INFORME PRACTICA 7
Producción de alginato a partir de Azotobacter vinelandii en medio sumergido a nivel matraz
Angela Zaramaa; Meliza Lopezb
a Facultad de Ingeniería; Programa de Ingeniería Química; Laboratorio de Bioquímica
b Facultad de Ingeniería; Programa de Ingeniería Química; Laboratorio de Bioquímica
INTRODUCCIÓN:
La azotobacter vinelandii comprende al
género de bacterias Gram- negativas, las
cuales poseen un capa interna de
peptidoglicano con ácido murámico y
mureína además de una membrana externa,
lo cual hace que presenten una pared celular
compleja. es una bacteria poliploide es decir
que posee un fenómeno genético originario
en la célula que permite que posea varias
copias de su cromosoma (Díaz barrera A,
2007). las capacidades metabólicas y
genéticas han sido fuentes de estudio,
principalmente por la capacidad de producir
alginato, el cual es un polisacárido usado
industrialmente para varios propósitos como
estabilizante, agente gelificante y
emulsificante (Silva P, 2014).producción que
ha de verse afectada cuando se varían
factores como la velocidad específica de
crecimiento y de transferencia de oxígeno.
la síntesis de alginato es posible pues la
azotobacter vinelandii es capaz a partir de
fructosa 6-p conjunto con una serie de
conversiones que permiten llegar a la
formación de ácido poli manurónico el cual
en el periplasma sus residuos son acetilados,
dicho polímero es llevado fuera del espacio
celular donde se son polimerizados a
residuos guluronicos por las epimerasas
extracelulares.
METODOLOGÍA PRACTICA 7
Primero se activó la cepa de Azotobacter
vinelandii ATCC® 12518 en medio Ashby
suplementado con agar y se incubó durante 48
horas a 30°C. La fermentación se realizó en un
erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio de
cultivo. La composición de dicho medio por litro
de agua desionizada fue: glucosa 40 g;
extracto de levadura 3.0 g; MgSO4.7H2O, 0.4
g; NaCl, 0.4 g; KH2PO4, 0.16 g; K2HPO4, 0,64
g; CaCl2.2H2O, 84 mg; NaMoO4.2H2O, 2 mg;
FeSO4.7H2O, 6 mg; H3BO4, 2.9 mg; CoCl2, 1.2
mg; CuSO4.5H2O, 0.1 mg; MnCl2. 4H2O, 0.09
mg; ZnSO4. 7H2O, 1.2 mg.
Para preparar 10 erlenmeyers de 100 ml de
medio de cultivo se hizo lo siguiente:
Se Preparó inicialmente 100 ml de una
solución de glucosa 40% p/v. Cuando se tuvo
disuelta la glucosa se aforó a 100 ml. En tubos
tapa rosca dispensamos 10 ml de esta solución
de glucosa.
Se preparó 50 ml de una solución de
microelementos 10X, esto pesando
CaCl2.2H2O, 84 mg; NaMoO4.2H2O, 2 mg;
FeSO4.7H2O, 6 mg; H3BO4, 2.9 mg; CoCl2, 1.2
mg; CuSO4.5H2O, 0.1 mg; MnCl2. 4H2O, 0.09
mg; ZnSO4. 7H2O, 1.2 mg. Se disolvió
inicialmente en 30 ml de agua destilada y luego
se aforó a 50 ml. En tubos tapa rosca
dispensamos 5 ml de esta solución de
microelementos.
Se preparó por separado las 10 soluciones de
macroelementos y fuente de nitrógeno (85 ml
cada una), la cual se obtuvo pesando para
cada solución: extracto de levadura 0.3 g;
MgSO4.7H2O, 0.04 g; NaCl, 0.04 g; KH2PO4,
0.016 g; K2HPO4, 0,064 g; disolviendo en 75 ml
de agua destilada, ajustando el pH a 7.2 con
NaOH o HCl entre 0.2 M y 1 M y aforando a 85
ml.
Se tomó 9.25 ml de cada solución de
macroelementos y se los adicionamos a la
misma cantidad de erlenmeyers de 25 ml.Se
esterilizó a 121°C durante 15 minutos todas las
soluciones preparadas.
Luego de la esterilización y al lado del mechero
manos limpias, micropipeta limpia y puntas
estériles adicionar 0.5 ml de la solución de
glucosa y 0.25 ml de la solución de
microelementos al erlenmeyer de 20 ml que
contiene los 9.25 ml de la solución de
macroelementos.
Se tomó con el asa microbiológica dos
porciones de bacterias crecidas en el medio
Ashby y resuspendidos en los 10 ml de medio
de cultivo presentes en el erlenmeyer, e
incubar durante 36-48 h a 30°C y 200 rpm.
Pasado ese tiempo, se mezcló los restantes
9.5 ml de glucosa y 4.75 ml de solución de
microelementos con la solución de
macroelementos presente en el erlenmeyer de
500 ml; y adicionamos también al erlenmeyer
de 500 ml para iniciar la fermentación lo
previamente crecido de la bacteria en el
Erlenmeyer de 20 ml. Se incubó durante 48 h
a 30°C y 200 rpm. Pasado ese tiempo
almacenamos en frio a 4 °C.
Ultima practica:
Se tomó 10 ml del caldo de cultivo y centrifugar
a 4000 rpm durante 10 minutos, a los 90 ml de
caldo de cultivo restante se le adicionaron 4 ml
de Na-EDTA, 0.5 M y 2 ml de NaCl 5 M, y se
agitó por 5 minutos de forma continua.
Al sobrenadante de esos 10 ml inicialmente
centrifugados se le determió azúcares
reductores por el método DNS y concentración
de proteína por él método de Biuret, lo cual se
hizo con medio de cultivo sin inocular y tuvimos
blancos para medición.
Se centrifugó 50 ml a 4000 rpm durante 30
minutos y se tomó 10 ml de dicho
sobrenadante y los enfriamos durante 20
minutos. A los 40 ml de sobrenadante restante
se le determinó la viscosidad, empleando el
viscosímetro Brookfield RVDVI+.
Al pellet de la centrifugación de 50 ml, se
resuspendió en 10 ml de agua destilada estéril
y centrifugó de nuevo en tubo de 15 ml
previamente pesado, así dos veces a 4000 rpm
durante 10 minutos, botando siempre el
sobrenadante. Por último retiramos el
sobrenadante y dejamos secando en horno a
80°C durante 48 horas.
Al sobrenadante previamente enfriado, se le
adicionó 30 ml de isopropanol frio y centrifugó
a 4000 rpm durante 30 minutos. Desechamos
el sobrenadante y adicionamos 3 ml de agua.
Transferimos a un tubo de centrifuga
previamente pesado de 15 ml y adicionar de 9
ml de isopropanol frio. Centrifugamos de nuevo
a 4000 rpm durante 30 minutos. Por último se
retiró el sobrenadante y se dejó secando en
horno a 80°C durante 48 horas.
Con los datos de peso seco de biomasa, peso 6 10 0,342
seco de alginato, concentración de glucosa y
concentración de proteína se determinó los
rendimientos Yx/s, Yx/N, Yp/s, Yp/N.
Gráfica 1. Curva de calibración de
concentración contra absorbancia.

RESULTADOS

Determinación de proteínas

para este paso se utilizó el método biuret el

cual es un método colorimétrico basado en
la formación de un complejo coloreado entre
Cu 2+ y los grupos NH4 de los enlaces
peptídicos en donde el color se lee a 540 nm,
par dicho propósito se utilizará la gráfica
patrón realizada en la práctica “Proteínas:
Extracción, cuantificación y análisis de las
proteínas de la leche”: a partir de la ecuación de la recta se obtiene
:

x=(y-0.0008)/0.0339
Tabla n 1 Datos curva de calibración
determinacion de proteinas metodo Biuret
tabla N2 resultados de determinacion de
muestra [muestra Absorbancia
proteinas
mg/ml]
muestra ABS(595 concentración
blanco 0 0
nm) mg/ml

1 0,5 0,015

2 1 0,043 1 0,262 1,9536

3 2,5 0,084 para la determinación de azúcares

reductores al igual que en la de proteínas se
4 5 0,164 utiliza el método colorimétrico de DNS para
lo cual se utilizó la curva de la práctica
“produccion de etanol a partir de
5 7,5 0,257
Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en
alginato de calcio”:
tabla 3 sustrato en fermentación (azúcares
reductores)
líquido a fluir. dicha fue medida mediante la
viscosidad dinámica en cP (centipoise) l cual
depende de presión y temperatura, cabe
aclarar que es tomada como referencia el
agua a 20ºC que posee una viscosidad de
1.002 cP. (Helbing Burkart, 1985), con lo cual
se observa que la muestra posee más
resistencia que se opone al deslizamiento
mutuo de dos capas líquidas adyacentes.

Gráfica 2 absorbancia respecto a

concentración de azúcares reductores
a partir de la ecuación de la recta se
obtiene que el número de azúcares
reductores es igual a :
DETERMINACIÓN DE RENDIMIENTOS

A partir de los resultados obtenidos durante

Tabla 4 Determinación de azúcares la práctica, puestos en la siguiente tabla,
reductores en muestra determinamos los correspondientes
rendimientos que posteriormente fueron
muestra ABS(595 concentración comparados con la literatura.
nm) mg/ml

1 0,517 1,21323
Datos recolectados en la práctica para
determinar rendimientos
viscosidad

Tabla 5. Datos viscosímetro

Tubo de falcón 1 9.5472 g
viscosidad cp 1.35

Tubo de falcón 2 11.0152g

la viscosidad es un propiedad especial de os
líquidos la cual describe la resistencia del

Peso de alginato 0.0983 g
seco
Peso de biomasa 0.0035 g
seca
Concentración 0.2035 mg/mL.
glucosa
Concentración 1.7315 mg/mL.
proteína
- Rendimiento de sustrato en biomasa
(Yx/s)
para la determinación de este primer
rendimiento se debe calcular la cantidad de
sustrato consumido, esto se hizo de la
siguiente forma, teniendo en cuenta la
cantidad de biomasa y el volumen:
una vez calculado la cantidad de sustrato que
hace referencia a los gramos de C
consumido, ya se pudo determinar el
rendimiento.
comparando este rendimiento obtenido de
0,17199, con el encontrado en la literatura
“Cultivos continuos de Azotobacter vinelandii
ATCC 9046” de de 0,15, se puede analizar
que se tiene un margen de error mínimo
(Díaz; 2014). Sin embargo en otra fuente, se
encontró un rendimiento del 0.8443
notándose el incremento proporcional entre
biomasa y la producción de alginato
obteniendo, esto se afirma cuando hacen una
segunda fermentación donde cambian el
medio de sacarosa por glucosa.(Martínez;
2009)
- Rendimiento de producto
(alginato) formado sobre sustrato
consumido (Yp/s)
Comparando este rendimiento obtenido
con el de la literatura con un valor de 0,63
se puede evidenciar como los valores
difieren considerablemente (Díaz; 2014).
- Biomasa producida sobre
nitrógeno consumido (Yx/N
primero fue calculada la cantidada de
nitrógeno teniendo en cuenta un volumen
de 50 ml.
Teniendo este dato se determinó el
rendimiento de la siguiente forma:
- Producto formado sobre
wnitrógeno consumido (Yp/N).
Se efectuó el cálculo de igual forma que
en el rendimiento anterior.
A partir de los resultados anteriores
obtenidos en el laboratorio se puede
afirmar que Azotobacter vinelandii ATCC®
12518 es una bacteria con la cual se puede
obtener un buen rendimiento de en la
producción de alginato cuando se usa glucosa CONDITIONS ON ITS
como fuente de carbono. BIOSYNTHESIS.
Conclusiones

● Se determinaron los rendimientos

Yx/s, Yx/N, Yp/s, Yp/N con los datos
de peso seco de biomasa, peso seco
de alginato, concentración de glucosa
y concentración de proteína.
● El uso de glucosa en el medio
favorece notablemente la producción
de alginato, en comparación con la
sacarosa.
Referencias
Arias, Miguel Á; Rodríguez, E; Hernández,
Dulce J ; Alarcón, J; García, José L.(2009).
PRODUCCIÓN DE UN BIOFERTILIZANTE Y
OBTENCIÓN DEALGINATO COMO
METABOLITO SECUNDARIO A PARTIR DE
Azotobacter vinelandii

Díaz-Barrera A, Peña C, Galindo E (2007) The

oxygen transfer rate influences the
molecular mass of the alginate produced by
Azotobacter vinelandii. Appl. Microbiol
Biotechnol 76 (4): 903-910.

Alvaro Díaz, Roxana Ávalos y Paulina

Silva.(2014)). PRODUCCIÓN DE ALGINATO
POR Azotobacter vinelandii EN CULTIVO
CONTINUO A DIFERENTES CONDICIONES DE
TRANSFERENCIA DE OXÍGENO. congreso
nacional de biotecnologia y bioingenieria

Helbing, W., & Burkart, A.

(1985). Química. Tablas
para laboratorio e
industria. En W. Helbing,
& A. Burkart, Química.
Tablas para laboratorio e
industria (pág. 246).
Barcelona: Editorial
Reverté SA.

Díaz- Barrera, A(2014)

CONTINUOUS PRODUCTION
OF BACTERIAL ALGINATE:
UNDERSTANDING THE ROLE
OF OXYGEN SUPPLY