Desarrollo del colesterol colorimétrico

kit de detección con nanofibras de TPU/celulosa

membrana de acetato

Resumen: En este estudio, los autores reportan una simple fabricación de un kit de
nanofibras de poliuretano termoplástico (TPU) para detección de colesterol. El TPU es un
polímero altamente elástico, resistente a los microorganismos, a la abrasión y compatible
con la sangre;lo que lo convierte en una selección natural como matriz de inmovilización
para la enzima colesterol oxidasa (ChOx). La nanofibra era fabricado mediante un
proceso de electrohilado y caracterizado mediante microscopía electrónica de barrido y
transformada por infrarrojos de Fourier. espectroscopia. El ChOx se inmovilizó
covalentemente en la nanofibra de TPU y se encontró visualmente el nivel de
colesterol/concentración utilizando 4-aminoantipirina, un colorante que reacciona con el
H2O2 producido por la oxidación del colesterol por el ChOx y que cambia de color desde
el de amarillo a rojo. Se comparó la eficacia de la nanofibra para actuar como sustrato de
detección con la membrana de acetato de celulosa (CA), una bien documentada matriz de
inmovilización de enzimas. Se optimizó la concentración de enzimas y la cantidad de
colorante utilizando un ensayo espectrofotométrico estándar de ChOx y el mismo se
utilizó en nanofibras de membrana de CA y TPU. El Cox La nanofibra inmovilizada mostró
un buen rango lineal de 2 a 10 mM con un límite de detección inferior de 2 mM y fue
altamente estable. en comparación con la de la membrana de CA. La nanofibra
inmovilizada enzimáticamente fue validada en muestras de suero.

1 Introduction
El colesterol es una biomolécula de esterol sintetizada por las células para mantener
la integridad estructural, la fluidez de las membranas celulares y es también una precursor
de los ácidos biliares, la vitamina D y varias hormonas esteroides [1]. El rango normal de
colesterol es <5. 1 mM y el borde se sitúan entre 5,1 y 6,21 mM[2]. Aunque el colesterol
es requerido para el cuerpo humano diariamente, el nivel más allá de 6. 21mM es
peligroso ya que está asociado con numerosas enfermedades como arteriosclerosis,
enfermedad de las arterias coronarias, trombosis cerebral y hipertensión[3]. Por lo tanto,
un seguimiento continuo del colesterol es necesario para el diagnóstico clínico de las
enfermedades mencionadas. Se han explorado numerosos métodos para determinar la
concentración de colesterol en la sangre. Incluye espectrofotometría [4], cromatografía de
líquidos de alta resolución[5], Colorimetría[6]. y métodos electroquímicos[7]. La
espectrofotometría es fácil de realizar pero implica un gran número de productos
químicos. Los métodos cromatográficos son fiables, selectivos y precisos. porque la
interferencia de otros esteroles está ausente. Sin embargo, su la eficiencia depende de
los procedimientos de extracción y de la de saponificación. Los métodos electroquímicos
tienen un cortocircuito tiempo de respuesta, alta sensibilidad, bajo límite de detección y
buena linealidad pero son muy complejos y tienen problemas de reproducibilidad. Los
métodos colorimétricos son muy prometedores porque no requieren cualquier equipo de
alta precisión como en las otras técnicas. En técnicas no invasivas que emplean
colorimetría no invasiva. sólo tiene la ventaja de ser fácil de detectar, pero también es
rentable. Los sensores colorimétricos desarrollados hasta ahora se basan en
nanomateriales que muestren un efecto de resonancia plasmónica superficial[8] o que
imitan a la peroxidasa de rábano de caballo (HRP)[9, 10].
El desenterramiento del potencial de los nanomateriales para actuar como imitadores de
enzimas.con Fe3O4 nanopartículas, que abrieron un nuevo campo de investigación
para nanopartículas[11]. De manera similar, las nanopartículas CO3O4 mostró
propiedades catalíticas de una enzima HRP para la detección de de glucosa[12]. Varios
nanomateriales basados en el carbono han sido explorados, incluyendo el óxido de
grafeno[13], los nanotubos de carbono[14], puntos de grafeno[15] y puntos de carbono[16]
por su actividad catalítica en la detección de H2O2. Sin embargo, sufrían de una falta de
sensibilidad, mala actividad catalítica, baja especificidad en comparación con la métodos
basados en enzimas y complejos de sintetizar. [17]. Debido a los inconvenientes de la
detección de corriente son sencillos, fiables y económicos es necesario desarrollar un
método eficaz. La alta relación superficie/volumen del electrospun nanofibras lo convierte
en un material prometedor para la fabricación de sensores. Estas nanofibras han sido
exploradas en gran medida debido a su facilidad de incorporación de agentes activos y
flexibilidad[18]. El poliuretano termoplástico (TPU) se utiliza en la medicina por sus
buenas propiedades compatibilidad con la sangre[19]. Posee una gama de atractivos
propiedades como flexibilidad, resistencia a los microorganismos, abrasión, buena
estabilidad hidrolítica y puede ser fácilmente electrospun[20]; así, haciendo del TPU una
selección natural como matriz de inmovilización para colesterol oxidasa (ChOx) en la
detección colorimétrica de colesterol. Por otra parte, la membrana de acetato de celulosa
(CA), se utiliza como matriz de inmovilización enzimática para la detección de glucosa
[21]. Es de naturaleza hidrofílica y la estabilidad de las oxidasas alcohólicas. en la
membrana de la CA también es reportada anteriormente por Murtinho et al.[22].

Hasta donde sabemos, los kits de detección colorimétrica basados en en membranas y

nanofibras. El potencial de este método para ser utilizado por simple observación radica
en la relación directa entre la concentración de colesterol y el tono de color. Aquí el
trabajo actual propone el uso de Membrana de TPU de nanofibras/acetato de celulosa
como sustratos para inmovilización y proporciona una rueda de color para la creciente de
colesterol, que podría utilizarse como una banda o tira para determinar el colesterol del
suero sanguíneo.

2 Experimental
2.1 Materials

Fosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4) (Merck, ⩾98%), fosfato de hidrógeno

dipotásico (K2HPO4) (Merck, ⩾98%),colesterol (Sigma Aldrich), ChOx (Sigma Aldrich, 17
U/mg), HRP (Sigma Aldrich, 150 U/mg), 4-aminiantipirina (Sigma Aldrich, ⩾98%), fenol
(LobaChemie, ⩾99. 5%), EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-hidrocloruro de
carbodiimida) (HiMedia, ⩾99%), N-hidroxisuccinimida (NHS) (Fluka, ⩾97%), TPU
(Covestro, grado Texin 945U), dimetilformamida (Merck,⩾99%), membrana CA
(WhatmanTM No 1, GE Healthcare UK Ltd. )
0,45 µm, 110 mm) se compraron y se utilizaron tal como se recibieron. Todos los
se prepararon con agua Millipore

. 2. 2 Preparación de la nanofibra de TPU

La nanofibra de TPU se preparó mediante un proceso de electrohilado. En resumen, la
solución de polímero se preparó disolviendo 1,5 g de TPU en 10 ml de N-
dimetilformamida seguido de un calentamiento a 60°C en una placa caliente con agitación
vigorosa. El polímero preparado la solución fue electrospun (Unidad Indígena de
Electrospinning), PSGIAS, India) sobre una placa de aluminio. Las nanofibras fueron
electrospun a 20 kV en una distancia de trabajo de 15 cm con jeringa (calibre 21) a un
caudal de 0,2 ml/h. La hora de recogida se mantuvo como 2 h[23]

2. 3 Caracterización de las nanofibras de TPU

Las nanofibras electrospun fueron sometidas a un examen morfológico. caracterización
usando SEM (ZEISS EVO 18) con LaB6 como la fuente de electrones y las imágenes
fueron capturadas a un ritmo acelerado. tensión de 10 kV. El infrarrojo por transformada
de Fourier (FTIR) se llevó a cabo un análisis espectroscópico para determinar la función
en la nanofibra utilizando Schimadzu, IR Affinity, donde la se registró utilizando el modo
ATR equipado con cristal ZnSe

2. 4 Ensayo de ChOx
El protocolo para el ensayo de ChOx fue adoptado de la anterior. y se redujo a una
reacción de microlitros[24]. El parámetros como la concentración de la enzima, una
concentración de 4- aminoantipirina (4-AAP) y el tiempo de incubación fueron optimizado
en el método espectrofotométrico. El procedimiento, en breve,, consiste en la preparación
de una mezcla de reacción de 200 µl con solución salina tampón fosfato 0,1M, 5 mM
colesterol, 150 U/ml HRP, 1. 76% AAP y 6% fenol. A la mezcla 8 µl de Se agregó la
enzima ChOx. Las soluciones fueron mezcladas e incubadas a 37°C durante 5 min. Luego
la absorbancia fue registrada en 500 nm. El experimento se realizó en triplicados

2. 5 Prueba de colesterol
La concentración optimizada del colorante, de la enzima y el tiempo de incubación se
utilizaron para realizar el ensayo estándar de colesterol donde la concentración de
colesterol variaba de 2 a 10 mM. El mismo ensayo se repitió con suero con picos de
colesterol muestras. Todos los experimentos se hicieron en triplicados.

2. 6 Inmovilización de ChOx en nanofibras de membrana de CA/TPU

La nanofibra de membrana de CA/TPU fue cortada en piezas con dimensiones 1 cm ×
1cm aproximadamente. 15 µl de 0,2 M EDC y 0,05 M NHS en la proporción 3:4 se añadió
a la nanofibra de membrana de CA/TPU y dejar secar a temperatura ambiente. Luego se
agregaron 8 µl de ChOx a la membrana de CA, incubada a temperatura ambiente durante
2 h y conservado durante la noche a 4°C[25].

2. 7 Ensayo de colesterol en nanofibras de membrana de CA/TPU

A la membrana de CA inmovilizada de ChOx, 25 µl de la reacción mezcla que contiene
una concentración creciente de colesterol (2-10 mM) y el cambio en la intensidad del color
fue observado después de 1 hora de incubación. El mismo procedimiento se repitió
con muestras de suero con colesterol (2-10 mM).

2. 8 Ensayos de reproducibilidad para nanofibras de TPU inmovilizadas

Las nanofibras de membrana de CA inmovilizada de ChOx/TPU fueron verificado para su
estabilidad hasta 7 días con 10 mM colesterol spiking muestras de suero.

3 Results y discusión

3. 1 Caracterización morfológica de las nanofibras

La nanofibra de TPU producida por electrohilado se estudió utilizando microscopía
electrónica de barrido (SEM). La Fig. 1a muestra claramente el formación de nanofibras
de TPU. Las nanofibras eran lisas y continuo con un diámetro medio de 298,7 nm y la
fibra- El rango de diámetro estaba entre 149. 39 y 413. 16 nm. La Fig. 1b muestra el
diagrama de EDS confirma además que la fibra electrospun es poliuretano. El espectro
FTIR del TPU (Fig. 2) mostró picos característicos en 1688 y 3330 cm-1, que refleja la
vibración de estiramiento esencial de los grupos carbonilo y aminoácidos en TPU. El pico
en 2930 cm-1 se atribuye a la asimetría estiramiento de los grupos CH. Los resultados
obtenidos fueron acuerdo con otras publicaciones[26]

3. 2 Ensayo de ChOx
Este ensayo es un método indirecto para cuantificar el colesterol. El 3-OH grupo de
colesterol se oxida en presencia de la enzima ChOx a forma cholest-4-en-3-one y H2O2.
El H2O2 producido es medido cuantitativamente en una peroxidasa catalizada
colorimétrica reacción donde H2O2 parejas con 4-AAP y fenol para producir un color rojo
Colorante de 4-quinoneimina como se muestra en la Fig. 3. El tinte intensidad medida
espectrofotométricamente da el colesterol concentración[24]. Investigar la influencia de los
colorantes y enzimas en el desarrollo de color, dos variaciones de 4-AAP (8, 12 µl) fueron
probado con concentraciones crecientes de enzimas (0. 2-1 U/ml). Se logró un perfil de
absorbancia cada vez mayor para aumentar concentración de enzimas en ambas
variaciones del colorante. Comparar los espectrofotométricas de 8 y 12 µl AAP, es
evidente que el aumento de la concentración de 4-AAP a 12 µl no mostró mucho aumento
significativo de la intensidad del color y también 8 µl de 4-AAP dio un gráfico lineal de la
intensidad del color después de 1 h de la incubación. Por lo tanto 8 µl de 4-AAP fue
tomada como una concentración optimizada. Desde Figs. 4 y 5, también está claro que
0,6 U/ml de enzima producida una intensidad de color considerable en comparación con
otros colores en la atmósfera. Actualmente, se encuentra disponible el ensayo
colorimétrico de colesterol
Emplean de Kits 0,2 U por ensayo para detectar el colesterol[27-29]. En el método
propuesto, 8 µl de solución de 0,6 U/ml que contiene 0,024 U de enzima ChOx, que es
casi diez veces menor que la cantidad de enzimas que se utiliza en los kits comerciales
de análisis de colesterol. La Fig. 6 muestra un diagrama de calibración estándar para el
espectrofotómetro. detección del colesterol mediante el protocolo optimizado. Un
colesterol con los parámetros optimizados se realizó con muestras de suero con picos de
colesterol para estudiar la influencia del suero interferencia en el ensayo. De la Fig. 7, se
observa que con la aumento de la concentración, la absorbancia aumenta. Aumentando el
tiempo de incubación, la absorbancia aumenta pero el perfil sigue siendo el mismo. Como
resultado, dependiendo del color observable cambio, 1 h del tiempo de incubación fue
fijado.

3. 3 Inmovilización de ChOx en la membrana de CA/; TPUnanofibra

El EDC es un reticulante que reacciona con el grupo carboxilo para formar un
O-acylisourea intermedia. Este intermediario en contacto con un grupo amino,
rápidamente forma un enlace amídico y libera un subproducto de la isourea. El intermedio
de O-acylisourea es inestable en soluciones acuosas y se hidroliza fácilmente si no
reacciona con una amina. Para evitar la hidrólisis, el producto intermedio es estabilizado
por el uso de NHS, que forma un éster de NHS que es estable y puede reaccionar con un
grupo de aminas. El NHS se estabilizó amina forma un enlace amídico con el primario.
NH2 presente en la enzima ChOx. El NHS como tal no es participa en la reacción de
reticulación pero actúa como estabilizador y también aumenta la eficiencia del
acoplamiento enzimático.

3. 4 Ensayo de colesterol en nanofibras de membrana de CA/TPU

La determinación del colesterol se hizo como se muestra en la Fig. 3. Cuando mezcla de
reacción que contiene diferentes concentraciones de colesterol se añadió a la membrana
de CA inmovilizada ChOx/TPU nanofibra, se produce la reacción (según la reacción 1
declarada anterior) formando un tinte de quinoneimina de color rojo que es observados
visualmente. La Fig. 8 muestra el cambio en la intensidad del color con el aumento de las
concentraciones de colesterol. Ambos sustratos mostró un aumento de la intensidad con
la concentración de colesterol. TPU nanofibra, en particular, mostró una mejor intensidad
porque la es un fenómeno de superficie, mientras que en la membrana de CA el los
agentes activos fueron absorbidos en la membrana debido a su hidrofilicidad produciendo
menos intensidad de color. La Fig. 9 muestra claramente que la intensidad del color está
más en muestras de suero que un colesterol estándar debido al hecho de que El suero en
sí contiene un 30% de colesterol en forma libre. Este suero el colesterol junto con el
colesterol añadido produce una mayor intensidad del color, tal como se ha observado en
los métodos espectrofotométricos anteriores. De la Fig. 9 también se desprende que la
nanofibra es capaz de producir mejores resultados que la membrana de CA similar al
colesterol estándar ensayo. Esto afirma además que la nanofibra es un material superior.
matriz de inmovilización y puede producir un cambio de color mejorado que puede ser
fácilmente visualizado. La nanofibra fue capaz de mostrar una rango lineal de 2 a 10 mM
con un límite de detección de 2 mM que era comparable con otros biosensores
colorimétricos, como se muestra a continuación en la Tabla 1.
3. 5 Estudio sobre el agente interferente
Estudiar el rendimiento de la membrana CA inmovilizada ChOx y nanofibras de TPU en
presencia de agentes interferentes, para el análisis se utilizaron muestras de suero con
picos de colesterol. El los posibles agentes que interfieren en este método de detección
son bioquímicos componentes en la sangre como ascorbato, ácido úrico, bilirrubina, y
triglicéridos según lo reportado por muchos kits de colesterol[27, 40]. El muestra de suero
real que contiene la sustancia interferente antes mencionada para comparar con una
solución estándar de colesterol. La Tabla 2 muestra los niveles normales de los agentes
que interfieren en el suero. y los niveles aceptables en el kit de detección de colesterol
total.

3. 6 Estudios de reproducibilidad
La membrana de CA inmovilizada ChOx y las nanofibras de TPU almacenadas a 4°C se
probó su reproducibilidad con una solución de 10 mM durante 7 días. La membrana de
CA retuvo su actividad sólo durante 3 días, Considerando que la nanofibra de TPU era
capaz de producir un color repetible hasta 7 días. La actividad de la enzima comenzó a
reducirse con una reducción de intensidad del color en el almacenamiento posterior hasta
10 días. Más allá de 10 días la actividad se perdió por completo. De esta reproducibilidad
resultados obtenidos, las nanofibras de TPU presentan una mejor inmovilización que la
membrana de CA. Esto se atribuye al aumento de la la relación superficie/volumen, lo que
permitió que la fibra tuviera una mayor capacidad de carga. aumentando así la actividad
del ChOx inmovilizado. Nanofibras de TPU hacia el colesterol durante un período
prolongado. En caso de la membrana de CA, la capacidad de unión de la proteína es muy
baja, ya que reportado por muchos tipos de literatura[41, 42]. Esto filtra la enzima en lugar
de anclarla a su superficie y, por lo tanto, la pérdida de
actividad.
4 Conclusion
En resumen, el ensayo de ChOx fue optimizado para 4-AAP, ChOx concentraciones y
tiempo de incubación utilizando un espectrofotómetro método de detección del colesterol.
La enzima ChOx estaba covalentemente inmovilizado sobre la membrana CA y nanofibras
de TPU electrospun utilizando la técnica EDC/NHS. El ensayo de ChOx optimizado fue
en ambos sustratos. Observamos que el ChOx la nanofibra de TPU inmovilizado produjo
una mejor intensidad de color en detectando colesterol que el de la membrana de CA.
Además, La nanofibra de TPU fue capaz de mantener la actividad de ChOx mejor que
Membrana de CA. Esto indica el uso potencial de ChOx nanofibra de TPU inmovilizado
como kit de diagnóstico para la detección del colesterol en el suero sanguíneo que es una
técnica fácil en comparación con los métodos comunicados anteriormente.
5 Acknowledgments
A los autores les gusta expresar su profunda gratitud al PSG Institute del Instituto de
Estudios Avanzados y del PSG College of Technology por el apoyo para llevar a cabo
este trabajo. Los autores también agradecen a la Comisión de Becas Universitarias
(UGC), Nueva Delhi, por el suministro de los fondos para llevar a cabo este proyecto en el
marco de la subvención principal de UGC no. 42-907/2013(SR).