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UNIVERSIDAD EL BOSQUE

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
PROFESORA SUSANA LARA

Extracción de proteínas y determinación de la actividad enzimática de Pinca mayor y


Festuca spp.
Ardila-Higuera, Juliana ; Garnica-Henao, Gabriela

RESUMEN

Las enzimas son proteínas que tienen poder catalítico para degradar un sustrato determinado y
convertirlo en producto, y actúan bajo determinadas características de actividad enzimática;
por esto, la práctica de laboratorio se dividió en dos partes: la primera consistió en la extracción
de proteínas y la segunda en la determinación de la actividad enzimáticas de estas. Para la
primera parte, se utilizaron dos muestras vegetales ( Festuca spp y Pinca mayor), estas se
lavaron y se pesó 0,5 g de cada una, posteriormente se colocaron cada una en un mortero, y se
maceraron con cuidado, después se les agregó a cada una un buffer y estas mezclas se
trasladaron a un tubo Falcon, se llevaron a la nevera y finalmente, se centrifugaron durante 35
min, al finalizar el centrifuge se extrajo el sobrenadante de cada mezcla y se puso en un
eppendorf para guardarlas en el congelador. En esta parte se obtuvo como resultado dos
eppendorf con las muestras vegetales que se utilizaron en la segunda parte del laboratorio. La
primera parte del laboratorio se realizó con el fin de familiarizarnos con algunos metodos de
extraccion de proteinas. Para la segunda parte del laboratorio se hizo una mezcla con guayacol,
peróxido de hidrógeno y tampón fosfato, se dejó en un vaso de precipitado recubierto con
aluminio, luego se procedió a llevar las muestras generadas en la primera parte del laboratorio
junto con la del vaso de precipitado al espectrofotómetro, allí se hizo lectura de la absorbancia
durante 1 min en intervalos de 10 segundos. Estos resultados se vieron reflejados con un cambio
de coloración naranja que representa la actividad enzimática, que posteriormente se va a ver
reflejada por medio una gráfica extraída con los datos obtenidos por el espectrofotómetro.
Esta parte del laboratorio se hizo con el fin de identificar la presencia y función de las enzimas
de cada una de las muestras obtenidas.
Palabras clave: Actividad enzimática , Centrifugado, Enzima, Espectrofotómetro,
Precipitado

INTRODUCCIÓN eficaces para catalizar una gran diversidad


de reacciones químicas, ya que tienen la
Las enzimas son catalizadores de sistemas
capacidad de unirse a un gran número de
biológicos, intervienen en la
moléculas. La catálisis de las reacciones
transformación de una energía a otra. Se
tiene lugar en el centro activo de la enzima,
caracterizan principalmente por su poder
además estas estabilizan los estados de
catalítico y alta especificidad. Las enzimas
son proteínas, macromoléculas muy
transición (Berg, Stryer & Tymoczko, pusieron cada una por aparte en un mortero
2007) para macerarlas junto con arena fina lavada,
a cada una se le agregó Buffer citrato 1:5
La peroxidasa es una enzima que tiene una
P/V, se mezclaron bien y se colocaron en
amplia distribución en la naturaleza, esta
tubos Falcon de 15 ml marcados, después
tiene la labor de oxidar a donadores de
se llevaron a la nevera por 5 minutos y
hidrógeno. Esta enzima pertenece al grupo
finalmente se llevaron a centrifugar por 35
de las oxidorreductasas, que se encargan de
minutos a 4000 rpm, luego se sacó con
catalizar un amplio rango de sustratos
ayuda de una pipeta Pasteur el
orgánicos e inorgánicos, usando el peróxido
sobrenadante, con el fin de colocar cada
de hidrógeno para ello (Sakharov, Ardila, &
sobrenadante en un tubo Eppendorf y
Sakharova, 1999).
conservarlos en el congelador.
La peroxidasa desempeña un papel
Para la segunda parte, inició con la
catalítico en el proceso de lignificación del
elaboración de una mezcla que contenía 5
xilema, participan en otros procesos
ml de Guayacol, 2 ml de peróxido de
fisiológicos como la superación, el
hidrógeno y 2,5 ml de tampón fosfato, esta
metabolismo de las auxinas, ensamblaje de
se depositó en un vaso de precipitado de 50
las proteínas de la pared celular, tolerancia
ml recubierto por papel aluminio, luego se
a sales y estrés hídrico (Matos et al., 2017).
procedió a llevar las mezclas al
La importancia de las proteínas y su acción espectrofotómetro, allí, se calibro el
como enzimas es evidente, pues participan espectrofotómetro y se emplearon
en diversos procesos que ocurren en los Micropipetas de 100/1000 µl, con punta
organismos, por ello su estudio es azul para la mezcla del vaso precipitado y
indispensable. Para el estudio de estas es punta amarilla para cada de las mezclas
indispensable su aislamiento y extracción, obtenidas en la primera parte, luego se
en este caso, en muestras vegetales. Es por realizó la lectura de la absorbancia a 470
ello que este estudio se plantea como nm y se hizo durante 1 minuto en intervalos
objetivo aplicar un método de extracción de de 10 segundos para cada de las muestras.
proteínas para posteriormente identificar la
presencia y función de la enzima
peroxidasa, a través de una prueba de RESULTADOS Y ANÁLISIS
cinética enzimática.
Parte 1
MATERIALES Y MÉTODOS
Pinca mayor
Esta práctica de laboratorio se divide en dos
Vi: 3 ml
partes; la extracción de proteínas y la
determinación de la actividad enzimática. Vf / sobrenadante: 1,5 ml + 0,6 ml

Para la primera parte se trajeron dos Volumen total : 0,9 ml


muestras vegetales diferentes (Festuca spp
Festuca spp.
y Pinca mayor), estas se lavaron, y se pesó
0,5 g de cada una, posteriormente se Vi: 2,5 ml
Vf / sobrenadante: 1,5 ml

Volumen total: 1 ml Parte 2

El aislamiento de proteínas inicia con la


lisis celular, pues estas se encuentran
contenidas en las células y al generar un
rompimiento de estas son liberadas al
medio haciendo más fácil el acceso a estas,
en este caso se usó el mortero, un método
de rompimiento por fricción, para ayudar al
proceso de trituración se adiciono arena,
un material abrasivo que al friccionar
facilita la liberación de las proteínas. Sin
embargo, este método no permite tener un
control total de la cantidad de fricción que
se genera y esto puede causar una elevación Figura 1. Cambio de coloración por
en la temperatura, lo cual genera calor que actividad enzimática en Festuca spp
puede alterar las proteínas a extraer
Tabla 1. Absorbancia de Festuca spp. de
(Alvarado, 2009).
10𝜇𝑙en un minuto
A su vez, es necesario congelar las muestras
después de realizar la extracción, ya que de Tiempo Absorbancia Absorbancia Absorbancia

esta forma se va a impedir una degradación


temprana de la proteína, además que 10 0,072 0,006 0,013
permite mantener la actividad enzimática
en un lapso de reposo que va a facilitar su 20 0,081 0,007 0,022

observación posterior sin cambios


30 0,091 0,010 0,029
significativos (Escorcia et al., 2009).

Luego de esto se coloca el buffer que 40 0,102 0,011 0,038


permite también que la célula termine de
vaciar su contenido y además proporciona 50 0,112 0,011 0,042

un pH adecuado para el proceso. La


60 0,122 0,013 0,047
centrifugación es un proceso que permite la
separación de materiales más grandes y Tabla 2. Absorbancia de Pinca mayor de
pesados de aquellos que son más ligeros, en 10𝜇𝑙en un minuto
el fondo del tubo quedan los materiales
como restos de células, moléculas enteras, Tiempo Absorbancia
orgánulos grandes y membranas, mientras
en en el sobrenadante quedan pequeños 10 0,011
orgánulos, proteínas, ADN y ARN
(Mendoza-Rodríguez, Sánchez, Leiva-Mora,
Acosta-Suárez, Rojas, Jiménez & Portal, 2006).
20 0,012 0,018 0,0003

30 0,015

40 0,016

50 0,017

60 0,018

En las tablas 1 y 2 se muestra la variación Gráfica 1. Absorbancia de Pinca mayor


de la absorbancia por una unidad de tiempo en función del tiempo (s).
ocasionada por la actividad enzimática.
Para la toma de esta se utilizó un método
cinético, que nos permite medir la
absorbancia varias veces en intervalos de
tiempo definidos; que permite comprobar
que se encuentra en la zona lineal de la
curva, ideal para la determinación; si se
detectan desvíos en la linealidad.

Tabla 3. Tabla de absorbancia vs valores de


unidades de actividad enzimática.

Promedio UAE:
absorbancia Δabs/Δtiempo Gráfica 2. Absorbancia de Festuca spp. en
función del tiempo (s).

0,011 0,0011 Para la constante Vm

b : 0,0247
0,012 0,0006
1 1
0,0247: 𝑙𝑙 Vm : 0,0247
0,015 0,0005
Vm: 40,48

0,016 0,0004 Para la Km


𝑙𝑙
m : 0,0006 0,0006 : 𝑙𝑙
0,017 0,00034
𝑙𝑙
0,0006 : 40,48 Km: 0,024288
actividad enzimática. La unidad enzimática
(UI) es la cantidad de enzima que cataliza
La Vmax corresponde al valor máximo al
la transformación de 1 µmol de sustrato en
que tiende la curva experimental, y la KM
un minuto, por lo que cualquier molécula
corresponde a la concentración de sustrato
adicional de sustrato tendrá que esperar
a la cual la velocidad de la reacción es la
hasta que una enzima se desocupe, por lo
mitad de la Vmax. De esta forma la Km
que la velocidad de reacción está limitada
describe la velocidad de reacción de la
por la concentración de enzima (Matute,
reacción enzimática, evidenciando la
2006 ).
relación enzima sustrato conforme una
unidad de tiempo específico (Johnson, K. CONCLUSIONES
A., & Goody, R. S. 2011).
El proceso de extracción de enzimas se
En las gráficas se puede observar la inicia vaciando el contenido celular, por
velocidad de reacción como una función de medio de un rompimiento generado por
la concentración del sustrato, y brinda fricción, luego de esto las proteínas quedan
información acerca de la actividad libres. Es importante generar condiciones
enzimática, esta se ve representada por propicias para evitar su degradación por lo
medio de la absorbancia, La absorbancia que se adiciona el Buffer, por último la
indica que tanta luz se absorbe, si el centrifugación facilita la separación de
producto absorbe luz a una longitud de moléculas pesadas y livianas, dejando a
onda determinada es posible analizar la disposición las proteínas en el sobrenadante
desaparición del sustrato de acuerdo al del tubo.
incremento de absorbancia (Salve, Amich,
La actividad enzimática se puede observar
Prieto & Casas, 1994).
mediante el espectrofotómetro, en donde se
Justo en el primer momento en el que se mide que tanta luz se absorbe en la
combina el sustrato con la enzima, está reacción, esto permite saber que tanto
cataliza la reacción tan rápido como sea sustrato está desapareciendo. En este caso
posible dependiendo de la cantidad de la cinética enzimática observada es en el
sustrato (porque la velocidad de reacción momento de la unión enzima-sustrato.
disminuirá a cero conforme se usa el
El cambio de coloración a marrón indica la
sustrato), se podrá medir la cantidad de
presencia suficiente de la enzima
producto sintetizado por unidad de tiempo
peroxidasa para llevar a cabo su labor de
al inicio de la reacción, cuando la
óxido-reducción del sustrato peróxido de
concentración de producto aumenta en
hidrógeno.
forma lineal. Este valor, la cantidad de
producto sintetizado por unidad de tiempo El valor máximo de tendencia de la curva
al inicio de la reacción, se llama Vinicial 0 experimental es de 40,48 valor que junto
para esa concentración, pero si la cantidad con la pendiente de la gráfica permite
de sustrato disminuye drásticamente la obtener la constante de Michaelis-Menten
velocidad de reacción también lo hará que describe la velocidad en la que ocurre
proporcionalmente modificando la
la reacción enzimática que corresponde a intercelular en hojas de banano, cultivar
un valor de 0,024. ‘Grande naine’(Musa AAA). Biotecnología
Vegetal, 6(1).
REFERENCIAS
Salve ML, Amich S, Prieto S &
Alvarado, L. (2009). Biología
Casas A. (1994). Laboratorio Clínico.
celular, centrifugación y electroforesis (p.
Madrid. Ed. Interameericana•McGraw-Hill
4). Universidad Centroccidental.
Sakharov, I. Y., Ardila, G. B., &
Berg, J. M., Stryer, L., &
Sakharova, I. V. (1999). Peroxidasa de
Tymoczko, J. L. (2007). Bioquímica.
plantas tropicales. Revista Colombiana de
Reverté.
Química, 28(1), 97-106.
Escorcia, D., Hernández, D.,
Sánchez, M., & Benevente, M. (2009).
Diseño y montaje de una planta piloto para
la extracción de quitina y proteínas. Nexo
Revista Científica, 22(2), 45-55.

Johnson, K. A., & Goody, R. S.


(2011). The original Michaelis constant:
translation of the 1913 Michaelis–Menten
paper. Biochemistry, 50(39), 8264-8269.

Matos-Trujillo, Madyu, Díaz-


Solares, Maykelis, Samaniego-Fernández,
Luz María, Cortegaza-Ávila, Leydis,
Pérez-Milian, José R, Pellón-Guzmán,
Yenima, Rufín-Hernández, Yordanka, &
Pérez-Pérez, Josel. (2017). Expresión de la
enzima peroxidasa en plantas de
Saccharum sp. híbrido inoculadas con
Xanthomonas albilineans Ashby
(Dowson). Pastos y Forrajes.

Matute, B. M. (2006). Resolución


cinética dinámica catalizada por enzimas y
metales de transición. In Anales de la Real
Sociedad Española de Química (No. 4, pp.
46-52). Real Sociedad Española de
Química.

Mendoza-Rodríguez, M., Sánchez,


A., Leiva-Mora, M., Acosta-Suárez, M.,
Rojas, L., Jiménez, E., & Portal, O. (2006).
Extracción de proteínas a partir del fluido