VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN

EL GENOTIPO
Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo
largo de la evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en los
genotipos, que esencialmente pueden ser de dos tipos:

mutaciones. pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y

tiende a la conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las
mutaciones son cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son
transmitidos a las generaciones siguientes.
recombinaciones subsiguientes a intercambio genético.En la mayoría de
los eucariotas, pueden ocurrir recombinaciones entre genotipos
individuales de una misma población. En los fenómenos de sexualidad se
origina una variedad casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin
necesidad del aporte de nuevas mutaciones. Ello suministra una materia
prima sobre la que puede actuar la selección, de modo que las poblaciones
pueden ir evolucionando con el paso del tiempo, en función de presiones
ambientales.

¿Qué ocurre en bacterias?

Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se

reproducen rápidamente y pueden dar origen en poco tiempo a grandes
poblaciones. Por supuesto, experimentan fenómenos de mutación, por lo
que las poblaciones pueden acumular gran número de mutaciones.

Definiciones iniciales:
Desde un punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y
espontánea de una variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite
hereditariamente a la progenie.

Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos

plasmar una definición más ajustada, desde el punto de vista genotípico:

Mutación es cualquier alteración de la secuencia de bases de un segmento

de ADN correspondiente a un gen o a un locus (sea éste transcribible o
no), aun cuando esta alteración no se refleje en forma de cambio
fenotípico observable o detectable.
 Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un
gen.

alelo silvestre: "forma" (secuencia) de un gen en las bacterias

aisladas de su hábitat natural (estirpes silvestres). En la naturaleza
es muy frecuente la existencia de polimorfismo:existen diversos
alelos silvestres diferentes para un mismo locus.

alelos mutantes: las distintas "formas" (secuencias) que resultan de

mutaciones del alelo silvestre.

Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la

célula, o de sus interacciones con su medio natural. La mayoría aparecen
por errores en los procesos de replicación, reparación o recombinación del
ADN. (O sea, para abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas de
forma experimental).

Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración

experimental del ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por
agentes físicos o químicos denominados mutágenos.

2. MUTACIONES ESPONTÁNEAS.

Los principales tipos son:

1. Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:

a. transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py  Pu:Py;
b. transversiones: cambio de una pareja Pu:Py  Py:Pu.
2. Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de lectura
["frameshift"]. Se deben a:
a. eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;
b. incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.
3. Grandes delecciones (o borraduras).
4. Inversiones
5. Traslocaciones.
6. Duplicaciones en tándem
7. Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos
transponibles.

Los estudiaremos a continuación, insistiendo sobre todo en su base molecular.

2.1 MUTACIONES PUNTUALES

 Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a
otra purina:pirimidina:

A:T   G:C

Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a

una pirimida:purina (o viceversa):

A:T   T.A

G:C   C:G

BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES

PUNTUALES
BASE MOLECULAR DE LAS TRANSICIONES
Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación,
de formas raras tautoméricas de las bases nitrogenadas. Los
desplazamientos tautoméricos del protón cambian las propiedades de
formación de puentes de H, de tal modo que:

forma tautomérica Se comporta como

A* (imino) G
G* (enol) A
C* (imino) T
T* (enol) C

Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas

serían:

A* : C

C* : A

T* : G

G* : T
 1. Base molecular de las transversiones

(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las

formas sin y anti)

El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases

dependerá de:

constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10-4

- 10-5);
frecuencia de dNTPs en forma sin. (G sin aparece con frec. de 10-1, A , con
5·10-2).

De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de

mutaciones puntuales:

frec. prevista de transiciones: 10-4 - 10-5

frec. prevista de transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7
(para la A)

Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más bajas
(del orden de 10-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los
emparejamientos erróneos: como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una
capacidad correctora de pruebas ("editing"): cada paso de elongación es seguido
inmediatamente por una comprobación del emparejamiento. Si este
emparejamiento es erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3' 5'
para elimininar la base mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en
el mismo lugar (por su actividad polimerasa 5' 3').

Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma

imino, que se empareja con la adenina:

1. C  Cimino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)

2. Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…
3. C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)
4. La actividad exonucleasa 3' 5' elimina la A recién incorporada
5. Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5' 3', que incorpora G
6. El resultado final es el emparejamiento correcto C  G

De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente

equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.

Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia una
frecuencia baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado
biológico es que de esta forma se combina una alta tasa de fidelidad en la
replicación, pero con suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para
generar innovaciones sobre las que pueda actuar la presión selectiva, lo cual
permite evolución.

Puntos calientes de mutación ("hot-spots"): son puntos o zonas dentro del

genomio donde se concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la
esperada si se distribuyeran al azar.

Ejemplo: véase el histograma de frecuencias que muestra el número

de mutaciones puntuales en las distintas pares de bases del gen
lacI. Observar que hay una zona especialmente "caliente" cerca de
la coordenada 200, donde la probabilidad de encontrar mutaciones
es muy superior a la del resto de la secuencia.

Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de

secuencia, son modificadas químicamente por acción de alguna
enzima (normalmente una metilasa), y ello provoca una mayor
susceptibilidad a la aparición de mutaciones puntuales:

La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:

CCAGG

GGTCC

es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos
citosinas dentro de esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina
experimenta espontáneamente una desaminación oxidativa, que la convierte en
timina, de manera que se produce finalmente una transición:

C:G  5-metil-C:G  T:G (emparejamiento anómalo) T:A

CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN

PUNTUAL
Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:

Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN

polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no
se produce la expresión de los genes del operón.

En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará

que el promotor del operón lac tiene una secuencia -10 atípica, que
obliga a que la expresión a alto nivel requiera el concurso de la
proteína CAP activa. Pues bien, por medio de mutaciones puntuales
se puede lograr que esa secuencia atípica adquiera las
 características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o
similar). En este caso, el efecto de estas mutaciones es que el
operón lac se vuelve independiente de la proteína CAP para su
expresión eficiente: el operón se hará independiente de la
represión catabólica.

En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el

operador provocan una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor).
El efecto es el de crear una expresión constitutiva (es decir, el operón se
expresa incluso en presencia del represor activo, debido a que éste no reconoce
al operador mutante).

Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un

codón. Las consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:

1. Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a

la sinonimia o "degeneración" del código genético, que afecta sobre todo a
la tercera base del codón) se origina una mutación neutra, que es
"silenciosa" (no hay ningún cambio en el fenotipo).
2. Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias
posibilidades:
a. mutaciones de sentido erróneo o alterado ("missense"):
i. si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo,
puede cumplir una función semejante en la proteína
mutante, por lo que el fenotipo sería también una mutación
silenciosa por sustitución de aa.
ii. En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad
estructural, que puede reflejarse en que la proteína sea
termosensible o criosensible, o más susceptible a efectores
alostéricos. La proteína termosensible es funcional a
temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente altas, a las cuales la correspondiente proteína
silvestre es activa.La proteína criosensible es funcional a
temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas
relativamente bajas, a las cuales la proteína silvestre es
activa. La proteína más susceptibles a efectores alostéricos
es aquella que se inhibe por efectores de forma más acusada.
En esta categoría entran también las proteínas con actividad
residual.
iii. Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su
actividad biológica debido a que la sustitución del aa.
provoca la alteración de la estructura secundaria y terciaria
de la proteína: por ejemplo, la aparición por mutación de
una prolina en mitad de una  -hélice destruye esta
estructura, y puede originar inactivación de la función.
 iv. La alteración del centro activo suele provocar inactivación
total o parcial. NOTA: Aquí se plantea la siguiente pregunta:
si la mutación inactiva totalmente la capacidad funcional de
la proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa proteína
alterada está presente en la célula? La proteína se puede
identificar por medio de anticuerpos (Ac) obtenidos frente a
la proteína silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un
extracto de las células mutantes, se producirá una reacción
antígeno-anticuerpo. Las proteínas inactivas caracterizadas
de esta manera se suelen denominar como "CRM" iniciales de
"cross-reactive material" (material que da reacción cruzada
respecto de la proteína silvestre).
b. mutaciones "sin sentido" ("nonsense"), o sea, aquellas que
cambian un codón original a una de las tres tripletas que significan
"señal de parada" de la traducción:U A G (codón "ámbar"), U A A
(codón "ocre"), U G A (codón "ópalo"). Obviamente, el efecto de
estas mutaciones sin sentido es producir la detención de la lectura
del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se produce una
proteína truncada, que suele ser inactiva.

Como ya vimos en el capítulo anterior, si la mutación sin sentido se produce en

un gen de un operón policistrónico, y si esa mutación cae cerca de una zona del
ARNm capaz de formar estructuras secundarias en horquilla, aparte del efecto de
mutación sobre el gen afectado, se detectará un fenómeno de polaridad, debido
a que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no transcripción de la
región situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habrá
transcripción de los genes distales del operón.

2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA

FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA
["FRAMESHIFTS"]
Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que
no sea 3 o múltiplo de 3)

Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En
este tipo de secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden
producir malos alineamientos por desplazamiento de una o varias copias de la
secuencia repetitiva.
Ejemplo:

GTCCGTCCGTCCGTCC

CAGGCAGGCAGGCACC

Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del

sitio de la mutación se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada
(debido a que al cambiar la pauta de lectura, pueden aparecer tripletas sin
sentido).

Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no

afecta a una zona importante de la proteína, se puede producir un producto que
aún tenga actividad biológica.

2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS):

Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.

Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior

escisión de dichos bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a
delecionar existen secuencias de ADN que son repeticiones directas una de otra,
lo que facilita algún fenómeno de recombinación que lleva a la eliminación del
material (bucle) intercalado entre esas secuencias.

Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios

genes.

2.4 INVERSIONES:

Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben

a emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente
repetidas en los extremos del material que sufre la inversión.

Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que

simplemente se ha invertido el orden de los genes del segmento invertido
en relación al resto del genoma. A diferencia de las deleciones, las
inversiones suelen revertir, precisamente por un nuevo proceso de
recombinación entre las secuencias inversamente repetidas.

2.5 TRANSLOCACIONES:

Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.

2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM

 Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación
de la localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y
recombinación entre secuencias similares en dos moléculas de ADN (en
realidad, en este evento, de las dos moléculas de ADN, una se queda con
una duplicación mientras que la otra se queda con una delección).

Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir

a inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede
haber una mezcla de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres
de dichos genes en el mutante).

Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem

es su inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva
recombinación dentro del segmento duplicado.

A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel

importante en la evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado,
hay dos copias de uno o varios genes, de modo que una de las copias de
cada pareja puede lentamente ir evolucionando e incluso adquirir una
nueva función.

2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS

TRANSPONIBLES

La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en

de un gen origina la inactivación insercional, debida a:

desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos,

generan frecuentes señales de fin de traducción;
terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos
polares (debido a que las IS llevan frecuentes señales de
terminación compleja de la transcripción, dependiente de  ).

Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden

producirse ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte del
elemento transponible, y a veces también delecciones del material
genético adyacente (fenómenos de escisión imprecisa del IS o Tn).

Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta
distancia una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por
dichas IS se pueden producir:

inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;

 translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de
inserción.

3. CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES

Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué
tipo de mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de
cada mutante.

Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una

2ª mutación (ver más adelante, en este mismo capítulo).
Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de
lectura.
Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del
material insertado.
Las delecciones no pueden revertir.
Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos
transponibles no aumentan su frecuencia por tratamiento con
agentes mutagénicos, mientras que el resto sí lo hacen.

4. DEMOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS MUTACIONES

BACTERIANAS

Uno de los rasgos característicos de las mutaciones es su espontaneidad: surgen

al azar, independientemente de las condiciones ambientales. El efecto del medio
ambiente es seleccionar o no las mutaciones (es decir, favorecer o no el
crecimiento diferencial del fenotipo mutante). De todas formas, más adelante
veremos que el medio ambiente puede alterar la tasa global de aparación de
mutaciones.

Durante mucho tiempo se estuvo discutiendo la posibilidad de que las bacterias

tuvieran algún tipo de herencia lamarckiana de caracteres adquiridos (de hecho,
hasta mediados del siglo XX muchos científicos pensaban que las bacterias
seguían un tipo de herencia distinta a la de los organismos superiores, en la que
las adaptaciones a cambios del medio se podían transmitir a la descendencia, al
modo lamarckiano). Esta visión "antropomórfica" de un proceso de evolución
"guiada" llevó a proponer que, por ejemplo, al poner un antibiótico (Ab) en un
medio de cultivo, era el antibiótico el que "inducía" la aparición de mutaciones.
Aparentemente, la observación apoyaba esta postura: si se colocaba un cultivo
bacteriano sensible al antibiótico en presencia de ese antibiótico, al cabo de
cierto tiempo, todas las células del cultivo son resistentes al antibiótico.

Todos estaban de acuerdo en que la mayoría de la población bacteriana inicial

moría al exponerse al agente selectivo (el antibiótico en este ejemplo, o un fago
en otros experimentos), y que el cultivo resistente final procedía del crecimiento
de una pequeña proporción de células resistentes al agente. La disputa estribaba
precisamente en cómo interpretar estos datos de observación. Veamos las
posturas contrapuestas:

Hipótesis lamarckiana: cada célula del cultivo inicial tiene una

probabilidad pequeña, pero finita, de sobrevivir al agente selectivo. Una
vez que algunas células logran sobrevivir transmiten este rasgo a su
descendencia.
Hipótesis darwiniana (denominada "de las mutaciones preexistentes"):
ciertas bacterias del cultivo inicial son ya resistentes al agente antes de
ser expuestas a él. El agente sólo actúa seleccionando las células
resistentes y eliminando a las demás (sensibles).

La polémica fue ganada por los darwinianos ((por supuesto!), debido a unos
elegantísimos y sencillos diseños experimentales:

El primer "golpe de gracia" lo dio la prueba de las fluctuaciones de Salvador

Luria y Max Delbrück (1943): Si las mutaciones a la resistencia surgieran
espontáneamente antes de exponer las bacterias al agente, entonces diversos
cultivos en paralelo en medio líquido deberían de tener su primera mutación a
tiempos distintos. Cuando recogiéramos los cultivos al final del tiempo del
experimento y contáramos las bacterias resistentes, cada cultivo en paralelo
debería dar números variables de resistentes. Veamos el experimento:

cultivo inicial de una bacteria sensible a la estreptomicina (Str S).

Inoculamos muchos tubos en paralelo, con el mismo n1 de bacterias en
cada uno; los tubos se incuban hasta la fase estacionaria,y se estudian al
mismo tiempo final.

de (n-1) tubos sembrar alícuotas de 109
bacterias en placas+estreptomicina
Recuento de colonias StrR
Resultado:
Amplias fluctuaciones de colonias derivadas
de los distintos tubos:
30, 10, 40, 45, 183, 12, 173, 23, 173, 23, 57,
63
Media (x) = 62
del tubo restante, sembrar muchas alícuotas de 109
bact. en placas+estreptomicina
recuento de colonias StrR
resultado:
números similares de colonias en las placas
derivadas del mismo tubo:
46, 56, 52, 48, 65, 44, 49, 51, 56, 48
media (x) = 51,4
Varianza (v) = 3498 varianza (v) = 6,33

Razonamiento y conclusiones del experimento:

1. en ningún momento los cultivos líquidos estuvieron expuestos al

antibiótico;
2. todos los cultivos crecieron en idénticas condiciones (tiempo,
temperatura, etc.);
3. conclusión: las oscilaciones (fluctuaciones) entre diversos tubos se
explican porque en cada uno de ellos debieron surgir mutaciónes
espontáneamente a tiempos distintos, de modo que los tubos en los que el
primer mutante apareció tempranamente generaron mayor número de
colonias resistentes (cada colonia se establece por una célula
descendiente de algún mutante inicial).

Poco más tarde, esta conclusión se afianzó con otro experimento "clásico":
Prueba de la réplica en placa (Lederberg, 1952).

1. Supongamos una cepa silvestre de E. coli, que es sensible a la

estreptomicina (StrS).Sembramos masivamente (p. ej. 108 células) en una
placa matriz de un medio sin estreptomicina. Se incuba la placa en estufa
a la temperatura adecuada (37oC). Obtendremos un crecimiento que
origina un césped continuo de bacterias (por crecimiento confluyente).
2. Se hace una réplica con un tampón estéril de terciopelo desde la placa
matriz a una placa de medio con estreptomicina. Incubamos en estufa. Se
observa que en esta placa ha habido un crecimiento de una o unas pocas
colonias StrR (cada colonia procede de una célula individual).
3. Ahora volvemos a la placa matriz (sin Str) y delimitamos la zona
aproximada "gemela" de aquella que en la placa con Str ha dado la colonia
StrR. Cortamos un cuadradito de agar que incluya esa zona, y recuperamos
las células (resuspendiendo en solución salina estéril).
4. A partir de esa suspensión inoculamos 104 células en una nueva placa
matriz sin Str, y dejamos que crezcan. Veremos una multitud de pequeñas
colonias casi confluyentes.
5. Repetimos la réplica desde esta 2ª placa matriz a una nueva placa con Str.
Tras incubar veremos un número de colonias StrR mayor que en la 1ª
réplica.
6. Volvemos a la 2ª placa matriz y repetimos la operación: escogemos un
cuadradito que corresponda a una de las colonias de la placa de réplica, lo
cortamos, resuspendemos las células y sembramos una 3ª placa matriz (sin
Str), pero ahora el nº de bacterias que inoculamos es de unas 100.
Incubamos esta placa matriz, y observaremos unas 100 colonias
perfectamente separadas unas de otras.
7. Realizamos una 3ª réplica con el tampón de terciopelo a una 3ª placa con
Str. Tras incubar obtenemos un número de colonias más elevado que en la
 2ª réplica, y además, este número se aproxima al de las colonias de la
placa matriz correspondiente.
8. Reiterando este proceso se logra finalmente que todas las colonias de la
placa matriz se correspondan con las colonias de la placa de réplica
correspondiente: es decir, al final, todas las células son Str R.

Conclusión: Observen que en el experimento hemos realizado una selección

indirecta de las bacterias StrR: siempre vamos tomando células de la placa
matriz (que no tiene presión selectiva del antibiótico) y las pasamos a una placa
selectiva, donde sólo crecen los StrR. La conclusión es clara: las pocas colonias
mutantes StrR detectadas en la 1ª placa de réplica procedieron de un mismo n1
de células StrR que ya estaban presentes en la 1ª placa matriz, antes del
contacto con el antibiótico. La reiteración del proceso de selección indirecta va
"estrechando el cerco" a las células resistentes, de manera que al final logramos
una placa matriz donde todas las células son resistentes, descendientes de la
primera colonia StrR que detectamos en la primera fase de réplica.

Pero después de todo ¿existen mutaciones adaptativas en

bacterias?
A finales de los años 80 ciertos experimentos sugirieron la existencia de ciertas
mutaciones que parecían ser adaptativas, surgiendo "después" de ser sometidas a
determinadas condiciones de cultivo. Para tratar este polémico asunto, véase el
documento sobre mutaciones adaptativas, que incluye un modelo reciente.

5. TASA DE MUTACIÓN

En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un

determinado fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese
fenotipo en un determinado intervalo de tiempo. Luria y Delbrück (1943)
escogieron como intervalo de tiempo unitario el correspondiente a un ciclo
celular (o sea, a una generación), que es el tiempo necesario para completar una
ronda de división celular. Por lo tanto:

T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº

de divisiones ocurridas en ese tiempo t.

Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N0)

NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a distintas
tasas de crecimiento
En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el momento de
determinar el número de células (N), las bacterias se encuentran en distintas etapas del siguiente
ciclo celular, de modo que el promedio real de divisiones es mayor que N en un factor
equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:

T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)

A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación no es tan

fácil como ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el parámetro m mide el número de
eventos de mutación en un lapso de tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes
medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil que suele ser cuantificar el número de mutantes, en
el experimento, en ese cantidad medida se incluyen los descendientes de eventos más o menos
antiguos de mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m hay que recurrir a ciertos
métodos estadísticos.

Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la distribución
de Poisson. Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la misma cantidad inicial de
bacterias sensibles a la estreptomicina e incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones,
de modo que la N-N0 sea 5.6X108; imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los
20 tubos no han surgido mutantes resistentes al antibiótico. De acuerdo con la aproximación de
Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un cultivo sería:

P0 = m0·e-m/0!

Aplicando esto a nuestro ejemplo:

P0 = 11/20 = 1·e-m/1

Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora podemos
calcular la tasa de mutación:

T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9

NOTA2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de un fenotipo. Esto significa
que aquellos fenotipos que dependan de varios genes tendrán tasas de mutación superiores a las
de aquellos que dependan de un solo gen. Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para
la histidina o el triptófano (cuya biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10 -7,
mientras que la tasa de mutación a resistencia a estreptomicina (que, como se recordará,
depende de la alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es de sólo 10 10 o 1011.

6. REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS

Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas

son transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el
cambio, éste es permanente, pero no necesariamente irreversible
(como ya dijimos, solamente las grandes delecciones son irreversibles).
 La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda
mutación que restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de
dos tipos principales, y varios subtipos:

Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto

equivale a una retromutación ("back-mutation").
Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura
el genotipo original. Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula
queda con dos mutaciones. La supresión se clasifica a su vez en:
a. Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen,
pero la 2ª mutación anula las consecuencias fenotípicas.
Ejemplos:
i. Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado
por la 1ª mutación.
ii. El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al
producto de la primera.
iii. Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que
el producto alterado de la primera mutación vuelva a ser
funcional.
b. Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer
gen mutado. Puede ser de dos tipos principales:
i. Supresión intragénica: la 2ª mutación ocurre en el mismo
gen donde ocurrió la primera.
ii. Supresión intergénica (= extragénica): la mutación supresora
afecta a otro gen, que suele ser uno de los genes
implicados en la maquinaria de traducción del ARNm: ARNt
y proteínas ribosómicas.

6.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS

INTRAGÉNICAS

Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera mutación 

restauración de la pauta de lectura alterada por una previa mutación de
desfase de lectura ("frameshift"). La única zona alterada tras la mutación
supresora sería la que queda entre ella y la 10 mutación. Si esta zona es
corta y no es esencial para la actividad biológica, se puede restablecer el
fenotipo primitivo.
Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación,
de modo que se codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del
aa. del primer mutante, pero que restaura la funcionalidad de la proteína.
A este tipo de supresión se la denomina también pseudorreversión.
Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la
primera mutación: la 2ª mutación compensa a la 1ª, de modo que se
restaura la estructura tridimensional y/o el centro activo de la proteína.
6.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS
INTERGÉNICAS

Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)

a. supresores de mutaciones que introducen codones de parada de

lectura (o sea, de codones "sin sentido, nonsense"): son ARNt
mutados en el anticodón, de modo que este anticodón mutado
puede emparejarse con alguno de los tres tipos de codones "sin
sentido", insertando ahora los aa. correspondientes que
transportan; por lo tanto, impiden la terminación prematura de la
traducción. Ejemplos: El codón sin sentido UAG ("ámbar") puede ser
suprimido por versiones mutantes (supresoras) de los siguientes
ARNt:

Tipo de ARNt Normalmente reconoce

supresor a
ARNtSer UCG
ARNtG ln CAG
ARNtTyr UC
ARNtLys AAG

(La letra sombreada indica la base que cambia en la mutación

supresora).
a. El codón sin sentido U A A ("ocre") puede ser suprimido por una
versión mutante de ARNtGlyGAA
b. Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido
erróneo ("missense"): Ejemplo: El ARNtGly cuyo anticodón es UCU,
por mutación se convierte en un ARNt supresor cuyo anticodón es
UCC, que entonces reconoce al codón AGA (de la Arg). Por lo tanto,
este supresor inserta Gly frente a cada codón AGA.
c. supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt
mutantes que tienen un anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de
los 3 habituales.Ejemplo: Existe un ARNtPhe que tiene un anticodón
que reconoce la secuencia UUUC.
Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la
alteración por mutación de determinadas proteínas adquieren zonas de
conformación cambiada, de modo que reconocen tripletas de forma
errónea. Al introducir aminoácidos cambiados en codones que a su vez
 proceden de mutaciones, pueden restaurar la funcionalidad de algunas
proteínas mutantes.Ejemplos:
a. mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad
30S del ribosoma, de modo que éste puede suprimir una gran
variedad de mutaciones sin sentido y por desfases. (El nombre de
ram corresponde a las iniciales de ribosomas ambiguos).
b. Mutaciones StrR: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma.
Hacen que las mutaciones sin sentido sean menos defectuosas
("leaky" = débiles).

6.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNT

MUTANTES

Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se

refleja en la proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son
terminadas de forma normal (en lugar de quedarse truncadas). Esta
eficacia depende, esencialmente de:

la concentración del ARNt supresor en la célula;

afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;
afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los
factores de terminación de traducción que reconocen el mismo
codón "sin sentido" (de parada de lectura).

La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de

crecimiento de la bacteria, debido a que, aparte de sucapacidad
supresora, introduce errores de lectura en los ARNm normales.

Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no
hacer que la célula muera por introducción de demasiados errores en la
lectura de los ARNm normales (es decir, la mayor parte de las veces, los
supresores introducen el aminoácido correcto). Pero por otro lado, han de
ser suficientemente eficicientes como para poder introducir aminoácidos
en codones mutantes con la frecuencia adecuada para suprimir la
mutación primaria. Normalmente, los supresores típicos suprimen 5-10%
de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el aa. correcto
frente al codón correcto.
7. AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE
MUTACIONES
Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones
concretas (p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes
resistentes). Ahora bien, lo que sí pueden hacer determinadas condiciones
ambientales es elevar la tasa global de aparición de mutaciones.

Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN

o interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una
mayor frecuencia de aparición de mutaciones (y en este sentido
hablamos de "mutaciones inducidas"). A dichos agentes se les llama
mutágenos o agentes mutagénicos. Así pues, en última instancia, los
mutágenos causan alguna alteración en el ADN que

bien no puede ser reparada convenientemente,

o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los
mecanismos celulares normales de reparación (consultar el tema de
"Mecanismos de Reparación de los daños al ADN").

AGENTES FÍSICOS

RADIACIÓN UV

Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener

mutaciones en las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su
efecto principal es originar dímeros de pirimidina intracatenarios (con
creación de una anillo ciclobutano entre dos Py consecutivas). Las
proporciones de lesiones son las siguientes:

50% T-T
40% T-C
10% C-C

Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del

mecanismo posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el
sistema SOS). Con menor frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la
C, lo que da origen a transiciones.

RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES

Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil
manejo, por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan
daños reparables por el sistema SOS.

Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos  ) provocan labilizaciones en el

ADN, que terminan en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace
fosfodiéster), que finalmente pueden conducir a delecciones.

AGENTES QUÍMICOS

Se pueden agrupar en varias categorías:

1. Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del

ADN.
2. Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.
3. Agentes alquilantes.
4. Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del
ADN, entre pares de bases consecutivas.
5. Bloqueadores del emparejamiento de las bases.

ANÁLOGOS DE BASES
Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de
los ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como
ejemplos tenemos:

5-bromouracilo (5-BrU)
2-aminopurina (2AP).

Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los

correspondientes "dNTP", de modo que su estructura les permite ser
incorporados durante la replicación del ADN.

1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A  G:C debido a

que experimenta frecuentes cambios tautoméricos desde su forma ceto a
su forma enol:

BUceto:A BUenol:G

Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-

polimerasa introducen un BUceto frente a la adenina, los acontecimientos
hasta llegar a la mutación se pueden resumir así:
A:T  (la primera replicación incorpora BU)  A:BUceto 
(tautomerización y 2ª replicación)  G:BUenol  (3ª replicación)  G:C

2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:T C:G debido a

sus frecuentes tautomerizaciones (APamino  APimino). Veamos el proceso:

A:T  (primera replicación)  APamino:T  (tautemerización y 2ª

replicación)  APimino:C  (3ª replicación)  G:C

AGENTES DESAMINANTES O
HIDROXILANTES
Alteran las Pu o las Py, de modo que:

causan errores en el emparejamiento, o bien

labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se
modifican químicamente con gran frecuencia.

1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que

origina transiciones

sobre C  dU, que se empareja con la A.

sobre A (6-aminopurina)  hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su

forma ceto se empareja con la citosina:

A:T  HXceto:C  G:C

El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no

hay mutación:

G  xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.

2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente sobre la citosina,

añadiéndole un hidroxilo a su grupo -NH2:

AGENTES ALQUILANTES
 Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes
monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN,
produciendo efectos letales y mutagénicos.

Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 ("Acción de

los agentes químicos").
Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el
O6 de la G.

Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:

gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por

ejemplo:
Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.
etil-etano-sulfonato (EES): CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3
etil-metano-sulfonato (EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3
nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-
nitrosoguanidina:

Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro.
La NTG sólo actúa in vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de
replicación del ADN. La NTG es uno de los mutágenos más potentes que se
conocen, pero es un agente "sucio", en el sentido de que genera varias
mutaciones en la misma célula. Induce reparación SOS propensa a error,
dando origen a transiciones, transversiones y desfases del marco original
del lectura.

Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico

principal consistente en alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran
distorsión en la doble hélice, que posteriormente se plasma en
transiciones del tipo G:C  A:T.

Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar

las lesiones de la O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:

8. La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-

glucosídico entre la O6-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación
de un sitio apurínico (sitio AP).
9. El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora
(apurinasa), que rompe el enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio
apurínico.
10. Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño
n1 de nucleótidos, pero si el daño es muy grande se produce una
situación SOS que tiende a ser reparada por el sistema propenso a
error ya estudiado, lo que provoca introducción de errores, que
conducen a transiciones y transversiones.
SUSTANCIAS INTERCALANTES
Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o
ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la
pauta de lectura del mensaje genético).

Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados, que

presentan un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se
pueden incorporar covalentemente al esqueleto de éste, sino que se
intercalan entre dos pares de bases consecutivas, con lo que provocan
distorsiones de la doble hélice.

Algunos ejemplos:

o derivados de la acridina, como el naranja de acridina

o bromuro de etidio (ver nota)
o derivados de la flavina (como la proflavina).

Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la

recombinación del ADN, dando origen a desplazamientos de la pauta de
lectura.

Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de

inhibir tumores cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo
causante de la malaria.

AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL

EMPAREJAMIENTO DE BASES
Este grupo incluye potentes carcinógenos como:

o benzo-a-pireno
o aflatoxina-B1.

Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el

sistema SOS de reparación, lo que finalmente implica reparación propensa
a error.
8. LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS
Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS

Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como
consecuencia de fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los
carcinógenos son también mutágenos.

Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una

prueba rápida, sencilla y económica por la que se pueden ensayar
compuestos como posibles carcinógenos. Su base consiste precisamente en
ver si son mutágenos frente a bacterias (es decir, se comprueba si tras el
tratamiento de un cultivo bacteriano con la sustancia en cuestión,
aumenta la tasa de aparición de mutantes.

TEST DE AMES:

Usa una serie de cepas his- de Salmonella typhimurium, muy bien

caracterizadas a nivel genético-molecular.

1. Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 108) en

placas Petri que llevan un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin
aminoácidos- .
2. A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco
de papel de filtro impregnado con la sustancia que se desea
ensayar. Acto seguido, las placas se incuban en estufa a la
temperatura óptima de crecimiento de la bacteria (37oC).
3. Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se
cuentan las colonias surgidas en cada placa, comparándolas con las
colonias de una placa control que no llevaba la sustancia. Las
colonias habrán surgido por el crecimiento de bacterias que hayan
experimentado reversiones (=retromutaciones). Cada reversión en
el alelo original his-- restituye el fenotipo silvestre His+, y por lo
tanto capacita a la bacteria a crecer y dividirse en el medio
mínimo.

Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas tasas de

mutación sobre la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado
sea también carcinógeno, por lo que habrá que continuar estudiándolo a
estos niveles. (El 90% de los compuestos que dan positivo en el Test de
Ames se ha demostrado que son carcinógenos).

Ulteriores mejoras en el test de Ames:

 En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla o
adaptarla a situaciones especiales. Veamos algunas de estas
modificaciones:

o uso de cepas de Salmonella defectivas en reparación (uvrA--, uvrB--,

uvrC--, etc). En estas cepas, cualquier daño al ADN no puede ser
corregido con total eficiencia. Esto hace que estas cepas sean más
sensibles frente a sustancias con menor potencial carcinogénico.
o Muchos agentes son mutágenos en humanos sólo tras su "activación"
metabólica por el hígado, pero son inactivas por sí mismas. Para
detectar a estas sustancias, el test de Ames puede modificarse
incorporando un extracto microsomal estéril (fracción libre de
células de hígado animal o de cultivos de tejidos). El extracto
microsomal posee oxigenasas que originan epóxidos a partir de la
sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de tipo epóxido
los que verifican la acción mutagénica.
o Algunas sustancias a ensayar no entran eficientemente a la bacteria
debido al efecto de barrera de la membrana externa de la pared
celular. Para solventar esto, se recurre a emplear mutantes LPS -- de
Salmonella (o sea, mutantes alterados en el lipopolisacárido, LPS),
que facilitan la entrada de moléculas hidrofóbicas.

9. ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS

EMPLEADOS EN LABORATORIO
9.1 ALGUNOS CONCEPTOS BASICOS

En este apartado pretendemos realizar una sencilla sinopsis de algunos

tipos de mutaciones que se utilizan con frecuencia en los laboratorios de
investigación. Previamente repasaremos algunos conceptos y términos que
son igualmente de uso común en muchos estudios de genética:

Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel

fenotípico, y según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar
las mutaciones de la siguiente manera:

mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;

mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:
letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del
microorganismo;
 condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones
el mutante pierde la viabilidad, pero bajo otras la mantiene.
mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida
o la merma de alguna función que no sea esencial para la
viabilidad del organismo. Dentro de ellos están los mutantes
condicionales (su fenotipo alterado se manifiesta en
determinadas circunstancias).

Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son

muy útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En
estos mutantes hay que distinguir dos tipos de condiciones:

condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son

aquellas condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde
la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el producto
afectado por la mutación pierde su actividad biológica.
condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto
del gen mutado es aún funcional.

Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:

mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar

con las siglas ts. El producto del gen mutado es más sensible al
calor que el producto silvestre
mutantes de biosíntesis sensible al calor;
mutantes sensibles al frío (criosensibles)
mutantes sensibles a efectores alostéricos
mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por
ARNt supresores, mutantes);
mutantes dependientes de estreptomicina (consultar "antibióticos
aminoglucósidos", del cap. 20);
mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas
concentraciones de sales).

En principio, y "por definición", es imposible obtener mutantes letales

estrictos de genes esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en
genes de la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa, ADN-ligasa, etc.), pero sí es
posible conseguir mutantes condicionalmente letales, especialmente los
termosensibles. Por ejemplo, si tras un tratamiento mutagénico
sembramos células de Escherichia coli en placas y las cultivamos a 30ºC, y
luego hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC, las colonias
"ausentes" en estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la
placa matriz candidatas a mutantes termosensibles.

Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son

aquellos con mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el
 ribosoma llega al codón sin sentido, se detiene la traducción ulterior. Sin
embargo, si esa bacteria tiene simultáneamente una segunda mutación de
tipo supresor extragénico, a saber, un ARNt mutante adecuado, se puede
restablecer el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).

9.2 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN

LABORATORIO

MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS

MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS:
Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos
en placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los
aspectos de las colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de
nada, vamos a describir brevemente tres tipos de colonias que pueden
darse en una misma especie:

colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas

obtusas (plano-convexas); superficie lisa y brillante; se dispersan
fácilmente en agua, dando suspensiones homogéneas.
colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más
agudas; textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se arrastra
un "moco").
colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o
festoneado; son planas; textura rugosa, y aspecto mate (no
brillante); no se dispersan bien en agua, dando grumos más o menos
gruesos.

Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos

de disociación de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que
alteran moléculas de las envueltas (p. ej., de la membrana externa de las
bacterias Gram-negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:

En algunas bacterias se puede observar una disociación M  S, que

se suele deber a la pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.
En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S  R se debe a
pérdida de la cápsula.
En bacterias Gram-negativas, las disociación S  R se debe a
menudo a la pérdida de la capacidad de sintetizar las cadenas
laterales polisacarídicas del LPS (antígeno somático "O").
Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en
bacterias patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la
pérdida de propiedades de virulencia y de especificidad antigénica.

MUTACIONES QUE AFECTAN A

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
En estudios de genética bacteriana (p. ej., a la hora de elaborar mapas
genéticos), es muy habitual recurrir al empleo de mutantes auxotróficos
(es decir, mutantes afectados en algún gen de alguna ruta biosintética -de
aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas-). Por supuesto, estos
mutantes presentan interés por sí mismos, ya que su estudio permite
"diseccionar" la base genética de las vías metabólicas.

Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar

mutantantes bacterianos auxotrofos:

1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):

cultivo original à tratar con mutágeno à lavarà siembra placas de medio

mínimo (MM)+ suplementos nutricionales à réplica a MM

Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos

nutricionales) con las colonias que hayan aparecido en la placa de réplica
(carente de suplementos). La ausencia de colonia en la placa de réplica en
una posición en la que existe colonia en la placa-matriz incica que la
colonia de la placa matriz que no tiene "gemela" en la réplica es un
mutante auxotrófico.

Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que
determinar qué requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué
compuesto o compuestos no puede sintetizar debido a la mutación). Para
ello se realiza una sencilla prueba en placas de Petri, denominada
auxonograma.

Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico,

la frecuencia de aparición de un determinado fenotipo mutante es
relativamente baja. Esto significa que en el experimento anterior,
tendríamos que sembrar y replicar numerosas placas con grandes números
de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de probabilidad para
 detectar mutaciones auxotróficas. Para solventar este inconveniente, se
suele recurrir a una modificación del método anterior basada en
enriquecer en mutantes auxotrofos el cultivo tratado con el mutágeno:

2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes

auxotróficos (resumen de un protocolo):

cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)

tratamiento con el mutágeno
mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) y
bacterias vivas, entre ellas unos pocos mutantes de diversos tipos
el cultivo se transfiere a un medio líquido rico,
para permitir la recuperación y la expresión fenotípica (lag fenotípico)
incubar unas cuantas horas
el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo
añadir penicilina e incubar
la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren,
porque no crecen en MM (muerte selectiva de los parentales
prototrofos)
plaquear en medio sólido rico
hacer réplica a medio sólido mímino
identificar los auxotrofos (no crecen en MM)
recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos
(hacer auxonograma)

MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS

Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de
mecanismos, entre los que se encuentran:

alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del
antibiótico;
alteración de algún gen responsable de permeabilidad al
antibiótico.

Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de

receptores de la superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.

Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para "marcar" cepas
bacterianas en experimentos de genética (especialmente los que implican
algún proceso de transferencia de material genético desde una estirpe
donadora a otra receptora). Estos marcadores genéticos permiten
seleccionar directamente la cepa que los porte añadiendo al medio de
cultivo el correspondiente agente selectivo (antibiótico o fago), que
obviamente mata o inhibe el crecimiento de las cepas sensibles.
 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE
AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C Y
ENERGÍA
Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados
sustratos, pero pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos
mutantes se puede recurrir en muchos casos al uso de medios diferenciales
que incorporan indicadores de pH, que cambian de color en función del
uso o no del sustrato en cuestión.

Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E. coli, sembraríamos

en Agar Mac Conckey. Los mutantes Lac-- dan colonias transparentes,
mientras que el fenotipo silvestre Lac+ da colonias rojas opacas con un
precipitado alrededor de sales biliares (recordar el uso de este medio en
las prácticas).

10. VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN

DE PLÁSMIDOS
Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico
que se replican independientemente del cromosoma (replicones
autónomos), y que no son indispensables para la viabilidad de la bacteria
que los posee. Hay plásmidos crípticos que no dan ningún fenotipo
detectable (función desconocida), pero existen muchos plásmidos que
codifican funciones como resistencia a antibióticos o a metales pesados,
virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno atmosférico,
etc.

Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de

experimentar mutaciones. Pero la posesión de plásmidos por muchas
bacterias puede condicionar otro tipo de variaciones genotípicas
heredables: la curación, consistente en la pérdida del plásmido, lo que
acarrea obviamente la pérdida concomitante de las funciones y fenotipos
codificado por aquel, sin que se afecte la viabilidad de la bacteria.

Métodos de curación de plásmidos:

 Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas
a la temperatura máxima);
Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en
el ADN, interfiriendo con la replicación, estabilidad o reparto del
plásmido a las células hijas (bromuro de etido, naranja de acridina,
etc.).

BIBLIOGRAFIA
LIBROS DE TEXTO Y DE CONSULTA:
LEWIN: "Genes" (Ed. Reverté). Pero es preferibla la 6ª edición en inglés
(Ed. Wiley).

STANIER y otros: "Microbiología-2ª edición" (Ed. Reverté, 1988). Muy

recomendable todo el cap. 10, con un excelente tratamiento de los tipos
de mutaciones y sus bases moleculares, de la supresión, y de la tasa de
mutación. Contiene una sección sobre metodología para aislar y
caracterizar mutaciones.

DAVIS y otros: "Tratado de Microbiología" (4ª edición, Masson- Salvat).

JIMÉNEZ SÁNCHEZ, A. Y R. GUERRERO (coords.): "Genética molecular

bacteriana". (Ed. Reverté, 1982). Contiene varios capítulos muy
recomendables:cap. 1: "Fidelidad de la expresión génica y base molecular
de la mutación espontánea". Incluye esquemas sobre los emparejamientos
entre las formas tautoméricas de las bases del ADN. Cap. 12: "Mecanismo
de la reparación SOS". Cap. 13: "Utilización de microorganismos en la
detección de sustancias con acción mutagénica y carcinogénica". Describe
las bases del test de Ames (y otras pruebas), y sus mejoras hasta la fecha.

JIMÉNEZ SANCHEZ, A., JIMÉNEZ MARTÍNEZ, J (1998): "Genética

microbiana". Ed. Síntesis.Madrid.

MALOY, S.R., J.E. CRONAN, D. FREIFELDER (1994): "Microbial genetics" (2ª

edición). Jones and Bartlett Publishers, Boston y Londres. Consultar
capítulo 10.

SNYDER, L., Y W. CHAMPNESS (1997): Molecular Genetics of Bacteria.

Washington DC: American Association for Microbiology. Consúltese sobre
todo el magnífico capítulo 3
SUZUKI y otros: "Genética" (5ª edición: Ed. Interamericana-MacGraw Hill,
Madrid).

ARTICULOS EN REVISTAS DE DIVULGACION

BLANCO, M. (1980): Reparación del material genético. Inv. y Ciencia
(enero): 6-15.

DEVORET, R. (1979): Tests bacterianos de sustancias potencialmente

cancerígenas. Inv. y Ciencia 37 (octubre): 6-16.

GIBERT, I., J. BARBÉ (1990): La respuesta adaptativa a los agentes

alquilantes en Escherichia coli.

En "Microbiología 1990", págs. 64-70.

HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparación inducible de ADN. Inv. y

Ciencia 64 (enero): 28-37.

RADMAN, M., R. WAGNER (1988): Fidelidad en la duplicación del ADN. Inv.

y Ciencia 145 (octubre):

20-29.

ARTICULOS DE REVISION
BACHMANN, B.J. (1996): Derivations and genotypes of some mutant
derivatives of Escherichia coli K-12. En: "Escherichia coli and Salmonella
typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart,
ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs.
2460-2488.

HUTCHINSON, F. (1996): Mutagenesis. En: "Escherichia coli and Salmonella

typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart,
ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs.
2218-2235.

LAROSSA, R.A. (1996): Mutant selections linking physiology, inhibitors and

genotypes. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and
molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for
Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 2527-2587.

LINDAHL, T., B. SEDGWICK, M. SEKIGUCHI, Y. NAKABEPPU (1988):

Regulation and expression of the adaptative response to alkilating agents.
Ann. Rev. Biochem. 57: 133-157.
SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev. Biochem.
57: 29-67.

SANCAR, G.B., A. SANCAR (1987): Structure and function of DNA

photolyases . Trends Biochem. Sci. 12: 259-261.

SEDGWICK, S.G. (1986): Inducible DNA repair. Microbiol. Sci. 3: 76-83.

SEKIGUCHI, M., Y. NAKABEPPU (1987): Adaptative response: induced

synthesis of DNA repair enzymes by alkylating agents. Trends Genet. 3: 51-
54.

WALKER, G.C. (1984): Mutagenesis and inducible responses to

deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 48: 60-
93