ESTUDO DIRIGIDO – MÉTODOS GERAIS DE IDENTIFICAÇÃO DE

BACTÉRIAS

1. Quais são as principais colorações diferenciais utilizadas na identificação

de bactérias? Descreva cada uma delas.

Coloração de Gram: O fundamento do método deve-se ao fato de que as

bactérias, quando coradas por tons derivados de rosa (violeta de
genciana, cristal de violeta) e depois tratadas por lugol (solução de iodo)
formam um composto de coloração escura. Esse composto nas bactérias
gram positivas é retido e não consegue ser removido no processo de
descoloração (tratamento com álcool), enquanto nas bactérias gram
negativas esse composto é facilmente removido, descorado. Após a
descoloração, é feita uma nova coloração por safranina ou fucsina, onde,
então, as bactérias gram negativas aparecerão vermelhas, devido à cor
do corante, e as gam positivas aparecerão roxa, uma vez que conservam
a cor do corante inicial.

Coloração de Ziehl-Nellsen: é mais agressiva e utilizada para as bactérias

que não são bem coradas pelo método de Gram, já que resistem ao
descoramento por possuírem alto teor de lipídeo na parede celular. Essas
bactérias são denominadas de bacilos álcool ácidos resistentes (BAAR)
(Mycobacterium e Nocardia).

Colorção de Albert-Laybourn: baseia-se no fato de algumas bactérias

apresentarem corpúsculos citoplasmáticos localizados nas regiões
polares, que se coram pelo Lugol (de cor marrom), evidenciando-se, em
contraste com o corpo bacilar, que se cora em verde-azulado pela solução
de Laybourn. Essas características são encontradas nas corinebactérias,
utilizadas para o diagnóstico de difteria.

2. Qual o principal grupo de bactérias que não se cora no método de

coloração de Gram?

Mycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae) e Nocardia.

3. O que é um meio de cultura?

Meios de cultura são preparações sólidas, semissólidas ou líquidas,

simples ou complexas, estéreis que permitem o crescimento de
microrganismos.

Possuem funções de fornecer nutrientes para o crescimento bacteriano –

cultivo in vitro, podendo ser específicos para cada microrganismo ou não,
identificam sua família, gênero e espécie e formam cultura bacteriana a
partir de um inóculo.

Um inóculo é uma amostra de material contendo geralmente uma

pequena quantidade de microrganismos.
4. O que é ágar? Qual a função do ágar em um meio de cultura?

Ágar é um polissacarídeo proveniente de algas marinhas, utilizado como

agente solidificador (semelhante à gelatina), este ágar é adicionado ao
meio líquido para alterar a consistência do meio de cultura, tornando-o
semissólido. São geralmente utilizados em tubos.

5. Diferencie os meios complexos e quimicamente definidos.

Um meio quimicamente definido é aquele no qual a composição química

exata é conhecida. Um meio complexo é aquele no qual a composição
química exata não é conhecida.

6. O que é um microrganismo fastidioso? Cite um exemplo de bactéria

patogênica que é extremamente fastidiosa.

Os organismos que requerem muitos fatores de crescimento são definidos

como fastidiosos.

7. Qual o tipo de meio de cultura utilizado para microrganismos

anaeróbicos?

Como os anaeróbios podem ser destruídos pela exposição ao oxigênio,

meios especiais, chamados de meios redutores, devem ser utilizados.
Esses meios contêm ingredientes, como o tioglicolato de sódio, que se
combinam quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam do meio
de cultura.

8. O que são meios de cultivo seletivos, diferenciais e de enriquecimento?

Os meios seletivos permitem o crescimento somente dos microrganismos

de interesse, por inibição de microrganismos indesejados com sais,
corantes ou outros compostos químicos.

Os meios diferenciais são utilizados para distinguir microrganismos

diferentes.

Uma cultura de enriquecimento é utilizada para favorecer o crescimento

de um microrganismo específico em uma cultura mista.

9. A partir de testes bioquímicos, é possível a identificação de

microrganismos. Qual família tem todos os membros oxidase-negativa?

A família das Enterobactérias.

10. Quais bactérias entéricas não fermentam lactose?

Salmonella e Shigella.
11. Quais as vantagens de um sistema automatizado de identificação?

Capacidade para realizar um grande número de análises microbiológicas

simultâneas com resultados liberados de 6 a 8 horas.

12. Explique os principais testes sorológicos utilizados na identificação de

microrganismos.

Em um procedimento chamado de teste de aglutinação em lâmina,

amostras de uma bactéria desconhecida são colocadas em uma gota de
solução salina em várias lâminas. A seguir, diferentes antissoros
conhecidos são adicionados a cada amostra. As bactérias aglutinam-se
(agregam-se) quando misturadas aos anticorpos que são produzidos em
resposta a essa espécie ou linhagem de bactéria; um teste positivo é
indicado pela presença de aglutinação.

O teste chamado de ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA, de

enzyme-linked immunosorbent assay) é amplamente utilizado por ser um
teste rápido e porque pode ser lido por um computador. Em um ELISA
direto, anticorpos conhecidos são colocados (e aderem-se) em canaletas
de uma microplaca, e um tipo desconhecido de bactéria é adicionado a
cada canaleta. A reação entre os anticorpos conhecidos e as bactérias
fornece uma identificação das bactérias. Um ELISA é utilizado no
diagnóstico de Aids para detectar a presença de anticorpos contra o vírus
da imunodeficiência humana (HIV), o vírus que causa a Aids.

Outro teste sorológico, o Western blotting, também é utilizado para

identificar anticorpos no soro de um paciente:

A eletroforese é utilizada para separar as proteínas no soro. As proteínas

movem-se em velocidades diferentes em função de sua carga e tamanho
quando o gel é exposto a uma corrente elétrica.

As bandas são transferidas para um filtro de nitrocelulose por blotting

(transferência). Cada banda consiste em muitas moléculas de uma
proteína em particular (antígeno). As bandas ainda não são visíveis neste
ponto.

As proteínas (antígenos) são posicionadas no filtro exatamente da mesma

forma como estavam no gel.

O filtro é, então, lavado com o soro do paciente, seguido por uma

marcação com anticorpos anti-humanos conjugados a uma enzima. Os
anticorpos do paciente, que se combinam ao seu antígeno específico,
tornam-se visíveis (mostrados aqui em vermelho) quando o substrato para
a enzima é adicionado.

O teste encontra-se pronto para a leitura. A fixação dos anticorpos

conjugados ao filtro consiste em uma evidência da presença do
microrganismo no soro do paciente.
 A infecção por HIV é confirmada pelo Western blotting, e a doença de
Lyme, causada por Borrelia burgdorferi, frequentemente é diagnosticada
por Western blot.

13. O que é determinado pela fagotipagem?

Assim como o teste sorológico, a fagotipagem procura semelhanças entre

as bactérias. Ambas as técnicas são úteis para localizar a origem e
rastrear o curso do surto de uma doença. A fagotipagem é um teste para
determinar a quais fagos uma bactéria é suscetível.

14. Como é realizada a identificação de bactérias a partir dos ácidos graxos?

As bactérias sintetizam uma ampla variedade de ácidos graxos, e, em

geral, eles são constantes para uma espécie em particular. Sistemas
comerciais têm sido projetados para separar os ácidos graxos celulares e
os comparar ao perfil de ácidos graxos de organismos conhecidos.

15. Para qual objetivo é utilizada a técnica de Fingerprinting de DNA?

O fingerprinting de DNA é utilizado para determinar a fonte de infecções

hospitalares.

16. O que é PCR? Explique suscintamente os procedimentos da técnica.

É uma técnica de amplificação do DNA in vitro, capaz de fazer várias

cópias do fragmento de DNA que pretende ser examinado e estudado.

O teste clona cópias de fragmento de DNA em um plasmídeo para, então,

estudá-lo e realizar outros experimentos. A técnica de PCR consiste em
avaliar este fragmento de DNA e verificar se ele está predisposto à
doença.

Nos dias atuais, o teste é muito utilizado para a investigação de doenças

hereditárias, teste de paternidade, investigação de microrganismos
causadores de infecção, entre outros.

A técnica se inicia com a extração do DNA da célula (material genético),

contudo o RNA também pode ser utilizado. Após a extração do material
genético, adiciona-se dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato) em uma
solução tampão. Esta mistura é colocada em um aparelho específico,
chamado termociclador, o qual aquecerá e resfriará o material em ciclos
preestabelecidos, para que ocorra a desnaturação do DNA (separação
das fitas) e, depois, a hibridação ou o anelamento, em que os primers irão
se ligar especificamente às sequências complementares de DNA. A
seguir, a temperatura se eleva novamente para que ocorra a síntese da
polimerase, a extensão de uma nova molécula. Na sequência, inicia-se
um novo ciclo. São realizados, em média, 25 a 40 ciclos por reação,
apresentando grande relevância na taxa de replicação.

O resultado é analisado através de uma técnica de eletroforese em gel de

agarose ou poliacrilamida.
17. Explique o método de hibridização de ácidos nucleicos.

O método considera que, se duas espécies são similares ou relacionadas,

a maior parte das sequências dos seus ácidos nucleicos também será
similar. O procedimento mensura a habilidade das fitas de DNA de um
organismo de hibridizar (ligar-se por pareamento de bases
complementares) com as fitas de DNA de outro organismo. Quanto maior
o grau de hibridização, maior o grau de parentesco.
 ESTUDO DIRIGIDO – ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO

1. Defina:

a) Esterilização: é processo de destruição de todas as formas de vida

microbiana (bactérias nas formas vegetativas e esporuladas, fungos e
vírus) mediante a aplicação de agentes físicos e ou químicos, Toda
esterilização deve ser precedida de lavagem e enxaguadura do artigo
para remoção de detritos.

b) Desinfecção: é o processo pelo qual se destroem particularmente os

germes patogênicos e/ou se inativa sua toxina ou se inibe o seu
desenvolvimento. Os esporos não são necessariamente destruídos.

c) Antissepsia: é o conjunto de medidas propostas para inibir o

crescimento de microorganismos ou removê-los de um determinado
ambiente, podendo ou não destruí-los e para tal fim utilizamos
antissépticos ou desinfetantes.

d) Degerminação: significa a diminuição do número de microorganismos

patogênicos ou não, após a escovação da pele com água e sabão.

e) Sanitização: Remoção de micróbios de utensílios de cozinha e de

áreas de manipulação de alimentos. Tratamento destinado a reduzir
as contagens microbianas nos utensílios alimentares a níveis seguros
de saúde pública.

2. Descreva os padrões de morte microbiana ocasionada pelos tratamentos

com agentes de controle microbiano.

Quando as populações bacterianas são aquecidas ou tratadas com

substâncias químicas antimicrobianas, elas normalmente morrem em
uma taxa constante. Por exemplo, suponha que uma população de um
milhão de microrganismos foi tratada por um minuto e 90% da população
morreu. Restam agora 100 mil microrganismos. Se a população for
tratada por mais um minuto, 90% desses micróbios morrem, restando
10.000 sobreviventes. Em outras palavras, para cada minuto em que o
tratamento é aplicado, 90% da população remanescente é. Se a curva de
morte for representada logaritmicamente, a taxa de morte aparece
constante.

3. Quais as condições que influenciam a ação antimicrobiana?

a. O número de micróbios. Quanto mais microrganismos existem no

início, mais tempo é necessário para eliminar a população inteira;

b. Influências ambientais. A maioria dos desinfetantes atua melhor em

soluções aquecidas;
 c. A presença de matéria orgânica frequentemente inibe a ação dos
antimicrobianos químicos;

d. A natureza do meio de suspensão também é um fator importante no

tratamento com calor. Gorduras e proteínas são especialmente
protetoras, e um meio rico nessas substâncias protege os
microrganismos que, dessa forma, terão uma taxa de sobrevivência
maior;

e. Tempo de exposição. As substâncias químicas antimicrobianas

frequentemente requerem um maior tempo de exposição, a fim de
afetarem os micróbios mais resistentes ou os endósporos;

f. Características microbianas. As características microbianas interferem

na escolha dos métodos de controle químicos e físicos.

4. Quais são os modos de ação dos antimicrobianos?

a. Alteração na permeabilidade da membrana;

b. Danos às proteínas e aos ácidos nucleicos.

5. Quais são os dois tipos de agentes de esterilização e desinfecção?

Agentes físicos e agentes químicos.

6. Quais são os métodos físicos de controle microbiano?

Os métodos físicos mais utilizados em hospitais, clínicas e laboratórios

incluem calor, combinação de calor e pressão, dessecação, radiação,
rompimento sônico e filtração.
7. Qual o mecanismo de ação do calor úmido e calor seco?

Calor úmido: Utilizado para materiais que não suportam altas

temperaturas. É o calor aplicado na presença de umidade (fervura ou
vapor), sendo mais rápido e eficaz que o calor seco. Pode ser utilizado
em temperaturas mais baixas. Exemplo: vidros e metais limpos, como
seringas e agulhas, podem ser desinfetados pela fervura por um tempo
de 30 minutos.

Calor seco: Eficaz para metais, vidrarias, algumas substâncias em forma

de pó, óleos e ceras. É necessário um aquecimento em temperaturas de
160 a 165ºC duas horas, ou 170 a 180ºC por uma hora. A eficiência desse
método depende da intensidade da penetração do calor nos materiais a
serem esterilizados e do posicionamento correto – os materiais precisam
estar posicionados de forma que o ar circule livremente entre eles.
8. O que é autoclave?

A autoclave, muito parecida com uma grande panela de pressão, é feita

de metal e utiliza vapor sob pressão para destruir completamente toda
forma de vida microbiana. O aumento da pressão aumenta a temperatura,
além da fervura da água acima de 100o C, e força a entrada de vapor nos
materiais que estão sendo esterilizados.

9. Quais métodos podem ser aplicados para indicar se a esterilização foi

obtida por tratamento com calor?

Vários métodos comercialmente disponíveis indicarão se a esterilização

por tratamento com calor foi obtida. Alguns deles são reações químicas
em que um indicador altera sua cor quando os tempos e temperaturas
corretos tiverem sido atingidos. Esse teste apresenta uma vantagem
prática; não requer um tempo de incubação para o crescimento do
organismo-teste, o que é importante se o produto esterilizado destina-se
ao consumo imediato.

Um outro teste amplamente utilizado consiste na preparação de

determinadas espécies de endósporos bacterianos impregnados em tiras
de papel. Após a autoclave, as tiras podem, então, ser inoculadas
assepticamente em meios de cultura. O crescimento nos meios de cultura
indica a sobrevivência dos endósporos e, assim, o processamento
inadequado. Outros métodos usam suspensões de endósporos que
podem ser liberadas, após o aquecimento, em um meio de cultura
circundante dentro do mesmo frasco.

10. Qual é o mecanismo de ação da pasteurização?

A pasteurização consiste em se realizar um aquecimento leve, suficiente

para destruir os organismos que causavam o problema específico de
deterioração, sem alterar consideravelmente o sabor do produto. O
mesmo princípio é aplicado ao leite, para produzir o que hoje
denominamos leite pasteurizado.

11. Se a pasteurização não atinge a esterilização, por que o alimento é tratado

por pasteurização?

O objetivo ao pasteurizar o leite é eliminar microrganismos patogênicos.

O processo também reduz o número de microrganismos, prolongando a
qualidade do leite quando mantido sob refrigeração.

12. Quais os principais métodos de esterilização com calor seco?

a. Um dos métodos mais simples de esterilização por calor seco é a

chama direta;

b. Outra forma de esterilização por calor seco é a esterilização em ar

quente.
13. O que são filtros HEPA? Em quais locais são utilizados?

Algumas salas de cirurgia e salas ocupadas por pacientes queimados

recebem ar filtrado para reduzir o número de microrganismos
transmissíveis pelo ar. Os filtros de ar particulado de alta eficiência
(HEPA, de high-efficiency particulate air filters) removem quase todos os
microrganismos maiores do que cerca de 0,3 micrometros de diâmetro.

14. Quais as aplicações das baixas temperaturas no controle microbiano?

A refrigeração comum tem efeito bacteriostático. Por exemplo, nas

temperaturas dos refrigeradores comuns (0 a 7°C), a taxa metabólica da
maioria dos microrganismos é tão reduzida que eles não podem se
reproduzir ou sintetizar toxinas.

15. Qual é o princípio da dessecação? Qual é a sua principal aplicação?

Na ausência de água, uma condição conhecida como dessecação, os

microrganismos não podem crescer ou se reproduzir, contudo,
permanecem viáveis por anos.

Essa capacidade de certos microrganismos e endósporos secos de

permanecerem viáveis é importante em um ambiente hospitalar. A poeira,
as roupas, os lençóis e os curativos podem conter microrganismos
infecciosos em resíduos secos de muco, urina, pus e fezes.

16. Qual a principal utilização do controle microbiano a partir da pressão

osmótica?

O princípio da pressão osmótica é utilizado na conservação dos

alimentos. Por exemplo, soluções concentradas de sal são usadas para
conservar carnes, e soluções espessas de açúcar são usadas para
conservar frutas.

17. Quais são os tipos de radiação que matam microrganismos? Cite

exemplos de aplicações destes métodos.

A radiação ionizante – raios gama, raios X ou feixes de elétrons de alta

energia. A radiação ionizante, sobretudo os feixes de elétrons de alta
energia, é usada na esterilização de produtos farmacêuticos e materiais
descartáveis dentários e médicos, como seringas plásticas, luvas
cirúrgicas, materiais de sutura e cateteres.

A radiação não ionizante: luz ultravioleta (UV). A radiação UV é usada

para controlar os microrganismos no ar. Uma lâmpada UV ou “germicida”
é comumente encontrada em salas de hospitais, enfermarias, salas de
cirurgia e refeitórios. A luz UV também é usada para desinfetar vacinas e
outros produtos médicos.
18. Quais são os principais grupos de desinfetantes e antissépticos?

a. Os compostos fenólicos;

b. Bisfenóis;

c. As biguanidas;

d. Alguns halogênios (iodo e cloro);

e. Os álcoois;

f. A prata, o mercúrio, o cobre e o zinco;

g. Os sabões;

h. Os detergentes ácido-aniônicos;

i. Os quats: são detergentes catiônicos unidos ao NH;

j. O SO2, o ácido sórbico, o ácido benzoico e o ácido propiônico;

k. A nisina e a natamicina: são antibióticos usados na conservação de

alimentos, sobretudo queijos;

l. Os aldeídos, como o formaldeído e o glutaraldeído

m. O óxido de etileno é o gás mais frequentemente usado para a este-

rilização;

n. Os radicais livres nos gases de plasma são utilizados para esterilizar

instrumentos plásticos;

o. Fluidos supercríticos, que apresentam propriedades de líquidos e

gases, podem esterilizar em baixas temperaturas;

p. Peróxido de hidrogênio, ácido peracético, peróxido de benzoíla e

ozônio.

19. Qual o mecanismo de ação do fenol e compostos fenólicos? Cite produtos

que possuem estes compostos.

Os compostos fenólicos exercem sua ação lesando as membranas

plasmáticas. Exemplos: algumas pastilhas e sprays para a garganta;
produtos que contêm o Cresol.

20. Quais sãos os dois álcoois mais utilizados?

Dois dos álcoois mais comumente utilizados são o etanol e o isopropanol.

21. Qual a concentração recomendada de etanol para uso como bactericida?

A concentração ótima de etanol recomendada é 70%.

22. O álcool etílico é desinfetante ou antisséptico? Explique.

Álcool etílico é usado como antisséptico e desinfetante. A concentração

ideal é de 70%. Age rapidamente sobre bactérias vegetativas (inclusive
micobactérias), vírus e fungos, mas não é esporicida. Por isso não se
recomenda para esterilização, apenas para desinfecção de superfícies e
antissepsia de pele.

23. Qual é o uso da clorexidina no controle microbiano?

Clorexidina é antisséptico que age por rompimento de membranas

citoplasmáticas, precipitando conteúdos celulares. Tem melhor atividade
contra bactérias gram-positivas, menor atividade contra bactérias gram-
negativas e fungos e mínima atividade contra o bacilo da tuberculose. Não
é esporicida. Combinada a um detergente ou álcool, a clorexidina é
frequentemente utilizada na escovação cirúrgica das mãos e no preparo
pré-operatório da pele de pacientes.

24. Qual o mecanismo de ação dos halogênios? Quais são os mais

utilizados?

O iodo inibe a função das proteínas e é um forte agente oxidante; o cloro

forma o agente oxidante forte ácido hipocloroso, que altera os
componentes celulares.

25. O que é oligodinâmica?

A capacidade de pequenas quantidades de um composto de metal

pesado exercer atividade antimicrobiana.

26. Qual o mecanismo de ação de metais pesados?

Desnaturação das enzimas e de outras proteínas essenciais.

27. O que são agentes de superfícies?

Os agentes de superfície, ou surfactantes, podem reduzir a tensão

superficial entre as moléculas de um líquido. Esses agentes incluem os
sabões e os detergentes.

28. Quais são os principais esterilizantes químicos? E quais são as suas

aplicações?

O óxido de etileno: destrói todos os microrganismos e endósporos; Entre

suas vantagens está o fato de que é possível realizar processos de
esterilização à temperatura ambiente e ele é altamente penetrante.
Alguns hospitais maiores são frequentemente capazes de esterilizar até
mesmo colchões em câmaras de óxido de etileno especiais.

O dióxido de cloro: é um gás de curta duração que, em ge- ral, é preparado

no local de sua utilização. Notavelmente, ele tem sido utilizado na
fumigação de ambientes fechados contamina- dos com endósporos de
 antraz. O dióxido de cloro é mais estável em soluções aquosas. Seu uso
mais comum é no tratamento de água, antes da etapa de cloração, onde
seu objetivo é remover ou reduzir a formação de alguns compostos
carcinogênicos às vezes formados durante a cloração.

29. Quais são os principais agentes oxidantes? Quais as principais aplicações

de cada um?

O peróxido de hidrogênio é um antisséptico encontrado em muitos

armários de medicamentos domésticos e em salas de suprimentos
hospitalares. Ele não é um bom antisséptico para feridas expostas, sendo
rapidamente degradado em água e oxigênio gasoso pela ação da enzima
catalase, que está presente nas células humanas. Contudo, o peróxido de
hidrogênio desinfeta efetivamente objetos inanimados, e chega a
apresentar efeito esporocida nessas aplicações em concentrações
elevadas.

O peróxido de hidrogênio gasoso, aquecido, pode ser utilizado como um

esterilizante de atmosferas e superfícies. Os quartos de hospital, por
exemplo, podem ser rápida e rotineiramente descontaminados utilizando-
se um equipamento da marca Bioquell.

O ácido peracético (ácido peroxiacético, ou PAA) é um dos esporicidas

químicos líquidos disponíveis mais efetivos e pode ser utilizado como
esterilizante. O ácido peracético tem muitas aplicações na desinfecção de
equipamentos médicos e de processamento de alimentos, sobretudo
endoscópios. A FDA aprovou o uso do PAA para lavagem de frutas e
vegetais.

Outros agentes oxidantes (outras formas de oxigênio): Peróxido de

benzoíla, provavelmente mais conhecido como o principal componente
dos medicamentos de venda livre para acne; O ozônio (O3) é
frequentemente utilizado em suplementação à cloração na desinfecção
da água, uma vez que ele auxilia na neutralização de sabores e odores.

30. Quais são os microrganismos mais resistentes a biocidas químicos?

Entre as bactérias gram-negativas, membros dos gêneros Pseudomonas e

Burkholderia são muito resistentes aos biocidas.

As micobactérias são outro grupo de bactérias que exibem uma resistência maior
que o normal aos biocidas químicos. Esse grupo inclui Mycobacterium
tuberculosis, o patógeno que causa a tuberculose. Os endósporos, os cistos e
os oocistos dos protozoários são muito resistentes aos desinfetantes e aos
antissépticos.

Os vírus não envelopados geralmente são mais resistentes do que os vírus

envelopados aos desinfetantes e antissépticos.

Os príons são resistentes à desinfecção e à autoclavação.