidad.

Para prepararlos se deben seguir las instrucciones del fabricante, respetando las
proporciones, los disolventes y las temperaturas que constarán en las etiquetas de los
productos. El procedimiento se desarrolla en las mismas fases que hemos explicado para los
medios para bacterias: disolución, esterilización y reparto en los recipientes.

Algunos antibióticos deben añadirse al medio cuando este haya sido esterilizado y la
temperatura haya bajado suficientemente, de modo que no resulten desactivados por las
altas temperaturas de la esterilización.

Las placas con el medio ya solidificado se deben sellar con cinta adhesiva para que no se
abran accidentalmente. A continuación, para prevenir la desecación, se recomienda
colocarlas en posición invertida dentro de bolsas de plástico. En estas condiciones y
debidamente marcadas para que se pueda saber qué medio contienen y en qué fecha se han
preparado, se guardan refrigeradas a 2-8 °C. Las placas de Petri suelen conservarse en buen
estado unos tres meses.

Los cultivos en placas de Petri son los más habituales, ya que proporcionan una superficie
plana y suficientemente grande en la que se puede apreciar la forma de las colonias, y en la
cual hay zonas con distinta carga de microorganismos. Pero para algunos hongos son
preferibles los medios semisólidos o líquidos, que se colocan en tubos con tapón de rosca.

La incubación
Las placas o tubos sembrados se disponen en estufas de incubación durante el tiempo que
corresponda, según el medio y el tipo de hongo cuya presencia se quiere detectar.

Las placas sembradas se deben sellar con una cinta adhesiva que evite contaminaciones o
aperturas accidentales, pero que permita el intercambio gaseoso con la atmósfera de la
estufa. En el interior de la estufa debe haber un cierto nivel de humedad para evitar la
desecación de los cultivos. Si la estufa no tiene control de humedad, es conveniente poner un
recipiente con agua cerca de las placas para evitar su desecación.

La temperatura óptima de crecimiento de la mayoría de los hongos patógenos, especialmente

los que infectan la piel, es 30 °C; para los hongos dimórficos y algunos otros patógenos es de
37 °C.

Los cultivos no deben desecharse cuando se aísla un hongo, sino que se debe completar el
periodo de incubación (3-4 semanas). Sin embargo, hay muestras que se pueden eliminar a
los siete días de forma habitual, como es el caso de las de orina y de los exudados de
mucosas.
 Estufa con placas y tubos en incubación. Estas estufas suelen tener la puerta de vidrio, para
que se pueda observar el interior sin tener que abrir la puerta (lo que ocasiona fluctuaciones
de temperatura).
Fuente: Altamar

4. LA IDENTIFICACIO N DE LEVADURAS
La identificación de las levaduras se puede llevar a cabo atendiendo a distintos criterios:
morfológicos, bioquímicos, inmunológicos y proteómicos.

4.1. Identificación mediante criterios morfológicos

Para la identificación se debe realizar una observación a nivel tanto macroscópico como
microscópico.

Observación macroscópica
Se observa el aspecto de las colonias de levaduras al crecer en los diferentes medios de
cultivo.
En un cultivo en SDA, medio de aislamiento habitual para levaduras, las colonias suelen ser
planas o ligeramente convexas, de consistencia cremosa y olor dulzón, y pueden tener
textura lisa o rugosa.

Lo más habitual es que sean de color blanquecino.

Algunas características observables pueden orientar en la identificación, como por ejemplo:

 • Si se observa un micelio aéreo definido, se tratará de alguna de las pocas especies de
levaduras que pueden formar micelio verdadero, como Geotrichum o Trichosporon, o
bien será un hongo dimórfico.
• Si las colonias tienen aspecto mucoide posiblemente se deba a la formación de
cápsulas. Es posible que se trate de Cryptococcus neoformans.
• Si las colonias tienen color rojo-anaranjado o naranja, y aspecto cremoso o rugoso, se
tratará de especies de los géneros Rhodotorula o Sporobolomyces, que son levaduras
ricas en carotenoides.

Observación microscópica
Ciertas características microscópicas son muy útiles para la identificación de algunas especies
de levaduras.

Para estimular la formación de estructuras y permitir su visualización se aplican diversas

técnicas.

Las más habituales son la visualización de hifas y esporas, la prueba del tubo germinal o de
filamentación precoz y las tinciones.

Rhodotorula rubra
Fuente: Altamar

4.2. Identificación mediante criterios bioquímicos

La mayoría de las técnicas bioquímicas se basan en la identificación de enzimas características

de algún género o especie.

Pruebas para la identificación de Candida

Candida es un género muy extendido y de gran interés. Recordemos que provoca diversos
tipos de micosis cutáneomucosas bastante frecuentes, y que además es responsable de
muchas de las micosis sistémicas, que pueden comprometer la vida de pacientes
inmunodeprimidos.
Por todo ello, existen distintos sistemas específicos para la identificación de especies del
género Candida. Cabe destacar los medios cromogénicos y los medios fluorogénicos, en los
cuales se siembran colonias sospechosas, previamente aisladas. También existen sistemas
rápidos de identificación, que proporcionan el resultado en pocos minutos.

Aspecto de las colonias de distintas especies de Candida creciendo en el medio cromogénico

CHROMagar Candida
Fuente: Altamar

4.3. Identificación mediante criterios inmunológicos

Las pruebas de identificación mediante criterios inmunológicos se basan en detectar si en una

muestra o en una colonia aislada está presente un determinado antígeno, característico de
una especie patógena. Sirven para confirmar o rechazar la sospecha de la presencia de ese
patógeno.

Las más utilizadas se basan en la aglutinación de partículas de látex y en técnicas ELISA.

Aglutinación de partículas de látex

Existen varios sistemas comercializados, que se basan en la prueba de aglutinación de
partículas de látex.

Esta prueba consiste en mezclar sobre una superficie lisa una alícuota de la colonia
sospechosa o de la muestra biológica con unas gotas de una suspensión de partículas de látex
recubiertas con un anticuerpo específico. El conjunto se somete a rotación; si el antígeno
sospechoso está presente en la muestra, las partículas de látex aglutinan. Para visualizar
mejor la aglutinación, las partículas de látex suelen estar coloreadas.

Técnica ELISA
Para el diagnóstico presuntivo rápido de candidiasis sistémica es útil detectar en el suero de
los pacientes el antígeno manano, un componente de la pared celular de Candida. La
detección se realiza mediante una técnica ELISA con un anticuerpo específico antimanano.

Técnica de aglutinación de partículas de látex para identificación de especies de levaduras.

Fuente: Altamar

5. LA IDENTIFICACIO N DE HONGOS MICELIARES

En la identificación de especies de hongos que forman micelio podemos distinguir tres

grupos:

• Dermatofitos, que producen tiñas. Los agentes causantes son distintas especies de
los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton. Son hongos miceliares
con hifas septadas.

• Zigomicetes (clase Zygomycota), que producen miosis sistémicas conocidas de forma

genérica como zigomicosis. Son hongos miceliares cuyas hifas no tienen septos.
• Hifomicetes (clase Hyphomycetes). Los hongos de este grupo causan micosis
sistémicas. Son hongos miceliares con hifas septadas.
Para saber más

El método principal de identificación es el estudio morfológico, macro y microscópico, que se

detalla a continuación para cada grupo de hongos.

Sin embargo, en ocasiones se recurre a otras determinaciones bioquímicas, nutricionales e

inmunológicas. En este sentido, está tomando auge en los últimos tiempos la identificación
por criterios proteómicos mediante espectrometría de masas (técnica MALDI-TOF).

5.1. Identificación de hongos dermatofitos

La identificación de género y especie de un hongo causante de tiña se puede delimitar a partir

de la localización y características de las lesiones. La identificación rutinaria en el laboratorio
se basa fundamentalmente en criterios morfológicos macroscópicos (colonias) y
microscópicos, relacionados con la fase de reproducción asexual de estos hongos (esporas).

A partir del crecimiento en cultivos de aislamiento, como un medio SDA con

antibióticos y cicloheximida, se pueden identificar las especies más frecuentes.
Aunque en ocasiones, la identificación definitiva requiere pruebas bioquímicas
o nutricionales.

Características macroscópicas
La morfología de las colonias de dermatofitos suelen ser típica de género e incluso de
especie. Para analizar sus características macroscópicas hay que valorar varios parámetros,
como forma, textura, elevación, superficie y color. Los que suelen aportar mayor información
son la superficie y el color:

• Superficie: hay que estudiar la presencia de plegamientos, surcos radiales,

sectorización con-céntrica, aspecto cerebriforme, etc.
• Color: tanto en el anverso como en el reverso de la colonia. Suelen tener colores
claros, en tonos blanquecinos, amarillentos o pardos. En algunos casos se observan
colonias con colores oscuros, como ocurre con las de T. violaceum que son de color
púrpura oscuro, o las de T. rubrum que tienen el reverso de color rojo.

Características microscópicas
Para determinar la presencia de estructuras características a partir del cultivo, se realiza una
preparación entre porta y cubre con un pequeño fragmento de una de las colonias.

Una alternativa muy utilizada es la técnica del papel celo, que se realiza de la siguiente
manera:

1. Preparar un portaobjetos limpio con una gota de colorante en el centro.

2. Cortar un cuadrado de papel celo y presionar con él sobre una zona de la superficie de la
colonia fúngica. De esta manera, todas las posibles estructuras presentes en la colonia
quedan pegadas al papel celo.

3. Colocar el papel celo sobre la gota de colorante depositada en el portaobjetos.

4. Colocar una nueva gota de colorante sobre el papel celo.

5. Cubrir todo el conjunto con un cubreobjetos y analizar la preparación con el microscopio.

Pruebas adicionales
En algunos casos, para establecer una diferenciación entre dos especies morfológicamente
parecidas o para confirmar una identificación, se requiere realizar pruebas adicionales. Las
más habituales son:

• Prueba de la ureasa. Mediante inoculación del medio agar-urea de Christensen. La

principal aplicación es la diferenciación entre T. mentagrophytes (ureasa positiva) y T.
rubrum (ureasa negativa).
• Ensayos nutricionales. Estas técnicas se basan en la diferenciación de especies según
los requerimientos específicos que tienen algunas de ellas por ciertas vitaminas y
otros factores de crecimiento.
• Ensayo de perforación de pelo in vitro. Consiste en hacer crecer el dermatofito en
una placa con fragmentos de pelo esterilizados y, tras incubar tres semanas, observar
al microscopio si el hongo ha producido o no perforaciones en el pelo.

Colonias de diferentes especies de dermatofitos crecidas en SDA

Fuente: Altamar

5.2. Identificación dede zigomicetes

Los zigomicetes se diferencian del resto de los hongos miceliares en que presentan hifas
anchas, ramificadas, generalmente no septadas, y esporas sexuales características
denominadas zigosporas.

Las infecciones ocasionadas por estos hongos se denominan de forma genérica zigomicosis.
Dentro de los zigomicetes debemos destacar los pertenecientes al orden Mucorales. Estos
hongos provocan infecciones de evolución rápida, cuyo pronóstico suele ser fatal, por lo que
al diagnóstico rápido resulta esencial. En la actualidad, la identificación del género o de la
especie solo es posible mediante el cultivo.

Características morfológicas
Los Mucorales crecen rápidamente y es habitual que a los cuatro días hayan ocupado toda la
placa de cultivo. Las colonias suelen presentar un aspecto algodonoso y colores grisáceos.

Estos hongos presentan hifas sin septos, aunque en algunos casos se pueden observar septos
en las hifas fértiles. Generalmente solo desarrollan esporangiosporas a partir de
esporangióforos, en el interior de esporangios.

Otras estructuras con valor diagnóstico son:

• La columela, que es una prolongación estéril del esporangióforo, dentro del

esporangio.
• La apófisis, que es ensanchamiento en la parte apical del esporangióforo, por debajo
del esporangio.
• Los rizoides, con estructura parecida a una raíz.
• Los estolones, que son hifas aéreas no ramificadas, que conectan los rizoides.

La identificación del género se puede realizar a partir de estas características morfológicas

observadas en cultivos primarios de las muestras sobre un medio SDA. De esta forma se
pueden diferenciar los géneros más frecuentes en clínica, que son Absidia, Rhizopus, Mucor y
Saksenaea.

La identificación de la especie, en cambio, requiere el uso de medios de cultivo específicos

que encontramos comercializados, como el agar glucosado de patata (PDA) o el agar extracto
de malta (MEA); se deben sembrar dos placas, que se incuban protegidas de la luz, una a 25
ºC y otra a 35 ºC.
 Microfotografía de una preparación en fresco de un hongo del orden Mucorales en el que
se distinguen varias estructuras características de estos hongos. Fuente: Altamar

5.3. Identificación de hifomicetes

Los hifomicetes, con una gran diversidad y una amplia distribución, constituyen el grupo más
numeroso de hongos microscópicos. En este grupo se incluyen géneros como Aspergillus,
Alternaria, Acremonium, Cladophialophora, Cladosporium, Fonsecaea, Phialophora, etc.

La característica común a todos ellos son las hifas septadas. Las esporas o conidios se
desarrollan a partir de células conidiógenas, que generalmente se forman sobre hifas soporte
denominadas conidióforos aunque en algunos casos se pueden formar directamente sobre
hifas vegetativas.

Aunque se están desarrollando otras técnicas, el cultivo sigue siendo la clave para la
identificación.

El cultivo en medios ricos como el SDA no es recomendable en este caso porque estimula la
producción de micelio en detrimento de la formación de las estructuras esporulantes,
imprescindibles para la identificación.

Para favorecer la esporulación se usan medios como PDA, agar harina de

maíz (CMA), agar harina de avena (OA) o agar patata-zanahoria (PCA). La
incubación se suele realizar con las placas protegidas de la luz y a 25 °C.
 Detalle a gran aumento de las estructuras formadoras
de esporas típicas de los hongos hifomicetes
Fuente: Altamar

Características morfológicas
El examen de las características morfológicas es imprescindible para la identificación de
hifomicetes, tanto a nivel de género como de especie. Las claves dicotómicas y las tablas
comparativas ayudan a sistematizar la observación y a conseguir la identificación precisa. Las
características morfológicas más destacadas son:

Los conidióforos, que pueden crecer:

• Aislados.
• Agrupados. Si son cortos y se agrupan formando estructuras similares a cojines se
denominan esporodoquios; si son largos y se agrupan formando estructuras similares
a árboles se denominan sinemas.

Las células conidiógenas, que pueden ser:

• Fiálides: en forma de botella o de copa, de cuyo interior emergen los conidios.

• Anélides: presentan cicatrices anulares en su extremo, debidas a la formación
sucesiva de conidios. Su longitud aumenta a medida que se forman los conidios.
• Además, las células conidiógenas pueden tener uno o más puntos de formación de
conidios.
• Los conidios pueden formar masas mucosas o disponerse en cadenas. Para observar
esta característica se deben usar pocos aumentos; con una lupa se pueden observan
bien.
Además de estas estructuras comunes, algunas especies pueden desarrollar otras, como
esclerocios (estructura de resistencia consistente en una masa compacta de hifas) o
clamidosporas.

Pruebas adicionales
Como ocurría en las micosis sistémicas por Candida, se han desarrollado técnicas ELISA para
el diagnóstico presuntivo rápido de las aspergilosis.

En este caso se detecta el antígeno galactomanano, un componente de la pared de

Aspergillus, en el suero de los pacientes mediante un anticuerpo específico

antigalactomanano. La técnica se realiza en tiras de pocillos tipo microtiter que se leen
automáticamente en un lector de placas.

Técnica ELISA para galactomanano de Aspergillus: tiras de pocillos donde se realiza la técnica
(a) y lector de placas para la lectura colorimétrica automática de cada pocillo (b).
Fuente: Altamar

6. LOS ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD A ANTIFUNGICOS

Tal como ocurre con los antibióticos, también con los antifúngicos se realizan pruebas de
sensibilidad que permiten establecer el tratamiento más adecuado frente a la cepa aislada.

Estas pruebas se suelen realizar en micosis:

• Invasoras.
• Orofaríngeas que no responden al tratamiento. Producidas
por patógenos emergentes.

Igual que en el caso de las bacterias, los estudios se basan en crear un antifungigrama, que
determina la sensibilidad de la cepa frente a una serie de antifúngicos.

6.1. Métodos estandarizados

Actualmente existen dos estándares aceptados internacionalmente:

• CLSI, del Clinical Laboratory Standards Institute (Estados Unidos). Entre ellos
podemos destacar los métodos de referencia para levaduras M27-A3 y M44-A, y el
método para hongos filamentosos M38-A.
• EUCAST, del European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (Europa).
Incluye dos Antifungal susceptibility testing (AFST): uno para Candida y otro para
Aspergillus.

Estas pruebas se basan en cuantificar la inhibición de crecimiento que se produce en un

medio que contiene antifúngico, comparada con el crecimiento que tiene lugar en el mismo
medio pero sin antifúngico (control).

Para cada uno de los métodos, el organismo responsable proporciona un

documento en el que se detalla el procedimiento que se debe seguir y los
criterios para interpretar los resultados. Es imprescindible que el medio de
cultivo, el pH, las concentraciones, los inóculos, el tiempo y temperatura de
incubación, etc. se ajusten estrictamente a las indicaciones recogidas en el
documento.

CLSI-M27-A3. Levaduras: método de microdilución

Este método se realiza sobre una placa con 96 pocillos. Primero se deben preparar los
antifúngicos y los hongos, siguiendo estrictamente las instrucciones del documento del CLSI:

• Con los antifúngicos se prepara un banco de diluciones, que se colocan en los

pocillos. Para los antifúngicos solubles en agua, el diluyente es RPMI 1640; para los
insolubles en agua, DMSO.
• Con las colonias aisladas se realiza una disolución con suero salino, y se añade la
cantidad establecida a cada uno de los pocillos que contienen las diluciones de
antifúngicos.
Dos de los pocillos se reservan para controles: de crecimiento (sin antifúngico) y de
esterilidad.

Seguidamente se procede a incubar la placa a 35 ºC. Si el hongo es Candida spp. durante 48

horas, y si es Cryptococcus spp., durante 72.

La lectura se realiza mediante espectrofotometría y el documento del CLSI proporciona las

tablas para interpretar el resultado.

CLSI-M44-A3. Levaduras: método de difusión en disco

Se preparan placas de Petri con agar Mueller Hinton (MHA) suplementado con 2% de glucosa
y 0,5 g/ml de azul de metileno.

Se debe preparar el inóculo de levaduras, elaborando una disolución en suero salino de la

misma forma que el método anterior. El inóculo se siembra en las placas y se colocan discos
impregnados con fluconazol sobre cada inóculo.

Las placas se incuban a 35 ºC durante 20-24 h para Candida spp. y 48 h para Cryptococcus
spp. La lectura consiste en detectar la presencia o ausencia de un halo de inhibición alrededor
del disco con antifúngico.

CLSI-M38-A2: Hongos filamentosos: método de microdilución en caldo

Este método se puede usar en especies de los géneros Aspergillus, Fusarium y Rhizopus, así
como en Pseudallescheria boydii y en las formas micelares de Sporothrix schenckii.

El procedimiento es básicamente el mismo que el del método M27-A3, aunque se deben

aplicar medidas especiales para preparar el inóculo, ya que es necesario inducir la formación
de las estructuras características de estos hongos:

• En los géneros Aspergillus y Rhizopus, así como en las especies Pseudallescheria

boydii y Sporothrix schenckii, el inóculo se prepara a partir de un cultivo en PDA
incubado durante 7 días a 35 °C, ya que de esta forma se induce la formación de
conidias o esporangiosporas.
• Para las especies del género Fusarium se parte de un cultivo en PDA de 48 a 72 h a 35
°C, y posteriormente a 25-28 °C hasta completar siete días.

Método MIC de EUCAST

Es un método parecido al de microdiluciones del CLSI, en el que también se usan placas que,
tras la incubación, se leen con un lector de placas de microdilución que detecta la densidad
óptica de los pocillos. Existen métodos MIC para el estudio de Candida spp. Y de Aspergillus
spp.
Muchos kits comerciales permiten realizar a la vez la identificación y el estudio de sensibilidad
a antibióticos.
Fuente: Altamar
6.2. Métodos comerciales

Además de los métodos estandarizados, existen también diversos métodos comerciales, no

estandarizados, para valorar la sensibilidad antifúngica.

Métodos colorimétricos
Se basan en el método microdilución para levaduras del CLSI, e incorporan un indicador
REDOX que cambia de color cuando hay crecimiento fúngico. Algunos de los más utilizados
son Sensititre y Fungitest.

• Sensititre. Consta de placas de microtitulación desechables, que contienen diluciones

seriadas de seis antifúngicos (anfotericina B, fluconazol, itraconazol, ketoconazol,
5fluorocitosina y voriconazol) con un indicador colorimétrico. El inóculo se introduce
en los pocillos y se incuba 24 horas a una temperatura de 35 ºC.

La lectura se puede realizar visualmente, tomando como referencia la escala de color que
incluye el kit, o con un lector de microplacas.

• Fungitest. La microplaca incluye también seis agentes antifúngicos (los mismos que el
Sensititre, pero con miconazol en lugar de voriconazol), pero solo con dos
concentraciones de cada uno. Tras la inoculación y la incubación, los pocillos tienen
color azul (no crecimiento) o rosa (crecimiento); para obtener el resultado se observa
la pareja de pocillos de cada antifúngico:
o Azul-Azul. No hay crecimiento: el antifúngico ha inhibido el crecimiento in
vitro.
o Rosa-Azul. Existe un crecimiento lento.
o Rosa-Rosa. Hay crecimiento: el antifúngico no ha inhibido el crecimiento in
vitro.

Métodos de difusión en agar

Estos métodos utilizan tiras con un gradiente de concentración del antifúngico. El más
utilizado es el Etest, cuyo funcionamiento hemos explicado en relación con los antibiogramas.
 Kit Fungitest
Fuente: Altamar

7. LOS RESULTADOS DEL ESTUDIO MICOLO GICO

Los estudios de identificación de hongos exigen mayoritariamente la realización de cultivos.

Puesto que los cultivos de hongos requieren un tiempo de incubación largo, el tiempo que
transcurre entre la toma de muestras y el diagnóstico puede ser excesivo.

7.1. Recomendaciones para el estudio micológico

En estos estudios se recomienda adoptar las siguientes pautas:

• Las conclusiones de la observación al microscopio se deberían comunicar el mismo

día, ya que se pueden conseguir diagnósticos presuntivos o descartar opciones, y esta
información puede ser de gran importancia para el personal clínico.

Por ejemplo, la observación permite identificar la presencia de dermatofitos, aunque

luego se deba hacer el cultivo para identificar la especie, o la tinción con tinta china
permite identificar la presencia de Criptococcus.

• Los cultivos se descartan como negativos si no hay crecimiento tras cuatro semanas.
A pesar de ello, es poco habitual que se produzcan cambios durante la cuarta
semana, por lo que es frecuente reducir el tiempo máximo de incubación a tres
semanas. Pero esto no significa que se deban esperar esas tres semanas para realizar
la observación y emitir el informe.

La identificación se debe llevar a cabo en el momento en que sea posible y se

produzca crecimiento; la información obtenida se debe comunicar lo antes posible. Si
el estado del paciente o el tipo de hongo lo requieren, se puede transmitir también
información parcial a medida que se obtenga (por ejemplo, la identificación del
género, con la indicación de que se está trabajando para identificar la especie; o la
identificación de la especie, con la indicación de que se está trabajando en el
antifungigrama de la cepa).
Para saber más
Otro aspecto que se debe tener en cuenta es el nivel de precisión que requiere cada
identificación, ya que si bien en algunos casos se debe llegar hasta la identificación de la
especie o incluso de la cepa, en otros basta identificar el género. El nivel de precisión
depende de diversos factores:

• El patógeno y su tratamiento. Por ejemplo, si para todas las especies de un

género es válido el mismo tratamiento, o si el género solo tiene una especie,
a nivel clínico será suficiente con identificar el género.
• El estado clínico del paciente. Para emprender una terapia lo más
especializada posible contra algunas patologías poco graves y de larga
duración, se requiere un diagnóstico preciso; en otros casos, un estado grave
exige una respuesta rápida para emprender una u otra terapia de forma
inmediata.
• El nivel de diagnóstico que corresponde al laboratorio. El tipo de laboratorio y
su nivel de especialización determinan el nivel diagnóstico que se
proporciona. Los procedimiento de trabajo establecidos por el laboratorio
determinan la actuación en los distintos supuestos.

Resumen

La micología es la rama de la biología que tiene por objetivo el estudio de los hongos.

Los hongos patógenos incluyen especies unicelulares y pluricelulares. Por ello, su estudio
morfológico se debe hacer en tres niveles: el celular, el de organización pluricelular (en las
especies pluricelulares) y el que concierne al aspecto de la colonia sobre medios de cultivo in
vitro.

Los hongos pueden causar en el ser humano diversas patologías, del tipo de infecciones,
reacciones de hipersensibilidad e intoxicaciones.

La identificación del hongo responsable de una micosis permite establecer un tratamiento

específico.

La identificación de las levaduras se puede llevar a cabo atendiendo a distintos criterios:

morfológicos, bioquímicos, inmunológicos y proteómicos.

En la identificación de especies de hongos que forman micelio podemos distinguir tres

grupos:

Dermatofitos, Zigomicetes y Hifomicetes.

Tal como ocurre con los antibióticos, también con los antifúngicos se realizan pruebas de
sensibilidad que permiten establecer el tratamiento más adecuado frente a la cepa aislada.

Los estudios de identificación de hongos exigen mayoritariamente la realización de cultivos.