Obtención de un cultivo puro, caracterización y cinética

de crecimiento de la levadura
Valdez-Tresierras D. A., Pérez-Valenzuela D. M., Arciniega-Valenzuela J. A., Rivera-
Romero F. J., Monjardin-Cuevas J.P.
Instituto Tecnológico de Sonora, Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias,
Antonio Caso s/n Col. Villa Itson, Cd obregón, Sonora C.P. 85130
Teléfono:(644) 4109000 ext. 1323, e-mail: daniielavaldez@hotmail.com

Resumen. Las levaduras son organismos
unicelulares que forman sobre los medios
de cultivo colonias con una apariencia
pastosa de color blanco, tienen una
morfología esférica, ovoides, elipsoides o
alargadas, y su tamaño oscila de 20 a 100
veces más grandes que la mayoría de las
bacterias, midiendo de 1 a 9 µm de ancho
y de 2 a más de 20 µm de largo. Tienen
una gran cantidad de aplicaciones dentro
de la biotecnología tradicional y moderna.
Dentro de sus más importantes
aplicaciones, las levaduras participan en
procesos de producción de alimentos
desde la antigüedad, y se han ganado un
gran reconocimiento como protagonistas
de la fermentación de bebidas alcohólicas
como vino o cerveza, aunque también
tienen aplicaciones para la obtención de
vitaminas del complejo B, pigmentos,
cofactores, proteínas de organismos
unicelulares, biomasa y otros productos
de valor añadido. El objetivo de este
estudio fue aislar un cultivo puro de
levadura por métodos normalizados
mediante la NOM-110-SSA1-1994 y
NOM-092-SSA1-1994, además de
determinar su cinética de crecimiento
mediante el uso de la cámara de Neubauer
y el espectrofotómetro. El análisis se
llevó a cabo en el Laboratorio de
microbiología LV-513 del Instituto
Tecnológico de Sonora, Campus Nainarí
desde el día 2 de marzo del 2019 a las
10:30 horas hasta las posteriores 18 horas
a partir de la hora de inicio, llevando un
conteo de levaduras cada 2 horas por
medio de la cámara de Neubauer y del
espectrofotómetro UV-VIS. El conteo
total de levaduras se registró en una tabla
de resultados mostrando los datos en
absorbancia y en células por mililitro.
Finalmente, de la tabla de resultados se
establecieron dos gráficas donde se logró
observar la curva de crecimiento de las
levaduras. Los resultados de la curva de
crecimiento indica la rapidez con la que
las levaduras se reproducen y qué
cantidad de células hay. Mediante la
curva también es posible diferenciar entre
las fases de latencia, exponencial,
estacionaria y muerte del microorganismo
de estudio.
Introducción. Las levaduras son
microorganismos eucarióticos
denominadas como hongos unicelulares y
no filamentosos. Se pueden encontrar en
la naturaleza donde los azucares simples
estén presentes, como en los frutos, en la
savia que se derrama de los árboles o en
el suelo alrededor de los árboles frutales.
(Sánchez Contreras, M. A. y cols.).
Las levaduras varían considerablemente
en cuanto a su tamaño, oscilando entre 1
y 5 µm de ancho y entre 5 a 30 µm de
largo. Cada especie de levadura tiene una
forma característica, pero aun en un
cultivo puro existe una considerable
variación en el tamaño y forma, esta
última puede ser redonda, elipsoide o casi
cilíndrica. Sus características
morfológicas se ven afectadas por la edad
y el entorno en el que viven. Las
levaduras no poseen flagelos ni ningún
otro órgano de locomoción. (Montoya
Villafañe, H. H. et al 2008).
Las levaduras son organismos
heterótrofos, es decir, consiguen su
energía mediante el carbono y depende de
plantas superiores y de los animales para
obtener su energía por medio de
desasimilación de oxidante aerobia o por
la fermentación anaerobia de azucares
(Rojas Padilla, J. et al 2016).
Las levaduras pueden dividirse por
brotación o por fisión. Las levaduras en
brotación, como Saccharomyces, se
dividen de manera irregular, en el proceso
la célula parental forma un brote en su
superficie externa, cuando este se alarga
el núcleo de la célula parental se divide y
un núcleo migra al interior del brote, el
material de la pared celular se deposita
entre el brote y la célula parental y
finalmente el brote se separa. Una sola
célula de levadura por brotación puede
formar hasta 24 células hijas. Algunas
levaduras producen brotes que no pueden
separarse y forman una cadena corta de
células denominadas seudohifas. Las
levaduras de fisión, como
Schizosaccharomyces, se dividen de
modo uniforme produciendo dos células
hijas. Durante la fisión la célula parental
se alarga, su núcleo se divide y se
producen dos células nuevas. (Tortora, G.
J. y cols. et al 2007).
En la vida cotidiana nos encontramos
expuestos a múltiples tipos de levaduras
las más comunes son Candida albicans,
Candida tropicalis, Candida parapsilosis
y Cryptococcus neoformans. Estas actúan
como agentes de enfermedades humanas.
Los organismos que alguna vez se
consideraron contaminantes ambientales
o solo de importancia industrial, como
Candida utilis y Cándida lipolytica, ahora
han sido implicados como agentes de
fungemia, onicomicosis y enfermedades
sistemáticas. Las levaduras poco comunes
infectan principalmente a pacientes
inmunocomprometidos, recién nacidos y
ancianos.
Las levaduras tienen gran cantidad de
aplicaciones en la biotecnología
tradicional y moderna: participan en
procesos de producción de alimentos
ganándose un gran reconocimiento como
protagonistas por la fermentación,
también son utilizadas como fuentes de
obtención de vitaminas del complejo B,
obtención de proteínas de mecanismos
unicelulares, obtención de biomasa y de
productos con valor añadido.
Sin embargo a pesar de presentar muy
buenas ventajas algunas levaduras son
patógenos oportunistas asociados a
enfermedades como el VIH, también son
causantes del deterioro de alimentos
frescos y elaborados para el consumo
humano y por ende pueden ocasionar
importantes pérdidas económicas en la
conservación y producción comercial y
manufacturada de alimentos y bebidas.
(Orberá Ratón, T. et al 2004).
Hay numerosas industrias como la
alimentaria, agrícola, farmacéutica y
otras, que trabajan directamente con las
levaduras aprovechando sus aplicaciones,
es por eso que dentro de la microbiología
industrial es importante el desarrollo de
simuladores para el crecimiento de
levaduras o microorganismos para evitar
pérdidas económicas y tiempo invertido.
En ellos se aplican características
biológicas para diferenciar las etapas del
crecimiento de microorganismos e
identificar la fase de latencia mediante
una curva de crecimiento expresada en
una gráfica. Estos modelos y partiendo de uno mixto donde se incluían
simulaciones se aplican en todas las
disciplinas científicas y comenzó en 1920
con los cálculos de tiempo de muerte
térmica en alimentos enlatados para
Clostridium botulinum. Su objetivo es
describir matemáticamente el crecimiento
o la declinación de microorganismos bajo
específicas condiciones ambientales
experimentales y predecir el
comportamiento microbiano, sin
necesidad de realizar ensayos largos y
costosos. (Cattaneo, C. A. y cols. et al
2007).
Materiales y métodos.
Este trabajo fue realizado en el
Laboratorio de microbiología LV-513 del
Instituto Tecnológico de Sonora, Campus
Nainarí desde el día 2 de marzo del 2019
a las 10:30 horas hasta las posteriores 18
horas a partir de la hora de inicio,
llevando un conteo de levaduras cada 2
horas por medio de la cámara de
Neubauer y del espectrofotómetro UV-
VIS.
Diluciones.
Para obtener un cultivo puro de levaduras
bacterias y hongos se siguió la NOM-110-
SSA1-1994 la cual indica el método
correcto para realizar diluciones. El
objeto de realizar dichas diluciones fue
bajar la carga microbiana. Seguido de
esto, para el conteo total viable de
mesofilos aerobios se trabajó bajo las
normas de la NOM-092-SSA1-1994,
donde se prepararon 6 cajas con 1 mL de
cada una de las diluciones y se le adicionó
a cada una Agar Estándar Métodos
realizando seguidamente movimientos de
8 y repitiendo 8 veces para cada ocasión.
Al solidificar el se llevó a incubar a
35±2°C durante un tiempo de 24-48hrs.
 Ilustración 1: Diagrama para la cuantificación y aislamiento de cultivos puros de microorganismos.
Conteo de mesofilos aerobios.
A las 24h y 48h se realizó un conteo de
UFC en cada una de las cajas con Agar
Estándar Métodos. Tomando en cuenta lo
mencionado por la Norma 092 se tomaron
las cajas con UFC dentro del rango de 25
a 250 UFC/mL.
Identificación de la levadura.
Para la identificación de la levadura
primeramente se buscaron colonias por
encima del medio que presentaran una
textura cremosa y de color blanco, para
confirmar la identificación se realizó una
tinción simple y se observó con objetivo
de 10x, 40x y 100x notándose una
morfología ovoidea.
Resembrar.
La levadura identificada y confirmada se
resembró en un medio con medio con
mayor selectividad para levaduras como
lo indica la NOM-11-SSA1-1994, siendo
este medio el Agar Extracto de Malta,
para así obtener colonias de levaduras
para este estudio.
Curva de crecimiento.
La cepa aislada y confirmada como
levadura fue tomada para ser inoculada
dentro de un tubo que contenía 10mL de
caldo extracto de malta que sirvió para
obtener un cultivo joven antes de
comenzar con la curva de crecimiento y
tener a las levaduras en su mejor
momento. Posteriormente se prepararon 5
tubos con 10mL de caldo extracto de
malta estéril que fueron usados como
blanco al momento de medir la
absorbancia en el espectrofotómetro UV-
VIS. En un matraz Erlenmeyer se
prepararon 250 mL de caldo de extracto
de malta como medio de cultivo
definitivo para las levaduras de donde se
tomaron las muestras para el conteo y
realización de la curva de crecimiento.
Pasadas las 24h, del tubo inoculado se
obtuvo un cultivo joven y apto para este
estudio, por lo tanto se vertió en el caldo
extracto de malta preparado en el matraz
de 250 mL. Fue importante agitar el
matraz correctamente antes de cada
conteo para homogenizar el medio. Para
saber la cantidad promedio de levaduras
por mL se colocó una gota de medio en la
Ilustración 2: Diagrama para la cinética de crecimiento de levaduras.
Tinción de Güstein.
Mediante la tinción de Güstein es posible
observar la viabilidad de las células
mediante un conteo de células teñidas de
color rojo para las no viables y de color
azul para las células viables. En este
trabajo la tinción de Güstein se usó para
cámara de Neubauer y fue vista bajo el
microscopio. Para medir la absorbancia
en el espectrofotómetro UV-VIS se
tomaron 3 mL del mismo medio y se
vertieron en una celda de cuarzo, se hizo
lo mismo con una segunda celda pero con
el caldo extracto de malta estéril (usado
como blanco) y se midió la absorbancia a
620 nm. Este procedimiento fue realizado
cada 2 horas a partir de las 10:30 hrs del
día 2 de marzo del 2019 hasta las
posteriores 18 horas.
observar cualitativamente la viabilidad de
las levaduras. La viabilidad es el
porcentaje de células vivas que existe en
relación al total de células. Su
importancia radica en que nos brinda una
idea de la eficiencia de la levadura en
procesos fermentativos, por lo tanto este
tipo de tinciones para la viabilidad tiene
un gran uso dentro del mundo de la
industria. Para que las levaduras puedan
ser utilizadas dentro de un proceso
biotecnológico debe de tener un
porcentaje de viabilidad comprendido por
lo menos entre un 85% a un 90% (Rojas
Padilla, J. et al 2016). Para la realización
de la tinción de Güstein se preparó 1% de
azul de metileno en agua destilada, 5% de
ácido tánico en agua destilada y 1% de
safranina en agua destilada. Después se
realizó un frotis de la levadura y se le
Ilustración 3: Diagrama para la realización de la tinción de Gustein
Resultados y discusión
La levadura objeto de estudio fue
observada en el microscopio con tinción
simple y tinción de Güstein para
adicionó la solución de azul de metileno
durante 4 minutos, se enjuagó por 30
segundos con agua destilada,
seguidamente se le adiciono ácido tánico
que actúa como mordiente por 2 minutos,
se retiró el ácido enjuagando por 30
segundos con agua destilada, y finalmente
se adicionó la solución de safranina por 1
minuto y se enjuago por 30 segundos con
agua destilada. Después se observó bajo
el microscopio con objetivo de 10x, 40x
y 100x.
caracterizarse como tal, se comparó con
una levadura comercial “tradi-pan”
mediante una tinción en fresco y se
observó una morfología ovoidea y tamaño
muy similar entre sí.
 Ilustración 4: Levadura Ilustración 5: Levadura Ilustración 6: Levadura
comercial "Tradi-pan" cándida (tinción simple). cándida (tincion
(tinción en fresco). Güstein).

Al momento de realizar el conteo total de células de levaduras por medio de la cámara de

Neubauer se tomaron en cuenta los cálculos comprendidos mediante la siguiente relación
matemática:

Donde X(levaduras) es el promedio de 4 0.966 7,750,000

levaduras contado en diagonal los cuatro 6 1.382 32,500,000
cuadros medianos dentro del cuadro 8 1.599 39,400,000
central de la cámara, Y(cuadros) es el 10 1.765 59,600,000
total de cuadros medianos comprendidos 12 1.777 71,325,000
dentro del cuadro central de la cámara y 14 1.81 72,500,000
tiene un valor de 16 cuadros, #(cuadros
cámara) es el total de los cuadros más
pequeños de la cámara dentro del cuadro Se obtuvo un promedio de 36,571,875
células/mL (Gráfica 1) y el resultado
central, siendo estos 400 en total, y el
volumen de la cámara siendo de 0.1 mm3. promedio para la absorbancia fue de
1.21975 nm (Gráfica 2). En ambas
Los resultados de cada conteo se
muestran en la tabla 1. graficas es posible observar que el
crecimiento de levadura no tomó mucho
Tabla 1: Datos del conteo de levaduras. tiempo en comenzar con su fase
Tiempo Absorbancia Células/mL exponencial hablándose así de un cultivo
(620 nm) inicial joven.
0 0.092 750,000
2 0.367 8,750,000
El cálculo para la velocidad de Para calcular el tiempo de duplicación y
crecimiento se realizó tomando los saber cada cuanto tiempo nacería una
valores de células por mililitro presentes nueva levadora se hizo mediante la
en las 8 y 10 horas mediante la ecuación ecuación:
matemática:

Obteniéndose un tiempo de duplicación

De tal forma que se obtuvo una velocidad de 3.35 horas.
especifica de crecimiento de 0.2069 h-1.

Gráfica 1: Curva de crecimiento de la levadura (células/mL)

 Gráfica 2: Curva de crecimiento de la levadura (absorbancia a 620 nm)
Conclusión. Se cumplió con el objetivo
que fue establecer la viabilidad y las fases
de desarrollo de un cultivo puro de
levaduras mediante el uso de la cámara de
Neubauer y el espectrofotómetro, además
de determinar la curva de crecimiento de
la levadura. Este tipo de simulador de
crecimiento tiene una gran importancia
dentro de la microbiología industrial ya
que es necesario saber cómo y en que
medio tratar las levaduras o cualquier
microorganismo para llegar rápidamente a
la fase exponencial y saber el tiempo de
vida del mismo identificando la fase de
muerte.
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