Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

PRÁCTICA N° 9.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

INTRODUCCIÓN

El recuento de microorganismos tiene gran importancia en la evaluación de la calidad

sanitaria de alimentos; según la FAO todo alimento inicia su proceso de
descomposición desde el momento en que es concebido como tal, por ello es de gran
importancia la adecuada conservación y manipulación del mismo con la finalidad de
evitar ETAS (enfermedades de transmisión alimentaria).
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos deben
de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una
sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y deben ser capaces de
desarrollarse extraintestinalmente.

El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente

intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y
casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera
del intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza
como indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose que mientras mayor
sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una
contaminación reciente.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces

de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C.
Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo, la más prominente es
Escherichia coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y
diferenciales.

COMPETENCIAS

 Conocerá y aplicará las técnicas para el recuento de microorganismos en

alimentos.
 Evaluará la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la
búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia
coli.

RECOMENDACIONES

 Mantener las medidas de Bioseguridad para evitar accidentes biológico-laborales,

utilizando equipos de protección personal y evitar la exposición directa a
radiaciones ionizantes.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

 Mantener las medidas de Esterilidad para evitar la contaminación de las muestras

a analizar.

MATERIALES

 Muestras de alimentos y agua de consumo humano.

 Tubos de ensayo de 15 x 150 ml.
 Solución salina fisiológica estéril (SSF).
 Caldo peptonado.
 Agar Plate count, licuado y enfriado a 45 – 50 °C.
 Caldo BRILLA (Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante) en tubos con
campana de Durham.
 Incubadora.
 Pipetas Pasteur estériles.
 Placas Petri estériles.
 Contador de Colonias digital.
 Tablas estandarizadas para NMP.

PROCEDIMIENTOS

A. Numeración de Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables

a. Preparación de diluciones seriadas

1. Enumerar 6 tubos de dilución (15 x150) del 1 al 6.

2. Frente a fuego de mechero agregar a cada uno de ellos 9 ml de SSF estéril.
3. Con la ayuda de una pipeta estéril tomar 1 ml de la muestra y transferirla al
tubo n°1. Mezclar cuidadosamente con la SSF aspirando varias veces con
la pipeta, obteniendo de esta manera una dilución 1/10 (10-1).
4. Con la ayuda de una nueva pipeta estéril tomar 1 ml de la primera dilución
transferirla al tubo n°2. Mezclar cuidadosamente con la SSF aspirando
varias veces con la pipeta, obteniendo de esta manera una dilución 1/100
(10-2).
5. Repetir la misma operación hasta obtener una dilución 1/1000000 (10 -6).

b. Siembra por técnica de la Placa vertida.

1. Con una pipeta estéril obtener alícuotas de 1 ml a partir de la dilución 1/1000

(10-3) hasta la dilución 10-6 y depositar en placas por duplicado para cada
dilución.
2. Agregar 15 – 20 ml de agar Plate Count previamente diluido y enfriado a 50°C
a cada una de las placas conteniendo el inóculo.
3. Mezclar por movimientos horario, antihorario y de vaivén para distribuir
uniformemente el inóculo.
4. Dejar solidificar el medio en la placa de Petri.
5. Llevar a incubación a 37°C por 24 – 48 horas.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Muestra

9 ml
SSF
estéril

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

c. Lectura e Interpretación.

1. Para el recuento se seleccionarán 2 placas correspondientes a cada

dilución que contengan un recuento de entre 30 y 300 colonias.
2. Obtener el promedio de ambas placas y multiplicar posteriormente por el
factor de dilución al cual corresponden las placas leídas.
3. Finalmente, el resultado obtenido del conteo, se reportará como número de
microorganismos aerobios mesófilos por mL ó UFC/ml de muestra (para el
caso de muestras líquidas) ó UFC/gr de muestra para el caso de muestras
sólidas.

B. Numeración de Bacterias Coliformes (Colimetría)- Método del NMP (número

más probable).

a. Preparación de diluciones seriadas

1. Enumerar 3 tubos de dilución (15 x150) del 1 al 3.

2. Frente a fuego de mechero agregar a cada uno de ellos 9 ml de caldo
peptonado estéril.
3. Con la ayuda de una pipeta estéril tomar 1 ml de la muestra y transferirla al
tubo n°1. Mezclar cuidadosamente con el caldo peptonado aspirando varias
veces con la pipeta, obteniendo de esta manera una dilución 1/10 (10 -1).
4. Con la ayuda de una pipeta nueva tomar 1 ml del tubo de dilución n° 1 y
transferir al tubo n°2. Mezclar cuidadosamente con el caldo peptonado
aspirando varias veces con la pipeta, obteniendo de esta manera una
dilución 1/100 (10-2).
5. Repetir la misma operación hasta obtener una dilución 1/1000 (10-3).

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

b. Siembra en tubos de fermentación

1. Con una pipeta estéril obtener alícuotas de 1 ml a partir de la dilución 1/10

(10-1) y depositar en tubos de fermentación con caldo Brilla y campana de
Durham, por triplicado para cada dilución (series de 3 tubos).
2. Repetir la misma operación para cada dilución.
3. Llevar los tubos de fermentación con campana de Durham a incubación a
T° de 37°C por 24 – 48 horas.

1ml 1ml 1ml

Muestra

9 ml
Caldo
Peptonado

10-1 10-2 10-3

1ml 1ml 1ml

c. Lectura e interpretación

1. Después de 24 horas de incubación se observan y se anotan los tubos de

cada serie que tengan producción de gas (burbujas o elevación de la
campana de Durham).
2. Los tubos que no presenten producción de gas continuaran en incubación
por 24 horas más.
3. Para obtener la lectura del NMP (número más probable), se procede a
anotar los tubos de cada serie en los cuales se observe producción de gas
y luego se lleva los resultados a la tabla de NMP, para hallar la
equivalencia.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

Tabla para recuento de coliformes por NMP

CUESTIONARIO

1. Esquematice lo realizado en práctica.

2. Reporte e interprete los resultados obtenidos para el recuento de mesófilos
viables y Número Más Probable de la muestra trabajada.
3. ¿Qué serotipos de E. coli son los principales causantes de Infecciones
gastrointestinales?
4. ¿Qué importancia tiene la vigilancia de Staphylococcus aureus en los
alimentos?
5. ¿Que especies de microorganismo son los más frecuentes como agente causal
de ETAS (enfermedades de transmisión alimentaria)?.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal