OBTENCIÓN DE ALCOHOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE MEDIANTE

LEVADURAS INMOVILIZADAS

Introducción

La investigación sobre inmovilización de organismos unicelulares ha generado gran interés en

la comunidad científica, debido a sus grandes ventajas técnicas y económicas respecto a la
fermentación tradicional. Entre las principales ventajas que presentan los sistemas
biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de
una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control en
sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. En
general, los materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser
grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para
condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et al., 1992 y 1996; Bardi y Koutinas, 1994;
Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los métodos de inmovilización de células
más usados son la autofloculación (Verstrepen y Klis, 2006; Stewart y Russel, 1986), la
adsorción sobre soportes (Bardi et al., 1996) y la incorporación de levaduras en matrices
sólidas.

La floculación es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y Russel,
1986). La adsorción consiste en la adhesión de las levaduras a la superficie externa de un
soporte como es el caso del gluten (Stewart y Russel, 1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y
Ahvenaimen, 1990). La incorporación de células a matrices sólidas se realiza por el
atrapamiento de las mismas en el seno de un material polimérico. Las matrices más adecuadas
son polímeros naturales como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en
condiciones muy suaves aunque también se pueden usar matrices sintéticas como
poliacrilamida y poliuretano (Groboillot et al., 1994).

El “atrapamiento” de levaduras en matrices sólidas puede realizarse por difusión de las células
en matrices sólidas sintetizadas previamente (Baron y Willaert, 2004) o por formación de las
matrices alrededor de las células (Ramakrishna y Pakasham, 1999). Este método de
inmovilización permite conseguir grandes concentraciones de biomasa (Stewart y Russel, 1986)
con el uso de reactores fluidizados (Verbelen et al., 2006). Además se pueden inmovilizar en
matrices independientes células que no podrían coexistir en contacto directo debido al efecto
“killer” (Pérez e et al., 2001). No obstante, al igual que los otros métodos de inmovilización
presenta desventajas. Las más importantes son los posibles problemas de difusión de nutrientes
y productos a través de la matriz porosa y la pobre resistencia mecánica de los soportes sólidos
(Verbelen et al., 2006).

La inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado con éxito

en la fermentación de vino blanco y en la producción de etanol (Cachon y Divies, 2001). Debido
a cambios en la composición de las células por interacción con el soporte de alginato, estos
catalizadores se vuelven más activos y se observa que la fermentación ocurre a mayor velocidad
respecto a los casos en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey, 1990). Otra
ventaja importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura de la
acción de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas. Además, a diferencia
de los flóculos de biomasa, estos sólidos al ser más sencillos de manejar, permiten un mejor
control de la actividad catalítica en reactores de tipo lote y continuos.

La implementación de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial interés para el

área de los vinos espumosos. La forma tradicional de preparación de estos vinos implica el uso
de levaduras libres y la posterior eliminación de éstas por medio del “dégorgement”, esto es
mediante congelación (-25°C) del cuello de la botella donde las levaduras se acumulan por
sedimentación durante el “remuage”. Este proceso lento y costoso puede ser sustituido mediante
el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cinética del proceso se vea
afectada consiguiéndose las mismas propiedades organolépticas que los vinos producidos de
manera tradicional (Yokotsuka et al., 1997). En el año 2001 el “Institute Oenologique des Vins
de Champange (IOC)” reportó la fabricación de tres millones de botellas mediante el uso de
este tipo de tecnología (Divies y Chacon, 2005). También se han reportado estudios en los que
se usan estos dispositivos para la producción de sidra espumosa y vinos de piña (Divies y
Deschamps, 1986).

Cabe destacar que combinando esta tecnología con el uso de reactores de alta presión y
reactores de flujo continuo ha sido posible la producción a gran escala de vinos espumosos con
composiciones y propiedades sensoriales similares a los fabricados tradicionalmente en botellas
con levaduras libres (Iconomopoulou et al., 2002) En el campo de los vinos espumosos también
se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapón de la botella que permiten el
contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentación final (Lemonnier, 1992). Esta
técnica alarga los tiempos de fermentación, pero ofrece la posibilidad de realizar el
“dégorgement” de manera más sencilla sin necesidad de enfriar la botella.
Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes naturales
o sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Ésta técnica permite alcanzar altas
concentraciones celulares en volúmenes reducidos, así como la reutilización como
biocatalizador y la implantación de sistemas de continuos de producción (2).

En este caso, el uso de células inmovilizadas dentro de procesos continuos para la producción
de bebidas fermentadas representa una línea de investigación de elevado interés debido a las
ventajas económicas y técnicas que presenta en comparación a los sistemas discontinuos en
células libres. En ese sentido, los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes
gelificantes, proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentación y
maduración encontrados en las industrias cerveceras tradicionales (3) ; dichos geles que
contienen levaduras inmovilizadas en su estructura, se utilizan para controlar el pardeamiento
de bebidas que se produce con el paso del tiempo. Los geles comprenden una matriz de
polisacáridos natural como base del gel, y células de levaduras inmovilizadas en la estructura
de dicha matriz. Los geles así constituidos permiten tanto corregir el color de una bebida que
ya ha pardeado, como para prevenir el desarrollo de color en una bebida susceptibles de pardear
con el paso del tiempo.

Material y Métodos

 Reactivación de Saccharomyces cerevisiae

Se preparó un medio caldo YPG (pectona + dextrosa):

Para 100mL

- 1g pectona

- 5 g dextrosa

- 2 mL de inóculo de levaduras (Saccharomyces cerevisiae)

Se autoclavó un matraz con 100mL de agua destilada, pectona y dextrosa; se dejó enfriar y se
le añadió el inóculo de levaduras, se midió el pH (6) a nuestro medio, luego se esperó 12 horas
para que nuestras levaduras se reproduzcan; dentro de esas horas, se tomó una muestra de
nuestro medio cada 2 horas para medir el crecimiento (Cámara de New bauer) de nuestras
levaduras, empezando a contar des la hora cero de inoculada las levaduras; luego se realizó una
curva de crecimiento.

Figura 01: análisis del crecimiento de las levaduras a través de la cámara de New bauer.

 Inmovilización de levaduras
Para la inmovilización de nuestras levaduras se utilizó agar agar (150 mL al 3%) se autoclava
y dejamos enfriar a 42oC evitando la gelidificación. Después de las 12 horas de haber reactivado
las levaduras en el caldo YPG, se colocó directamente 10 mL del inóculo (concentración
celular final: 7,28 x 106 cel/mL) al agar agar; se tomó una jeringa de 20 mL, y se dejó caer gota
a gota sobre un vaso de precipitado que contenía aceite refrigerado (8oC) para formar nuestro
pellets. Posteriormente con la ayuda de un colador se hizo el lavado para retirar todo el aceite que
pudiera estar impregnado en las paredes de los pellets, con agua destilada y luego con agua destilada
estéril para evitar contaminación.
 Figura 02: Inmovilización de levaduras utilizando agar agar.

 Producción de alcohol utilizando las levaduras inmovilizadas

Se preparó un sustrato con 350mL de agua destilada estéril y una concentración de sacarosa del
10% (35g) del total del sustrato (9.5o Brix) y un pH de 6.

Se agregaron las levaduras inmovilizadas y se dejó fermentar por espacio de 8 días, tomando
una muestra del fermento cada 12horas para medir la concentración de azúcares reductores
(utilizando un refractómetro), el pH (utilizando tiras de pH), y concentración de etanol que
produce (utilizando la tabla de conversiones de oBrix a concentración de alcohol).
Figura 03: Análisis inicial de pH y concentración de azúcares reductores en nuestro reactor de
levaduras inmovilizadas
Resultados
Tabla 1: Crecimiento de levaduras en medio YPG; luego utilizar a cámara de New bauer,
los datos se plasmaron en una curva de crecimiento.

Crecimiento de levaduras en medio

YPG
media x 10000 cells/ml

800

700

600

500

400

300

200

100

0
0h 2h 4h 6h 8h 10h

Tabla 2: Evaluación de la producción de alcohol, se analizó cada 12 horas empezando

desde la hora 0.

Evaluación de la producción de alcohol

12

10

0
0h 12h 24h 36h
-2

pH oBrix oAlcohol
Anexos
Tabla 3: Tabla de conversión de gravedad específica a Boume, Brix y Alcohol
BIBLIOGRAFÍA

1. Cachon, R. y Divies, C. 2001. Immobilised cell technology in winery and fruit wine
production. Engineering and Manufacturing for Biotechnology. 413-421.
2. Galazzo, J. L. and Bailey, y J.E. 1990. Growing Saccharomyces cerevisiae in calcium-
alginate beads induces cell alteration which accelerate glucose conversion to ethanol.
Biotechnology and Bioengineering. 36: 417-426.
3. Pérez, F., Ramírez, M., y Regodón, J. A. 2001. Influence of killer strains of Saccharomyces
cerevisiae on wine fermentation. Antonie Van Leeuwenhoek. 79: 393-399.
4. Bakoyianis, V, Kanellaki, M., Kaliafas, A. y Koutinas, 1992. A. A. Low temperature wine
making by immobilized cells on mineral Kissiris. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 40(7): 1293–1296.
5. DURAN-PARAMO. (1997). PhD. thesis, Universite de Thecnologie de Compiegne,
France.
6. DEOBURG, A. (1993). The developments of brewery fermentations. The impact of new
technologies. Cerevisia and Biotechnology, v.18, p 25-30.
7. Stewart, G. G., y Russell, I. 1986. One hundred years of yeast research and development
in the brewing industry. Journal of the Institute of Brewing. 92: 537–558.
8. Verbelen, P. J., De Schutter, D. P., Delvaux, F., Verstrepen, K. J., y Delvaux, F. R. 2006.
Immobilized yeast cell Systems for continuous fermentation applications. Biotechnology
Letters. 28: 1515-1525.